Abstract
La placenta es el primer órgano de desarrollar durante la embriogénesis y es necesario para la supervivencia del embrión en desarrollo. La placenta está compuesto de varias células trofoblásticas que la diferencian de las células trophectoderm extra-embrionarias de blastocisto preimplantación. Como tal, nuestra comprensión de los eventos tempranos de diferenciación de la placenta humana es limitada debido a las restricciones éticas y legales sobre el aislamiento y la manipulación de la embriogénesis humana. Células madre pluripotentes humanos (hPSCs) son un sistema de modelo sólido para investigar el desarrollo humano y también pueden diferenciarse in vitro en células trofoblásticas que expresan marcadores de los diversos tipos de células trofoblásticas. A continuación, presentamos un protocolo detallado para la diferenciación en células trofoblásticas hPSCs utilizando la proteína morfogenética ósea 4 y los inhibidores de las vías de señalización de Activina / nodal. Este protocolo genera diversos tipos de células trofoblásticas que pueden ser transfectadas con siRNAspara la investigación de fenotipos de pérdida de función o pueden ser infectados con patógenos. Además, hPSCs pueden ser modificados genéticamente y luego diferenciarse en progenitores trofoblásticas para los análisis de ganancia de función. Este método de diferenciación in vitro para la generación de trofoblastos humanos a partir de hPSCs supera las restricciones éticas y legales de trabajar con embriones humanos tempranos, y este sistema se puede utilizar para una variedad de aplicaciones, incluyendo el descubrimiento de fármacos y investigación de células madre.
Introduction
Se requiere la placenta para el crecimiento y la supervivencia del feto durante el embarazo y facilita el intercambio de gases, nutrientes, productos de desecho y hormonas entre la circulación materna y fetal. El primer órgano formado durante la embriogénesis de mamíferos es la placenta, que comienza el desarrollo de 6-7 días después de la concepción en los seres humanos y 3.5-4.5 días en ratones 1, 2, 3, 4. Las células trofoblásticas son las células más importantes de la placenta, y estas células representan uno de los acontecimientos más tempranos de diferenciación del linaje del embrión de mamífero. Surgen de las células trophectoderm extra-embrionarias exteriores del blastocisto preimplantación. Nuestro conocimiento de las primeras etapas del desarrollo de la placenta está limitado por las restricciones éticas y logísticas en el modelado de desarrollo humano temprano.
Durante la implantación de embriones, los trofoblastosinvadir el epitelio materna y diferenciarse en células progenitoras especializados 5. Citrofoblastos (CTBS) son mononucleadas, progenitores no diferenciadas que se fusionan y se diferencian en sinciciotrofoblastos (SYN) y trofoblastos invasivos extravillous (EVT), que ancla la placenta al útero. SYN son multinucleadas, células diferenciadas terminales que sintetizan hormonas necesarias para sostener el embarazo. Los eventos que generan diferenciación temprana EVT y SYN son esenciales para la formación de la placenta, como alteraciones en las células trofoblásticas dan lugar a aborto involuntario, la preeclampsia, restricción del crecimiento intrauterino y 1. Los tipos de líneas de células trofoblásticas humanas que se han desarrollado incluyen CTBS y coriocarcinomas, que producen hormonas placentarias y propiedades invasivas de visualización 6 inmortalizados. células trofoblásticas primaria a partir de placentas de primer trimestre humanos se pueden aislar, pero las células rápidamente differentiate y detener la proliferación in vitro. Es importante destacar que, transformado y líneas celulares primarias tienen diferentes perfiles de expresión génica, lo que indica que las líneas celulares inmortalizadas trofoblásticas oncogénicas y pueden no representar con precisión los trofoblastos primaria 7. Además, estas líneas es poco probable que se asemejan a trofoblasto placentario progenitores de células madre, ya que se derivan de una etapa más avanzada primero a través de tercer trimestre.
