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Developmental Biology

मानव pluripotent की इन विट्रो भेदभाव में स्टेम कोशिकाओं Trophoblastic में कोशिकाओं

Published: March 16, 2017 doi: 10.3791/55268
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, University of Pennsylvania

Abstract

नाल embryogenesis दौरान विकसित करने के लिए पहली अंग है और विकासशील भ्रूण के अस्तित्व के लिए आवश्यक है। नाल विभिन्न trophoblastic कोशिकाओं है कि preimplantation ब्लास्टोसिस्ट के अतिरिक्त भ्रूण ट्रोफेक्टोडर्म कोशिकाओं से अलग के शामिल है। जैसे, मानव प्लेसेंटा के प्रारंभिक भेदभाव की घटनाओं के बारे में हमारी समझ क्योंकि अलगाव और मानव embryogenesis के हेरफेर पर नैतिक और कानूनी प्रतिबंध के सीमित है। मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) मानव विकास की जांच के लिए एक मजबूत मॉडल व्यवस्था कर रहे हैं और यह भी trophoblastic कोशिकाओं है कि विभिन्न trophoblast प्रकार की कोशिकाओं के मार्कर एक्सप्रेस में इन विट्रो में भेदभाव किया जा सकता है। यहाँ, हम हड्डी morphogenic प्रोटीन 4 और Activin / नोडल संकेत दे रास्ते के अवरोधकों का उपयोग कर trophoblastic कोशिकाओं में hPSCs फर्क के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इस प्रोटोकॉल विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं trophoblast कि siRNAs के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता उत्पन्न करता हैनुकसान के समारोह phenotypes की जांच या रोगजनकों से संक्रमित हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, hPSCs आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है और उसके बाद के लिए के समारोह के लाभ का विश्लेषण करती है trophoblast progenitors में विभेदित। HPSCs से शुरू मानव trophoblasts पैदा करने के लिए इन विट्रो भेदभाव विधि जल्दी मानव भ्रूण के साथ काम करने का नैतिक और कानूनी प्रतिबंध पर काबू पा, और इस प्रणाली के आवेदनों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, दवाओं की खोज और स्टेम सेल अनुसंधान भी शामिल है।

Introduction

नाल गर्भावस्था के दौरान विकास और भ्रूण के अस्तित्व के लिए आवश्यक और मातृ और भ्रूण संचलन के बीच गैसों, पोषक तत्वों, अपशिष्ट उत्पादों, और हार्मोन के आदान-प्रदान की सुविधा है। पहली अंग स्तनधारी embryogenesis दौरान गठन नाल, जो 6-7 दिनों के विकास शुरू होता है चूहों 1, 2, 3, 4 में 3.5-4.5 दिनों मानव में पोस्ट-गर्भाधान और है। Trophoblastic कोशिकाओं नाल का सबसे महत्वपूर्ण कोशिकाओं रहे हैं, और इन कोशिकाओं स्तनधारी भ्रूण की जल्द से जल्द वंश भेदभाव की घटनाओं में से एक का प्रतिनिधित्व करते हैं। वे preimplantation ब्लास्टोसिस्ट के बाहरी अतिरिक्त भ्रूण ट्रोफेक्टोडर्म कोशिकाओं से उत्पन्न होती हैं। अपरा विकास के प्रारंभिक दौर के हमारे ज्ञान जल्दी मानव विकास मॉडलिंग पर नैतिक और सैन्य प्रतिबंधों द्वारा सीमित है।

भ्रूण आरोपण, trophoblasts के दौरानमातृ उपकला आक्रमण और विशेष पूर्वज कोशिकाओं 5 में अंतर है। Cytotrophoblasts (CTBs) mononucleated कर रहे हैं, undifferentiated progenitors कि फ्यूज और syncytiotrophoblasts (SYNs) और extravillous आक्रामक trophoblasts (EVTs) में अंतर है, जो लंगर गर्भाशय को अपरा। SYNs multinucleated कर रहे हैं, टर्मिनली विभेदित कोशिकाओं है कि गर्भावस्था को बनाए रखने के लिए आवश्यक हार्मोन synthesize। जल्दी भेदभाव की घटनाओं है कि EVTs और SYNs उत्पन्न, अपरा गठन के लिए आवश्यक हैं के रूप में trophoblastic कोशिकाओं में क्षति गर्भपात, पूर्व एक्लंप्षण, और जन्म के समय वजन 1 में परिणाम। मानव ट्रोफोब्लास्ट सेल लाइनों के प्रकार है कि विकसित किया गया है और CTBs choriocarcinomas, जो अपरा हार्मोन और प्रदर्शन आक्रामक गुण 6 का उत्पादन अमर शामिल हैं। मानव पहली तिमाही गर्भनालों से प्राथमिक trophoblastic कोशिकाओं को अलग किया जा सकता है, लेकिन कोशिकाओं को जल्दी से अलगferentiate और इन विट्रो में proliferating बंद करो। महत्वपूर्ण बात है, बदल गया है और प्राथमिक सेल लाइनों अलग जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल है, यह दर्शाता है कि tumorigenic और अमर trophoblast सेल लाइनों सही प्राथमिक trophoblasts 7 प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता। इसके अतिरिक्त, इन लाइनों अपरा trophoblast स्टेम सेल progenitors जैसे लगते हैं, क्योंकि वे पहले तीसरे trimesters के माध्यम से बाद में मंच से प्राप्त कर रहे हैं संभावना नहीं है।

