Abstract
Плацента является первым органом развивать в процессе эмбриогенеза и необходим для выживания развивающегося эмбриона. Плацента состоит из различных клеток трофобласта, которые дифференцируются из внеэмбриональной трофэктодерме клеток предимплантационной бластоцисты. Таким образом, наше понимание ранней дифференциации событий плаценты человека ограничена из-за этических и правовых ограничений на изоляции и манипуляции человеческой эмбриогенеза. Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) представляют собой надежную модель системы для исследования развития человека , а также могут быть дифференцированы в пробирке в трофобласта клеток , которые экспрессируют маркеры различных типов клеток трофобласта. Здесь мы представляем подробный протокол для дифференциации hPSCs в трофобластических клеток с использованием костного морфогенного белка 4 и ингибиторы / Узловые сигнальных путей активин. Этот протокол генерирует различные трофобласта типы клеток, которые могут быть трансфицированы с киРНКдля исследования с потерей функции фенотип или могут быть заражены патогенами. Кроме того, hPSCs могут быть генетически модифицированы, а затем дифференцировались в трофобласта клеток-предшественников для усиления из-функции анализа. Это в пробирке метод дифференциации для формирования человека трофобласта , начиная с hPSCs преодолевает этические и правовые ограничения работы с ранних человеческих эмбрионов, и эта система может быть использована для различных приложений, включая обнаружение наркотиков и исследования стволовых клеток.
Introduction
Плацента необходим для роста и выживания плода во время беременности и облегчает обмен газов, питательных веществ, отходов производства, а также гормонов между материнской и кровообращение плода. Первый орган формируется во время эмбриогенеза млекопитающих является плацента, которая начинает разработку 6-7 дней после зачатия в организме человека и 3,5-4,5 дней у мышей 1, 2, 3, 4. Трофобластические клетки являются наиболее важными клетками плаценты, и эти клетки представляют собой одну из самых ранних событий дифференцировки родословная зародыша млекопитающих. Они возникают из внешних внеэмбриональной трофэктодерме клеток предимплантационной бластоцисты. Наши знания о ранних стадиях развития плаценты ограничивается этическими и материально-технических ограничений по моделированию раннего развития человеческого потенциала.
Во время эмбрионального имплантации трофобластавторгнуться материнский эпителий и дифференцироваться в специализированные клетки - предшественники 5. Cytotrophoblasts (CTBS) являются Мононуклеированные, недифференцированные клетки-предшественники, которые взрывателем и дифференцируются в syncytiotrophoblasts (SYNs) и extravillous инвазивными трофобласта (EVTs), которые закрепляют плаценту к матке. SYNs являются многоядерные, терминально дифференцированные клетки, которые синтезируют гормоны, необходимые для поддержания беременности. Ранние дифференциации событий , которые генерируют EVTs и SYN , имеют важное значение для формирования плацентарной, так как нарушения в клетках трофобласта приводит к выкидышу, преэклампсии и внутриутробное ограничение роста 1. Которые были разработаны типы линий человеческих клеток трофобласта включают увековечены CTBS и хориокарцинома, которые производят плацентарных гормонов и отображать инвазивные свойства 6. Первичные трофобластические клетки из плацент первого триместра человека могут быть выделены, но клетки быстро дифсовыми и остановить пролиферирующих в пробирке. Важно отметить, что трансформировали и первичные клеточные линии имеют различные профили экспрессии генов, указывая , что онкогенные и увековечил линии трофобласта клеток не могут точно представлять первичные трофобласта 7. Кроме того, эти линии вряд ли будут похожи на плацентарного трофобласта клетки-предшественники стволовых клеток, так как они получены из поздних стадиях первого до третьего триместра.
