Abstract
Moderkakan är det första organ som utvecklas under embryogenes och krävs för överlevnad det växande embryot. Moderkakan består av diverse trofoblastiska celler som skiljer från de extra embryonala trophectoderm celler i preimplantatorisk blastocyst. Som sådan är vår förståelse av de tidiga differentierings händelserna i human placenta begränsad på grund av etiska och juridiska restriktioner för isolering och manipulering av mänskliga embryogenes. Humana pluripotenta stamceller (hPSCs) är ett robust modellsystem för undersökning av människans utveckling och kan också differentieras in vitro till trofoblastiska celler som uttrycker markörer för de olika trofoblasten celltyper. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för differentiering hPSCs i trofoblastiska celler med användning av benmorfogent protein 4 och hämmare av Aktivin / Nodal signalvägar. Detta protokoll genererar olika trofoblasten celltyper som kan transfekteras med siRNAför att undersöka förlust av funktions fenotyper eller kan infekteras med patogener. Dessutom kan hPSCs genetiskt modifierade och sedan differentieras till trofoblasten stamceller för vinst-of-funktion analyser. Detta in vitro differentiering metod för att generera humana trofoblaster utgående från hPSCs i vinner de etiska och juridiska restriktioner för att arbeta med mänskliga embryon början, och detta system kan användas för en mängd olika tillämpningar, inklusive läkemedelsforskning och stamcellsforskning.
Introduction
Moderkakan krävs för tillväxt och överlevnad av fostret under graviditeten och underlättar utbytet av gaser, näringsämnen, avfallsprodukter och hormoner mellan moderns och fostrets cirkulation. Det första organet bildas under däggdjursembryogenes är moderkakan, som börjar att utveckla 6-7 dagar efter befruktning hos människor och 3,5-4,5 dagar hos möss 1, 2, 3, 4. Trofoblastiska celler är de viktigaste cellerna i moderkakan, och dessa celler representerar en av de tidigaste härstamning differentiering händelserna i däggdjursembryo. De uppstår från de yttre extra embryonala trophectoderm celler i preimplantatorisk blastocyst. Vår kunskap om de tidiga stadierna av placenta utveckling begränsas av etiska och logistiska begränsningar för modellering människans tidiga utveckling.
Under embryonala implantation, trofoblasterinvadera moderns epitel och differentierar till specialiserade progenitorceller 5. Cytotrofoblaster (CTBs) är mononukleära, odifferentierade stamceller som smälter och differentieras till syncytiotrophoblasts (Syns) och extravillous invasiva trofoblaster (EVTs), vilket ankare moderkakan i livmodern. Syns är flerkärniga, terminalt differentierade celler som syntetiserar hormoner som är nödvändiga för att upprätthålla graviditet. De tidiga differentieringshändelser som genererar EVTs och Syns är avgörande för placenta bildning, som försämringar i trofoblastiska celler resulterar i missfall, havandeskapsförgiftning, och intrauterin tillväxthämning 1. De typer av trofoblasten cellinjer mänskliga som har utvecklats innefattar odödlig CTBs och choriocarcinomas, som producerar moderkakan hormoner och visa invasiva egenskaper 6. Primära trofoblastiska celler från humana första trimestern placentor kan isoleras, men cellerna snabbt differentiate och stoppa prolifererande in vitro. Viktigt är transformerade och primära cellinjer har olika genuttrycksprofilerna, vilket tyder på att tumörogena och förevigade trofoblasten cellinjer inte exakt kan representera primär trofoblaster 7. Dessutom är det osannolikt att likna placental trofoblasten stamceller stamceller eftersom de härrör från senare steg först genom tredje trimestern dessa linjer.
