Abstract
De placenta is het eerste orgaan optreden tijdens embryogenese en is nodig voor de overleving van het ontwikkelende embryo. De placenta bestaat uit verschillende trofoblastcellen dat onderscheiden van de extra-embryonale trophectoderm cellen van de inplanting blastocyst. Als zodanig is ons begrip van de vroege differentiatie gebeurtenissen van de menselijke placenta beperkt omwille van ethische en juridische beperkingen op de isolatie en manipulatie van de menselijke embryogenese. Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) is een robuust modelsysteem voor het onderzoeken van menselijke ontwikkeling en kan ook in vitro worden gedifferentieerd tot cellen die markers trofoblastische van de trofoblast verschillende celtypen tot expressie. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor differentiatie hPSCs in trofoblastcellen behulp botmorfogeen eiwit 4 en remmers van de activine / Nodal signaalroutes. Dit protocol genereert verschillende trofoblast celtypes die kunnen worden getransfecteerd met siRNAvoor het onderzoeken van het verlies-van-functie fenotypes of kunnen worden besmet met ziektekiemen. Bovendien kan hPSCs genetisch worden gemodificeerd en vervolgens onderverdeeld in trofoblast progenitors voor gain-of-function analyses. Deze in vitro differentiatie werkwijze voor het genereren van menselijke trophoblasts vanaf hPSCs overwint de ethische en wettelijke beperkingen van het werken met vroege menselijke embryo's, en het systeem kan worden gebruikt voor diverse toepassingen, zoals geneesmiddelen en stamcelonderzoek.
Introduction
De placenta is nodig voor de groei en overleving van de foetus tijdens de zwangerschap en vergemakkelijkt de uitwisseling van gassen, voedingsstoffen, afvalstoffen, hormonen en tussen maternale en foetale bloedsomloop. Het eerste orgaan gevormd tijdens embryogenese zoogdieren is de placenta, die begint ontwikkelen 6-7 dagen na de bevruchting bij de mens en bij muizen 3,5-4,5 dagen 1, 2, 3, 4. Trofoblastcellen zijn de belangrijkste cellen van de placenta, en deze cellen vertegenwoordigen één van de eerste lijn differentiatie gebeurtenissen bij zoogdieren embryo. Ze ontstaan uit de buitenste extra-embryonale trophectoderm cellen van de pre-implantatie blastocyst. Onze kennis van de vroege stadia van ontwikkeling van de placenta wordt beperkt door ethische en logistieke beperkingen modelleren vroege menselijke ontwikkeling.
Tijdens de embryonale implantatie, trofoblastenbinnenvallen de moederlijke epitheel en differentiëren in gespecialiseerde stamcellen 5. Cytotrofoblasten (CTBS) worden mononucleaire, ongedifferentieerde voorlopers die fuseren en differentiëren in syncytiotrofoblasten (SYN) en extravilleuze invasieve trofoblasten (EVTS), dat anker de placenta naar de baarmoeder. SYN zijn meerkernige, terminaal gedifferentieerde cellen die hormonen noodzakelijk voor het behoud van de zwangerschap synthetiseren. De vroege differentiatie gebeurtenissen die EVTS en SYN genereren zijn essentieel voor de vorming van de placenta, zoals stoornissen in trophoblastic cellen resulteren in een miskraam, pre-eclampsie, en Dysmaturiteit 1. De typen humane trofoblast cellijnen die zijn ontwikkeld onder onsterfelijk CTBS en choriocarcinomas, die placenta hormonen en weergave invasieve eigenschappen 6 produceren. Primaire trophoblastic cellen van het eerste trimester placenta mens kan worden geïsoleerd, maar de cellen snel differentiate en stoppen prolifererende in vitro. Belangrijk is getransformeerd en primaire cellijnen hebben verschillende genexpressie profielen, wat aangeeft dat tumorigene en onsterfelijk trofoblast cellijnen primaire trophoblasts 7 niet nauwkeurig kan vertegenwoordigen. Bovendien, deze lijnen is het onwaarschijnlijk dat de placenta trofoblast stamcellen voorlopers lijken, omdat ze voor het eerst zijn afgeleid van later stadium via derde trimester.