Hay una necesidad de un sólido en el sistema de cultivo in vitro de trofoblastos humanos en fase inicial con el fin de estudiar los primeros eventos de la formación y la función de la placenta. Las células madre embrionarias humanas (hESCs), que comparten propiedades con la masa celular interna del embrión preimplantatorio, con frecuencia se utilizan para modelar el desarrollo humano temprano, incluyendo la formación de la placenta temprana. Tanto las células madre pluripotentes inducidas humanas (hESCs hiPSCs) y pueden diferenciarse en los trofoblastos in vitro usando hueso MorProtein phogenic 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Esta conversión de las células pluripotentes a las células trofoblásticas usando BMP4 es específico para las células humanas y se utiliza ampliamente para estudiar el desarrollo de la placenta humana temprana, ya que no requiere acceso a los embriones humanos tempranos 9, 16. Recientemente, se descubrió que la adición de los inhibidores de A83-01 (A) y PD173074 (P), que bloquean las vías de señalización SMAD2 / 3 y MEK1 / 2, aumenta la eficiencia de diferenciación HPSC en progenitores trophectoderm-como, principalmente SYN y EVT, sin la extensa generación de mesodermo, endodermo, o células del ectodermo 9, 17 in vitro 9, 11. A continuación, presentamos un protocolo detallado para la diferenciación in vitro de células progenitoras en hPSCs trofoblásticas humanas usando BMP4 Un medio de cultivo / / P. Estas condiciones producen abundantes cantidades de células para una amplia variedad de aplicaciones, incluyendo la secuenciación de ARN, la alteración génica utilizando siRNAs, infecciones por patógenos, y la modificación genética usando transfección lipofección mediada.
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Protocol
NOTA: Para la diferenciación de cualquiera de hESCs o hiPSCs en progenitores trofoblásticas, hPSCs cultivados en fibroblastos de embriones de ratón (MEFs) son la transición al alimentador libres condiciones para dos pasajes antes de iniciar la diferenciación con BMP4 / A / P. Este proceso elimina la contaminación MEF de células diferenciadas. A continuación, se presenta un protocolo para la diferenciación de células madre, y el mismo protocolo se puede aplicar a hiPSCs.
1. Cultura y recuperación de hESCs irradiados en fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) (Preparaciones)
- Gamma-irradiación de MEFs
- Hacer 500 ml de medio para el cultivo de los MEFs: DMEM con 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 1x penicilina / estreptomicina (Pen / Strep), y 0,1 mM de aminoácidos no esenciales (NEAA).
- Descongelar un vial de MEFs primarios y el uso de medio MEF para cultivar las células. Ampliar los MEFs primarios de 30 planchas en medio de cultivo MEF.
NOTA: Las concentraciones de oxígeno no son críticos para este paso, por loo bien condiciones fisiológicas (4%) o ambientales (20%) dentro de la incubadora se pueden utilizar. - Recoger los MEFs. Utilizar 0,25% de tripsina para eliminar los MEFs de las placas y transferir las células a un tubo cónico. Coloque los MEFs en un instrumento de irradiación y exponer las células a 3.500 grises.
NOTA: La cantidad de tiempo dependerá de la actividad de la fuente dentro de la unidad de irradiación. - Resuspender las MEFs irradiados con medio de cultivo MEF y contar el número de células utilizando un hemocitómetro.
- Se precipitan los MEFs utilizando una centrífuga y se añaden 50% medio de cultivo MEF y el 50% de células medio (80% de SFB y medio de cultivo MEF 20%) de congelación. Alícuota de 1 x 10 6 células por vial.
- Colocar los viales MEF irradiado en un congelador a -80ºC durante la noche, y luego transferirlos a nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.
- Descongelación de MEFs congelados y hESCs para la cultura
- Hacer 500 ml de medio de células madre: DMEM / F-12 con 20% de suero Replacement, NEAA 0,1 mM, 2 mM L-glutamina, 10 ng / ml bFGF, 0,1 mM ß-mercaptoetanol, y 1x Pen / Strep.
- Descongelar un vial de MEFs un día antes de la descongelación de la hESCs. Rociar una placa de 6 pocillos con 0,1% de gelatina, usando 1 ml de cada pozo. Incubar durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente, y luego retire la gelatina.
- Retirar un vial de MEFs del almacenamiento en nitrógeno líquido y sumergir el vial en un baño de agua a 37 °. Mira el vial de forma intermitente hasta que sólo quedan pequeños cristales de hielo. transferir rápidamente el contenido del vial a 9 ml de medio de MEF dentro de un tubo cónico de 15 ml.