अपरा के गठन और समारोह के प्रारंभिक घटनाओं का अध्ययन करने के क्रम में प्रारंभिक अवस्था मानव trophoblasts के इन विट्रो संस्कृति प्रणाली में एक मजबूत करने की जरूरत है। मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) है, जो साझा preimplantation भ्रूण के आंतरिक कोशिका द्रव्यमान के साथ गुण, अक्सर जल्दी मानव विकास के मॉडल के लिए, जल्दी नाल के गठन सहित उपयोग किया जाता है। दोनों मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) और hESCs अस्थि मोर का उपयोग कर इन विट्रो में trophoblasts में भेदभाव किया जा सकताphogenic प्रोटीन 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15। BMP4 का उपयोग कर trophoblastic कोशिकाओं को pluripotent कोशिकाओं का यह रूपांतरण मानव कोशिकाओं के लिए विशिष्ट है और व्यापक रूप से है क्योंकि यह जल्दी मानव भ्रूण 9, 16 के लिए उपयोग की आवश्यकता नहीं है जल्दी मानव प्लेसेंटा के विकास का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हाल ही में, यह पाया गया कि अवरोधकों के अलावा A83-01 (ए) और PD173074 (पी), जो SMAD2 / 3 और MEK1 / 2 संकेत दे रास्ते को ब्लॉक, ट्रोफेक्टोडर्म-तरह पूर्वज, मुख्य रूप से SYNs में hPSC भेदभाव की क्षमता बढ़ जाती है और EVTs, mesoderm, endoderm, या बाह्य त्वक स्तर कोशिकाओं 9, 17 के व्यापक पीढ़ी के बिना इन विट्रो मॉडल प्रणाली 9, 11 की वैधता का समर्थन। यहाँ, हम BMP4 / ए / पी संस्कृति के माध्यम का उपयोग मानव trophoblast progenitors में hPSCs की इन विट्रो भेदभाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इन हालात में शाही सेना अनुक्रमण, जीन व्यवधान siRNAs का उपयोग कर, रोगज़नक़ संक्रमण, और आनुवंशिक संशोधन lipofection की मध्यस्थता अभिकर्मक का उपयोग कर सहित आवेदन की एक विस्तृत विविधता के लिए कोशिकाओं की प्रचुर संख्या का उत्पादन।

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Protocol

नोट: या तो hESCs या hiPSCs के भेदभाव trophoblast progenitors में के लिए, माउस भ्रूणीय (MEFs) fibroblasts पर हो hPSCs BMP4 / ए / पी के साथ भेदभाव की शुरुआत से पहले फीडर मुक्त करने के लिए दो मार्ग के लिए शर्तों को संक्रमित कर रहे हैं। इस प्रक्रिया को विभेदित कोशिकाओं की MEF संदूषण समाप्त। यहाँ, हम hESC भेदभाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, और एक ही प्रोटोकॉल hiPSCs के लिए लागू किया जा सकता है।

1. संस्कृति और पर विकिरणित माउस भ्रूणीय Fibroblasts hESCs के रिकवरी (MEFs) (तैयारी)

  1. MEFs के गामा विकिरण
    1. 10% FBS, 2 मिमी एल glutamine, 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन / Strep) के साथ DMEM, और 0.1 मिमी गैर आवश्यक अमीनो एसिड (NEAA): MEFs संवर्धन के लिए माध्यम की 500 मिलीलीटर बनाओ।
    2. प्राथमिक MEFs से एक शीशी पिघलना और संवर्धन कोशिकाओं के लिए MEF मध्यम उपयोग करें। MEF संस्कृति के माध्यम का उपयोग कर 30 प्लेटों के लिए प्राथमिक MEFs का विस्तार करें।
      ध्यान दें: ऑक्सीजन सांद्रता इस कदम के लिए महत्वपूर्ण नहीं हैं, इसलिएया तो मशीन के भीतर शारीरिक (4%) या परिवेश (20%) की स्थिति में इस्तेमाल किया जा सकता है।
    3. MEFs हार्वेस्ट। 0.25% trypsin का उपयोग प्लेटों से MEFs हटाने और एक शंक्वाकार ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण करने के लिए। MEFs एक विकिरण साधन में रखें और 3,500 grays के लिए कोशिकाओं को बेनकाब।
      ध्यान दें: समय की राशि irradiator यूनिट के अंदर स्रोत की गतिविधि पर निर्भर करेगा।
    4. MEF संस्कृति के माध्यम से विकिरणित MEFs Resuspend और एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की संख्या गिनती।
    5. एक सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर MEFs गोली और 50% MEF संस्कृति के माध्यम से और 50% सेल ठंड मध्यम (80% FBS और 20% MEF संस्कृति के माध्यम से) जोड़ें। अशेष शीशी प्रति 1 x 10 6 कोशिकाओं।
    6. एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रात भर विकिरणित MEF शीशियों की जगह है, और फिर लंबी अवधि के भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन के लिए उन्हें स्थानांतरित।
  2. जमे हुए MEFs और संस्कृति के लिए hESCs विगलन
    1. hESC माध्यम की 500 मिलीलीटर बनाओ: DMEM / F-12 के साथ 20% सीरम replacement, 0.1 मिमी NEAA, 2 मिमी एल glutamine, 10 एनजी / एमएल bFGF, 0.1 मिमी एसएस mercaptoethanol, और 1x पेन / Strep।
    2. hESCs विगलन से पहले MEFs एक दिन की एक शीशी पिघलना। कोट 0.1% जिलेटिन के साथ 6 अच्छी तरह से थाली, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 1 मिलीलीटर का उपयोग कर। कमरे के तापमान पर कम से कम 20 मिनट के लिए सेते हैं, और उसके बाद जिलेटिन को हटा दें।
    3. तरल नाइट्रोजन में भंडारण से MEFs की एक शीशी निकालें और एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में शीशी विसर्जित कर दिया। शीशी रहकर तक केवल छोटे बर्फ क्रिस्टल रहने देखो। जल्दी से एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के अंदर MEF मध्यम के 9 मिलीलीटर शीशी की सामग्री हस्तांतरण।
    4. 5 मिनट के लिए 200 XG पर centrifuging द्वारा गोली कोशिकाओं। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और MEF मध्यम में सेल गोली resuspend। 6 अच्छी तरह से थाली पर समान रूप से MEFs विभाज्य। रात भर एक 37 डिग्री सेल्सियस कम ऑक्सीजन (4%) इनक्यूबेटर में थाली रखो।
  3. MEFs पर hESCs की दिनचर्या संस्कृति
    1. तरल नाइट्रोजन से एक hESC शीशी निकालें और जल्दी से एक 3 का उपयोग शीशी पिघलना7 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान। धीरे से एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार hESC माध्यम के 9 मिलीलीटर युक्त ट्यूब में hESCs पिपेट और 5 मिनट के लिए 200 XG पर नीचे स्पिन। मध्यम निकालें और hESC माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं resuspend।
    2. कदम 1.2.4 में तैयार की थाली से MEF मध्यम Aspirate और hESC माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें। रॉक अवरोध करनेवाला वाई 27,632 (10 माइक्रोन) के hESC मध्यम जोड़ें। MEFs पर hESCs स्थानांतरण।
    3. रात भर एक 37 डिग्री सेल्सियस कम ऑक्सीजन (4%) इनक्यूबेटर में कोशिकाओं रखें। hESC मध्यम दैनिक बदलें। एक पाश्चर विंदुक, 4x में एक ईमानदार माइक्रोस्कोप के तहत कल्पना के साथ भेदभाव कोशिकाओं परिमार्जन।
    4. पारित होने hESCs हर 4-6 दिनों, सेल confluency और hESC कालोनियों के आकार पर निर्भर करता है। passaging पहले दिन MEFs की एक थाली तैयार करें। जब कोशिकाओं को पारित होने के लिए तैयार हैं, hESC मध्यम हटाने और पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से धो लें।
    5. 1 मिलीग्राम / एमएल collagenase जोड़ें (37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म), 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, और collagenase को हटा दें। डब्ल्यूपीबीएस के साथ कोशिकाओं राख अच्छी तरह से प्रति hESC माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और स्वयं एक 5 मिलीलीटर पिपेट की नोक का उपयोग कर छोटे गुच्छों में कोशिकाओं परिमार्जन। में एक नया MEF लेपित अच्छी तरह से (एस) को निलंबित कर दिया सेल clumps स्थानांतरण।