Er is behoefte aan een krachtige in vitro kweeksysteem van beginnende menselijke trophoblasts om de vroege gebeurtenissen van placenta vorming en functie te bestuderen. Humane embryonale stamcellen (hESCs), welke eigenschappen de binnenste celmassa van pre-implantatie embryo delen worden vaak gebruikt om vroege menselijke Ontwikkelmodel, waaronder de vorming van de vroege placenta. Zowel menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) en hESCs kunnen worden onderscheiden in trophoblasts in vitro met behulp van Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Deze omzetting van pluripotente cellen trofoblastcellen behulp BMP4 specifiek is voor humane cellen en wordt veel gebruikt om de ontwikkeling van de vroege menselijke placenta te bestuderen omdat het geen toegang heeft tot vroege menselijke embryo 9, 16 noodzakelijk. Recent werd ontdekt dat het toevoegen van de remmers A83-01 (A) en PD173074 (P), die de SMAD2 / 3 en MEK1 / 2 signaleringsroutes te blokkeren, verhoogt de efficiëntie van differentiatie in HPSC trophectoderm-achtige stamcellen voornamelijk SYN en EVTS zonder uitgebreide vorming van mesoderm, endoderm of ectoderm cellen 9, 17 in vitro modelsysteem 9, 11. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de in vitro differentiatie van hPSCs in humane trofoblast voorlopers gebruikt BMP4 / A / P cultuurmedium. Deze omstandigheden produceren overvloedige aantallen cellen voor een groot aantal toepassingen, waaronder RNA sequentie, gendisruptie behulp siRNA, pathogeen infecties en genetische modificatie onder toepassing van lipofectie-gemedieerde transfectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Voor de differentiatie van beide hESCs of hiPSCs in trofoblast voorlopers, hPSCs geteeld op muis embryonale fibroblasten (MEF) worden overgebracht naar feeder-vrije omstandigheden gedurende twee passages voor het begin van differentiatie met BMP4 / A / P. Dit proces elimineert de MEF besmetting van gedifferentieerde cellen. Hier presenteren we een protocol voor differentiatie hESC en hetzelfde protocol kan worden toegepast hiPSCs.
1. Cultuur en herstel van hESCs op bestraalde muis embryonale fibroblasten (MEF) (Voorbereidingen)
- Gamma-bestraling van MEF
- Voeg 500 ml van medium voor het kweken van de MEF: DMEM met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 1 x penicilline / streptomycine (Pen / Strep) en 0,1 mM niet- essentiële aminozuren (NEAA).
- Dooi een flacon van de primaire MEF en gebruik MEF medium voor het kweken van de cellen. Vouw de primaire MEF tot 30 platen met behulp van MEF kweekmedium.
OPMERKING: Zuurstofconcentraties niet kritisch voor deze stap, zodathetzij fysiologische (4%) of omgeving (20%) omstandigheden in de incubator kan worden gebruikt. - Oogst de MEF. Gebruik 0,25% trypsine aan de MEF uit de platen en de cellen overbrengen naar een conische buis. Plaats de MEF tot een bestraling instrument en bloot de cellen tot 3.500 grijstinten.
OPMERKING: De hoeveelheid zal afhangen van de activiteit van de bron in de bestraler apparaat. - Resuspendeer de bestraalde MEF met MEF kweekmedium en tel het aantal cellen met een hemocytometer.
- Pellet de MEF met behulp van een centrifuge en voeg 50% MEF kweekmedium en 50% cel bevriezing medium (80% FBS en 20% MEF kweekmedium). Aliquot 1 x 10 6 cellen per flesje.
- Plaats de bestraalde MEF flacons in een -80 ° C vriezer gedurende de nacht, en vervolgens overbrengen naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
- Ontdooien van bevroren MEF en hESCs voor cultuur
- Maak 500 ml van hESC medium: DMEM / F-12 met 20% Serum Replacement, 0,1 mM NEAA, 2 mM L-glutamine, 10 ng / ml bFGF, 0,1 mM ß-mercaptoethanol en 1x Pen / Strep.
- Dooi een flacon van MEF één dag voor het ontdooien van de hESCs. Coat een 6-wells plaat met 0,1% gelatine, 1 ml gebruikt voor elke wel. Incubeer gedurende minstens 20 minuten bij kamertemperatuur, en verwijder vervolgens de gelatine.
- Verwijder een flacon MEFs van opslag in vloeibare stikstof en dompel de flacon in een 37 ° C waterbad. Kijk naar de flacon met tussenpozen tot slechts kleine ijskristallen blijven. Vlug de inhoud van het flesje over te dragen aan 9 ml MEF medium in een 15 ml conische buis.
- Pellet de cellen door centrifugeren bij 200 g gedurende 5 min. Zuig het supernatant en resuspendeer de cel pellet in MEF medium. Aliquot de MEFs gelijkmatig op een 6-wells plaat. Plaats de plaat in een 37 ° C zuurstofarme (4%) incubator nacht.
- Routine cultuur van hESC 's op MEF
- Verwijder een hESC flesje uit vloeibare stikstof en ontdooien snel het flesje met een 37 ° C waterbad. Voorzichtig pipet de hESCs in een 15 ml conische buis met 9 ml van hESC medium en spin neer op 200 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het medium en resuspendeer de cellen met 1 ml van hESC medium.
- Zuig het MEF medium van de plaat bereid in stap 1.2.4 en voeg 1 ml van hESC medium. Voeg Rock remmer Y-27632 (10 uM) aan de hESC medium. Breng de hESC 's op MEF.