Существует потребность в надежной в пробирке системы культуры новообразующимися человека трофобласта с целью изучения ранних событий плацентарной формирования и функции. Человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), которые разделяют свойства с внутренней клеточной массы эмбриона предимплантационной, часто используются для моделирования раннего развития людских ресурсов, в том числе формирование ранней плаценты. Оба человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) и ЭСК могут быть дифференцированы в трофобласта в пробирке с использованием Bone Morphogenic белка 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Это превращение плюрипотентных клеток трофобласта клеток с использованием ВМР4 является специфическим для клеток человека и широко используется для изучения развития ранней плаценты человека , поскольку он не требует доступа к ранних эмбрионов человека 9, 16. Недавно было обнаружено, что добавление ингибиторов A83-01 (А) и PD173074 (P), которые блокируют сигнальные пути SMAD2 / 3 и MEK1 / 2, повышает эффективность HPSC дифференциации в трофэктодерме типа клеток-предшественников, в основном SYNs и EVTs, без обширного поколения мезодермы, энтодермы, или клетки эктодермы 9, 17 в лабораторных условиях модельной системы 9, 11. Здесь мы представляем подробный протокол для дифференцировки в пробирке hPSCs в предшественниках трофобласта человека с помощью BMP4 / A / P культуральной среды. Эти условия продуцируют обильные количества клеток для широкого спектра применений, в том числе РНК-последовательности, разрушение гена с использованием киРНК, патогеном инфекций и генетической модификации, Липофекция-опосредованной трансфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Для дифференциации либо ЭСК или hiPSCs в трофобласта клеток-предшественников, hPSCs, выращенные на мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) являются переведены на фидерных свободные условия для двух пассажей до начала дифференцировки с BMP4 / A / P. Этот процесс устраняет MEF загрязнение дифференцированных клеток. Здесь мы приводим протокол для дифференцировке ЭСК, и тот же протокол может быть применен к hiPSCs.
1. Культура и восстановление ЭСК на облученного мышиных эмбриональных фибробластах (МЭФ) (подготовка)
- Гамма-облучение MEFs
- Сделать 500 мл среды для культивирования MEFs: DMEM с добавлением 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 1x пенициллина / стрептомицина (Pen / Strep) и 0,1 мМ несущественных аминокислот (NEAA).
- Оттепель один флакон первичных MEFs и использовать MEF среду для культивирования клеток. Разверните первичные MEFs 30 пластин с использованием MEF культуральной среды.
Примечание: Концентрация кислорода не являются критическими для этого шага, таклибо могут быть использованы физиологические (4%) или температуре окружающей среды (20%) условий в инкубаторе. - Урожай MEFs. Используйте 0,25% трипсина, чтобы удалить MEFs из пластин и переноса клеток в конической трубе. Поместите MEFs в инструмент облучения и подвергать клетки до 3500 оттенков серого.
Примечание: Количество времени, будет зависеть от активности источника внутри блока облучателя. - Ресуспендируют облученные MEFs с MEF культуральной среде и подсчитывают количество клеток с помощью гемоцитометра.
- Гранул MEFs с помощью центрифуги и добавьте 50% среды MEF культуры и 50% клетки замораживания среды (80% FBS и 20% средних MEF культуры). Алиготе 1 × 10 6 клеток на флакон.
- Поместите облученные MEF флаконов в -80 ° C в течение ночи с морозильной камерой, а затем передавать их в жидкий азот для длительного хранения.
- Размораживание замороженных MEFs и ЭСК для культуры
- Сделать 500 мл ЭСК среды: DMEM / F-12 с 20% сыворотки замеement, 0,1 мМ NEAA, 2 мМ L-глутамина, 10 нг / мл bFGF, 0,1 мМ бета-меркаптоэтанола, и 1x пен / стреп.
- Оттепель один флакон MEFs за один день до оттаивания ЭСК. Покройте 6-луночный планшет с 0,1% желатина, используя 1 мл для каждой лунки. Выдержите в течение по крайней мере 20 мин при комнатной температуре, а затем удалить желатин.
- Удалить флакон MEFs от хранения в жидком азоте и погрузить флакон в C водяной бане при 37 °. Смотрите флакон с перерывами до только мелкие кристаллы льда остаются. Быстро перенесите содержимое флакона до 9 мл MEF среды внутри 15 мл коническую трубку.
- Гранул клетки центрифугированием при 200g в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в MEF среде. Алиготе MEFs равномерно на 6-луночный планшет. Поместите пластинку в 37 ° С низким содержанием кислорода (4%) инкубаторе в течение ночи.
- Рутинное культуры ЭСК на MEFs
- Удаление флакона чЭСК из жидкого азота и быстро таять флакон с использованием 37 ° C на водяной бане. Аккуратно пипетки ЭСК в 15 мл коническую пробирку, содержащую 9 мл ЭСК среды и спином вниз при 200g в течение 5 мин. Удалите среду и ресуспендирования клеток с 1 мл ЭСК среды.
- Аспирируйте MEF среды из пластины, полученного на стадии 1.2.4 и добавляют 1 мл чЭСК среды. Добавить ингибитор Рок Y-27632 (10 мкМ) в среде чЭСК. Передача ЭСК на MEFs.
- Поместите клетки в 37 ° С с низким содержанием кислорода (4%) инкубаторе на ночь. Замените среду чЭСК ежедневно. Соскребите дифференцированные клетки с помощью пипетки Пастера, визуализированы под микроскопом при вертикальном 4X.