MEFs से hESCs के 2. संक्रमण फीडर मुफ्त बाह्य मैट्रिक्स में लिपटे प्लेटों पर स्थितियों को

  1. तैयार MEF वातानुकूलित मध्यम (मुख्यमंत्री)
    1. 90-100% confluency पर थाली एक T75 फ्लास्क में विकिरणित MEFs; यह महत्वपूर्ण है कि MEFs घनी चढ़ाया जाता है। एक माइक्रोस्कोप का उपयोग निर्धारित करने के लिए कि क्या वे कुप्पी के नीचे से जुड़ी है कोशिकाओं का निरीक्षण करें (MEFs चढ़ाना या अगले दिन के बाद लगभग 6 घंटा देते हैं)।
      ध्यान दें: स्वाधीन कोशिकाओं माध्यम में तैरने लगते हैं, जब एक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर मनाया। अगले दिन, MEF मध्यम हटाने और कमी बी FGF hESC माध्यम के 25 मिलीलीटर जोड़ें।
    2. ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद वातानुकूलित माध्यम लीजिए। 12 दिनों की एक अधिकतम के लिए दैनिक ताजा माध्यम के साथ बदलें। एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर एकत्र मुख्यमंत्री फ़िल्टर। , उपयोग करने से पहले मुख्यमंत्री के ताजा बी FGF जोड़ें।
      नोट: मुख्यमंत्री -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए हैं और 1 साल तक के लिए भंडारित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मुख्यमंत्री की दुकान।
  2. संक्रमण MEFs पर संस्कृति से hESCs फीडर मुक्त करने के लिए बाह्य मैट्रिक्स में लिपटे प्लेटों।
    1. कोटिंग टिशू कल्चर प्लेट के लिए बाह्य मैट्रिक्स की तैयारी
      1. (3-4 के बारे में मानव संसाधन) बर्फ पर बाह्य मैट्रिक्स के एक विभाज्य पिघलना। ठंडा टिप्स, एक, ठंड से 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब, और DMEM / F12 मध्यम, स्थानांतरण ठंडा DMEM के 24 मिलीलीटर में बाह्य मैट्रिक्स के 2 मिलीग्राम का प्रयोग / एफ 12 (कमजोर पड़ने बाह्य मैट्रिक्स एकाग्रता पर निर्भर करता है आपूर्तिकर्ता से )।
      2. इसके तत्काल बाद 50 मिलीलीटर बर्फ के लिए शंक्वाकार ट्यूब हस्तांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान। कोटिंग टिशू कल्चर प्लेटों के लिए, अच्छी तरह से करने के लिए पतला बाह्य मैट्रिक्स की उचित मात्रा में जोड़ने (जैसे, 6 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर)। कोट करने के लिए थाली ज़ुल्फ़ और कम से कम 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    2. (1.3 चरण में के रूप में) MEFs से पारित होने hESCs युक्त बी FGF (10 एनजी / एमएल) के मुख्यमंत्री के प्रयोग से।
      1. महाप्राण नई प्लेट से बाह्य मैट्रिक्स को हटाने और युक्त बी FGF मुख्यमंत्री जोड़ने के लिए। एक पिपेट का उपयोग MEF थाली से scraped सेलुलर झुरमुटों स्थानांतरण और बाह्य मैट्रिक्स लेपित थाली में यह विभाज्य। 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात कम ऑक्सीजन इनक्यूबेटर में सेते हैं।
      2. दैनिक बी FGF माध्यम के साथ मुख्यमंत्री की जगह; मध्यम की राशि संस्कृति कुप्पी के आकार पर निर्भर करेगा। के लिए एक 6 अच्छी तरह से अच्छी तरह से मध्यम 2 मिलीलीटर का प्रयोग करें। पाश्चर विंदुक के साथ विभेदित कोशिकाओं परिमार्जन।
      3. पारित होने hESCs हर 6-7 दिन, जब माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जब कालोनियों उज्ज्वल है।
        नोट: hESC बाह्य मैट्रिक्स में लिपटे प्लेटों पर हो कालोनियों MEF-संवर्धित कोशिकाओं की तुलना में बड़ा हो जाना।
      4. जब फीडर मुफ्त कोशिकाओं पारित होने के लिए तैयार हैं, मध्यम हटाने, विज्ञापन से धोनेएक पिपेट, महाप्राण का उपयोग कर पीबीएस दूर करने के लिए पीबीएस के डिंग 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, 0.5 मिलीग्राम / एमएल Dispase एक विंदुक के साथ (37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म), और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      5. अच्छी तरह से प्रति पीबीएस के 2 मिलीलीटर जोड़ने और बाद में श्वास द्वारा पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। अच्छी तरह से प्रति मुख्यमंत्री के 1 मिलीलीटर जोड़ें और स्वयं एक 5 मिलीलीटर पिपेट की नोक का उपयोग कर छोटे गुच्छों में कोशिकाओं परिमार्जन।
      6. प्लेट नए बाह्य मैट्रिक्स में लिपटे प्लेटों में निलंबित सेल clumps; कोशिकाओं को 24 घंटे के बाद का पालन करना चाहिए।