- Plaats de cellen in een 37 ° C zuurstofarme (4%) incubator nacht. Vervang de hESC medium dagelijks. Schraap gedifferentieerde cellen met een Pasteur pipet, gevisualiseerd onder een microscoop rechtop op 4X.
- Passage de hESCs om de 4-6 dagen, afhankelijk van de cel confluentie en de grootte van de hESC kolonies. Bereid een plaat van MEF de dag voor passage. Wanneer de cellen klaar om doorgang, verwijderen hESC medium en was de put met 1 ml PBS.
- Voeg 1 mg / ml collagenase (voorverwarmd tot 37 ° C), incuberen bij 37 ° C gedurende 5 min, en verwijder de collagenase. was van de cellen met PBS, voeg 1 ml van hESC medium per well, en de cellen handmatig schrapen in kleine groepjes met behulp van de punt van een 5 ml pipet. Breng de geschorste cel klonten in een nieuwe MEF-gecoate put (s).
2. Overgang van hESC 's van MEF feeder-vrije omstandigheden op extracellulaire matrix-gecoate platen
- Bereid MEF geconditioneerd medium (CM)
- Plate de bestraalde MEFs in een T75 kolf bij 90-100% samenvloeiing; Het is belangrijk dat de MEFs dicht worden uitgeplaat. Observeer de cellen met behulp van een microscoop om te bepalen of ze naar de bodem van de kolf zijn gehecht (MEFs hechten ongeveer 6 uur na plateren of de volgende dag).
OPMERKING: Losse cellen drijven in het medium wanneer waargenomen met behulp van een microscoop. De volgende dag, verwijder MEF medium en voeg 25 ml van hESC medium zonder B-FGF. - Verzamel het geconditioneerde medium na 24 uur incubatie. Vervangen door vers medium per dag gedurende maximaal 12 dagen. Filter de verzamelde CM behulp van een 0,22 pm filter. Voorafgaand aan het gebruik, voeg verse B-FGF aan de CM.
OPMERKING: CM kan worden ingevroren bij -80 ° C bewaard tot 1 jaar. Alternatief bewaar het GH bij 4 ° C gedurende 2 weken.
- Plate de bestraalde MEFs in een T75 kolf bij 90-100% samenvloeiing; Het is belangrijk dat de MEFs dicht worden uitgeplaat. Observeer de cellen met behulp van een microscoop om te bepalen of ze naar de bodem van de kolf zijn gehecht (MEFs hechten ongeveer 6 uur na plateren of de volgende dag).
- De overgang van de hESCs van cultuur op de MEF feeder-vrije extracellulaire matrix gecoate platen.
- Bereiding van extracellulaire matrix voor het bekleden weefselkweekplaten
- Dooi een hoeveelheid extracellulaire matrix op ijs (ongeveer 3-4 uur). Gebruik ijskoude tips, een koude, 50 ml conische buis en DMEM / F12 medium, overdracht 2 mg van extracellulaire matrix in 24 ml ijskoude DMEM / F-12 (verdunning hangt af van de extracellulaire matrix concentratie van de leverancier ).
- Onmiddellijk over de 50 ml conische buis op ijs en het op 4 ° C. Voor coating weefselkweekplaten, voeg de juiste hoeveelheid verdund extracellulaire matrix naar de bron (bijvoorbeeld 1 ml per putje in een 6-wells plaat). Zwenk het bekleden van de plaat en incubeer bij kamertemperatuur gedurende tenminste 1 uur.
- HESCs passage van MEF (zoals in stap 1,3) via CM bevattende B-FGF (10 ng / ml).
- Zuig aan de extracellulaire matrix van de nieuwe plaat te verwijderen en voeg CM bevatten B-FGF. Breng de geschraapt cellulaire klonten van het MEF plaat met behulp van een pipet en aliquot het in de extracellulaire matrix gecoate plaat. Incubeer in het 37 ° C zuurstofarme incubator 's nachts.
- Vervang de CM met B-FGF medium dagelijks; de hoeveelheid medium zal afhangen van de grootte van de kweekfles. Gebruik 2 ml medium voor een 6-well well. Schraap gedifferentieerde cellen met een Pasteur pipet.
- Passage hESCs elke 6-7 dagen, toen kolonies zijn helder wanneer bekeken onder de microscoop.
LET OP: hESC kolonies gegroeid op extracellulaire matrix gecoate platen groeien groter dan MEF-gekweekte cellen. - Wanneer de feeder-vrije cellen zijn klaar om passage, verwijder het medium, wassen door adding 1 ml PBS met een pipet, zuig de PBS te verwijderen, 0,5 mg / ml dispase (voorverwarmd tot 37 ° C) met een pipet, en incuberen bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
- Was de cellen met PBS door toevoeging van 2 ml PBS per putje en daarna afzuigen. Voeg 1 ml per putje CM handmatig schrapen van de cellen in kleine klompjes met de punt van een 5 ml pipet.