Det finns ett behov av en robust in vitro-kultur system för tidigt skede mänskliga trofoblaster för att studera de tidiga händelserna i placenta bildning och funktion. Humana embryonala stamceller (hESCs), som delar egenskaper med den inre cellmassan av preimplantationsembryot, används ofta för att modellera människans tidiga utveckling, inklusive bildandet av den tidiga moderkakan. Både mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) och hESCs kan delas in i trofoblaster in vitro med hjälp av Bone Morphogenic protein 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Denna omvandling av pluripotenta celler till trofoblastiska celler med användning av BMP4 är specifik för humana celler och används ofta för att studera utvecklingen av den tidiga human placenta, eftersom den inte kräver tillgång till tidiga mänskliga embryon 9, 16. Nyligen upptäcktes det att tillsatsen av inhibitorerna A83-01 (A) och PD173074 (P), som blockerar de Smad2 / 3 och MEK1 / 2 signalvägar, ökar effektiviteten i hPSC differentiering till trophectoderm liknande progenitorer, huvudsakligen Syns och EVTs, utan omfattande generationen av mesoderm, endoderm, eller ektoderm celler 9, 17 in vitro-modellsystem 9, 11. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för differentiering in vitro av hPSCs i humana trofoblasten stamceller med hjälp av BMP4 / A / P odlingsmedium. Dessa villkor producerar rikliga mängder celler för en mängd olika tillämpningar, inklusive RNA-sekvensering, gen störningar med hjälp av siRNA, patogena infektioner, och genetisk modifiering med hjälp av lipofektion-medierad transfektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: För differentiering av antingen hESCs eller hiPSCs i trofoblasten stamceller, hPSCs odlas på mus embryonala fibroblaster (MEF) är över till feeder-fria förhållanden för två passager innan behandling differentiering med BMP4 / A / P. Detta förfarande eliminerar MEF kontamination av differentierade celler. Här presenterar vi ett protokoll för hESC differentiering och samma protokoll kan tillämpas på hiPSCs.
1. Kultur och återvinning av hESCs på Bestrålade mus Embryonala fibroblaster (MEF) (Förberedelser)
- Gamma-bestrålning av MEF
- Göra 500 ml medium för odling av MEF: DMEM med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1 x penicillin / streptomycin (Pen / Strep) och 0,1 mM icke-essentiella aminosyror (NEAA).
- Tina en ampull av primära MEF och använda MEF medium för odling av celler. Expandera primära MEFs till 30 plattor med användning av MEF odlingsmedium.
OBS: Syrehalter är inte avgörande för detta steg, såantingen fysiologiska (4%) eller omgivnings (20%) förhållanden inom inkubatorn kan användas. - Skörda MEFS. Använda 0,25% trypsin för att avlägsna de MEFs från plattorna och överföra cellerna till en konisk tub. Placera MEF i en bestrålning instrument och exponera cellerna till 3500 gråskalor.
OBS: Den tid kommer att bero på aktiviteten hos källan inuti bestråenheten. - Resuspendera de bestrålade MEFs med MEF odlingsmedium och räkna antalet celler med användning av en hemocytometer.
- Pellets MEFs med användning av en centrifug och tillsätt 50% MEF odlingsmedium och 50% cellfrysmedium (80% FBS och 20% MEF odlingsmedium). Portion 1 x 10 6 celler per flaska.
- Placera de bestrålade MEF flaskor i en -80 ° C frys över natten, och sedan överföra dem till flytande kväve för långtidslagring.
- Upptining frysta MEF och hESCs för kultur
- Göra 500 ml av hESC-medium: DMEM / F-12 med 20% Serum ersätement, 0,1 mM NEAA, 2 mM L-glutamin, 10 ng / ml bFGF, 0,1 mM p-merkaptoetanol, och 1 x Pen / Strep.
- Tina en injektionsflaska med MEF en dag innan upptining av hESCs. Belägga en 6-brunnsplatta med 0,1% gelatin, med användning av 1 ml för varje brunn. Inkubera under minst 20 minuter vid rumstemperatur, och sedan ta bort gelatinet.
- Ta en flaska med MEF från lagring i flytande kväve och sänk flaskan i ett 37 ° C vattenbad. Titta på flaskan intermittent tills endast små iskristaller kvar. Snabbt överföra innehållet i flaskan till 9 ml MEF-medium i en 15 ml koniska rör.
- Pellets cellerna genom centrifugering vid 200 xg under 5 min. Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i MEF medium. Alikvotera MEF jämnt på en 6-brunnsplatta. Sätta plattan i en 37 ° C med låg syrehalt (4%) inkubator över natten.
- Rutin kultur av hESCs på MEFs
- Ta en hESC flaska från flytande kväve och snabbt tina flaskan med hjälp av en 37 ° C vattenbad. pipett försiktigt hESCs i en 15 ml koniskt rör innehållande 9 ml hESC medium och spinn ner vid 200 xg under 5 minuter. Avlägsna mediet och återsuspendera cellerna med 1 ml hESC medium.
- Aspirera MEF mediet från plattan som framställts i steg 1.2.4 och tillsätt 1 ml hESC medium. Lägga Rock inhibitor Y-27632 (10 pM) till hESC mediet. Överför hESCs på MEFs.