- Прохождение ЭСК через каждые 4-6 дней, в зависимости от состояния сплошности клеток и размера чЭСК колоний. Подготовьте тарелку MEFs за день до пассажей. Когда клетки готовы к прохождению, удалите среду чЭСК и промыть скважину с 1 мл PBS.
- (Предварительно нагретый до 37 ° С) Добавить 1 мг / мл коллагеназы, инкубировать при 37 ° С в течение 5 мин, и удалить коллагеназы. Wпепел клеток с PBS, добавляют 1 мл ЭСК среды на лунку, и вручную очистить клетки на мелкие комки, используя кончик 5 мл пипетки. Передача приостановленные сгустки клеток в новую MEF покрытием хорошо (с).
2. Переход от ЭСК MEFs фидера безупречных условий на пластинах внеклеточный матрикс покрытием
- Подготовка MEF - кондиционированной среды (см)
- Пластина облученные MEFs в Т75 колбу на 90-100% сплошности; важно, чтобы MEFs плотно высевали. Обратите внимание на клетки с помощью микроскопа, чтобы определить, были ли они прикреплены к основанию колбы (МЭФ присоединять примерно через 6 ч после посева или на следующий день).
Примечание: Unattached клетки плавают в среде при наблюдении с помощью микроскопа. На следующий день, удалить MEF среды и добавляют 25 мл чЭСК среду, лишенную B-FGF. - Собирают кондиционированной среды после 24 ч инкубации. Заменить свежей средой ежедневно в течение максимум 12 дней. Фильтр собранный см с помощью 0,22 мкм фильтра. Перед использованием добавить свежий B-FGF в КМ.
Примечание: СМ могут быть заморожены при -80 ° С и хранили в течение до 1 года. В качестве альтернативы, хранить СМ при температуре 4 ° С в течение 2-х недель.
- Пластина облученные MEFs в Т75 колбу на 90-100% сплошности; важно, чтобы MEFs плотно высевали. Обратите внимание на клетки с помощью микроскопа, чтобы определить, были ли они прикреплены к основанию колбы (МЭФ присоединять примерно через 6 ч после посева или на следующий день).
- Переход в ЭСК из культуры на MEFs фидерных свободных внеклеточных пластин матрицы покрытием.
- Получение внеклеточного матрикса для покрытия тканевых культуральных планшетах
- Оттепель аликвоту внеклеточного матрикса на льду (около 3-4 ч). Использование ледяной штекеры, один холодный, 50 мл коническую пробирку и DMEM / F12, передачу 2 мг внеклеточного матрикса в 24 мл охлажденного на льду DMEM / F-12 (разбавление зависит от концентрации внеклеточного матрицы от поставщика ).
- Немедленно передать 50-мл коническую трубку на лед и хранить его при температуре 4 ° С. Для покрытия тканевых культуральных планшетах, добавить соответствующее количество разбавленного внеклеточного матрикса в скважине (например, 1 мл на лунку в 6-луночный планшет), Вихревой, чтобы покрыть планшет и инкубировали при комнатной температуре в течение по крайней мере 1 часа.
- Прохождение ЭСК из MEFs (как на этапе 1.3) с использованием СМ, содержащего B-FGF (10 нг / мл).
- Отберите для удаления внеклеточного матрикса из новой плиты и добавьте CM, содержащую B-FGF. Передача Царапины клеточные комки из MEF пластины с помощью пипетки и аликвоту его в внеклеточной матрицы пластины с покрытием. Выдержите в 37 ° C инкубаторе низким содержанием кислорода в течение ночи.
- Заменить КМ с B-FGF среды в день; количество среды будет зависеть от размера колбы культуры. Используйте 2 мл среды для одного 6-хорошо хорошо. Соскребите дифференцированные клетки с помощью пипетки Пастера.
- Прохождение ЭСК каждые 6-7 дней, когда колонии светлые, если смотреть под микроскопом.
Примечание: чЭСК колонии, выращенные на пластинах внеклеточного матрикса покрытием расти больше, чем MEF-культивируемых клеток. - Когда фидерные свободные клетки готовы к прохождению, удалите среду, Мытье объявлениемDing 1 мл PBS с помощью пипетки, аспирация, чтобы удалить PBS, добавляют 0,5 мг / мл диспаза (предварительно нагретый до 37 ° С) с помощью пипетки, и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 5 мин.
- Промывают клетки с PBS путем добавления 2 мл PBS на лунку и аспирационного после этого. Добавьте 1 мл CM на лунку и вручную очистить клетки на мелкие комки, используя кончик 5 мл пипетки.
- Пластина приостановленных скопления клеток в новые внеклеточных матричных пластин с покрытием; клетки должны придерживаться после 24 часов.