- Sedimentar las células por centrifugación a 200 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en medio MEF. Alícuota del MEF uniformemente sobre una placa de 6 pocillos. Poner la placa en una incubadora a 37 ° C bajo contenido de oxígeno (4%) durante la noche.
- El cultivo rutinario de hESCs en MEFs
- Retirar un vial de células madre a partir de nitrógeno líquido y descongelar rápidamente el vial utilizando un 37 ° C baño de agua. pipeta suavemente la hESCs en un tubo cónico de 15 ml que contiene 9 ml de medio de células madre y centrifugar a 200 xg durante 5 min. Se elimina el medio y volver a suspender las células con 1 ml de medio de células madre.
- Aspirar el medio MEF de la placa preparada en el paso 1.2.4 y se añade 1 ml de medio de células madre. Añadir inhibidor de la roca Y-27632 (10 mM) al medio de células madre. Transferir la hESCs en MEFs.
- Colocar las células en una incubadora a 37 ° C bajo contenido de oxígeno (4%) durante la noche. Reemplazar el medio hCME diaria. Raspe células diferenciadas con una pipeta Pasteur, se visualizaron bajo un microscopio vertical en 4X.
- Passage la hESCs cada 4-6 días, dependiendo de la confluencia celular y el tamaño de las colonias de células madre. Preparar un plato de MEFs el día antes de los pases. Cuando las células están listas para el paso, eliminar el medio de células madre y lavar el pocillo con 1 ml de PBS.
- Añadir 1 mg / ml de colagenasa (previamente calentada a 37 ° C), se incuba a 37 ° C durante 5 minutos, y retirar la colagenasa. Wcenizas las células con PBS, añadir 1 ml de medio de células madre por pozo, y raspar manualmente las células en pequeños grupos utilizando la punta de una pipeta de 5 ml. La transferencia de los grupos de células en suspensión en un pozo (s) nueva MEF-revestido.
2. La transición de hESCs MEFs de que los enlaces de forma gratuita Condiciones sobre placas recubiertas con matriz extracelular
- Preparar MEF medio condicionado (CM)
- La placa de las MEFs irradiados en un matraz T75 a 90-100% de confluencia; es importante que los MEFs están densamente plateado. Observar las células utilizando un microscopio para determinar si se han unido a la parte inferior del frasco (MEFs se unen aproximadamente 6 hr después de la siembra o al día siguiente).
NOTA: solteras células flotan en el medio cuando se observa con un microscopio. Al día siguiente, retire medio MEF y añadir 25 ml de medio de células madre que carecen de B-FGF. - Se recoge el medio acondicionado después de 24 horas de incubación. Reemplazar con medio fresco al día durante un máximo de 12 días. Filtrar el CM recogido utilizando un filtro de 0,22 mM. Antes de su uso, añada fresca B-FGF al CM.
NOTA: CM se puede congelar a -80 ° C y se almacenó durante hasta 1 año. Como alternativa, el CM almacenar a 4 ° C durante 2 semanas.
- La placa de las MEFs irradiados en un matraz T75 a 90-100% de confluencia; es importante que los MEFs están densamente plateado. Observar las células utilizando un microscopio para determinar si se han unido a la parte inferior del frasco (MEFs se unen aproximadamente 6 hr después de la siembra o al día siguiente).
- Transición desde la hESCs la cultura en los MEFs al alimentador de placas de matriz libre con recubrimiento extracelulares.
- Preparación de la matriz extracelular para las placas de cultivo de tejidos de revestimiento
- Descongelar una alícuota de la matriz extracelular en hielo (aproximadamente 3-4 horas). Utilizando puntas de frío de hielo, uno 50 ml tubo cónico de frío, y el medio DMEM / F12, la transferencia de 2 mg de la matriz extracelular en 24 ml de DMEM enfriado con hielo / F-12 (la dilución depende de la concentración de la matriz extracelular del proveedor ).