3. BMP4 / ए / पी का प्रयोग hESCs के भेदभाव

  1. भेदभाव माध्यम से तैयार करें। उपयोग मुख्यमंत्री (कमी बी FGF) और जोड़ें (ताजा) BMP4 (50 एनजी / एमएल), A83-01 (1 माइक्रोन), और PD173074 (0.1 माइक्रोन) के। मुख्यमंत्री के इन अवरोधकों का उपयोग करने से पहले जोड़े।
  2. फीडर मुफ्त 1 पारित होने के लिए बाह्य मैट्रिक्स में लिपटे प्लेटों पर बढ़ hESCs, एक मशीन 4% ऑक्सीजन पर सेट अंदर सुसंस्कृत का प्रयोग करें। पहले पारित होने के बाह्य मैट्रिक्स लेपित प्लेटों पर बाद,कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए देते हैं। अगले दिन, भेदभाव आरंभ करें। मुख्यमंत्री (युक्त बी FGF) निकालें और युक्त BMP4 / ए / पी (6 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति 2 मिलीलीटर) मुख्यमंत्री के साथ बदलें। 4% ऑक्सीजन के स्तर का उपयोग कोशिकाओं संवर्धन जारी रखें।
  3. मुख्यमंत्री युक्त BMP4 / ए / पी (2 मिलीग्राम / अच्छी तरह से करने के लिए 6 अच्छी तरह से थाली) हर 2 दिन बदलें। महाप्राण पुराने मध्यम हटाने और एक पिपेट का उपयोग कर नए मुख्यमंत्री जोड़ने के लिए। BMP4 जोड़ने और बी FGF (माना भेदभाव 2 दिन) को हटाने के बाद दूसरे दिन, सेल आकृति विज्ञान, बदल जाएगा, जब एक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर मनाया बड़ा दिखाई दे।
    नोट: undifferentiated कोशिकाओं है, जो चमकदार गोल किनारों दिखा रहे हैं, मौजूद नहीं होगा।
  4. वांछित समय अंक पर कोशिकाओं को ले लीजिए। विभेदित कोशिकाओं लगभग 2 हफ्तों के बाद विभाजित बंद हो जाएगा। इस समय अवधि के दौरान Transfect कोशिकाओं (अगले अनुभाग देखें)।

siRNAs या प्लास्मिड डीएनए के साथ Trophoblastic प्रकोष्ठों के 4. अभिकर्मक

  1. अभिकर्मक के लिए trophoblastic कोशिकाओं को तैयार
  2. उन्हें MEFs से स्थानांतरित होने के बाद बाह्य मैट्रिक्स पर दो मार्ग के लिए संस्कृति hESCs (2.2 कदम देखें)। बी-युक्त FGF hESC मध्यम का प्रयोग करें।
  3. भेदभाव से पहले एक नया बाह्य मैट्रिक्स प्लेट पर एक दिन hESCs विभाजित। उच्च सेलुलर confluency महत्वपूर्ण है, तो कोशिकाओं को विभाजित 1: 1 के लिए एक नया थाली पर / अच्छी तरह से है, जो अगले दिन कम से कम 50% confluency सुनिश्चित करेगा। कम ऑक्सीजन इनक्यूबेटर में रातोंरात कोशिकाओं को सेते हैं।
    नोट: hESCs इस कदम के दौरान गिना जा करने की जरूरत नहीं है।
  4. अगले दिन, भेदभाव माध्यम के साथ मध्यम जगह (मुख्यमंत्री 6 अच्छी तरह से थाली के लिए युक्त BMP4 / ए / पी और कमी बी FGF, 2 का उपयोग कर मिलीग्राम / अच्छी तरह से)। आकांक्षा से पुराने मध्यम निकालें और नए मध्यम (2 मिलीलीटर) एक पिपेट का उपयोग हस्तांतरण। एक कम ऑक्सीजन इनक्यूबेटर (4% ऑक्सीजन) रात भर में कोशिकाओं की जगह।
  • Transfections जीन विघटन के लिए siRNAs का उपयोग कर या प्लास्मिड डीएनए का उपयोग
    1. वांछित समय तक कोशिकाओं को अलग(दिन 1 और 14 के बीच) इशारा करते हैं। दिन अभिकर्मक से पहले 5 मिनट के लिए 0.05% trypsin का उपयोग कोशिकाओं trypsinize। उन्हें वांछित confluency (अभिकर्मक अभिकर्मक प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है) एक जिलेटिन लेपित प्लेट पर थाली (20 मिनट और महाप्राण के लिए एक टिशू कल्चर प्लेट में 0.1% जिलेटिन जोड़ने, हटाने के लिए)। युक्त BMP4 / ए / पी (कमी बी FGF) मुख्यमंत्री जोड़ें और रातोंरात सेते हैं।
    2. अगले दिन, कोशिकाओं को नए सिरे से भेदभाव के माध्यम जोड़ें। Transfect siRNAs एक siRNA अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग कर। प्लास्मिड डीएनए के लिए, एक उचित lipofectamine अभिकर्मक का उपयोग करें।
    3. के रूप में प्रत्येक अभिकर्मक अभिकर्मक के लिए वर्णित उत्पाद प्रोटोकॉल का पालन करें। siRNA-lipofectamine परिसरों एक कम ऑक्सीजन इनक्यूबेटर में रातोंरात, कोशिकाओं में से प्रत्येक में अच्छी तरह से / प्लेट पर स्थानांतरण धीरे मिश्रण, और संस्कृति कोशिकाओं।
      नोट: कुछ अभिकर्मक अभिकर्मकों एंटीबायोटिक दवाओं, जो मुख्यमंत्री की कमी पेन / Strep आवश्यकता से हिचकते हैं।
    4. अगले दिन, ताजा भेदभाव मीडिया के साथ बदलें।
    5. इच्छा पर कोशिकाओं फसलघ समय अंक (जैसे, 24 घंटा, 48 घंटा, और 72 घंटा) जीन व्यवधान दक्षता मात्रात्मक आरटी पीसीआर का उपयोग कर जाँच करें। कटाई कोशिकाओं के लिए, 0.05% trypsin का उपयोग करें, अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर जोड़ने और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए incubating। अच्छी तरह से प्रति MEF मध्यम के 5 मिलीलीटर trypsin बेअसर करने के लिए जोड़ें। 5 मिनट के लिए 200 XG पर कोशिकाओं नीचे स्पिन और आरएनए अलगाव के लिए सेल गोली का उपयोग करें।

