Abstract
Die Plazenta ist das erste Organ während der Embryogenese zu entwickeln, und ist für das Überleben der sich entwickelnden Embryo erforderlich. Die Plazenta besteht aus verschiedenen trophoblastic Zellen, die von den extraembryonalen Trophektoderm Zellen des preimplantation Blastozyste unterscheiden. Als solches unser Verständnis der frühen Differenzierungsereignisse der menschlichen Plazenta ist begrenzt, weil der ethischen und rechtlichen Beschränkungen für die Isolation und Manipulation der menschlichen Embryonalentwicklung. Menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) sind eine robuste Modellsystem für die Untersuchung der menschlichen Entwicklung und können auch in vitro in trophoblastische Zellen unterschieden werden , die Marker der verschiedenen Trophoblasten - Zelltypen exprimieren. Hier präsentieren wir ein ausführliches Protokoll für hPSCs in Trophoblastzellen mit knochenmorphogenes Protein 4 und Inhibitoren der Activin / Nodal Signalwege zu unterscheiden. Dieses Protokoll erzeugt verschiedene Trophoblastenzelle Typen, die mit siRNAs transfiziert werden könnenzur Untersuchung loss-of-function Phänotypen oder können mit Krankheitserregern infiziert werden. Zusätzlich werden kann hPSCs genetisch modifiziert und dann in Trophoblasten Vorläufern differenziert für gain-of-function Analysen. Diese in vitro Differenzierung Methode menschlichen Trophoblasten zur Erzeugung von hPSCs Ausgangswindet die ethischen und rechtlichen Einschränkungen mit frühen menschlichen Embryonen zu arbeiten, und dieses System kann für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden, einschließlich der Wirkstoffforschung und Stammzellforschung.
Introduction
Die Plazenta ist für das Wachstum und Überleben des Fötus während der Schwangerschaft erforderlich und erleichtert den Austausch von Gasen, Nährstoffen, Abfallprodukte und Hormone zwischen mütterlichen und fetalen Kreislauf. Das erste Organ während Säugetierembryogenese gebildet ist , der Plazenta, die bei Menschen und 3,5-4,5 Tagen bei Mäusen 1, 2, 3, 4 6-7 Tagen nach der Empfängnis beginnt entwickeln. Trophoblastische Zellen sind die wichtigsten Zellen der Plazenta, und diese Zellen stellen eine der frühesten lineage Differenzierungsereignisse des Säugetierembryo. Sie ergeben sich aus den äußeren extraembryonalen Trophektoderm Zellen des preimplantation Blastozyste. Unser Wissen über die frühen Phasen der Entwicklung der Plazenta wird durch ethische und logistische Einschränkungen begrenzt auf frühe menschliche Entwicklung zu modellieren.
Während der embryonalen Implantation Trophoblastendringen in das mütterliche Epithel und unterscheiden sich in spezialisierte Vorläuferzellen 5. Cytotrophoblasten (CTBs) sind einkernigen, undifferenzierten Vorläufern, die in Synzytiotrophoblasten (SYNs) und extravillösen invasive Trophoblasten (EVT), die Anker, die Plazenta in die Gebärmutter verschmelzen und zu differenzieren. SYNs werden, terminal differenzierte Zellen mehrkernige, die Hormone notwendig für die Aufrechterhaltung der Schwangerschaft zu synthetisieren. Die frühe Differenzierung Ereignisse , die EVTs und SYNs erzeugen , sind von wesentlicher Bedeutung für Plazentabildung, wie Beeinträchtigungen in Trophoblastzellen in einer Fehlgeburt führen, Präeklampsie und intrauterine Wachstumsrestriktion 1. Die Typen der humanen Trophoblasten - Zelllinien , die entwickelt wurden , umfassen CTBs und Chorionkarzinome verewigt, die 6 Plazentahormone und Anzeige invasiven Eigenschaften herzustellen. Primäre trophoblastic Zellen aus menschlichen ersten Trimenon Plazenten isoliert werden können, aber die Zellen schnell difzieren und stoppen in vitro vermehren. Wichtig ist , transformiert und primären Zelllinien unterschiedliche Genexpressionsprofile haben, was darauf hinweist , dass tumorerzeugend und trophoblast immortalisierte Zelllinien nicht genau primäre Trophoblasten 7 darstellen. Darüber hinaus sind diese Linien unwahrscheinlich, dass der Plazenta Trophoblasten Stammzellen Vorläufern ähneln, weil sie von einer späteren Phase ersten bis dritten Trimester abgeleitet werden.