- Placera cellerna i ett 37 ° C med låg syrehalt (4%) inkubator över natten. Byt hESC mediet dagligen. Skrapa av differentierade celler med en Pasteur-pipett, visualiseras i en upprättstående mikroskop vid 4X.
- Passage hESCs varje 4-6 dagar, beroende på cellsammanflytning och storleken på de hESC kolonier. Förbered en platta med MEF dagen före passage. När cellerna är redo att passagen, ta bort hESC mediet och tvätta brunnen med 1 ml PBS.
- Lägg 1 mg / ml kollagenas (förvärmd till 37 ° C), inkubera vid 37 ° C under 5 minuter, och avlägsna kollagenas. Waska cellerna med PBS, tillsätt 1 ml hESC medium per brunn, och manuellt skrapa cellerna i små klumpar med hjälp av spetsen på en 5 ml pipett. Överföra de suspenderade cellklumpar i en ny MEF-belagda brunnen (er).
2. Övergång av hESCs från MEFs till matarfria förhållanden på extracellulär matrix-belagda plattor
- Förbereda MEF Konditionerat medium (CM)
- Plate de bestrålade MEFs i en T75 kolv vid 90-100% konfluens; det är viktigt att de MEFs är tätt pläteras. Observera cellerna med användning av ett mikroskop för att bestämma huruvida de har fäst till botten av kolven (MEFs fäster cirka 6 h efter plätering eller nästa dag).
OBS: Unattached celler flyta i mediet när observerats med hjälp av ett mikroskop. Nästa dag, ta bort MEF medium och tillsätt 25 ml hESC medium som saknar B-FGF. - Samla in det konditionerade mediet efter 24 h av inkubation. Ersätt med färskt medium dagligen under högst 12 dagar. Filtrera samlas CM användning av ett 0,22 pm filter. Före användning, tillsätt färsk B-FGF till CM.
OBS: CM kan frysas vid -80 ° C och lagrades under upp till 1 år. Alternativt förvara CM vid 4 ° C under 2 veckor.
- Plate de bestrålade MEFs i en T75 kolv vid 90-100% konfluens; det är viktigt att de MEFs är tätt pläteras. Observera cellerna med användning av ett mikroskop för att bestämma huruvida de har fäst till botten av kolven (MEFs fäster cirka 6 h efter plätering eller nästa dag).
- Övergång hESCs från kultur på MEF att matarfria extracellulära matrix-belagda plattor.
- Framställning av extracellulär matris för beläggning vävnadsodlingsplattor
- Tina en alikvot av extracellulär matris på is (ca 3-4 h). Med användning av iskalla spetsar, en kall, 50 ml koniskt rör, och DMEM / F12-medium, överförings 2 mg av extracellulär matris i 24 ml iskall DMEM / F-12 (utspädningen beror på den extracellulära matrisen koncentration från leverantören ).
- Omgående överlåta 50 ml koniskt rör till is och lagra den vid 4 ° C. För beläggning vävnadsodlingsplattor, tillsätt lämplig mängd utspätt extracellulär matris till brunnen (t.ex., 1 ml per brunn i en 6-brunnsplatta). Virvla för att belägga plattan och inkubera vid rumstemperatur under minst 1 timme.
- Passage hESCs från MEF (som i steg 1,3) med användning av CM innehållande B-FGF (10 ng / ml).
- Aspirera för att avlägsna den extracellulära matrisen från den nya plattan och tillsätt CM innehåller B-FGF. Överför skrapas cellulära klumpar från MEF plattan med hjälp av en pipett och delprov in den extracellulära matrix belagda plattan. Inkubera i 37 ° C låg syrehalt inkubator över natten.
- Byt CM med B-FGF-medium dagligen; mängden medium beror på storleken av odlingskolven. Använd 2 ml medium för en 6-väl bra. Skrapa av differentierade celler med en Pasteur-pipett.
- Passage hESCs var 6-7 dagar, då kolonier är ljusa när de ses i mikroskop.
OBS: hESC kolonier odlade på extracellulära matrixbelagda plattor växa sig större än MEF-odlade celler. - När matarfria celler är redo att passage, avlägsna mediet, tvätta av adding 1 ml PBS med hjälp av en pipett, aspirera för att ta bort PBS, tillsätt 0,5 mg / ml dispas (förvärmd till 37 ° C) med en pipett, och inkubera vid 37 ° C under 5 minuter.
- Tvätta cellerna med PBS genom att tillsätta 2 ml PBS per brunn och aspire efteråt. Tillsätt 1 ml CM per brunn och manuellt skrapa cellerna i små klumpar med hjälp av spetsen på en 5 ml pipett.