    • Trophoblastic प्रकोष्ठों के 5. पैथोजन संक्रमण: सेंडाइ वायरल संक्रमण

    1. भेदभाव के लिए hESCs तैयार
      1. बाह्य मैट्रिक्स MEFs से स्थानांतरण के बाद दो मार्ग के लिए संस्कृति hESCs (2.2 कदम देखें)। बी-युक्त FGF hESC मध्यम का प्रयोग करें।
      2. भेदभाव से पहले एक नया बाह्य मैट्रिक्स प्लेट पर एक दिन hESCs विभाजित। एक नई प्लेट / अच्छी तरह से है, जो अगले दिन कम से कम 50% confluency यह सुनिश्चित करेंगे पर 1: उच्च सेलुलर confluency महत्वपूर्ण है, तो विभाजन कोशिकाओं है 1। एक कम ऑक्सीजन इनक्यूबेटर (4% ऑक्सीजन) में रात भर कोशिकाओं को सेते हैं। <br /> नोट: hESCs इस कदम के दौरान गिना जा करने की जरूरत नहीं है।
      3. अगले दिन, भेदभाव माध्यम (मुख्यमंत्री युक्त BMP4 / ए / पी और कमी बी FGF) और रातोंरात संस्कृति एक कम ऑक्सीजन इनक्यूबेटर (4% ऑक्सीजन) के साथ मध्यम जगह।
    2. Trophoblastic कोशिकाओं के सेंडाइ वायरल संक्रमण
      1. वांछित भेदभाव दिन पहले एक दिन, 5 मिनट के लिए (एकल कक्षों के लिए) फर्क कोशिकाओं 0.05% trypsin का उपयोग trypsinize और उन्हें एक जिलेटिन लेपित प्लेट के लिए स्थानांतरण। भेदभाव मध्यम जोड़ें और एक कम ऑक्सीजन इनक्यूबेटर में रातोंरात सेते हैं।
      2. अगले दिन, (इस वायरस के आधार पर अलग अलग होंगे) के संक्रमण के लिए मध्यम जोड़ने। उपयोग के मुख्यमंत्री पेन / Strep युक्त BMP4 / ए / पी, एक 6 अच्छी तरह से थाली में से एक अच्छी तरह से करने के लिए 0.5 मिलीलीटर का उपयोग कर कमी। सेंडाइ वायरस जोड़े MOI एक कम ऑक्सीजन मशीन में 8 घंटे के लिए = के लिए 1. सेते हैं।
      3. अतिरिक्त समय अंक जरूरी हैं, तो 4 घंटे के बाद वायरस युक्त मध्यम हटाने और BMP4 / ए / पी मुख्यमंत्री के साथ बदलें। कोशिकाओं को ले लीजिएशाही सेना के अलगाव के लिए एक सेल खुरचनी का उपयोग कर।
      4. वायरल प्रतिक्रिया 18 में शामिल जीनों के लिए QRT- पीसीआर प्रदर्शन से वायरल संक्रमण की क्षमता का निर्धारण।

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    Representative Results

    HPSCs की इन विट्रो भेदभाव का अवलोकन

    यह इन विट्रो भेदभाव प्रोटोकॉल MEFs कि फीडर मुक्त करने के लिए एक मार्ग (चित्रा 1 ए) के लिए शर्तों को संक्रमित कर रहे हैं पर हो undifferentiated hESCs के साथ शुरू होता है। हम इस प्रोटोकॉल में hESCs के भेदभाव का वर्णन किया है, हम सफलतापूर्वक trophoblastic कोशिकाओं में hiPSCs अंतर करने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया। बाह्य मैट्रिक्स के लिए संक्रमण विकिरणित MEFs, जो विश्लेषण करती है कि मानव trophoblastic कोशिकाओं का शुद्ध आबादी की आवश्यकता के लिए अवांछनीय हैं के बहुमत को हटा। अविभाजित hPSCs और बाह्य मैट्रिक्स पर हो रहे मुख्यमंत्री बी युक्त FGF जब तक कालोनियों passaging (लगभग एक सप्ताह) लिए तैयार हैं के साथ सुसंस्कृत। इस pluripotent राज्य BMP4 / ए / पी की मध्यस्थता भेदभाव उत्प्रेरण करने से पहले बनाए रखता है। कालोनियों के झुरमुटों में बाधित कर रहे हैं ~ 50-100 कोशिकाओंDispase का उपयोग कर और एक बाह्य मैट्रिक्स लेपित थाली पर एक दूसरी बार passaged। दिन passaging के बाद, पक्षपाती कोशिकाओं भेदभाव प्रेरित करने के लिए तैयार कर रहे हैं, और मध्यम BMP4 / ए / पी कमी बी FGF को रोकने के लिए बंद है। विभेदित कोशिकाओं लगभग 2 सप्ताह है, जो समय के दौरान कोशिकाओं आरएनए अलगाव के लिए एकत्र किया जा सकता है या अभिकर्मक प्रयोगों के लिए इस्तेमाल के लिए पैदा करना। रूपात्मक परिवर्तन दिखाई भेदभाव के बाद 1-2 दिनों शुरू किया गया है, और एक प्रतिनिधि प्रयोग से परिणाम चित्रा 1 बी में दिखाया जाता है। सूचना है कि भेदभाव दिनों 1-2 पर कोशिकाओं दिन 0 (चित्रा 1 बी) से कोशिकाओं की तुलना में आकार में बड़े होते हैं। अलग-अलग सेल कॉलोनी तेजी से बढ़ता है, और इस परिवर्तन हर दिन साफ ​​दिखती है। भेदभाव के रूप में आय, कोशिकाओं के विभाजन और कॉलोनी के केन्द्र से बाहर का विस्तार, एक जावक दिशा में बढ़ रही है (दिन में 3-5, चित्रा 1 बी)। कॉलोनी के बाहरी हिस्से टी की तुलना में बड़ा सेल शामिलवह कॉलोनी के केंद्र में कोशिकाओं। फर्क कोशिकाओं गहरा और स्टेम कोशिकाओं बाह्य मैट्रिक्स पर संवर्धित से चापलूसी हो जाते हैं; सेल चमक में परिवर्तन और अधिक स्पष्ट है जब एक ईमानदार दिनचर्या सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल माइक्रोस्कोप के साथ कोशिकाओं को देख रहे हैं। अलग-अलग कालोनियों, भेदभाव दिन 5 (चित्रा 1 बी) द्वारा एक साथ विलय कोशिकाओं को एक दूसरे के शीर्ष पर बढ़ रहा है। भेदभाव दिन 4-5 के बाद, कई नाभिक युक्त कोशिकाओं वर्तमान (नहीं दिखाया गया है) (चित्रा 1 बी) कर रहे हैं।