- Plate de geschorste cel klonten in nieuwe extracellulaire matrix beklede platen; de cellen moeten zich houden na 24 uur.
- Bereiding van extracellulaire matrix voor het bekleden weefselkweekplaten
3. Differentiatie van hESCs behulp BMP4 / A / P
- Bereid de differentiatie medium. Gebruik CM (gebrek B-FGF) en voeg (vers) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 uM) en PD173074 (0,1 uM). Voeg deze remmers van het GH voor gebruik.
- Gebruik feeder-free hESCs groeien op extracellulaire matrix gecoate platen voor 1 passage, gekweekt in een incubator ingesteld op 4% zuurstof. Na de eerste passage op extracellulaire matrix gecoate platen,laat de cellen hechten gedurende 24 uur. De volgende dag initiëren differentiatie. Verwijder de CM (met B-FGF) en vervangen door CM bevattende BMP4 / A / P (2 ml per putje in een 6-wells plaat). Verder kweken van de cellen onder toepassing van 4% zuurstof.
- Vervang het GH bevattende BMP4 / A / P (2 ml / putje van een 6-wells plaat) elke 2 dagen. Zuig de oude medium verwijderen en voeg nieuwe CM met een pipet. Op de tweede dag na het toevoegen en verwijderen BMP4 B-FGF (beschouwd differentiatie dag 2), zal de celmorfologie wijzigt, verschijnen groter bij waarneming met een microscoop.
OPMERKING: ongedifferentieerde cellen zijn licht afgeronde hoeken vertonen, niet aanwezig zal zijn. - Verzamel cellen op de gewenste tijdstippen. Gedifferentieerde cellen zal stoppen met delen na ongeveer 2 weken. Transfecteren cellen tijdens deze periode (zie de volgende paragraaf).
4. Transfectie van trofoblastcellen met siRNA of Plasmide DNA
- Bereid trofoblastcellen voor transfectie
- Cultuur hESCs voor twee passages over de extracellulaire matrix na hen overbrengen van de MEF (zie stap 2.2). Gebruik hESC medium dat B-FGF.
- Splits de hESC 's op een nieuwe extracellulaire matrix plaat één dag voor differentiatie. Hoge cellulaire confluentie belangrijk, zodat de cellen gesplitst 1: 1 op een nieuwe plaat / putje, die de volgende dag garandeert minimaal 50% confluentie. Incubeer de cellen 's nachts in de zuurstofarme incubator.
LET OP: hESCs hoeft niet tijdens deze stap te tellen. - De volgende dag vervangen door het product met de differentiatie medium (CM bevattende BMP4 / A / P en weinig B-FGF toepassing van 2 ml / putje van een 6-wells plaat). Verwijder het oude medium door afzuigen en breng het nieuwe medium (2 ml) met een pipet. Plaats de cellen in een zuurstofarme incubator (4% zuurstof) gedurende de nacht.
- Differentiëren de cellen tot de gewenste tijd-punt (tussen dag 1 en 14). De dag voor transfectie, trypsinize de cellen met behulp van 0,05% trypsine gedurende 5 min. Plaat ze de gewenste confluentie (afhankelijk van het transfectiereagens protocol) op een met gelatine beklede platen (voeg 0,1% gelatine een weefselkweekplaat gedurende 20 min en zuig te verwijderen). CM bevatten BMP4 / A / P (gebrek aan B-FGF) toe te voegen en incubeer overnacht.
- De volgende dag, toevoegen van vers medium tot differentiatie van de cellen. Transfecteren siRNAs met een siRNA transfectiereagens. Voor plasmide-DNA, gebruik van een geschikt lipofectamine reagens.
- Volg de product-protocol zoals beschreven voor elke transfectiereagens. Breng de siRNA-lipofectamine complexen aan elk putje / plaat van cellen, meng voorzichtig, en de cultuur van de cellen 's nachts in een zuurstofarme incubator.
OPMERKING: Sommige transfectiereagentia worden geremd door antibiotica, die nodig CM ontbreekt Pen / Strep. - De volgende dag, te vervangen door verse differentiatie media.
- Oogst de cellen op het verlangend tijdstippen (bijvoorbeeld, 24 uur, 48 uur en 72 uur) aan de gendisruptie efficiëntie wordt gecontroleerd met behulp van kwantitatieve RT-PCR. Oogst cellen Gebruik 0,05% trypsine, toevoegen van 1 ml per putje en incubatie gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Voeg 5 ml van MEF medium per goed aan de trypsine te neutraliseren. Spin down de cellen bij 200 xg gedurende 5 minuten en gebruik de celpellet voor RNA-isolatie.