- Plate suspenderade cellklumpar till nya extracellulära matrixbelagda plattor; cellerna bör följa efter 24 timmar.
- Framställning av extracellulär matris för beläggning vävnadsodlingsplattor
3. Differentiering av hESCs Använda BMP4 / A / P
- Förbered differentieringsmedium. Användning CM (som saknar B-FGF) och tillsätt (färska) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 | iM), och PD173074 (0,1 | iM). Lägg till dessa inhibitorer till CM före användning.
- Använda feeder-fria hESCs växer på extracellulära matrisbelagda plattor för en passage, odlade inuti en inkubator inställd på 4% syre. Efter den första passagen till extracellulära matrixbelagda plattor,låta cellerna fästa under 24 timmar. Nästa dag, initiera differentiering. Ta CM (innehållande B-FGF) och ersätta den med CM innehållande BMP4 / A / P (2 ml per brunn i en 6-brunnar). Fortsätter att odla celler med användning av 4% syrenivåer.
- Byt CM innehåller BMP4 / A / P (2 ml / brunn för en 6-brunnar) var 2 dagar. Aspirera för att ta bort det gamla mediet och lägga till nya CM med hjälp av en pipett. På den andra dagen efter att ha lagt BMP4 och ta bort B-FGF (anses differentiering dag 2), kommer cellen morfologi förändras, visas större när observerats med hjälp av ett mikroskop.
NOT: odifferentierade celler, vilka uppvisar ljusa runda kanter, inte kommer att vara närvarande. - Samla celler vid önskade tidpunkter. Differentierade celler kommer att sluta att dividera efter cirka två veckor. Transfektera celler under denna tidsperiod (se nästa avsnitt).
4. Transfektion av trofoblastisk celler med siRNA eller plasmid DNA
- Förbered trofoblastiska celler för transfektion
- Kultur hESCs för två passager på extracellulära matrisen efter att överföra dem från MEF (se steg 2,2). Använda hESC medium innehållande B-FGF.
- Dela upp hESCs på en ny extracellulära matrisplatta en dag före differentiering. Hög cellulär konfluens är viktigt, så dela cellerna 1: 1 på en ny platta / brunn, vilket kommer att säkerställa åtminstone 50% konfluens nästa dag. Inkubera cellerna över natten i låg syrehalt inkubator.
OBS: hESCs behöver inte räknas under detta steg. - Nästa dag, ersätta mediet med differentieringsmedium (CM innehållande BMP4 / A / P och saknar B-FGF, med 2 ml / brunn för en 6-brunnar). Ta bort det gamla mediet genom aspiration och överföra det nya mediet (2 ml) med användning av en pipett. Placera cellerna i en låg-syre inkubator (4% syre) över natten.
- Differentiera cellerna tills den önskade tids-led (mellan dag 1 och 14). Dagen före transfektion, trypsinize cellerna med användning av 0,05% trypsin under 5 min. Plattan dem till önskad konfluens (beroende på transfektionsreagens protokoll) på en gelatin-belagd platta (lägg 0,1% gelatin till en vävnadsodlingsplatta under 20 min och aspirera för att ta bort). Lägg CM innehållande BMP4 / A / P (som saknar B-FGF) och inkubera över natten.
- Nästa dag, tillsätt färskt differentieringsmedium till cellerna. Transfektera siRNA med användning av en siRNA transfektion reagens. För plasmid-DNA, använd en lämplig lipofektamin reagens.
- Följ produktprotokoll som beskrivs för varje transfektion reagens. Överföra de siRNA-lipofectamine-komplexen till varje brunn / platta av celler, blanda försiktigt, och odla cellerna över natten i en låg syrehalt inkubator.
OBS: Vissa transfektionsreagens hämmas av antibiotika, som kräver CM saknar Pen / Strep. - Nästa dag, ersätta med färsk differentiering media.
- Skörda cellerna vid en önskand tidpunkter (t.ex. 24 timmar, 48 timmar och 72 timmar) för att kontrollera genen störningar effektivitet med hjälp av kvantitativ RT-PCR. För skörd av celler, använda 0,05% trypsin, tillsätta 1 ml per brunn och inkubering under 5 minuter vid 37 ° C. Tillsätt 5 ml MEF-medium per brunn för att neutralisera trypsin. Centrifugera ner cellerna vid 200 xg under 5 min och använda cellpelleten för RNA-isolering.