- Получение внеклеточного матрикса для покрытия тканевых культуральных планшетах
3. Дифференциация ЭСК Использование BMP4 / A / P
- Приготовьте дифференциации среды. Использование CM (отсутствие B-FGF) и добавьте (свежий) ВМР4 (50 нг / мл), A83-01 (1 мкМ), и PD173074 (0,1 мкМ). Добавьте эти ингибиторы КМ перед использованием.
- Используйте фидерных свободных ЭСК, растущие на внеклеточных матричных пластин с покрытием за 1 проход, культивируемые в инкубатор при 4% кислорода. После первого прохода на внеклеточных матричных пластин с покрытием,пусть клетки прикрепляться в течение 24 часов. На следующий день, инициировать дифференциацию. Удалите CM (содержащий B-FGF) и заменить его на СМ, содержащей BMP4 / A / P (2 мл на лунку в 6-луночный планшет). Продолжить культивирования клеток с использованием 4% уровня кислорода.
- Заменить КМ, содержащий BMP4 / A / P (2 мл / лунку для 6-ти луночного планшета) каждые 2 дня. Аспирируйте, чтобы удалить старую среду и добавить новый CM с помощью пипетки. На второй день после добавления ВМР4 и удаления B-FGF (считается дифференцировка 2-й день), морфология клеток изменяется, появляется больше при наблюдении с помощью микроскопа.
Примечание: недифференцированные клетки, которые обладают яркой закругленные края, не будет присутствовать. - Сбор клеток в требуемых временных точках. Дифференцированные клетки прекращают деление примерно через 2 недели. Трансфекции клеток в течение этого периода времени (смотрите следующий раздел).
4. Трансфекция клеток трофобласта с миРНК или плазмидной ДНК
- Подготовьте трофобластические клетки для трансфекции
- Культура ЭСК для двух пассажей на внеклеточный матрикс после переноса их из MEFs (см шаг 2.2). Используйте среду чЭСК, содержащую B-FGF.
- Разделить ЭСК на новый внеклеточный матрикс пластины за один день до дифференциации. Высокая клеточная конфлуэнтности имеет важное значение, так разделить ячеек 1: 1 на новую пластину / лунку, которая будет обеспечивать по меньшей мере 50% слитности на следующий день. Инкубируйте клетки в течение ночи в инкубаторе с низким содержанием кислорода.
Примечание: ЭСК не нужно быть подсчитаны в течение этого шага. - На следующий день, замените носитель с дифференциацией среды (СМ, содержащей BMP4 / A / P и B не хватает-FGF, используя 2 мл / лунку в течение 6-луночный планшет). Удалите старую среду путем аспирации и передать новую среду (2 мл) с помощью пипетки. Поместите клетки в инкубаторе с низким содержанием кислорода (4% кислорода) в течение ночи.
- не Дифференцировать клетки до желаемого Time-точка (между 1-й и 14). За день до трансфекции, Trypsinize клеток с использованием 0,05% трипсина в течение 5 мин. Пластинчатый их к желаемому сплошности (в зависимости от протокола реагента для трансфекции) на пластину желатин покрытием (добавить 0,1% желатина в культуральную чашку ткани в течение 20 мин и аспирата для удаления). Добавить СМ, содержащий BMP4 / A / P (недостающую B-FGF) и инкубировать в течение ночи.
- На следующий день, добавить свежую среду дифференцировки в клетки. Трансфекцию миРНК с использованием реагента для трансфекции миРНК. Для получения плазмидной ДНК, используют соответствующий реагент Липофектамин.
- Следовать протоколу продукта, как это описано для каждого реагента для трансфекции. Передача миРНК-Липофектамин комплексов в каждую лунку / пластины клеток, осторожно перемешать, и культуры клеток в течение ночи в инкубаторе с низким содержанием кислорода.
Примечание: Некоторые реагенты трансфекции подавляются антибиотиками, которые требуют CM отсутствуют пен / стреп. - На следующий день, заменить свежей среде для дифференцировки.
- Сбора клеток по желаниюг временные точки (например, 24 ч, 48 ч и 72 ч) , чтобы проверить эффективность разрушения гена с использованием количественной ОТ-ПЦР. Для сбора клеток, используют 0,05% трипсина, добавив 1 мл на лунку и инкубировали в течение 5 мин при 37 ° С. Добавьте 5 мл MEF среды на лунку, чтобы нейтрализовать трипсина. Спин вниз клетки при 200 мкг в течение 5 мин и используют осадок клеток для выделения РНК.