5. Pathogeen Infectie van trofoblastcellen: Sendai virale infectie
- Bereid hESCs voor differentiatie
- Cultuur hESCs voor twee passages over de extracellulaire matrix na de overdracht van het MEF (zie stap 2.2). Gebruik hESC medium dat B-FGF.
- Splits de hESC 's op een nieuwe extracellulaire matrix plaat één dag voor differentiatie. Hoge cellulaire confluentie belangrijk, zodat split cellen 1: 1 op een nieuwe plaat / putje, die de volgende dag garandeert minimaal 50% confluentie. Incubeer de cellen 's nachts in een zuurstofarme incubator (4% zuurstof). <br /> NB: hESCs hoeft niet tijdens deze stap te tellen.
- De volgende dag, vervang het medium met de differentiatie medium (CM bevatten BMP4 / A / P en ontbreekt B-FGF) en cultuur 's nachts in een zuurstofarme incubator (4% zuurstof).
- Sendai virale infectie van trofoblastcellen
- Een dag voor de gewenste differentiatie dag, trypsinize de differentiërende cellen (tot enkele cellen) met behulp van 0,05% trypsine gedurende 5 minuten en overbrengen naar een gelatine-gecoate plaat. Voeg differentiatie medium en incubeer overnacht in een zuurstofarme incubator.
- De volgende dag, voeg medium geïnfecteerd (dit hangt af van het virus). Gebruik CM ontbreekt Pen / Strep met BMP4 / A / P, met behulp van 0,5 ml voor één putje van een 6-wells plaat. Voeg Sendai virus voor MOI = 1. Incubate voor 8 uur in een zuurstofarme incubator.
- Als extra tijd-punten nodig zijn, verwijder het virus bevattend medium na 4 uur en vervang deze door BMP4 / A / P CM. Verzamel cellenvoor RNA-isolatie met een cel schraper.
- Bepaal de efficiëntie van virale infectie door het uitvoeren qRT-PCR voor genen betrokken bij de virale respons 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overzicht van In Vitro Differentiatie van hPSCs
Dit in vitro differentiatie protocol begint met ongedifferentieerde hESC 's geteeld op MEF die worden overgebracht naar feeder-vrije omstandigheden gedurende één doorgang (Figuur 1A). Terwijl we de differentiatie van hESC 's beschreven in dit protocol, gebruikten we dit protocol om hiPSCs succesvol differentiëren in trofoblastische cellen. De overgang naar extracellulaire matrix verwijdert het grootste deel van de bestraalde MEF, hetgeen ongewenst analyses die pure populaties van humane trofoblastcellen nodig zijn. Ongedifferentieerde hPSCs worden geteeld op extracellulaire matrix en gekweekt met CM met B-FGF tot de kolonies zijn klaar voor passage (ongeveer een week). Dit handhaaft de pluripotente toestand voorafgaand aan het induceren BMP4 / A / P-gemedieerde differentiatie. De kolonies worden verstoord in groepjes van ~ 50-100 cellenmet behulp van dispase en gepasseerd voor de tweede keer op een extracellulaire matrix gecoate plaat. De dag na passage, de hechtende cellen klaar om differentiatie te induceren, en het medium wordt omgeschakeld naar BMP4 / A / P weinig B-FGF bevatten. De gedifferentieerde cellen prolifereren gedurende ongeveer 2 weken, gedurende welke tijd de cellen kunnen worden verzameld voor RNA-isolatie en gebruikt voor transfectie-experimenten. Morfologische wijzigingen zijn dan 1-2 dagen na differentiatie ingeleid en de resultaten van één representatief experiment worden getoond in Figuur 1B. Merk op dat cellen op differentiatie dagen 1-2 zijn groter dan de cellen van dag 0 (Figuur 1B). De gedifferentieerde cel kolonie groeit snel en deze verandering is merkbaar dagelijks. Differentiatie opbrengst, de cellen delen en breiden uit het centrum van de kolonie, groeien in een buitenwaartse richting (dagen 3-5 Figuur 1B). Het buitenste gedeelte van de kolonie bevat grotere cellen vergeleken met tHij cellen in het midden van de kolonie. De differentiërende cellen worden donkerder en vlakker dan pluripotente stamcellen gekweekt op extracellulaire matrix; de veranderingen in de helderheid cel duidelijker bij het bekijken van de cellen met een rechtopstaande microscoop gebruikt voor routinematige celkweek. De individuele kolonies samenvoegen van differentiatie dag 5 (Figuur 1B), met cellen groeien op elkaar. Na differentiatie dag 4-5, cellen met meerdere kernen aanwezig (niet getoond) (Figuur 1B).