- Inmediatamente transferir los 50 ml tubo cónico de hielo y almacenarlo a 4ºC. Para placas de cultivo de tejidos de revestimiento, añadir la cantidad apropiada de la matriz extracelular diluida al pocillo (por ejemplo, 1 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos). Agitar para recubrir la placa e incubar a temperatura ambiente durante al menos 1 hr.
- hESCs paso de los MEFs (como en el paso 1.3) utilizando CM-B que contiene FGF (10 ng / ml).
- Aspirar para eliminar la matriz extracelular de la nueva placa y añadir CM contiene B-FGF. La transferencia de los grupos celulares raspadas de la placa de MEF con una pipeta y alícuota en la placa de matriz recubierto extracelular. Incubar en la incubadora a 37ºC bajo contenido de oxígeno durante la noche.
- Reemplazar el CM con el medio B-FGF diaria; la cantidad de medio dependerá del tamaño del matraz de cultivo. Use 2 ml de medio para una 6-bien también. Raspe células diferenciadas con una pipeta Pasteur.
- hESCs paso cada 6-7 días, cuando las colonias son brillantes cuando se observa bajo el microscopio.
NOTA: colonias de células madre cultivadas en placas de matriz extracelular-revestido se hacen más grandes que las células MEF-cultivadas. - Cuando las células libres de alimentador están dispuestos a paso, se elimina el medio, lavar por el anuncianteding 1 ml de PBS utilizando una pipeta, aspirado para eliminar el PBS, añadir 0,5 mg / ml de dispasa (pre-calentado a 37 ° C) con una pipeta, y se incuba a 37 ° C durante 5 min.
- Se lavan las células con PBS mediante la adición de 2 ml de PBS por pocillo y aspirando después. Añadir 1 ml de CM por pocillo y raspar manualmente las células en pequeños grupos utilizando la punta de una pipeta de 5 ml.
- Placa de los grupos de células en suspensión en nuevas placas de matriz recubierto extracelulares; las células se adhieran después de 24 horas.
- Preparación de la matriz extracelular para las placas de cultivo de tejidos de revestimiento
3. La diferenciación de hESCs Uso de BMP4 / A / P
- Preparar el medio de diferenciación. Uso CM (que carece de B-FGF) y añadir (fresco) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 M), y PD173074 (0,1 M). Añadir estos inhibidores a la CM antes del uso.
- Utilizar hESCs libres de alimentador que crecen en placas de matriz extracelular con recubrimiento de 1 paso, que sean cultivadas dentro de una incubadora a 4% de oxígeno. Después de la primera paso en placas de matriz recubierto extracelulares,dejar que las células se adhieren durante 24 horas. El día siguiente, iniciar la diferenciación. Retire la CM (que contiene B-FGF) y reemplazarlo con CM que contiene BMP4 / A / P (2 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos). Continuar el cultivo de las células por medio de 4% los niveles de oxígeno.
- Reemplazar el CM que contiene BMP4 / A / P (2 ml / pocillo de una placa de 6 pocillos) cada 2 días. Aspirar para eliminar el medio viejo y añadir nuevas CM usando una pipeta. En el segundo día después de la adición de BMP4 y la eliminación de B-FGF (considerado diferenciación día 2), la morfología de la célula va a cambiar, apareciendo más grande cuando se observa usando un microscopio.
NOTA: indiferenciado de células, que presentan bordes redondos brillantes, no estarán presentes. - Recoger las células en los puntos de tiempo deseados. Las células diferenciadas se dejan de dividirse después de alrededor de 2 semanas. transfectar células durante este período de tiempo (véase la siguiente sección).
4. La transfección de las células trofoblásticas con siRNAs o el ADN del plásmido
- Preparar las células trofoblásticas para la transfección
- CMEh de cultivo para dos pasajes sobre la matriz extracelular después de su transferencia de los MEFs (véase el paso 2.2). Utilice medio que contiene células madre B-FGF.
- Dividir la hESCs en una nueva placa de matriz extracelular un día antes de la diferenciación. Alta confluencia celular es importante, así dividir las células 1: 1 en una nueva placa / pocillo, lo que garantizará al menos 50% de confluencia el día siguiente. Se incuban las células durante la noche en la incubadora de bajo oxígeno.