5. Возбудитель Инфекция трофобластические клеток: Сендай Вирусная инфекция
- Подготовка ЭСК для дифференциации
- Культура ЭСК для двух пассажей на внеклеточный матрикс после передачи из MEFs (см шаг 2.2). Используйте среду чЭСК, содержащую B-FGF.
- Разделить ЭСК на новый внеклеточный матрикс пластины за один день до дифференциации. Высокая клеточная конфлуэнтности имеет важное значение, так разделить ячейки 1: 1 на новую пластину / лунку, которая обеспечит по меньшей мере 50% слитности на следующий день. Инкубируйте клетки в течение ночи в с низким содержанием кислорода инкубатора (4% кислорода). <бр /> Примечание: ЭСК не нужно быть подсчитаны в течение этого шага.
- На следующий день, замените носитель с дифференциацией среды (СМ, содержащей BMP4 / A / P и B отсутствуют-FGF) и культуры в течение ночи в инкубаторе низким содержанием кислорода (4% кислорода).
- Сендай вирусная инфекция трофобластических клеток
- За один день до желаемого дня дифференцировки, Trypsinize дифференцирующие клетки (в отдельных клеток) с использованием 0,05% трипсина в течение 5 мин и передавать их на тарелку желатин покрытием. Добавить дифференциации среды и инкубировать в течение ночи в инкубаторе с низким содержанием кислорода.
- На следующий день, добавить среду для заражения (это будет варьироваться в зависимости от вируса). отсутствие Pen / Strep, содержащий BMP4 / A / P, используя 0,5 мл на одну лунку 6-луночного планшета Используйте СМ. Добавить вирус Сендай для MOI = 1. Выдержите в течение 8 часов в инкубаторе с низким содержанием кислорода.
- Если дополнительные временные точки необходимы, удалить вирус, содержащий среду после 4 ч и заменить его BMP4 / A / P CM. Собирают клеткидля выделения РНК с использованием клеточного скребка.
- Определить эффективность вирусной инфекции, выполняя QRT-PCR для генов , участвующих в вирусной реакции 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обзор In Vitro Дифференциация hPSCs
Это в пробирке протокол дифференцировки начинается с недифференцированных ЭСК , выращенных на MEFs, которые перешли на фидерных свободные условия для прохода по одному (Рис . 1А) В то время как мы описали дифференцировку ЭСК в этом протоколе, мы использовали этот протокол успешно дифференцировать hiPSCs в трофобластических клетки. Переход к внеклеточным матриксом удаляет большинство облучаемых MEFs, которые нежелательны для анализов, которые требуют чистых популяций трофобласта клеток человека. Неопределенная hPSCs выращивают на внеклеточный матрикс и культивировали с КМ, содержащие B-FGF, пока колонии не будут готовы к пассажей (примерно одна неделя). Это поддерживает плюрипотентных государства до индукции BMP4 / A / P-опосредованной дифференциации. Колонии разрушены в сгустки ~ 50-100 клетокиспользуя диспазу и пассируют во второй раз на внеклеточный пластину матрицы с покрытием. На следующий день после пересева, прилипшие клетки готовы для индукции дифференцировки, а среда переключается содержать BMP4 / A / P недостающую B-FGF. Дифференцированные клетки пролиферируют в течение приблизительно 2 недель, в течение которых клетки могут быть собраны для выделения РНК или использованы для трансфекции. Морфологические изменения появляются через 1-2 дней после дифференцировки было начато, и результаты от одного репрезентативного эксперимента показаны на фигуре 1В. Обратите внимание на то, что клетки на дифференцировку дни 1-2 больше по размеру , чем клетки со дня 0 (Фиг.1В). Дифференцированная клетка колонии быстро растет, и это изменение заметно каждый день. Как дифференциации доходов, клетки делятся и расшириться от центра колонии, растущие в наружном направлении (дни 3-5; Фигура 1В). Внешняя часть колонии содержит более крупные клетки по сравнению с Тон клетки в центре колонии. В дифференцирующие клетки становятся более темными и более пологий, чем плюрипотентных стволовых клеток, культивируемых на внеклеточного матрикса; изменения яркости ячейки являются более очевидными при просмотре клеток с использованием вертикального микроскопа, используемого для рутинного культуры клеток. Отдельные колонии сливаются дифференциацией 5 -й день (рис 1 , б), с клетки , растущие на верхней части друг друга. После дифференцировки день 4-5, клетки , содержащие множество ядер присутствуют (не показан) (Фигура 1В).