    BMP4 / ए / पी भेदभाव और ट्रोफोब्लास्ट मार्करों की अभिव्यक्ति लाती

    हम मात्रात्मक आरटी पीसीआर (QRT- पीसीआर) का उपयोग BMP4 / ए / पी भेदभाव के पहले तीन दिनों के दौरान जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की जांच की। आरएनए भेदभाव दिन 1, 2 में अलग किया गया था, और 3 और सीडीएनए को बदल दिया। स्टेम कोशिकाओं के लापता दोनों बी मूल्यांकन किया जा सकताY आकृति विज्ञान, नेत्रहीन, एक माइक्रोस्कोप का उपयोग, और QRT- पीसीआर द्वारा pluripotency जीनों के लिए प्राइमरों का उपयोग। NANOG, स्टेम कोशिकाओं के एक मार्कर, के रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर से कम है ~ 75% भेदभाव के एक दिन जब कोशिकाओं BMP4 साथ सुसंस्कृत हैं, और स्तर (BMP4 / ए / पी की उपस्थिति में ~ 90% तक कम कर रहे हैं के बाद चित्रा 2)। भेदभाव दिन 2, NANOG के स्तर को BMP4 अकेले या BMP4 / ए / पी में संवर्धित कोशिकाओं के लिए बहुत कम हैं hESC मुख्यमंत्री मध्यम में उन लोगों की तुलना में (युक्त बी FGF)। क्योंकि हम भेदभाव के दो दिन (चित्रा 1 बी), जो चमक और आकार में छोटे विभेदित कोशिकाओं की तुलना में बाद undifferentiated कोशिकाओं का पालन नहीं करते हैं यह एक उम्मीद परिणाम है। KRT7 और CDX2: trophoblastic कोशिकाओं को BMP4 की मध्यस्थता भेदभाव की दक्षता में सीधे दो trophoblast मार्करों के लिए विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग QRT- पीसीआर द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। इन जीनों के दोनों मानव स्टेम में व्यक्त नहीं कर रहे हैंकोशिकाओं, और (चित्रा 2) BMP4 उपचार के 2-3 दिनों के बाद उनकी अभिव्यक्ति बढ़ जाती है। यहाँ वर्णित शर्तों का उपयोग करना, KRT7 प्रतिलेख के स्तर BMP4 / ए / पी माध्यम में भेदभाव दिन 1 पर बढ़ाने के लिए और (चित्रा 2) भेदभाव के पहले 3 दिनों के लिए लगातार बने हुए हैं। KRT7 अभिव्यक्ति जब अकेले BMP4 का उपयोग कर पिछले टिप्पणियों के साथ सहमति है कि Activin / नोडल अवरोधकों hESCs 9 के भेदभाव की दर को बढ़ाने में 2 दिन से एक देरी वृद्धि की है। एक और तरीका है इन अवरोधकों का उपयोग करने की क्षमता का आकलन करने के लिए अकेले BMP4 के साथ इलाज किया कोशिकाओं में CDX2 और KRT7 टेप के स्थिर राज्य बहुतायत निर्धारित करने के लिए है। जब या तो अकेले या BMP4 BMP4 एक साथ प्रयोग Activin / नोडल अवरोधकों के साथ CDX2 स्तरों भेदभाव दिन 1-3 के लिए समान हैं। हालांकि, KRT7 टेप इन अवरोधकों की उपस्थिति है, जो एक अधिक का सुझाव में भेदभाव के एक दिन बाद और अधिक प्रचुर मात्रा में हैंतेजी से भेदभाव (चित्रा 2)। CDX2 अभिव्यक्ति आम तौर पर दोनों स्थितियों के लिए भेदभाव दिन 2 पर चोटियों और 3 दिन (चित्रा 2) के बाद कम हो जाती है। Undifferentiated hESCs या तो KRT7 या CDX2 (चित्रा 2) व्यक्त नहीं करते, जैसा कि उम्मीद थी। अंत में, BMP4 / ए / पी की स्थिति में तेजी से hESCs अंतर है, और अपरा मार्कर अभिव्यक्ति के रूप में जल्दी भेदभाव दिन 3 के रूप में पता लगाया जा सकता है।

    SiRNAs और प्लास्मिड डीएनए की transfections और वायरल संक्रमण के इन विट्रो में उपयोग करना Trophoblastic प्रकोष्ठों व्युत्पन्न

    इन विट्रो में निकाली गई मानव trophoblastic कोशिकाओं या तो कोडन या noncoding RNAs के जीन की अभिव्यक्ति को बाधित करने के siRNAs के साथ ट्रांसफ़ेक्ट जा सकता है। हम BMP4 / ए / पी का उपयोग कर hESCs के भेदभाव शुरू की, siRNA transfections के दो दौर प्रदर्शन भेदभाव दिन 1 और 2 पर (siRNAs की 75 pmol का उपयोग),और आरएनए अलगाव के लिए कोशिकाओं को एकत्र। मात्रात्मक आरटी पीसीआर या तो कोडन या noncoding जीनों के लिए पछाड़ना दक्षता का निर्धारण करने के लिए एक प्रभावी तरीका है। लंबे समय से विभिन्न क्षेत्रों के लिए पूरक दो siRNAs, आरएनए lncRHOXF1 19 noncoding उपयोग करना, हम lncRHOXF1 टेप (चित्रा 3 ए) के 80% पछाड़ना प्राप्त की। अगला, हम प्रोटीन कोडिंग जीन hnRNP यू के लिए एक siRNA (25 pmol) ट्रांसफ़ेक्ट भी भेदभाव दिनों पर 1 और 2 हम लगातार दो transfections निम्नलिखित hnRNP यू टेप में एक 80% की कमी मनाया। इन विट्रो भेदभाव trophoblast पूर्वज कोशिकाओं में भी सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम 1 के एक MOI में 2 कोशिकाओं सेंडाइ वायरस का उपयोग भेदभाव दिन के संक्रमण प्रदर्शन किया और वायरल ऊष्मायन के 8 घंटे के बाद कोशिकाओं को एकत्र। QRT- पीसीआर का उपयोग करना, हम संक्रमित कोशिकाओं (चित्रा 3 बी), सक्रिय वायरल समर्थक का संकेत में प्रचुर मात्रा में प्रोटीन वायरल टेप (सेव एनपी) का पता चलाtrophoblastic कोशिकाओं में pagation। महत्वपूर्ण रूप से, संक्रमित कोशिकाओं (MOI का उपयोग कर = 1) उपस्थिति में परिवर्तन नहीं करते हैं और व्यवहार्य हैं (नहीं दिखाया डेटा)। इन विट्रो निकाली गई trophoblastic कोशिकाओं में भी प्लास्मिड डीएनए के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है। हम एक GFP प्लाज्मिड का उपयोग कर transfections प्रदर्शन किया और इस भेदभाव दिन 1 और 3 दिन BMP4 / ए / पी इलाज कोशिकाओं में निर्माण और GFP अगले दिन (चित्रा 4) के लिए imaged की शुरुआत की। हम आम तौर पर 24 घंटे बाद अभिकर्मक पर 30-50% अभिकर्मक दक्षता प्राप्त की। अंत में, इन विट्रो निकाली गई trophoblastic कोशिकाओं में gain- और नुकसान के समारोह के प्रयोगों के लिए उपयोग किया जा सकता है।