5. patogeninfektion av trofoblastisk Cells: Sendai virusinfektion
- Förbereda hESCs för differentiering
- Kultur hESCs för två passager på extracellulärmatrix efter överföringen från MEF (se steg 2,2). Använda hESC medium innehållande B-FGF.
- Dela upp hESCs på en ny extracellulära matrisplatta en dag före differentiering. Hög cellulär konfluens är viktiga, så delade celler 1: 1 på en ny platta / brunn, vilket kommer att säkerställa åtminstone 50% konfluens nästa dag. Inkubera cellerna över natten i en låg syrehalt inkubator (4% syre). <br /> OBS: hESCs behöver inte räknas under detta steg.
- Nästa dag, ersätta mediet med differentieringsmedium (CM innehållande BMP4 / A / P och saknar B-FGF) och kultur över natten i en låg syrehalt inkubator (4% syre).
- Sendai virusinfektion i trofoblastiska celler
- En dag innan den önskade differentier dag, trypsinize de differentierande cellerna (till enstaka celler) med användning av 0,05% trypsin under 5 min och överföra dem till en gelatinbelagd platta. Lägg differentieringsmedium och inkubera över natten i en låg-syre inkubator.
- Nästa dag, tillsätt medium för infektion (detta kommer att variera beroende på det virus). Användning CM saknar Pen / Strep innehållande BMP4 / A / P, med användning av 0,5 ml för en brunn i en 6-brunnsplatta. Lägg Sendai-virus för MOI = 1. Inkubera under 8 timmar i en låg syrehalt inkubator.
- Om ytterligare tidpunkter är nödvändigt, ta bort viruset innehållande mediet efter 4 timmar och ersätta den med BMP4 / A / P CM. samla upp cellerför RNA-isolering med användning av en cellskrapa.
- Bestämma effektiviteten av virusinfektion genom att utföra QRT-PCR för gener som är involverade i virologiskt svar 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Översikt över In vitro-differentiering av hPSCs
Denna in vitro-differentieringsprotokoll börjar med odifferentierade hESCs odlas på MEFs som övergått i feeder-fria förhållanden för en passage (Figur 1A). Medan vi beskrev differentieringen av hESCs i detta protokoll använde vi detta protokoll för att framgångsrikt differentiera hiPSCs i trofoblastiska celler. Övergången till extracellulär matris avlägsnar huvuddelen av de bestrålade MEFs, vilka är oönskade för analyser som kräver rena populationer av humana trofoblastiska celler. Odifferentierade hPSCs odlas på extracellulär matris och odlades med CM innehållande B-FGF tills kolonierna är redo för passaging (omkring en vecka). Detta upprätthåller pluripotent tillstånd innan inducera BMP4 / A / P-medierad differentiering. Kolonierna störs i klumpar av ~ 50-100 celleranvändning av dispas och passerades en andra gång på en extracellulär matris-belagda plattan. Dagen efter passaging, de vidhäftande cellerna är redo att inducera differentiering, och mediet är påslagen för att innehålla BMP4 / A / P som saknar B-FGF. De differentierade celler prolifererar i ungefär två veckor, under vilken tid cellerna kan samlas in för RNA isolering eller användas för transfektionsexperiment. Morfologiska förändringar visas 1-2 dagar efter differentiering har inletts, och resultaten från ett representativt experiment visas i figur 1B. Märker att cellerna på differentieringsdagar 1-2 är större i storlek än cellerna från dag 0 (Figur 1B). Den differentierade cellkoloni växer snabbt, och denna förändring märks varje dag. Som differentieringsfortskrider, dela upp cellerna och expandera ut från centrum av kolonin, som växer i en riktning utåt (dagar 3-5; Figur 1B). Den yttre delen av kolonin innehåller större celler jämfört med than celler i centrum av kolonin. De differentierande cellerna blir mörkare och plattare än pluripotenta stamceller odlade på extracellulär matris; förändringarna i cell ljusstyrka är tydligare när du tittar på cellerna med en upprätt mikroskop användas för vanliga cellkultur. De individuella kolonierna samman tillsammans genom differentiering dag 5 (figur 1 B), med celler som växer på toppen av varandra. Efter differentiering dag 4-5, celler innehållande multipla kärnor är närvarande (ej visat) (Figur 1B).