Es besteht ein Bedarf für ein robustes in vitro Kultursystem im Frühstadium menschlichen Trophoblasten , um die frühen Ereignisse der Plazentabildung und Funktion zu untersuchen. Menschliche embryonale Stammzellen (hES-Zellen), die Eigenschaften mit der inneren Zellmasse des preimplantation Embryo zu teilen, werden häufig zur Modellierung der frühen menschlichen Entwicklung, einschließlich der Bildung der frühen Plazenta verwendet. Beide menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) und HES - Zellen können in Trophoblasten in vitro differenziert werden unter Verwendung von Knochen Morphogenic Protein 4 (BMP - 4) , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Diese Umwandlung von pluripotenten Zellen zu Trophoblastzellen BMP4 Verwendung ist für menschliche Zellen spezifisch und wird weithin verwendet , um die Entwicklung der frühen menschlichen Plazenta zu studieren , weil sie den Zugang zu frühen menschlichen Embryonen nicht erfordert 9, 16. Kürzlich wurde entdeckt, daß die Zugabe der Inhibitoren A83-01 (A) und PD173074 (P), die die SMAD2 / 3 und MEK1 / 2 Signalwege blockieren, erhöht die Effizienz der Differenzierung in HPSC Trophektoderm artigen Vorläufern, hauptsächlich SYNs und EVTs, ohne die umfangreiche Erzeugung von Mesoderm, Endoderm oder Ektodermzellen 9, 17 in vitro Modellsystem 9, 11. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die in vitro Differenzierung von hPSCs in menschliche Trophoblasten - Vorläufern unter Verwendung von BMP4 / A / P Kulturmedium. Diese Bedingungen erzeugen reichlich Anzahlen von Zellen für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich RNA-Sequenzierung, Genzerstörung verwendet siRNAs, Pathogen-Infektionen und genetischen Modifikation unter Verwendung von Lipofektion-vermittelte Transfektion.
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Protocol
HINWEIS: Für die Differenzierung von hES entweder oder hiPSCs in trophoblast Vorläufern, hPSCs auf embryonale Fibroblasten Maus gezüchtet (MEF) werden nicht umgestellt Zubringer freien Bedingungen für zwei Passagen vor Differenzierung Initiierung mit BMP-4 / A / P. Dieses Verfahren beseitigt die MEF Kontamination von differenzierten Zellen. Hier stellen wir ein Protokoll für HES-Differenzierung, und das gleiche Protokoll kann zu hiPSCs angewendet werden.
1. Kultur und Gewinnung von hES-Zellen auf Bestrahlte embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) (Vorbereitung)
- Gamma-Bestrahlung von MEFs
- Machen 500 ml Medium zur Kultivierung der MEFs: DMEM mit 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1x Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep) und 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA).
- ein Fläschchen mit primären MEFs auftauen und MEF Medium verwenden für die Kultivierung von Zellen. Erweitern Sie die primären MEFs auf 30 Platten mit MEF Kulturmedium.
HINWEIS: Sauerstoffkonzentrationen für diesen Schritt nicht kritisch sind, soentweder physiologische (4%) oder Umgebungs (20%) Bedingungen innerhalb des Inkubators verwendet werden. - Ernten Sie die MEFS. Verwenden 0,25% Trypsin die MEFs von den Platten zu entfernen und die Zellen in ein konisches Röhrchen übertragen. Legen Sie die MEFs in einem Bestrahlungsinstrument und setzen die Zellen zu 3500 Graustufen.
HINWEIS: Die Zeit auf der Aktivität der Quelle innerhalb der Bestrahlungseinheit abhängen. - Resuspendieren der bestrahlten MEFs mit MEF Kulturmedium und zählen die Anzahl der Zellen, die eine Zählkammer.
- Pellet die MEF unter Verwendung einer Zentrifuge und 50% MEF Kulturmedium hinzufügen und 50% Zellgefriermedium (80% FBS und 20% MEF Kulturmedium). Aliquot 1 x 10 6 Zellen pro Fläschchen.
- Legen Sie die bestrahlten MEF Fläschchen in einem -80 ° C Gefrierschrank über Nacht, und übertragen sie dann in flüssigen Stickstoff für die Langzeitlagerung.
- Auftauen gefrorenen MEFs und hESCs für Kultur
- Machen Sie 500 ml hES-Medium: DMEM / F-12 mit 20% Serum Replacement, 0,1 mM NEAA, 2 mM L-Glutamin, 10 ng / ml bFGF, 0,1 mM ß-Mercaptoethanol und 1x Pen / Strep.
- ein Fläschchen von MEFs 1 Tag auftauen, bevor Sie die hESCs Auftauen. Mantel eine Platte mit 6 Vertiefungen mit 0,1% Gelatine, unter Verwendung von 1 ml für jede Vertiefung. mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und anschließend die Gelatine zu entfernen.
- Entfernen Sie ein Fläschchen mit MEF aus Lagerung in flüssigem Stickstoff und tauchen Sie die Fläschchen in einem 37 ° C Wasserbad. Sehen Sie sich das Fläschchen mit Unterbrechungen, bis nur noch kleine Eiskristalle bleiben. Schnell wird der Inhalt des Fläschchens zu 9 ml MEF Medium in einem 15 ml konischen Röhrchen.
- Pelletieren Sie die Zellen bei 200 · g für 5 min zentrifugiert. Den Überstand aspirieren und resuspendieren in MEF Medium, welches das Zellpellet. Aliquot der MEF gleichmäßig auf eine 6-Well-Platte. Legen Sie die Platte in eine 37 ° C mit wenig Sauerstoff (4%) Inkubator über Nacht.
- Routine Kultur von hES auf MEFs
- Entfernen eines hESC Fläschchen aus flüssigem Stickstoff und schnell das Fläschchen tauen unter Verwendung eines 37 ° C Wasserbad. Pipette vorsichtig die hES in einen 15 ml konischen Röhrchen 9 ml hES-Medium mit und Spin bei 200 xg für 5 min nach unten. Entfernen Sie das Medium und Resuspendieren der Zellen mit 1 ml hES-Medium.