BMP4 / A / P induceert de differentiatie en expressie van Trofoblast Markers
We onderzochten genexpressie veranderingen tijdens de eerste drie dagen van BMP4 / A / P ontwikkeling met behulp van kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR). RNA werd geïsoleerd differentiatiepoging dagen 1, 2 en 3 en omgezet in cDNA. Het verdwijnen van pluripotente stamcellen kunnen worden beoordeeld zowel by morfologie visueel met behulp van een microscoop, en met qRT-PCR, onder gebruikmaking van primers voor pluripotentie genen. De relatieve expressieniveaus van NANOG, een marker van pluripotente stamcellen, verminderd met ~ 75% na een dag van differentiatie wanneer cellen worden gekweekt met BMP4 en niveaus worden verlaagd met ~ 90% in de aanwezigheid van BMP4 / A / P ( figuur 2). Door differentiatie dag 2, de niveaus van NANOG zeer laag voor cellen gekweekt in alleen of in BMP4 / A / P BMP4 vergeleken met die in hESC CM medium (bevattende B-FGF). Dit is een verwacht resultaat, omdat we geen ongedifferentieerde cellen nemen na twee dagen van differentiatie (figuur 1B), die lichter en kleiner vergeleken met gedifferentieerde cellen. De efficiëntie van BMP4 gemedieerde differentiatie trofoblastcellen kunnen direct worden beoordeeld door qRT-PCR met primers specifiek voor twee trofoblast markers: KRT7 en CDX2. Beide genen niet tot expressie gebracht in menselijke pluripotente stamcellencellen en hun expressie stijgt na 2-3 dagen BMP4 behandeling (Figuur 2). Met de hier beschreven omstandigheden KRT7 transcriptie verhogen differentiatie op dag 1 in BMP4 / A / P medium en constant blijven gedurende de eerste 3 dagen van differentiatie (figuur 2). KRT7 expressie bij het gebruik BMP4 alleen een vertraagde groei per dag 2, in overeenstemming met eerdere opmerkingen dat activine / Nodal remmers verhogen de differentiatie tarief van hESC 's 9. Een andere manier om de efficiëntie van het gebruik van deze remmers te bepalen, is de steady-state overvloed aan CDX2 en KRT7 transcripten bepaald in cellen behandeld met alleen BMP4. CDX2 niveaus zijn vergelijkbaar voor differentiatie 1-3 dagen bij gebruik hetzij alleen of BMP4 BMP4 met activine / Nodal remmers. Echter, KRT7 transcripten overvloedig na één dag van differentiatie in aanwezigheid van deze remmers, die een meer suggereertsnelle differentiatie (figuur 2). CDX2 expressie pieken kenmerkend differentiatiepoging dag 2 voor beide voorwaarden en neemt na dag 3 (Figuur 2). Ongedifferentieerde hESCs doen ofwel KRT7 of CDX2 (figuur 2) niet uit te drukken, zoals verwacht. Concluderend BMP4 / A / P condities snel onderscheid hESCs en placenta markerexpressie kan al differentiatie dag 3 gedetecteerd.
Transfecties van siRNA's en plasmide DNA en virale infecties Met behulp van In Vitro -afgeleide trofoblastcellen
In vitro kan afgeleid humane trofoblastcellen worden getransfecteerd met siRNA's de genexpressie van zowel coderende en niet-coderende RNA's verstoren. Wij begonnen de differentiatie van hESCs gebruik BMP4 / A / P, uitgevoerd twee rondes van siRNA transfecties (met 75 pmol siRNA's) op differentiatie dag 1 en 2,en verzamelde cellen voor RNA-isolatie. Kwantitatieve RT-PCR is een effectieve methode om de knock-down efficiëntie van zowel coderende en niet-coderende genen te bepalen. Met twee siRNAs complementair aan verschillende gebieden van het lange niet-coderende RNA lncRHOXF1 19, verkregen we 80% knockdown van lncRHOXF1 transcripten (figuur 3A). Vervolgens getransfecteerde we één siRNA (25 pmol) van de eiwit-coderende gen hnRNP U, ook op differentiatie dag 1 en 2. We zagen een 80% reductie in hnRNP U transcripten na twee achtereenvolgende transfecties. In vitro gedifferentieerde trofoblast stamcellen kan ook worden gebruikt om aangeboren immuunresponsen te onderzoeken. We voerden infecties van differentiatie dag 2 cellen middels Sendai-virus met een MOI van 1 en de cellen gewonnen na 8 uur van virale incubatie. Gebruik qRT-PCR gedetecteerd wij overvloedige viraal eiwit transcripten (Sev-NP) in geïnfecteerde cellen (Figuur 3B), indicatief voor actieve virale propagation in trofoblastische cellen. Belangrijker geïnfecteerde cellen (MOI = 1 gebruikt) veranderen niet in uiterlijk en levensvatbaar (gegevens niet getoond). In vitro verkregen trofoblastcellen kunnen ook worden getransfecteerd met plasmide DNA. We voerden transfecties met een GFP plasmide en ingebracht dit construct in BMP4 / A / P-behandelde cellen differentiatie op dag 1 en dag 3 en afgebeeld voor GFP de volgende dag (figuur 4). Wij doorgaans verkregen 30-50% transfectie-efficiëntie bij 24 uur na transfectie. Concluderend, in vitro verkregen trofoblastcellen kan worden gebruikt voor gain en loss-of-function experimenten.