BMP4 / A / P inducerar differentiering och uttryck av trofoblasten markörer
Vi undersökte genuttryck förändringar under de första tre dagarna av BMP4 / A / P differentiering med hjälp av kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR). RNA isolerades vid differentierings dag 1, 2, och 3 och omvandlas till cDNA. Försvinnandet av pluripotenta stamceller kan bedömas både by morfologi, visuellt med hjälp av ett mikroskop, och av QRT-PCR med användning av primers för pluripotens gener. De relativa uttrycksnivåerna av NANOG, en markör för pluripotenta stamceller, reduceras med ~ 75% efter en dag av differentiering när celler odlas med BMP4, och nivåerna minskar med ~ 90% i närvaro av BMP4 / A / P ( Figur 2). Genom differentiering dag 2, nivåerna av NANOG är mycket låga för celler odlade i enbart eller i BMP4 / A / P BMP4 jämfört med dem i hESC CM-medium (innehållande B-FGF). Detta är ett förväntat resultat, eftersom vi inte observera odifferentierade celler efter två dagar av differentiering (Figur 1B), som är ljusare och mindre i storlek jämfört med differentierade celler. Effektiviteten för BMP4-medierad differentiering till trofoblastiska celler kan bedömas direkt av QRT-PCR med användning av primrar som är specifika för två trofoblasten markörer: KRT7 och CDX2. Båda dessa gener inte uttrycks i human pluripotent stemceller och deras expressions ökar efter 2-3 dagars BMP4 behandling (Figur 2). Användning av de betingelser som beskrivs här, KRT7 transkriptnivåer ökar på differentiering dag 1 i BMP4 / A / P-medium och förblir konstant under de 3 första dagarna av differentiering (Figur 2). KRT7 uttryck när ensam användning av BMP4 har en fördröjd ökning av dag 2, i överensstämmelse med tidigare observationer att Aktivin / Nodal hämmare ökar differentieringen takten hESCs 9. Ett annat sätt att bedöma effektiviteten av att använda dessa inhibitorer är att fastställa steady-state överflöd av CDX2 och KRT7 transkript i celler behandlade med enbart BMP4. CDX2 nivåer är liknande för differentiering dagar 1-3 vid användning av antingen BMP4 ensam eller BMP4 tillsammans med aktivin / Nodal hämmare. Emellertid KRT7 transkript är mer rikligt efter en dag av differentiering i närvaro av dessa inhibitorer, vilket tyder på en mersnabb differentiering (Figur 2). CDX2 uttryck toppar vanligtvis vid differentiering dag 2 för båda villkoren och minskar efter dag 3 (figur 2). Odifferentierade hESCs uttrycker inte heller KRT7 eller CDX2 (Figur 2), som förväntat. Sammanfattningsvis, BMP4 / A / P förhållanden snabbt differentiera hESCs, och placenta markör uttryck kan upptäckas så tidigt som differentiering dag 3.
Transfektioner av siRNA och plasmid-DNA och virusinfektioner användning av in vitro-härledda trofoblastiska celler
In vitro härledda humana trofoblastiska celler kan transfekteras med siRNA att störa genuttryck antingen kodning eller icke-kodande RNA. Vi inledde differentiering av hESCs använder BMP4 / A / P, utförde två omgångar av siRNA transfektioner (med 75 pmol siRNA) på differentiering dag 1 och 2,och samlas cellerna för RNA-isolering. Kvantitativ RT-PCR är en effektiv metod för att bestämma den knockdown effektiviteten för antingen kodning eller icke-kodande gener. Med hjälp av två siRNA komplementära till olika delar av den långa, icke-kodande RNA lncRHOXF1 19 fick vi 80% knockdown av lncRHOXF1 transkript (figur 3A). Nästa transfekterade vi ett siRNA (25 pmol) för proteinkodande gen hnRNP U, även om differentiering dag 1 och 2. Vi observerade en minskning av hnRNP U-transkript efter två på varandra följande transfektioner 80%. I trofoblaster progenitor vitro differentierade celler kan också användas för att undersöka medfödda immunsvar. Vi utförde infektioner differentierings dag 2-celler med användning av Sendai-virus vid ett MOI av 1 och samlas cellerna efter åtta timmar av viral inkubation. Använda QRT-PCR, upptäckte vi rikligt virusproteintranskript (Sev-NP) i infekterade celler (figur 3B), som indikerar aktiv virus propagation i trofoblastiska celler. Viktigt är infekterade celler (med MOI = 1) inte förändras i utseende och är livskraftiga (data visas ej). I trofoblastiska vitro härledda celler också kan transfekteras med plasmid-DNA. Vi utförde transfektioner med hjälp av en GFP plasmid och infört denna konstruktion i BMP4 / A / P-behandlade celler på differentiering dag 1 och dag 3 och avbildas för GFP följande dag (Figur 4). Vi fick typiskt 30-50% transfektion effektivitet vid 24 timmar efter transfektion. Sammanfattningsvis i trofoblastiska vitro härledda celler kan användas för GAIN- och förlust av funktionsexperiment.