- Saugen Sie das MEF Medium aus der in Schritt hergestellten Platte 1.2.4 und 1 ml hES-Medium. In Rock-Inhibitor Y-27632 (10 & mgr; M) an die hESC Medium. Übertragen Sie die hESCs auf MEFs.
- Legen Sie die Zellen in eine 37 ° C mit wenig Sauerstoff (4%) Inkubator über Nacht. Ersetzen Sie die hESC Medium täglich. Abkratzen differenzierten Zellen mit einer Pasteurpipette unter einem aufrechten Mikroskop mit 4x sichtbar gemacht.
- Passage die hESCs alle 4-6 Tage, abhängig von der Zelle Konfluenz und der Größe der HES Kolonien. Bereiten Sie eine Platte von MEFs am Tag vor Passagierung. Wenn die Zellen bereit Passage sind, entfernen Sie die hESC Medium und waschen Sie die Vertiefung mit 1 ml PBS.
- 1 mg / ml Kollagenase (vorgewärmt auf 37 ° C), bei 37 ° C für 5 Minuten, und entfernen Sie die Kollagenase. WAsche, die Zellen mit PBS, 1 ml hES-Medium pro Vertiefung, und kratzen Sie manuell die Zellen in kleine Klumpen die Spitze einer 5 ml Pipette. Übertragen Sie die suspendierten Zellklumpen in eine neue MEF-beschichtete Vertiefung (en).
2. Übergang von hES von MEFs auf Feeder freien Bedingungen auf Extrazellulärmatrix beschichteten Platten
- Bereiten Sie MEF - konditioniertem Medium (CM)
- Platte, die die bestrahlten MEFs in einem T75-Kolben bei 90-100% Konfluenz; es ist wichtig, dass die MEFs dicht überzogen werden. Beachten Sie die Zellen mit einem Mikroskop, um festzustellen, ob sie mit dem Boden des Kolbens befestigt sind (MEFs befestigen etwa 6 Stunden nach der Plattierung oder am nächsten Tag).
HINWEIS: Unattached Zellen in dem Medium schwimmen, wenn mit einem Mikroskop beobachtet. Am nächsten Tag, entfernen MEF Medium und 25 ml hESC Medium ohne B-FGF. - Sammeln Sie das konditionierte Medium nach 24 Stunden Inkubation. Ersetzen mit frischem Medium täglich für maximal 12 Tage. Filtern des gesammelten CM unter Verwendung eines 0,22 um-Filter. Vor der Verwendung frischer B-FGF zum CM hinzuzufügen.
HINWEIS: CM kann für bis zu 1 Jahr bei -80 ° C aufbewahrt und eingefroren werden. Alternativ speichern Sie die CM bei 4 ° C für 2 Wochen.
- Platte, die die bestrahlten MEFs in einem T75-Kolben bei 90-100% Konfluenz; es ist wichtig, dass die MEFs dicht überzogen werden. Beachten Sie die Zellen mit einem Mikroskop, um festzustellen, ob sie mit dem Boden des Kolbens befestigt sind (MEFs befestigen etwa 6 Stunden nach der Plattierung oder am nächsten Tag).
- Der Übergang der hES von Kultur auf den MEFs auf Feeder-freie extrazelluläre Matrix beschichteten Platten.
- Herstellung der extrazellulären Matrix für die Beschichtung von Gewebekulturplatten
- Tauen Sie eine aliquote Menge von extrazellulären Matrix auf Eis (ca. 3-4 h). Mit eiskalter Tipps, ein kaltes, 50 ml konischen Röhrchen und DMEM / F12-Medium, Transfer 2 mg der extrazellulären Matrix in 24 ml eiskaltem DMEM / F-12 (hängt die Verdünnung auf die extrazelluläre Matrix Konzentration vom Lieferanten ).
- Unmittelbar übertragen die 50 ml konischen Röhrchen auf Eis und lagern bei 4 ° C. Für die Beschichtung von Gewebekulturplatten, fügen Sie die entsprechende Menge an verdünnten extrazellulären Matrix auf die gut (zB 1 ml pro Vertiefung in einer 6-Well - Platte). Swirl zur Beschichtung der Platte und Inkubation bei Raumtemperatur für mindestens 1 Stunde.
- Passage hESCs von den MEFs (wie in Schritt 1.3) unter Verwendung von CM-FGF enthält, B (10 ng / ml).
- Aspirieren die extrazelluläre Matrix aus der neuen Platte zu entfernen und fügen Sie CM B-FGF enthält. Übertragen Sie die geschabt Zellklumpen aus dem MEF Platte mit einer Pipette und Aliquotierung es in die extrazelluläre Matrix-beschichtete Platte. Inkubieren in der 37 ° C mit niedrigem Sauerstoff Inkubator über Nacht.
- Ersetzen Sie das CM mit B-FGF Medium täglich; die Menge des Mediums auf der Größe des Kulturflasche ab. Verwenden Sie 2 ml Medium für eine 6-well gut. Abkratzen differenzierten Zellen mit einer Pasteur-Pipette.
- Passage hESCs alle 6-7 Tage, wenn Kolonien hell sind, wenn sie unter dem Mikroskop betrachtet.