NOTA: hESCs no necesitan ser contados durante este paso. - Al día siguiente, reemplazar el medio con el medio de diferenciación (CM que contiene BMP4 / A / P y carente B-FGF, usando 2 ml / pocillo de una placa de 6 pocillos). Eliminar el medio viejo por aspiración y transferir el nuevo medio (2 ml) usando una pipeta. Colocar las células en una incubadora de bajo contenido de oxígeno (4% de oxígeno) durante la noche.
- Diferenciar las células hasta que la deseada tiempo-punto (entre los días 1 y 14). El día antes de la transfección, trypsinize las células utilizando tripsina al 0,05% durante 5 min. Placa a la confluencia deseada (según el protocolo de reactivo de transfección) en una placa recubierta con gelatina (añadir 0,1% de gelatina a una placa de cultivo de tejidos durante 20 min y aspirado para eliminar). Añadir CM que contiene BMP4 / A / P (que carece de B-FGF) e incubar durante la noche.
- El día siguiente, añadir medio de diferenciación fresco a las células. Transfectar siRNAs utilizando un reactivo de transfección de siRNA. Para ADN de plásmido, usar un reactivo de lipofectamina apropiado.
- Seguir el protocolo de producto como se describe para cada reactivo de transfección. La transferencia de los complejos de siRNA-lipofectamina a cada pocillo / placa de las células, mezclar suavemente, y cultivar las células durante la noche en una incubadora de bajo contenido de oxígeno.
NOTA: Algunos reactivos de transfección son inhibidas por los antibióticos, que exigen que carecen de CM penicilina / estreptomicina. - Al día siguiente, reemplazar con medio de diferenciación fresca.
- Recoger las células en el deseod puntos de tiempo (por ejemplo, 24 horas, 48 horas y 72 horas) para comprobar la eficacia de la interrupción de genes utilizando RT-PCR cuantitativa. Para las células de recolección, utilice 0,05% de tripsina, la adición de 1 ml por pocillo e incubando durante 5 min a 37 ° C. Añadir 5 ml de medio de MEF por pocillo para neutralizar la tripsina. Centrifugar las células a 200 xg durante 5 min y utilizar el sedimento celular para el aislamiento de ARN.
5. infección por patógenos de las células trofoblásticas: Infección viral de Sendai
- Preparar para la diferenciación de hESCs
- CMEh de cultivo para dos pasajes sobre la matriz extracelular después de la transferencia de los MEFs (véase el paso 2.2). Utilice medio que contiene células madre B-FGF.
- Dividir la hESCs en una nueva placa de matriz extracelular un día antes de la diferenciación. Alta confluencia celular es importante, así que las células de división 1: 1 en una nueva placa / pocillo, lo que garantizará al menos 50% de confluencia el día siguiente. Se incuban las células durante la noche en una incubadora de bajo contenido de oxígeno (4% de oxígeno). <br /> NOTA: hESCs no necesitan ser contadas durante este paso.
- Al día siguiente, reemplazar el medio con el medio de diferenciación (CM que contiene BMP4 / A / P y carente B-FGF) y el cultivo de una noche en un incubador con bajo contenido de oxígeno (oxígeno al 4%).
- Sendai infección viral de las células trofoblásticas
- Un día antes del día de diferenciación deseada, trypsinize las células de diferenciación (a células individuales) usando 0,05% de tripsina durante 5 min y transferirlos a una placa recubierta con gelatina. Añadir medio de diferenciación e incubar durante la noche en una incubadora de bajo contenido de oxígeno.
- El día siguiente, se añade medio para la infección (esto variará dependiendo del virus). Uso CM carece de Pen / Strep contiene BMP4 / A / P, usando 0,5 ml de un pocillo de una placa de 6 pocillos. Añadir virus Sendai para MOI = 1. Incubar durante 8 horas en una incubadora con bajo contenido de oxígeno.
- Si los puntos de tiempo adicionales son necesarios, se elimina el medio que contiene el virus después de 4 horas y sustituirla por BMP4 / A / P CM. recoger las célulaspara el aislamiento de ARN usando un rascador de células.
- Determinar la eficacia de la infección viral mediante la realización de QRT-PCR para los genes implicados en la respuesta viral 18.