BMP4 / A / P Индуцирует дифференцировке и экспрессия маркеров трофобласта
Мы исследовали изменения экспрессии генов в течение первых трех дней BMP4 / A / P дифференциации с использованием количественной ОТ-ПЦР (QRT-PCR). РНК выделяли при разграничении 1-й, 2-х, и 3 и превращают в кДНК. Исчезновение плюрипотентных стволовых клеток может быть оценена как бY морфология, визуально с помощью микроскопа, а QRT-ПЦР, с использованием праймеров для генов плюрипотентности. Относительные уровни экспрессии NANOG, маркера плюрипотентных стволовых клеток, уменьшается на ~ 75% после того, как один день дифференцировки , когда клетки культивируют с BMP4, и уровни уменьшаются на ~ 90% , в присутствии BMP4 / A / P ( Рисунок 2). Дифференцирование 2 -й день, уровни NANOG очень низки для клеток , культивируемых в одиночку или в BMP4 / A / P BMP4 по сравнению с теми , в чЭСК СМ среде (содержащей В-FGF). Это ожидаемый результат, потому что мы не наблюдаем недифференцированных клеток после двух дней дифференцировки (рис 1B), которые ярче и меньше по размеру по сравнению с дифференцированными клетками. Эффективность BMP4-опосредованной дифференциации клеток к трофобластических могут быть непосредственно оценены QRT-ПЦР с использованием праймеров , специфичных для двух трофобласта маркеров: KRT7 и CDX2. Оба этих генов не выражены в плюрипотентных стволовых человекаклеток и их экспрессия возрастает после 2-3 дней лечения BMP4 (рисунок 2). Используя условия , описанные здесь, уровни транскриптов KRT7 увеличиваются в 1 -й день дифференциации в BMP4 / A P / среде и остаются неизменными в течение первых 3 -х дней дифференциации (рисунок 2). Выражение KRT7 при использовании ВМР4 в одиночку имеет замедленное увеличение на 2 -й день, в соответствии с предыдущими наблюдениями , что Узловые ингибиторы активина / увеличить скорость дифференцировки ЭСК 9. Другой способ оценки эффективности использования этих ингибиторов является определение стационарного обилие CDX2 и KRT7 транскриптов в клетках , обработанных только BMP4. Уровни CDX2 одинаковы для дифференциации дней 1-3 при использовании либо по отдельности ВМР4 или ВМР4 вместе с Узловые ингибиторов активин /. Тем не менее, KRT7 транскрипты более многочисленны после того, как один день дифференцировки в присутствии этих ингибиторов, что свидетельствует о болееБыстрое дифференцирование (рисунок 2). Выражение CDX2 обычно достигает максимума в дифференциации 2 -й день для обоих условий и уменьшается после того, как 3 -й день (рисунок 2). Неопределенная ЭСК не выражают ни KRT7 или CDX2 (рисунок 2), как и ожидалось. В заключение, BMP4 условия / A / P быстро дифференцировать ЭСК и плацентарного экспрессии маркеров могут быть обнаружены уже в 3-й день дифференцировки.
Трансфекции миРНК и плазмидной ДНК и вирусные инфекции Использование In Vitro -derived трофобластические клетки
В пробирке , полученные трофобластические клетки человека могут быть трансфицированы с миРНК , чтобы нарушить экспрессию гена либо кодирующей или некодирующие РНК. Мы инициировали дифференцировку ЭСК с помощью BMP4 / A / P, провели два раунда миРНК трансфекциях (с использованием 75 пмоль миРНК) на дифференцировку дни 1 и 2,и собирали клетки для выделения РНК. Количественный ОТ-ПЦР является эффективным методом для определения эффективности нокдаун для любого кодирования или некодирующих генов. С помощью двух миРНК , комплементарных различных регионах длинный, некодирующей РНК lncRHOXF1 19, мы получили 80% нокдаун lncRHOXF1 транскриптов (рис 3А). Далее, мы трансфецировали один миРНК (25 пмоль) для кодирующей белок гена hnRNP U, а также на дифференциации дней 1 и 2. Мы наблюдали снижение на 80% в hnRNP U транскриптов следующие два последовательных трансфекций. В пробирке дифференцированы трофобласта клетки - предшественники могут быть также использованы для исследования врожденных иммунных реакций. Мы провели инфекции дифференцировки день 2 клетки с помощью вируса Сендай при MOI 1 и собирали клетки после 8 часов инкубации вируса. Используя QRT-PCR, мы обнаружили обильные вирусного белка транскриптов (Sev-NP) в инфицированных клетках (рис 3B), что указывает на активной вирусной проpagation в трофобластических клетках. Важно отметить, что инфицированные клетки (при использовании MOI = 1) не изменяются по внешнему виду и являются жизнеспособными (данные не показаны). В пробирке полученные трофобластических клетки также могут быть трансфицированы плазмидной ДНК. Мы провели трансфекций с использованием плазмиды GFP и ввел эту конструкцию в BMP4 / A / P обработанных клеток на 1 -й день дифференцировки и 3 -й день и для GFP отображены на следующий день (рисунок 4). Как правило, мы получали 30-50% эффективности трансфекции через 24 часа после трансфекции. В заключение в пробирке полученные трофобластических клетки могут быть использованы для амплитудно и с потерей функции экспериментов.