HINWEIS: hESC Kolonien auf der extrazellulären Matrix beschichteten Platten gewachsen wachsen größer als MEF-kultivierten Zellen. - Wenn der Feeder-freien Zellen der Passage fertig sind, entfernen Sie das Medium, waschen von adding 1 ml PBS mit einer Pipette, absaugen mit der PBS zu entfernen, mit 0,5 mg / ml Dispase (vorgewärmt auf 37 ° C) mit einer Pipette, und 5 min bei 37 ° C inkubieren.
- Waschen der Zellen mit PBS durch Zugabe von 2 ml PBS pro Vertiefung und Aspirieren danach. 1 ml CM pro Vertiefung und kratzen manuell die Zellen in kleine Klumpen die Spitze einer 5 ml Pipette.
- Platte um die suspendierten Zellklumpen in neue extrazelluläre Matrix beschichteten Platten; Die Zellen sollten nach 24 Stunden einzuhalten.
- Herstellung der extrazellulären Matrix für die Beschichtung von Gewebekulturplatten
3. Differenzierung von hES Mit BMP4 / A / P
- Bereiten Sie das Differenzierungsmedium. Verwenden CM (fehlende B-FGF) und fügen Sie (frisch) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 & mgr; M) und PD173074 (0,1 uM). Fügen Sie diese Inhibitoren an das CM vor dem Gebrauch.
- Verwenden Feeder freie hESCs wächst auf der extrazellulären Matrix beschichteten Platten für 1 Passage, kultiviert innerhalb einem Inkubator bei 4% Sauerstoff eingestellt. Nach dem ersten Durchgang auf der extrazellulären Matrix beschichteten Platten,lassen sich die Zellen für 24 Stunden befestigen. Am nächsten Tag initiieren Differenzierung. Entfernen Sie die CM (mit B-FGF) und ersetzen Sie es mit CM enthält, BMP-4 / A / P (2 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte). Weiter Kultivierung der Zellen unter Verwendung von 4% Sauerstoffgehalt.
- Ersetzen Sie das CM enthält, BMP-4 / A / P (2 ml / Vertiefung für eine 6-Well-Platte) alle 2 Tage. Absaugen das alte Medium zu entfernen und neue CM mit einer Pipette hinzu. Am zweiten Tag nach BMP-4 und Entfernen von B-FGF (als Differenzierung Tag 2) Zugabe wird die Morphologie der Zellen zu ändern, erscheinen größer, wenn mit einem Mikroskop beobachtet.
HINWEIS: undifferenzierte Zellen, die helle runde Kanten aufweisen, die nicht vorhanden sein wird. - Sammeln Zellen zu gewünschten Zeitpunkten. Differenzierte Zellen stoppt nach etwa 2 Wochen zu teilen. Transfizieren Zellen während dieser Zeit (siehe nächster Abschnitt).
4. Transfektion von Trophoblastzellen mit siRNAs oder Plasmid-DNA
- Bereiten Sie trophoblastic Zellen für die Transfektion
- Kultur hESCs für zwei Durchgänge auf der extrazellulären Matrix, nachdem sie von den MEFs übertragen (siehe Schritt 2.2). Verwenden Sie hES-Medium, das B-FGF.
- Teilen Sie die hESCs auf eine neue extrazelluläre Matrixplatte einen Tag vor der Differenzierung. Hohe zelluläre Konfluenz ist wichtig, aufgeteilt, so dass die Zellen 1: 1 auf eine neue Platte / Vertiefung, die mindestens 50% Konfluenz am nächsten Tag gewährleistet. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in der sauerstoffarmen Inkubator.
HINWEIS: hESCs müssen nicht bei diesem Schritt gezählt werden. - Am nächsten Tag, ersetzen Sie das Medium mit dem Differenzierungsmedium (CM enthält, BMP-4 / A / P und ohne B-FGF, unter Verwendung von 2 ml / Vertiefung für eine 6-Well-Platte). Entfernen Sie das alte Medium durch Absaugen und übertragen das neue Medium (2 ml) mit einer Pipette. Platzieren Sie die Zellen in einer sauerstoffarmen Inkubator (4% Sauerstoff) über Nacht.
- Differenzieren der Zellen, bis die gewünschte ZeitPunkt (zwischen den Tagen 1 und 14). Am Tag vor der Transfektion trypsinize die Zellen 0,05% Trypsin für 5 min mit. Platte an die gewünschte Konfluenz (je nach Transfektionsreagenz protocol) auf einen mit Gelatine beschichteten Platte (mit 0,1% Gelatine auf eine Gewebekulturplatte für 20 min und aspirieren zu entfernen). In CM enthält, BMP-4 / A / P (fehlende B-FGF) und über Nacht inkubiert.
- Am nächsten Tag, fügen Sie frische Differenzierungsmedium zu den Zellen. Transfektion von siRNAs eine siRNA Transfektionsreagenz verwenden. Für Plasmid-DNA, verwenden Sie ein geeignetes Lipofectamin Reagenz.
- Folgen Sie dem Produkt-Protokoll wie für jede Transfektionsreagenz beschrieben. Übertragen Sie die siRNA-Lipofectamin-Komplexe in jede Vertiefung / Platte von Zellen, vorsichtig mischen und Kultur die Zellen über Nacht in einer sauerstoffarmen Inkubator.