Figuur 1: In vitro differentiatie van pluripotente stamcellen menselijke vroeg trofoblastcellen behulp BMP4 / A / P. (A) Schematische voorstelling van BMP4 differentiatie van hPSCs tot trofoblastcellen behulp BMP4 / A / P. (B) Representatieve bright-field beelden van HUES9 cellen tijdens d0, d2 en d6 van BMP4 / A / P differentiatie. Schaal bar = 50 pm. De pijlpunten duiden eencellige hESCs die niet worden gedifferentieerd. De pijlen benadrukken morfologische kenmerken tijdens differentiatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: BMP4 / A / P differentiatie downregulates snel de pluripotentie marker NANOG en upregulates trofoblast genen CDX2 en KRT7. qRT-PCR-analyse voor NANOG (pluripotentie marker), CDX2 en KRT7 (trofoblast markers). De waarden zijn gemiddelden van drievoud maatregelen. //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Gene verstoring en virale infectie middels in vitro gedifferentieerde humane trofoblastcellen. (A) qRT-PCR-analyse van hESCs (HUES9) gesplitste en vervolgens getransfecteerd met siRNA's die specifiek zijn voor de lange-coderende RNA lncRHOXF1 (links) of het eiwit coderende gen hnRNP U (rechts) gedurende twee opeenvolgende dagen. De efficiëntie knockdown (KD) typisch 70-80%, en de resultaten van de ene transfectie experiment worden. (B) qRT-PCR-analyse van de Sendai virale eiwit transcript van differentiatie dag 2 trofoblastcellen geïnfecteerd met Sendai-virus (MOI = 1) voor 8 uur. De fout balken geven de SEM."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Introductie van plasmide DNA in in vitro gedifferentieerde humane trofoblastcellen. Transfectie van GFP plasmide DNA in differentiatie dag 1 en dag 3 trophectoderm progenitorcellen, gevisualiseerd de volgende dag. Schaal bar = 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We presenteerden de basisstappen voor de differentiatie hESCs in trophoblast voorlopers. Dit protocol is onlangs geoptimaliseerd om hESCs snel onderscheid met de toevoeging van activine / Nodal signalering remmers, waardoor de differentiatie trofoblastcellen en het vermijden van de vorming van mesoderm voorlopers, die typisch waargenomen BMP4 behandeling alleen. Het BMP4 model systeem maakt het mogelijk voor het onderzoek van de vroegste stadia van de menselijke afstamming trophoblast specificatie en expansie. Daarnaast is deze BMP4 modelsysteem is ook bruikbaar voor het onderzoeken van de differentiatie van trofoblastcellen specifieke sub-lijnen, wat niet mogelijk is met behulp choriocarcinoom cellijnen en extravilleuze trofoblast cellijnen. In vitro verkregen trofoblastcellen kan ook worden gebruikt voor loss-of-function experimenten met siRNA 19. Daarnaast kunnen hESCs of hiPSCs genetisch worden aangepast voor de induceerbare expressie van andere genen es 19 of voor het invoegen van reportergenen endogene loci 20, en deze cellen kunnen worden onderverdeeld in trofoblastcellen met de hier beschreven omstandigheden.
Kritische stappen in het protocol
Het is noodzakelijk om B-FGF (FGF2) van de CM differentiatie medium nalaten trophoblastic stamcellen uit hESCs verkrijgen. De aanwezigheid van B-FGF samen met BMP4 in het kweekmedium verhoogt de expressie van mesoderm en endoderm voorlopers 16. De opname van B-FGF in trofoblast differentiatie medium wordt verondersteld om uit te leggen waarom een recente studie bleek dat-BMP4 gemedieerde differentiatie genereert mesoderm en endoderm cellen in plaats van trofoblasten 21. Het is goed vastgesteld dat B-FGF samen met activine A en BMP4 bevordert endoderm en mesoderm differentiatie in een dosis-afhankelijke wijze 22,s = "xref"> 23. Bij de muis is de ontwikkeling van de epiblast, trophectoderm en primitieve endoderm lineages afhankelijk van FGF signaalroutes 24. In differentiërende hESCs, is B-FGF-geïnduceerde signalering vereist mesoderm formatie bij BMP4 wordt gebruikt om differentiatie 21, 25 opwekken. In tegenstelling tot de remming van zowel FGF en de activine / Nodal signaalwegen, alsmede BMP4, begunstigt SYN-vorming in hESC afgeleide trofoblast progenitors en voorkomt de vorming van mesoderm en endoderm primitieve progenitors 26.