Рисунок 1: В пробирке дифференциации человеческих плюрипотентных стволовых клеток ранних трофобластических клеток с использованием BMP4 / A / P. (А) Схема BMP4 дифференциации от hPSCs до трофобластических клеток с использованием BMP4 / A / P. (B) Представитель ярко-полевые изображения клеток HUES9 во время d0, D2 и d6 из BMP4 / A / P дифференциации. Шкала бар = 50 мкМ. Стрелки обозначают одноклеточных ЭСК, которые не разграничена. Стрелки выделить морфологические особенности во время дифференцировки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: BMP4 / A / P дифференциация быстро подавляет плюрипотентности маркера NANOG и активирует гены трофобласта CDX2 и KRT7. Анализ QRT-PCR для NANOG (плюрипотентности маркер), CDX2 и KRT7 (трофобласта маркеры). Значения являются средними из мер в трех повторах. //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: разрушение гена и вирусной инфекции с использованием в пробирке дифференцироваться трофобласта клеток человека. (А) QRT-PCR анализ ЭСК (HUES9) дифференцированы , а затем трансфицировали миРНК специфическими к длинному, некодирующих РНК lncRHOXF1 (слева) или белок-кодирующих генов hnRNP U (справа) в течение двух дней подряд. Нокдаун эффективность (КД), как правило, на 70-80%, а результаты одного эксперимента трансфекция показаны. (B) QRT-PCR анализ Сендай вирусного белка стенограмме дифференцировки день 2 трофобластических клеток , инфицированных вирусом Сендай (MOI = 1) в течение 8 часов. Столбики ошибок обозначают SEM."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig3large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Введение плазмидной ДНК в дифференцированных клетках трофобласта человека в лабораторных условиях . Трансфекция ДНК плазмиды GFP в клетки дифференцировка 1-й день и день 3 трофэктодерме предшественниках, визуализировали на следующий день. Шкала бар = 50 мкМ. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы представили основные шаги для дифференциации ЭСК в трофобласта клеток-предшественников. Этот протокол недавно был оптимизирован для быстро дифференцировать ЭСК с добавлением активин / сигнализации Узловое ингибиторов, увеличивая дифференциацию клеток трофобласта и избежать образования мезодермы клетки-предшественники, которые обычно наблюдаются при одной только BMP4 лечения. Система BMP4 модель позволяет для изучения самых ранних стадиях спецификации трофобласт клонов человека и расширения. Кроме того, эта система модель BMP4 также полезна для исследования дифференцировки трофобласта клеток к определенным подразделам родах, что невозможно с использованием клеточных линий Хориокарцинома и extravillous линии трофобласта клеток. В пробирке получены трофобластических клетки также могут быть использованы для экспериментов с потерей функции с использованием киРНК 19. Кроме того, ЭСК или hiPSCs могут быть генетически модифицированы для индуцируемой экспрессии трансгенной ES 19 или для введения генов репортер эндогенных локусов 20, и эти клетки могут быть дифференцированы в трофобласта клетки с использованием описанных здесь условий.
Критические шаги в рамках Протокола
Крайне важно, чтобы опустить B-FGF (FGF2) из CM дифференциации среды для получения трофобластические клеток-предшественников из ЭСК. Присутствие B-FGF вместе с BMP4 в культуральной среде усиливает экспрессию мезодермы и энтодермы предшественниках 16. Включение B-FGF в трофобласта дифференциации среды , как полагают , объяснить , почему недавнее исследование показало , что BMP4-опосредованной дифференциации создает мезодермы и энтодермы клетки вместо трофобласта 21. Это хорошо установлено , что B-FGF вместе с активина А и BMP4 способствует энтодерма и мезодерма дифференциации в моде 22 зависимости от дозы,s = "Xref"> 23. У мышей развитие эпибласта, трофэктодерме, и примитивные энтодермальные родословные зависят от сигнальных путей FGF 24. В дифференциации ЭСК, В-FGF-индуцированный сигнализации требуется для формирования мезодермы при BMP4 используется для индукции дифференцировки 21, 25. В противоположность этому , ингибирование как FGF и / Узловые сигнальных путей активин, вместе с BMP4, способствует формированию SYN в чЭСК производных трофобласта клеток - предшественников и предотвращает образование мезодермы и энтодермы примитивный предшественниках 26.