    आकृति 1
    चित्रा 1: BMP4 / ए / पी का उपयोग कर जल्दी trophoblastic कोशिकाओं को मानव स्टेम कोशिकाओं की इन विट्रो भेदभाव। (ए) BMP4 भेदभाव के योजनाबद्ध BMP4 / ए / पी का उपयोग कर trophoblastic कोशिकाओं को hPSCs की। (बी) के दौरान D0, डी 2, और BMP4 / ए / पी भेदभाव के डी 6 HUES9 कोशिकाओं के प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियों। स्केल बार = 50 माइक्रोन। तीर एकल कोशिका hESCs कि भेदभाव नहीं कर रहे हैं निरूपित। तीर भेदभाव के दौरान रूपात्मक सुविधाओं पर प्रकाश डाला। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र 2
    चित्रा 2: BMP4 / ए / पी भेदभाव जल्दी pluripotency मार्कर NANOG downregulates और upregulates trophoblast जीन CDX2 और KRT7। NANOG (pluripotency मार्कर), CDX2, और KRT7 (trophoblast मार्कर) के लिए QRT- पीसीआर विश्लेषण। मूल्यों तीन प्रतियों उपायों से औसत हैं। //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र तीन
    चित्रा 3: जीन व्यवधान और वायरल संक्रमण के इन विट्रो भेदभाव मानव trophoblastic कोशिकाओं में इस्तेमाल करते हैं। (ए) hESCs के QRT- पीसीआर विश्लेषण (HUES9) भेदभाव और फिर लंबे समय के लिए विशिष्ट siRNAs के साथ ट्रांसफ़ेक्ट, आरएनए lncRHOXF1 (बाएं) या लगातार दो दिनों के लिए प्रोटीन कोडिंग जीन hnRNP यू (दाएं) noncoding। पछाड़ना दक्षता (केडी) आम तौर पर 70-80% है, और एक अभिकर्मक प्रयोग से परिणाम दिखाए जाते हैं। (बी) के भेदभाव दिन 2 trophoblastic सेंडाइ वायरस से संक्रमित कोशिकाओं के सेंडाइ वायरल प्रोटीन प्रतिलेख के QRT- पीसीआर विश्लेषण (MOI = 1) 8 घंटे के लिए। त्रुटि सलाखों SEM निरूपित।"Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig3large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 4
    चित्रा 4: प्लाज्मिड की शुरूआत में इन विट्रो विभेदित मानव trophoblastic कोशिकाओं में डीएनए। भेदभाव दिन 1 और 3 दिन ट्रोफेक्टोडर्म पूर्वज कोशिकाओं में GFP प्लास्मिड डीएनए के अभिकर्मक, अगले दिन कल्पना। स्केल बार = 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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    Discussion

    हम trophoblast progenitors में hESCs फर्क के लिए बुनियादी कदम प्रस्तुत किया। इस प्रोटोकॉल हाल ही में trophoblastic कोशिकाओं को भेदभाव बढ़ रही है और mesoderm पूर्वज है, जो आम तौर पर अकेले BMP4 उपचार के साथ मनाया जाता है की पीढ़ी से बचने के लिए तेजी से Activin / नोडल संकेत अवरोधकों के अलावा के साथ hESCs अंतर करने के लिए अनुकूलित किया गया है। BMP4 मॉडल प्रणाली मानव trophoblast वंश विनिर्देश और विस्तार के प्रारंभिक चरणों की परीक्षा के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, इस BMP4 मॉडल प्रणाली भी विशिष्ट उप-प्रजातियों, जो गर्भाशयकर्कट सेल लाइनों और extravillous trophoblast सेल लाइनों का उपयोग करने के लिए संभव नहीं है trophoblastic कोशिकाओं के भेदभाव की जांच के लिए उपयोगी है। इन विट्रो निकाली गई trophoblastic कोशिकाओं में भी siRNAs 19 का उपयोग कर नुकसान के समारोह के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, hESCs या hiPSCs आनुवंशिक रूप से transgen की inducible अभिव्यक्ति के लिए संशोधित किया जा सकता तों 19 या अंतर्जात लोकी 20 में रिपोर्टर जीन की प्रविष्टि के लिए, और इन कोशिकाओं को यहाँ वर्णित शर्तों का उपयोग कर trophoblastic कोशिकाओं में भेदभाव किया जा सकता है।

    प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम

    यह मुख्यमंत्री भेदभाव माध्यम से बी-FGF (FGF2) न आना hESCs से trophoblastic पूर्वज कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। बी-FGF की उपस्थिति संस्कृति के माध्यम में BMP4 के साथ मिलकर mesoderm और एण्डोडर्म पूर्वज 16 की अभिव्यक्ति को बढ़ाता है। Trophoblast भेदभाव माध्यम में बी-FGF के शामिल किए जाने क्यों हाल के एक अध्ययन में पाया गया कि BMP4 की मध्यस्थता भेदभाव trophoblasts 21 के बजाय mesoderm और एण्डोडर्म कोशिकाओं को उत्पन्न करता है समझाने के लिए माना जाता है। यह अच्छी तरह से स्थापित है कि बी-FGF एक साथ Activin ए और BMP4 के साथ एक खुराक पर निर्भर फैशन 22 में एण्डोडर्म और mesoderm भेदभाव को बढ़ावा देता है,एस = "xref"> 23। माउस में, आद्यबहिर्जनस्तर, ट्रोफेक्टोडर्म के विकास, और आदिम endoderm प्रजातियों FGF संकेत दे रास्ते 24 पर निर्भर हैं। HESCs फर्क में, बी FGF प्रेरित सिगनल mesoderm गठन के लिए आवश्यक है जब BMP4 भेदभाव 21, 25 के लिए प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इसके विपरीत, दोनों FGF और Activin / नोडल संकेत दे रास्ते के अवरोध, BMP4 के साथ एक साथ, hESC व्युत्पन्न trophoblast progenitors में SYN गठन के पक्ष में है और mesoderm और आदिम endoderm पूर्वज 26 के गठन से बचाता है।