HINWEIS: Einige Transfektionsreagentien durch Antibiotika gehemmt werden, die CM erfordern Pen / Strep fehlt. - Am nächsten Tag, ersetzen mit frischen Differenzierung Medien.
- Ernten Sie die Zellen auf den Wunschd Zeitpunkten (zB 24 h, 48 h und 72 h) , um die Genin Effizienz mittels quantitativer RT-PCR zu überprüfen. Zum Ernten von Zellen verwenden 0,05% Trypsin, Zugabe von 1 ml pro Vertiefung und Inkubation für 5 min bei 37 ° C. 5 ml MEF Medium pro Vertiefung um das Trypsin zu neutralisieren. Spin down die Zellen bei 200 xg für 5 min und verwenden Sie das Zellpellet zur RNA-Isolierung.
5. Pathogen-Infektion von Trophoblastzellen: Sendai-Virus-Infektion
- Bereiten Sie hESCs zur Differenzierung
- Kultur hESCs für zwei Durchgänge auf der extrazellulären Matrix nach der Übertragung von der MEF (siehe Schritt 2.2). Verwenden Sie hES-Medium, das B-FGF.
- Teilen Sie die hESCs auf eine neue extrazelluläre Matrixplatte einen Tag vor der Differenzierung. Hohe zelluläre Konfluenz ist wichtig, so geteilte Zellen 1: 1 auf eine neue Platte / Vertiefung, die mindestens 50% Konfluenz am nächsten Tag gewährleistet. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einer sauerstoffarmen Inkubator (4% Sauerstoff). <br /> Hinweis: hESCs müssen nicht bei diesem Schritt gezählt werden.
- Am nächsten Tag, ersetzen Sie das Medium mit dem Differenzierungsmedium (CM enthält, BMP-4 / A / P und ohne B-FGF) und Kultur über Nacht in einer sauerstoffarmen Inkubator (4% Sauerstoff).
- Sendai Virus-Infektion von Trophoblastzellen
- Einen Tag vor der Differenzierung Tag gewünscht, trypsinize die differenzierenden Zellen (auf einzelne Zellen) unter Verwendung von 0,05% Trypsin für 5 min und übertragen sie auf eine mit Gelatine beschichtete Platte. In Differenzierungsmedium und Inkubation über Nacht in einer sauerstoffarmen Inkubator.
- Am nächsten Tag hinzuzufügen Medium für Infektion (das auf dem Virus variieren je). Verwenden CM fehlt Pen / Strep enthält, BMP-4 / A / P, unter Verwendung von 0,5 ml für eine Vertiefung einer 6-Well-Platte. In Sendai-Virus für MOI 1. Inkubation für 8 h in einer sauerstoffarmen Inkubator =.
- Wenn zusätzliche Zeit-Punkte notwendig sind, entfernen Sie das Virus enthaltenden Mediums nach 4 h und ersetzen Sie es mit BMP-4 / A / P CM. Sammeln Zellenfür die RNA-Isolierung mit einem Zellschaber.
- Bestimmen Sie die Effizienz der viralen Infektion , indem qRT-PCR für Gene , die in der viralen Reaktion beteiligt 18.
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Representative Results
Überblick über die in vitro Differenzierung von hPSCs
Diese in vitro Differenzierung Protokoll beginnt mit undifferenzierten hESCs auf MEFs gezüchtet , das umge sind zufuhrfreien Bedingungen für einen Durchgang (1A). Während wir die Differenzierung von hES in diesem Protokoll beschrieben, haben wir dieses Protokoll erfolgreich hiPSCs in trophoblastic Zellen differenzieren. Der Übergang zu extrazelluläre Matrix entfernt die Mehrzahl der bestrahlten MEFs, die für die Analysen, die unerwünscht sind reine Populationen menschlicher Trophoblastzellen erfordern. Undifferenzierte hPSCs werden auf der extrazellulären Matrix und kultiviert angebaut mit CM enthält B-FGF, bis die Kolonien bereit für Passagierung (ca. eine Woche) sind. Dies hält den pluripotenten Zustand vor der Induktion BMP4 / A / P-vermittelte Differenzierung. Die Kolonien werden gestört zu Klumpen von ~ 50 bis 100 ZellenVerwendung Dispase und ein zweites Mal auf einer extrazellulären Matrix beschichtet Platte passagiert. Am Tag nach Passagierung sind die anhaftenden Zellen bereit, Differenzierung zu induzieren, und das Medium geschaltet ist BMP4 / A / P fehlt, B-FGF enthalten. Die differenzierten Zellen proliferieren für etwa 2 Wochen, während welcher Zeit die Zellen können für die RNA-Isolierung verwendet oder für Transfektionsexperimente gesammelt werden. Morphologische Veränderungen erscheinen 1-2 Tage nach der Differenzierung wurde eingeleitet und die Ergebnisse von einem repräsentativen Experiment sind in Abbildung 1B gezeigt. Beachten Sie, dass die Zellen auf die Differenzierung 1-2 Tage sind größer als die Zellen von Tag 0 (1B). Die differenzierte Zellkolonie wächst schnell, und diese Änderung ist täglich spürbar. Als Differenzierung Erlös teilen sich die Zellen und erweitern vom Zentrum der Kolonie aus, in einer Richtung nach außen wachsen (Tage 3-5; 1B). Der äußere Teil der Kolonie enthält größeren Zellen im Vergleich zu ter Zellen in der Mitte der Kolonie. Die differenzierenden Zellen werden dunkler und flacher als pluripotente Stammzellen kultiviert auf der extrazellulären Matrix; die Veränderungen in der Zell Helligkeit sind deutlicher, wenn die Zellen mit einem aufrechten Mikroskop für Routinezellkultur verwendet sehen. Die einzelnen Kolonien verschmelzen durch Differentiation Tag 5 (1B), mit Zellen , die auf der jeweils anderen wachsen. Nach der Differenzierung Tag 4-5, sind die Zellen enthalten , mehrere Kerne vorhanden (nicht gezeigt) (1B).