Beperkingen van de Techniek
De meest typische probleem met dit protocol van HPSC differentiatie trophoblast voorlopers wordt in verband gebracht met het starten met een overwegend ongedifferentieerde populatie van hESC 's of hiPSCs op MEF. Omdat hPSCs accumuleren gedifferentieerde cellen op zowel de binnenste en buitenste randenvan de kolonies, is het belangrijk om de hoeveelheid differentiatie dagelijks controleren en om gedifferentieerde koloniën (of delen kolonies) te verwijderen. De aanwezigheid van gedifferentieerde cellen kan het differentiatieproces bemoeilijken, vooral wanneer de cellen worden overgebracht naar de extracellulaire matrix. De gedifferentieerde cellen zal snel verspreiden over de extracellulaire matrix in de aanwezigheid van CM, en deze cellen zal snel de cultuur over te nemen en uit-concurrentiebeding de hPSCs. Daarom is het ideaal om te beginnen met gezonde, ongedifferentieerde hPSCs kolonies gegroeid op MEF Alvorens de cellen aan de extracellulaire matrix.
Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / Alternative Methods
Bij gebruik van deze differentiatie protocol, de resulterende trofoblast voorlopers zijn een heterogeen mengsel van celtypen. Trophoblasts bestaan uit villous cytotrofoblasten, syncytiotrofoblasten (SYN), en extravilleuze cytotrofoblasten(EVTS) 27. Villous cytotrofoblasten zijn de voorlopers die EVTS en SYN genereren. -BMP4 gedifferentieerde hPSCs een mengsel van villi cytotrofoblasten, SYN en EVTS 9, 15, die zijn gedefinieerd door het gen of eiwitexpressie van placenta merkers genereren. De verschillende differentiatieomzettingswegen kunnen worden onderscheiden door de afscheiding van HLA-G (kenmerkend EVTS) of humaan choriongonadotrofine (van SYN) 28, 29. Recentelijk is aangetoond dat de remming van activine / Nodal signalering begunstigt EVT differentiatie van hESCs en verwijdering van deze remming bevordert differentiatie SYN 17. Inderdaad, een eerdere publicatie gevonden dat het gebruik van BMP4 alleen om hESCs differentiëren genereert meestal SYN cellen 26. De gegevens met behulp BMP4 / A / P en geconditioneerd medium (gebrek B-FGF) geven aan dat erzowel EVT en SYN aanwezige cellen door differentiatie dag 5. Indien pure EVT of SYN populaties gewenst, aanvullende zuivering met gebruik van celoppervlak markers, zoals HLA-G geconjugeerd aan korrels voor de isolatie van EVTS, kan 29. Concluderend, de cultuur hier beschreven methode is een efficiënte manier om grote hoeveelheden trofoblastcellen van hPSCs die kunnen worden gebruikt voor verschillende toepassingen genereren. Omdat dit protocol genereert zowel SYN en EVTS, is een geschikt modelsysteem voor de behandeling van vroege menselijke placenta. Deze cellen kunnen worden gebruikt voor verschillende toepassingen, zoals geneesmiddelen en genetische manipulatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knock Out Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | This is referred to as "serum replacement" in this protocol. |
| NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 10828-028 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-155 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| B-FGF | Millipore | GF-003 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase Type IV | Invitrogen | 17104-019 | |
| Rock inhibitor Y27632 | Calbiochem | 688000 | |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | 6001G | MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated. |
| 0.22 µm syringe filter | Millipore | SLGS033SS | |
| Heracell 150i low oxygen incubator | Heracell/VWR | 89187-192 | Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient. |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-01M | |
| A 83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| PD173074 | R&D Systems | 3044/10 | |
| RNAiMax | Invitrogen | 13778150 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | Trizol is used to isolate total RNA. |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol. |
References
- Rugg-Gunn, P. J.
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy. Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).
- Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. Human blastocysts grown in culture. Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).
- Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. The placenta as a barrier to viral infections. Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Bilban, M., et al. Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).
- Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
- Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).
- Genbacev, O., et al. Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion. Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).
- Marchand, M., et al. Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model. Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).
- Hyslop, L., et al. Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages. Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).
- Harun, R., et al. Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events. Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).
- Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).
- Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and biophysical research communications. , (2013).
- Roberts, R. M., et al. Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be? Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).
- Sarkar, P., et al. Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts. The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).
- Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).
- Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Bernardo, A. S., et al. BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).
- Zhang, P., et al. Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells. Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).
- Vallier, L., et al. Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways. PloS one. 4 (6), e6082 (2009).
- Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).
- Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation. Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).
- Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast. Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).
- Bischof, P., Irminger-Finger, I. The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon. The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).
- Cole, L. A.
- Apps, R., et al. Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).