    तकनीक की सीमाएं

    trophoblast progenitors के लिए hPSC भेदभाव के इस प्रोटोकॉल के साथ सबसे विशिष्ट समस्या hESCs या MEFs पर hiPSCs के एक मुख्य रूप से अविभाजित आबादी के साथ शुरू करने के साथ जुड़ा हुआ है। क्योंकि hPSCs दोनों आंतरिक और बाहरी किनारों पर विभेदित कोशिकाओं जमाकालोनियों की, यह दैनिक भेदभाव की राशि की निगरानी करने के लिए और अलग-अलग कालोनियों (या कालोनियों का भाग) को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है। विभेदित कोशिकाओं की उपस्थिति भेदभाव प्रक्रिया जटिल हो सकता है, खासकर जब कोशिकाओं बाह्य मैट्रिक्स के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं। विभेदित कोशिकाओं को जल्दी मुख्यमंत्री की उपस्थिति में बाह्य मैट्रिक्स पर पैदा करना होगा, और इन कोशिकाओं के तेजी से संस्कृति पर ले जाएगा और hPSCs बाहर प्रतिस्पर्धा। इसलिए, यह बाह्य मैट्रिक्स के लिए कोशिकाओं स्थानांतरित करने से पहले पर MEFs उगाया hPSCs के स्वस्थ, undifferentiated कालोनियों के साथ शुरू करने के लिए आदर्श है।

    मौजूदा / वैकल्पिक तरीके के लिए सम्मान के साथ तकनीक का महत्व

    इस भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप trophoblast पूर्वज सेल प्रकार की एक heterogenous मिश्रण हैं। Trophoblasts विलस cytotrophoblasts, syncytiotrophoblasts (SYNs), और extravillous cytotrophoblasts के शामिल हैं(EVTs) 27। विलस cytotrophoblasts progenitors कि EVTs और SYNs उत्पन्न कर रहे हैं। BMP4-भेदभाव hPSCs विलस cytotrophoblasts, SYNs, और EVTs 9, 15, जो अपरा-विशिष्ट मार्करों के जीन या प्रोटीन अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित किया गया है की एक मिश्रण उत्पन्न होगा। अलग भेदभाव रास्ते एचएलए-जी के स्राव (EVTs की विशेषता) या मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन (SYNs से) 28, 29 से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। हाल ही में, यह दिखाया गया है कि Activin / नोडल सिगनल के निषेध hESCs से EVT भेदभाव के पक्ष में है, और इस अवरोध को हटाने के SYN से 17 भेदभाव के पक्ष में गया है। दरअसल, पहले के एक प्रकाशन में पाया गया कि BMP4 का उपयोग कर अकेले hESCs अंतर करने के लिए उत्पन्न ज्यादातर SYN कोशिकाओं 26। BMP4 / ए / पी और वातानुकूलित मध्यम (कमी बी FGF) का उपयोग आंकड़ों से संकेत मिलता है कि वहाँदोनों EVT और SYN कोशिकाओं भेदभाव दिन 5. शुद्ध EVT या SYN आबादी वांछित, अतिरिक्त शुद्धि ऐसे एचएलए-जी के रूप में कोशिका की सतह मार्कर, EVTs के अलगाव के लिए मोती संयुग्मित का उपयोग कर रहे हैं, तो संभव है 29 से मौजूद हैं। अंत में, संस्कृति विधि यहाँ वर्णित एक कारगर तरीका है कि आवेदनों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता hPSCs से trophoblastic कोशिकाओं के महत्वपूर्ण मात्रा उत्पन्न करने के लिए है। क्योंकि इस प्रोटोकॉल दोनों SYNs और EVTs उत्पन्न करता है, यह जल्दी मानव नाल की जांच के लिए एक उपयुक्त मॉडल प्रणाली है। इन कोशिकाओं को दवाओं की खोज और जेनेटिक इंजीनियरिंग सहित आवेदन की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM/F12 Invitrogen 11330-057
    Knock Out Serum Replacement Invitrogen 10828-028 This is referred to as "serum replacement" in this protocol.
    NEAA Invitrogen 11140-050
    FBS Invitrogen 16000-044
    L-Glutamine Invitrogen 10828-028
    Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-155
    2-Mercaptoethanol Sigma M-7522
    B-FGF Millipore GF-003
    DMEM Invitrogen 11965-118
    Dispase Invitrogen 17105-041
    Collagenase Type IV Invitrogen 17104-019
    Rock inhibitor Y27632 Calbiochem 688000
    Irradiated CF1 MEFs GlobalStem 6001G MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated.
    0.22 µm syringe filter Millipore SLGS033SS
    Heracell 150i low oxygen incubator Heracell/VWR 89187-192 Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient.
    BMP4 R&D Systems 314-BP-01M
    A 83-01 R&D Systems 2939/10
    PD173074 R&D Systems 3044/10
    RNAiMax Invitrogen 13778150
    Trizol ThermoFisher 15596026 Trizol is used to isolate total RNA.
    X-tremeGENE 9 Roche 6365779001
    Matrigel Corning 356231 This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol.

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    References

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    Tags

    विकास जीवविज्ञान अंक 121 मानव trophoblastic कोशिकाओं स्टेम सेल मानव भ्रूण स्टेम सेल मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल, हड्डी morphogenic प्रोटीन 4 Activin / नोडल रास्ते
    मानव pluripotent की <em>इन विट्रो</em> भेदभाव <em>में</em> स्टेम कोशिकाओं Trophoblastic में कोशिकाओं
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    Wang, J., Anguera, M. C. In… More

    Wang, J., Anguera, M. C. In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells. J. Vis. Exp. (121), e55268, doi:10.3791/55268 (2017).

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