Figur 1: In vitro-differentiering av humana pluripotenta stamceller till tidiga trofoblastiska celler med användning av BMP4 / A / P. (A) Schematisk bild av BMP4 differentiering av hPSCs till trofoblastiska celler med användning av BMP4 / A / P. (B) Representativa ljusfält bilder av HUES9 celler under d0, d2, och D6 av BMP4 / A / P differentiering. Skalstreck = 50 | iM. Pilarna betecknar encelliga hESCs som inte är differentierade. Pilarna markerar morfologiska funktioner under differentiering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: BMP4 / A / P differentiering nedreglerar snabbt pluripotens markör NANOG och uppreglerar trofoblasten gener CDX2 och KRT7. QRT-PCR-analys för NANOG (pluripotens markör), CDX2 och KRT7 (trofoblasten markörer). Värdena är medelvärden från trippel åtgärder. //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Gene störningar och virusinfektion med hjälp av in vitro differentierade humana trofoblastiska celler. (A) QRT-PCR-analys av hESCs (HUES9) differentierade och sedan transfekteras med siRNA som är specifika för den långa, icke-kodande RNA lncRHOXF1 (vänster) eller proteinkodande gen hnRNP U (höger) under två dagar i följd. Den knockdown effektiviteten (KD) är typiskt 70 till 80%, och resultaten från en transfektion experiment visas. (B) QRT-PCR-analys av Sendai virusproteinet transkript av differentiering dag 2 trofoblastiska celler infekterade med Sendai-virus (MOI = 1) under 8 timmar. Felgränserna betecknar SEM."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Införande av plasmid DNA i in vitro differentierade humana trofoblastiska celler. Transfektion av GFP plasmid-DNA i differentiering dag 1 och dag 3 trophectoderm progenitorceller, visualiseras följande dag. Skalstreck = 50 | iM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterade de grundläggande stegen för att differentiera hESCs i trofoblasten stamceller. Detta protokoll har nyligen optimerats för att snabbt differentiera hESCs med tillsats av Aktivin / Nodal signalerings inhibitorer, vilket ökar differentiering till trofoblastiska celler och undvika alstringen av mesoderm stamceller, vilka typiskt observeras med BMP4 behandling ensam. Den BMP4 modellsystem gör det möjligt att undersöka de tidigaste stadierna av mänskligt trofoblasten härstamning specifikation och expansion. Dessutom är denna BMP4 modellsystem också användbart för att undersöka differentiering av trofoblastiska celler till specifika under härstamningar, vilket inte är möjligt med användning av koriokarcinom cellinjer och extravillous trofoblasten cellinjer. I trofoblastiska vitro härledda celler kan också användas för förlust-of-funktion experiment med användning av siRNA 19. Dessutom kan hESCs eller hiPSCs vara genetiskt modifierad för inducerbar expression av transgen es 19 eller för insättning av reportergener vid endogena loci 20, och dessa celler kan differentieras till trofoblastiska celler med användning av de betingelser som beskrivs här.
Kritiska steg i protokollet
Det är absolut nödvändigt att utelämna B-FGF (FGF2) från CM differentieringsmedium för att erhålla trofoblastiska progenitorceller från hESCs. Närvaron av B-FGF tillsammans med BMP4 i odlingsmediet förhöjer expressionen av mesoderm och endoderm progenitorer 16. Införandet av B-FGF i trofoblaster differentieringsmedium tros förklara varför en nyligen genomförd studie fann att BMP4-medierad differentiering genererar mesoderm och endoderm celler i stället för trofoblaster 21. Det är väl etablerat att B-FGF tillsammans med Activin A och BMP4 främjar endoderm och mesoderm differentiering i en dosberoende sätt 22,s = "xref"> 23. I mus är beroende av FGF signalvägar 24 utvecklingen av epiblasten, trophectoderm och primitiva endoderm linjerna. I att differentiera hESCs, är B-FGF-inducerad signalering krävs för mesoderm bildning när BMP4 används för att inducera differentiering 21, 25. I kontrast, genom hämning av både FGF och aktivin / Nodal signalvägar, tillsammans med BMP4, gynnar SYN-bildning i hESC härledda trofoblasten progenitorer och förhindrar bildandet av mesoderm och primitiv endoderm progenitorer 26.