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Representative Results
Visión general de diferenciación in vitro de hPSCs
Este protocolo de diferenciación in vitro comienza con hESCs indiferenciadas cultivadas en MEFs que están transición a alimentador libres condiciones para un paso (Figura 1A). Aunque hemos descrito la diferenciación de hESCs en este protocolo, se utilizó este protocolo para diferenciar con éxito hiPSCs en células trofoblásticas. La transición a la matriz extracelular elimina la mayoría de los MEFs irradiados, que son indeseables para los análisis que requieren poblaciones puras de células trofoblásticas humanas. hPSCs no diferenciadas se cultivan en la matriz extracelular y se cultivaron con CM que contiene B-FGF hasta que las colonias están listos para pases (aproximadamente una semana). Esto mantiene el estado pluripotente antes de la inducción de BMP4 / A / P diferenciación mediada. Las colonias se interrumpen en grupos de ~ 50-100 célulasusando dispasa y se pasaron una segunda vez sobre una placa de matriz extracelular-revestido. El día después de los pases, las células adherentes están listos para inducir la diferenciación, y el medio se cambió a contener BMP4 / A / P que carecen de B-FGF. Las células diferenciadas proliferan durante aproximadamente 2 semanas, tiempo durante el cual las células se pueden recoger para el aislamiento de ARN o utilizarse para experimentos de transfección. Los cambios morfológicos aparecen se ha iniciado 1-2 días después de la diferenciación, y los resultados de un experimento representativo se muestra en la Figura 1B. Nótese que las células en los días de diferenciación 1-2 son más grandes en tamaño que las células de día 0 (Figura 1B). La colonia de célula diferenciada crece rápidamente, y este cambio se nota cada día. A medida que avanza la diferenciación, las células se dividen y se expanden hacia fuera del centro de la colonia, que crece en una dirección hacia fuera (días 3-5; Figura 1B). La parte exterior de la colonia contiene células más grandes en comparación con tél células en el centro de la colonia. Las células que se diferencian vuelven más oscuras y más planas que las células madre pluripotentes cultivadas en la matriz extracelular; los cambios en el brillo de la célula son más evidentes cuando se ven las células con un microscopio vertical utilizado para el cultivo celular de rutina. Las colonias individuales se fusionan entre sí por día diferenciación 5 (Figura 1B), con células que crecen en la parte superior de la otra. Después de días diferenciación 4-5, las células que contienen múltiples núcleos están presentes (no mostrado) (Figura 1B).
BMP4 / A / P induce la diferenciación y la expresión de marcadores Trofoblasto
Examinamos cambios de expresión génica durante los tres primeros días de BMP4 / A / P diferenciación utilizando RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR). Se aisló ARN a día de diferenciación de 1, 2, y 3 y se convierte en cDNA. La desaparición de las células madre pluripotentes se puede evaluar tanto by morfología, visualmente usando un microscopio, y de QRT-PCR, usando cebadores para genes de pluripotencia. Los niveles de expresión relativos de NANOG, un marcador de células madre pluripotentes, se reduce en ~ 75% después de un día de diferenciación cuando las células se cultivan con BMP4, y los niveles se reducen en ~ 90% en presencia de BMP4 / A / P ( la Figura 2). Por diferenciación día 2, los niveles de NANOG son muy bajos para las células cultivadas en BMP4 solo o en BMP4 / A / P en comparación con aquellos en el medio de células madre CM (que contiene B-FGF). Este es un resultado esperado, ya que no observamos células indiferenciadas después de dos días de diferenciación (Figura 1B), que son más brillantes y más pequeños en tamaño en comparación con las células diferenciadas. La eficiencia de la diferenciación mediada por BMP4 