BMP4 / A / P induziert die Differenzierung und Expression von Trophoblast Markers
Wir untersuchten die Genexpression ändert sich während der ersten drei Tage der BMP4 / A / P Differenzierung mittels quantitativer RT-PCR (qRT-PCR). RNA wurde bei Differenzierungs Tagen 1, isoliert 2 und 3 und umgewandelt in cDNA. Das Verschwinden von pluripotenten Stammzellen können beide B bewertet werdeny Morphologie, visuell mit einem Mikroskop, und durch qRT-PCR, unter Verwendung von Primern für Pluripotenz-Gene. Die relativen Expressionsniveaus von NANOG, einem Marker von pluripotenten Stammzellen, vermindert um ~ 75% nach einem Tag der Differenzierung , wenn die Zellen mit BMP - 4 kultiviert werden und Ebenen werden durch ~ 90% in Gegenwart von BMP4 / A / P reduziert ( Abbildung 2). Durch Differentiation Tag 2 sind die Ebenen der NANOG sehr niedrig für Zellen, die in BMP4 allein oder in BMP4 / A / P im Vergleich zu denen in hES CM - Medium (enthaltend B-FGF). Dies ist ein erwartetes Ergebnis, weil wir undifferenzierten Zellen beobachten nicht nach zwei Tagen der Differenzierung (Abbildung 1B), die Größe kleiner und heller in sind im Vergleich zu differenzierten Zellen. KRT7 und CDX2: Die Effizienz der BMP - 4-vermittelte Differenzierung zu trophoblastic Zellen können direkt durch qRT-PCR - Primer spezifisch für zwei trophoblast Marker beurteilt werden. Beide Gene werden nicht in den menschlichen pluripotenten Stammzellen exprimiertZellen und deren Expression erhöht sich nach 2-3 Tagen von BMP - 4 - Behandlung (Abbildung 2). Mit den hier beschriebenen Bedingungen, erhöhen KRT7 Transkriptspiegel auf Differenzierung Tag 1 in BMP - 4 / A / P - Medium und bleiben konstant für die ersten 3 Tage der Differenzierung (Abbildung 2). KRT7 Ausdruck , wenn BMP4 allein verwendet , hat einen verzögerten Anstieg von Tag 2, in Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen , dass Activin / Nodal - Inhibitoren 9 die Differenzierungsrate von hES - Zellen zu erhöhen. Ein anderer Weg , um die Effizienz der Verwendung dieser Inhibitoren zu bewerten ist , die steady-state Fülle von CDX2 und KRT7 Transkripte in Zellen mit BMP4 allein behandelt zu bestimmen. CDX2 Ebenen sind ähnlich für die Differenzierung Tage 1-3 , wenn entweder BMP - 4 allein oder BMP - 4 zusammen mit Activin / Nodal - Inhibitoren. Jedoch sind KRT7 Transkripte reichlicher nach einem Tag der Differenzierung in Gegenwart dieser Inhibitoren, die eine schlägtschnelle Differenzierung (Abbildung 2). CDX2 Ausdruck Spitzen typischerweise bei Differenzierung Tag 2 für beide Bedingungen und nimmt nach Tag 3 (Abbildung 2). Undifferenzierte hESCs nicht exprimieren entweder KRT7 oder CDX2 (Abbildung 2), wie erwartet. Abschließend BMP4 / A / P Bedingungen schnell hESCs differenzieren und Plazentamarkerexpression kann bereits Differenzierungs Tag 3 festgestellt werden.