Begränsningar av tekniken
Det mest typiska problem med detta protokoll av hPSC differentiering till trofoblasten stamceller är associerad med att starta med en övervägande odifferentierat population av hESCs eller hiPSCs på MEF. Eftersom hPSCs ackumuleras differentierade celler på både inner- och ytterkanterav kolonierna, är det viktigt att övervaka den mängd av differentiering dagligen och för att avlägsna differentierade kolonier (eller delar av kolonier). Närvaron av differentierade celler kan komplicera differentieringsprocessen, särskilt när cellerna överförs till den extracellulära matrisen. De differentierade cellerna kommer snabbt proliferera på den extracellulära matrisen i närvaro av CM, och dessa celler kommer snabbt att ta över den kultur och konkurrera ut de hPSCs. Därför är det idealiskt att börja med friska, odifferentierade kolonier av hPSCs odlas på MEF innan överföring av cellerna till den extracellulära matrisen.
Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga / alternativa metoder
Vid användning av denna differentiering protokoll, de resulterande trofoblasten stamceller är en heterogen blandning av celltyper. Trofoblaster består av villösa cytotrofoblaster, syncytiotrophoblasts (Syns) och extravillous cytotrofoblaster(EVTs) 27. Villösa cytotrofoblaster är de progenitorer som genererar EVTs och Syns. BMP4-differentierade hPSCs kommer att generera en blandning av villösa cytotrofoblaster, Syns och EVTs 9, 15, som har fastställts av genen eller proteinuttryck av placenta specifika markörer. De distinkta differentieringsvägar kan särskiljas genom utsöndring av HLA-G (karakteristiskt för EVTs) eller humant koriongonadotropin (från Syns) 28, 29. Nyligen har det visats att hämning av Aktivin / Nodal signalering gynnar EVT differentiering från hESCs, och avlägsnande av denna hämning gynnar differentiering till SYN 17. I själva verket fann en tidigare publikation som använder BMP4 ensam att differentiera hESCs genererar mestadels SYN celler 26. Data med BMP4 / A / P och konditionerat medium (som saknar B-FGF) tyder på att detär både EVT och SYN celler närvarande genom differentiering dag 5. Om ren EVT eller SYN populationer önskas, ytterligare rening med hjälp av cellytemarkörer, såsom HLA-G konjugerade till pärlor för isolering av EVTs är möjlig 29. Sammanfattningsvis, odlingsmetoden som beskrivs här är ett effektivt sätt att generera signifikanta mängder av trofoblastiska celler från hPSCs som kan användas för en mängd olika tillämpningar. Eftersom detta protokoll genererar både Syns och EVTs, är det ett lämpligt modellsystem för att undersöka den tidiga human placenta. Dessa celler kan användas för en mängd olika tillämpningar, inklusive läkemedelsforskning och genteknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knock Out Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | This is referred to as "serum replacement" in this protocol. |
| NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 10828-028 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-155 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| B-FGF | Millipore | GF-003 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase Type IV | Invitrogen | 17104-019 | |
| Rock inhibitor Y27632 | Calbiochem | 688000 | |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | 6001G | MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated. |
| 0.22 µm syringe filter | Millipore | SLGS033SS | |
| Heracell 150i low oxygen incubator | Heracell/VWR | 89187-192 | Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient. |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-01M | |
| A 83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| PD173074 | R&D Systems | 3044/10 | |
| RNAiMax | Invitrogen | 13778150 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | Trizol is used to isolate total RNA. |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol. |
References
- Rugg-Gunn, P. J.
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy. Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).
- Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. Human blastocysts grown in culture. Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).
- Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. The placenta as a barrier to viral infections. Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Bilban, M., et al. Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).
- Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
- Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).
- Genbacev, O., et al. Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion. Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).
- Marchand, M., et al. Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model. Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).
- Hyslop, L., et al. Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages. Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).
- Harun, R., et al. Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events. Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).
- Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).
- Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and biophysical research communications. , (2013).
- Roberts, R. M., et al. Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be? Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).
- Sarkar, P., et al. Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts. The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).
- Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).
- Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Bernardo, A. S., et al. BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).
- Zhang, P., et al. Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells. Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).
- Vallier, L., et al. Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways. PloS one. 4 (6), e6082 (2009).
- Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).
- Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation. Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).
- Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast. Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).
- Bischof, P., Irminger-Finger, I. The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon. The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).
- Cole, L. A.
- Apps, R., et al. Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).