Ограничения техники
Наиболее типичная проблема с этим протоколом HPSC дифференцировки клеток-предшественников к трофобласта связано с началом с преимущественно недифференцированных ЭСК населения или hiPSCs на MEFs. Поскольку hPSCs накапливаются дифференцированные клетки на обоих внутренних и наружных кромокколоний, важно контролировать количество дифференциации ежедневно и удалить дифференцированные колонии (или части колоний). Наличие дифференцированных клеток может осложнить процесс дифференциации, в особенности, когда эти клетки переносили в внеклеточного матрикса. Дифференцированные клетки быстро пролиферируют на внеклеточный матрикс в присутствии КМ, и эти клетки будут быстро принимать культуру и вне конкуренции с hPSCs. Таким образом, он идеально подходит, чтобы начать со здоровыми, недифференцированных колоний hPSCs, выращенных на MEFs перед переносом клеток к внеклеточного матрикса.
Значимость техники в отношении существующих / альтернативных методов
При использовании этого протокола дифференцировки, полученные трофобласта клетки-предшественники представляют собой гетерогенную смесь типов клеток. Трофобласта состоят из ворсинок cytotrophoblasts, syncytiotrophoblasts (SYNs) и extravillous cytotrophoblasts(EVTs) 27. Ворсинок cytotrophoblasts являются прародителями, которые генерируют EVTs и SYN,. BMP4-дифференцированный hPSCs будет генерировать смесь ворсинчатыми cytotrophoblasts, SYNs и EVTs 9, 15, которые были определены по экспрессии генов или белков - маркеров плацентарных специфических. Явные пути дифференциации можно отличить по секреции HLA-G (характеристика EVTs) или хорионического гонадотропина человека (от SYNs) 28, 29. В последнее время было показано , что ингибирование активин / Узловое сигнализации способствует EVT дифференцировку ЭСК, и удаление этого торможения способствует дифференциации в SYN 17. Действительно, ранее публикации обнаружили , что использование ВМР4 в одиночку , чтобы дифференцировать ЭСК генерирует в основном SYN клетки 26. Данные с помощью BMP4 / A / P и кондиционированной среды (отсутствие B-FGF), показывают, что существуетоба ЭВТ и SYN клетки , присутствующие дифференциацией день 5. Если население чисто EVT или SYN желательно, дополнительную очистку с использованием маркеров клеточной поверхности, такие как HLA-G , конъюгированных с бусами для изоляции EVTs, возможно 29. В заключение отметим, что метод, описанный здесь культура является эффективным способом для получения значительных количеств трофобласта клеток из hPSCs, которые могут быть использованы для различных применений. Поскольку этот протокол генерирует как SYN, и EVTs, это подходящая модель системы для изучения ранней плаценты человека. Эти клетки могут быть использованы для различных применений, в том числе лекарств и генной инженерии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knock Out Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | This is referred to as "serum replacement" in this protocol. |
| NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 10828-028 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-155 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| B-FGF | Millipore | GF-003 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase Type IV | Invitrogen | 17104-019 | |
| Rock inhibitor Y27632 | Calbiochem | 688000 | |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | 6001G | MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated. |
| 0.22 µm syringe filter | Millipore | SLGS033SS | |
| Heracell 150i low oxygen incubator | Heracell/VWR | 89187-192 | Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient. |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-01M | |
| A 83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| PD173074 | R&D Systems | 3044/10 | |
| RNAiMax | Invitrogen | 13778150 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | Trizol is used to isolate total RNA. |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol. |
References
- Rugg-Gunn, P. J.
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy. Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).
- Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. Human blastocysts grown in culture. Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).
- Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. The placenta as a barrier to viral infections. Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Bilban, M., et al. Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).
- Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
- Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).
- Genbacev, O., et al. Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion. Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).
- Marchand, M., et al. Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model. Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).
- Hyslop, L., et al. Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages. Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).
- Harun, R., et al. Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events. Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).
- Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).
- Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and biophysical research communications. , (2013).
- Roberts, R. M., et al. Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be? Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).
- Sarkar, P., et al. Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts. The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).
- Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).
- Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Bernardo, A. S., et al. BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).
- Zhang, P., et al. Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells. Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).
- Vallier, L., et al. Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways. PloS one. 4 (6), e6082 (2009).
- Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).
- Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation. Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).
- Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast. Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).
- Bischof, P., Irminger-Finger, I. The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon. The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).
- Cole, L. A.
- Apps, R., et al. Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).