a células trofoblásticas puede evaluarse directamente mediante qRT-PCR usando cebadores específicos para dos marcadores trofoblásticas: KRT7 y CDX2. Ambos de estos genes no se expresan en células madre pluripotentes humanascélulas, y su expresión aumenta después de 2-3 días de tratamiento BMP4 (Figura 2). Utilizando las condiciones descritas aquí, aumentan los niveles de transcripción KRT7 en la diferenciación día 1 en BMP4 medio / A / P y se mantienen constantes durante los primeros 3 días de diferenciación (Figura 2). KRT7 expresión cuando se utiliza BMP4 el único que tiene un aumento retardado por el día 2, de acuerdo con observaciones anteriores que los inhibidores de Nodal Activina / aumentan la tasa de diferenciación de hESCs 9. Otra forma de evaluar la eficiencia de la utilización de estos inhibidores es determinar la abundancia de estado estacionario de CDX2 y KRT7 transcripciones en células tratadas con BMP4 solo. CDX2 niveles son similares para los días 1-3 de diferenciación cuando se utiliza ya sea solo o BMP4 BMP4 junto con inhibidores de Nodal Activina /. Sin embargo, las transcripciones KRT7 son más abundantes después de un día de diferenciación en presencia de estos inhibidores, lo que sugiere una mayorrápida diferenciación (Figura 2). Expresión de CDX2 normalmente alcanza su máximo en el día 2 la diferenciación de ambas condiciones y disminuye después del día 3 (Figura 2). HESCs indiferenciada no expresan ya sea KRT7 o CDX2 (Figura 2), como se esperaba. En conclusión, BMP4 condiciones / A / P se diferencian rápidamente hESCs, y la expresión de marcadores de la placenta pueden detectarse ya en el día 3 de diferenciación.
Las transfecciones de ADN plásmido y siRNAs y las infecciones virales Uso In Vitro -derivado células trofoblásticas
In vitro las células trofoblásticas humanas derivadas pueden ser transfectadas con siRNAs para interrumpir la expresión del gen de cualquiera de codificación o noncoding RNAs. Iniciamos la diferenciación de hESCs usando BMP4 / A / P, realizado dos rondas de transfecciones siRNA (usando 75 pmol de siRNAs) en los días 1 y 2 de diferenciación,y recogieron las células para el aislamiento de ARN. RT-PCR cuantitativa es un método eficaz para determinar la eficiencia desmontables para cualquiera de codificación o no codificantes genes. El uso de dos siRNAs complementarios a diferentes regiones del ARN no codificantes de largo, lncRHOXF1 19, se obtuvo el 80% desmontables de transcripciones lncRHOXF1 (Figura 3A). A continuación, transfectadas uno siRNA (25 pmol) para el gen que codifica la proteína hnRNP U, también en días de diferenciación 1 y 2. Se observó una reducción del 80% en hnRNP U transcripciones después de dos transfecciones consecutivos. En las células progenitoras in vitro trofoblasto diferenciado también se puede utilizar para investigar la respuesta inmune innata. Se realizó infecciones del día diferenciación 2 células utilizando virus Sendai a una MOI de 1 y recogieron las células después de 8 horas de incubación viral. El uso de QRT-PCR, hemos detectado abundantes transcripciones proteína viral (Sev-NP) en las células infectadas (Figura 3B), indicativo de pro viral activapagation en las células trofoblásticas. Es importante destacar que, las células infectadas (utilizando MOI = 1) no cambian en apariencia y son viables (datos no mostrados). En las células trofoblásticas vitro derivados también se pueden transfectar con ADN de plásmido. Se realizó transfecciones utilizando un plásmido GFP e introdujimos este constructo en células BMP4 / A / P-tratado sobre la diferenciación de los días 1 y 3 y fotografiado para GFP al día siguiente (Figura 4). Nos obtiene típicamente 30-50% de eficiencia de transfección a las 24 horas después de la transfección. En conclusión, en las células trofoblásticas vitro derivados pueden ser utilizados para los experimentos de ganancia y pérdida de función.