Mit Transfektionen von siRNAs und Plasmid - DNA und virale Infektionen In - vitro - abgeleitetes Trophoblastzellen
In vitro gewonnenen humanen kann trophoblastische Zellen mit siRNAs transfiziert werden , um die Genexpression entweder kodierenden oder nicht - kodierenden RNAs zu stören. Wir initiiert die Differenzierung von hES BMP4 / A / P, durchgeführt zwei Runden von siRNA Transfektionen (unter Verwendung von 75 pmol von siRNAs) auf Differenzierung den Tagen 1 und 2,und die Zellen für die RNA-Isolierung gesammelt. Quantitative RT-PCR ist eine effektive Methode, um die Zuschlagseffizienz für entweder Codierung zu bestimmen oder nicht-kodierenden Genen. Verwendung von zwei siRNAs komplementär zu unterschiedlichen Regionen des langen, nicht - kodierenden RNA lncRHOXF1 19, erhalten wir 80% des Zuschlags lncRHOXF1 Transkripte (3A). Eine 80% ige Reduktion der hnRNP U - Transkripte nach zwei aufeinanderfolgenden Transfektionen nächstes transfizierten wir eine siRNA (25 pmol) für die Protein-kodierenden Gen hnRNP U, auch auf die Differenzierung den Tagen 1 und 2. Wir beobachtet. In - vitro - trophoblast Vorläuferzellen differenziert können auch angeborene Immunreaktionen verwendet werden , zu untersuchen. Wir führten Infektionen Differenzierungs Tag 2 Zellen unter Verwendung von Sendai-Virus bei einer MOI von 1 und gesammelt, die Zellen nach 8 h Inkubation viral. Verwendung qRT-PCR, detektiert wir reichlich virales Protein - Transkripte (SeV-NP) in infizierten Zellen (3B), was auf eine aktive virale ProAusbreitungs- in Trophoblastzellen. Wichtig ist, dass infizierte Zellen (mit MOI = 1) nicht in Erscheinung ändern und lebensfähig sind (Daten nicht gezeigt). In vitro abgeleitet trophoblastische Zellen können auch mit Plasmid - DNA transfiziert werden. Wir führten Transfektionen ein GFP - Plasmid verwendet und führte dieses Konstrukts in BMP4 / A / P-behandelten Zellen auf die Differenzierung Tag 1 und Tag 3 und für GFP am folgenden Tag (Abbildung 4) abgebildet wird . Wir erhielten typischerweise 30-50% Transfektionseffizienz bei 24 Stunden nach der Transfektion. Abschließend in vitro abgeleitet trophoblastische Zellen können für Verstärkungs- und loss-of-function - Experimente verwendet werden.
Abbildung 1: In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen zu früh trophoblastic Zellen unter Verwendung von BMP - 4 / A / P. (A) Schematische Darstellung der BMP4 Differenzierung von hPSCs zu trophoblastic Zellen unter Verwendung von BMP-4 / A / P. (B) Repräsentative Hellfeld - Bilder von HUES9 Zellen während d0, d2 und d6 von BMP - 4 / A / P - Differenzierung. Maßstabsbalken = 50 & mgr; M. Die Pfeilspitzen bezeichnen Single-Cell-hES, die nicht unterschieden werden. Die Pfeile markieren morphologischen Merkmale während der Differenzierung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: BMP - 4 / A / P Differenzierung downregulates schnell die Pluripotenz Marker NANOG und upregulates trophoblast Gene CDX2 und KRT7. qRT-PCR - Analyse für NANOG (Pluripotenz Marker), CDX2 und KRT7 (trophoblast Marker). Die Werte sind Mittelwerte aus Dreifach Maßnahmen. //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Gene Störungen und Virusinfektion in vitro differenzierten humanen Trophoblasten - Zellen verwendet wird . (A) qRT-PCR - Analyse von hES - Zellen (HUES9) differenziert und dann mit siRNAs spezifisch auf die lange transfizierten, nicht - kodierenden RNA lncRHOXF1 (links) oder die Protein-kodierenden Gen hnRNP U (rechts) für zwei aufeinander folgenden Tagen. Die Zuschlagseffizienz (KD) beträgt typischerweise 70-80%, und die Ergebnisse von einem Transfektionsexperiment gezeigt. (B) qRT-PCR - Analyse des viralen Sendai Protein - Transkript von Trophoblastzellen Differenzierung Tag 2 infiziert mit Sendai - Virus (MOI = 1) für 8 Stunden. Die Fehlerbalken zeigen die SEM."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig3large.jpg" target = "_ blank"> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Einführung von Plasmid - DNA in in vitro differenzierten humanen Trophoblastzellen. Die Transfektion von GFP Plasmid-DNA in Differenzierung Tag 1 und Tag 3 Trophektoderm Vorläuferzellen, visualisiert am folgenden Tag. Maßstabsbalken = 50 & mgr; M. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Wir präsentierten die grundlegenden Schritte zur hESCs in trophoblast Vorläufern unterscheiden. Dieses Protokoll wurde kürzlich optimiert, um schnell hESCs mit der Zugabe von Activin / Nodal Signalisierungs Inhibitoren unterscheiden, die Differenzierung zu trophoblastische Zellen zu erhöhen und die Erzeugung von Mesoderm Progenitoren vermeiden, die mit BMP4 Behandlung werden in der Regel allein beobachtet. Das BMP-4-Modell-System ermöglicht die Prüfung der frühesten Stadien der menschlichen Trophoblasten Linie Spezifikation und Expansion. Verwendung Chorionkarzinom-Zelllinien und extravillösen Trophoblasten-Zelllinien in hinaus ist dieses BMP4 Modellsystem auch nützlich für die Differenzierung von Trophoblasten-Zellen zu bestimmten Teillinien zu untersuchen, was nicht möglich ist. In vitro abgeleitet trophoblastische Zellen können auch für loss-of-function - Experimente verwendet werden , unter Verwendung von siRNAs 19. Darüber hinaus können hESCs oder hiPSCs genetisch für die induzierbare Expression von transgen modifiziert werden es 19 oder zum Einsetzen von Reportergenen an endogenen Loci 20, und diese Zellen können in trophoblastische Zellen differenziert werden unter Verwendung der hier beschriebenen Bedingungen.
Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls
Es ist zwingend notwendig, B-FGF (FGF2) von der CM-Differenzierungsmedium zu erhalten trophoblastic Vorläuferzellen aus hES-Zellen zu unterlassen. Die Anwesenheit von B-FGF zusammen mit BMP4 im Kulturmedium erhöht die Expression von Mesoderm und Endoderm Progenitoren 16. Die Aufnahme von B-FGF in mittlerer Differenzierung trophoblast wird angenommen , zu erklären , warum eine aktuelle Studie fand heraus , dass BMP4-vermittelte Differenzierung Mesoderm und Endoderm 21 - Zellen anstelle von Trophoblasten erzeugt. Es ist gut etabliert , dass B-FGF zusammen mit Activin A und BMP4 Endoderm und Mesoderm Differenzierung in einer dosisabhängigen Art und Weise 22 fördert,s = "xref"> 23. Bei der Maus sind die Entwicklung des Epiblasten, Trophektoderm und primitive Endoderm Abstammungslinien abhängig von FGF Signalwege 24. In Differenzierung ist hESCs, B-FGF-induzierte Signalisierung für Mesodermbildung erforderlich , wenn BMP4 Differenzierung zu induzieren , verwendet wird , 21, 25. Im Gegensatz dazu ist 26 die Inhibierung von sowohl FGF und die Activin / Nodal Signalwegen zusammen mit BMP4, begünstigt SYN Bildung in hES-abgeleitete Trophoblasten Progenitoren und verhindert die Bildung von Mesoderm und Endoderm primitiven Vorläufern.
Einschränkungen der Technik
Das typischste Problem mit diesem Protokoll von HPSC Differenzierung zu trophoblast Vorläufern ist im Zusammenhang mit mit einer überwiegend undifferenzierten Population von hES oder hiPSCs auf MEFs starten. Weil hPSCs akkumulieren differenzierten Zellen an den beiden inneren und äußeren Rändernder Kolonien, ist es wichtig, die Menge der Differenzierung täglich zu überwachen und differenzierten Kolonien (oder Teile von Kolonien) zu entfernen. Die Gegenwart von differenzierten Zellen können den Differenzierungsprozess komplizieren, insbesondere, wenn die Zellen an die extrazelluläre Matrix übertragen werden. Die differenzierten Zellen werden schnell auf der extrazellulären Matrix in der Gegenwart von CM proliferieren, und diese Zellen übernimmt schnell die Kultur und die hPSCs out-konkurrieren. Daher ist es ideal mit gesunden, undifferenzierte Kolonien hPSCs auf MEFs gewachsen zu beginnen, bevor die Zellen an die extrazelluläre Matrix zu übertragen.
Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / Alternativmethoden
Wenn diese Unterscheidung Protokoll verwenden, sind die resultierenden Trophoblasten Progenitoren ein heterogenes Gemisch von Zelltypen. Trophoblaste aus villous Cytotrophoblasten besteht, Synzytiotrophoblasten (SYNs) und extravillösen Cytotrophoblasten(EVT) 27. Villöse Cytotrophoblasten sind die Vorfahren, die EVTs und SYNs erzeugen. BMP4 differenzierten hPSCs wird eine Mischung aus villous Zytotrophoblasten, SYNs erzeugen und EVTs 9, 15, die durch das Gen oder Protein - Expression von plazentalem spezifischen Marker definiert. Die unterschiedlichen Differenzierungswege kann durch die Sekretion von HLA-G (charakteristisch EVTs) oder humanes Choriongonadotropin (von SYNs) 28, 29 zu unterscheiden. Vor kurzem wurde gezeigt , dass die Hemmung der Activin / Nodal Signalisierungs begünstigt EVT Differenzierung von hES und die Entfernung dieser Inhibierung begünstigt Differenzierung SYN 17. Tatsächlich fand eine frühere Veröffentlichung , dass allein mit BMP4 hESCs zu unterscheiden erzeugt meist SYN Zellen 26. Die Daten unter Verwendung von BMP4 / A / P und konditioniertes Medium (fehlende B-FGF) zeigen, dass esbeide sind EVT und SYN vorhandenen Zellen durch Differenzierung Tag 5. Wenn reine EVT oder SYN - Populationen erwünscht sind, zusätzliche Reinigungsmarker unter Verwendung von Zelloberfläche, wie HLA-G für die Isolierung von EVTs an Kügelchen konjugiert ist möglich 29. Abschließend beschriebene Kulturverfahren hier ist eine effiziente Möglichkeit erhebliche Mengen von Trophoblastzellen aus hPSCs zu erzeugen, die für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden kann. Da dieses Protokoll sowohl SYNs und EVTs erzeugt, ist es ein geeignetes Modellsystem für die frühe menschliche Plazenta zu untersuchen. Diese Zellen können für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, einschließlich Arzneimittelforschung und Gentechnik.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knock Out Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | This is referred to as "serum replacement" in this protocol. |
| NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 10828-028 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-155 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| B-FGF | Millipore | GF-003 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase Type IV | Invitrogen | 17104-019 | |
| Rock inhibitor Y27632 | Calbiochem | 688000 | |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | 6001G | MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated. |
| 0.22 µm syringe filter | Millipore | SLGS033SS | |
| Heracell 150i low oxygen incubator | Heracell/VWR | 89187-192 | Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient. |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-01M | |
| A 83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| PD173074 | R&D Systems | 3044/10 | |
| RNAiMax | Invitrogen | 13778150 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | Trizol is used to isolate total RNA. |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol. |
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