Figura 1: diferenciación in vitro de células madre pluripotentes humanas a las células trofoblásticas primeras utilizando BMP4 / A / P. (A) Esquema de la diferenciación BMP4 de hPSCs a las células trofoblásticas usando BMP4 / A / P. (B) Las imágenes de campo brillante representativos de células HUES9 durante d0, d2, y D6 de BMP4 / A / P diferenciación. Barra de escala = 50 micras. Las puntas de flecha indican CMEh unicelulares que no se diferencian. Las flechas resaltan características morfológicas durante la diferenciación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: BMP4 / A / P diferenciación regula a la baja rápidamente el marcador de pluripotencia NANOG y regula por incremento genes trofoblásticas y CDX2 KRT7. QRT-PCR análisis de NANOG (marcador de pluripotencia), CDX2, y KRT7 (marcadores de trofoblasto). Los valores son promedios de medidas por triplicado. //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: la interrupción de genes y la infección viral usando en las células trofoblásticas humanas in vitro diferenciados. (A) QRT-PCR análisis de hESCs (HUES9) diferenciada y luego transfectadas con siRNAs específicos a la larga, no codificante ARN lncRHOXF1 (izquierda) o el gen codificante de la proteína hnRNP U (derecha) durante dos días consecutivos. La eficiencia desmontables (KD) es típicamente 70 a 80%, y los resultados de un experimento de transfección se muestran. (B) Análisis de QRT-PCR de la transcripción de la proteína viral de Sendai de la diferenciación de las células trofoblásticas día 2 infectadas con virus Sendai (MOI = 1) durante 8 horas. Las barras de error indican el SEM.objetivo "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig3large.jpg" = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Introducción del plásmido de ADN en las células trofoblásticas humanas diferenciadas in vitro. La transfección de ADN de plásmido GFP en células días diferenciación 1 y 3 días trophectoderm progenitoras, visualiza el día siguiente. Barra de escala = 50 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Nosotros presentamos los pasos básicos para diferenciar hESCs en progenitores trofoblasto. Este protocolo ha sido recientemente optimizado para diferenciar rápidamente hESCs con la adición de inhibidores de la activina / señalización nodal, el aumento de la diferenciación a células trofoblásticas y evitando la generación de los progenitores mesodermo, que normalmente se observan con el tratamiento BMP4 solo. El sistema modelo BMP4 permite el examen de las primeras etapas de especificación trofoblasto linaje humano y de expansión. Además, este modelo de sistema BMP4 también es útil para la investigación de la diferenciación de las células trofoblásticas a los sub-linajes específicos, que no es posible el uso de líneas de células de coriocarcinoma y líneas de células del trofoblasto extravillous. En las células trofoblásticas vitro derivada también puede ser utilizado para los experimentos de la pérdida de la función utilizando siRNAs 19. Además, CMEh o hiPSCs pueden ser modificados genéticamente para la expresión inducible del transgen es 19 o para la inserción de genes indicadores en los loci endógenos 20, y estas células pueden diferenciarse en células trofoblásticas usando las condiciones descritas aquí.
Los pasos críticos dentro del Protocolo
Es imperativo para omitir B-FGF (FGF2) desde el medio de diferenciación CM para obtener células progenitoras trofoblásticas de hESCs. La presencia de B-FGF junto con BMP4 en el medio de cultivo aumenta la expresión de mesodermo y endodermo progenitores 16. La inclusión de FGF-B en medio de diferenciación del trofoblasto se cree que explicar por qué un estudio reciente encontró que la diferenciación mediada por BMP4 genera células mesodermo y endodermo en lugar de trofoblastos 21. Está bien establecido que B-FGF junto con activina A y BMP4 promueve endodermo y mesodermo diferenciación de una manera dependiente de la dosis 22,s = "xref"> 23. En el ratón, el desarrollo del epiblasto, trophectoderm, y linajes endodermo primitivo dependen de rutas de señalización de FGF 24. En la diferenciación de hESCs, se requiere la señalización inducida por B-FGF para la formación de mesodermo cuando BMP4 se utiliza para inducir la diferenciación 21, 25. En contraste, la inhibición tanto de FGF y las vías de señalización / nodales activina, junto con BMP4, favorece la formación de SYN en progenitores trofoblasto de células madre derivadas de y previene la formación de mesodermo y endodermo primitivo progenitores 26.
Limitaciones de la Técnica
El problema más común con este protocolo de diferenciación de progenitores HPSC trofoblasto se asocia con partiendo de una población predominantemente indiferenciada de hESCs o hiPSCs en MEFs. Debido hPSCs acumulan células diferenciadas, tanto en los bordes interior y exteriorde las colonias, es importante controlar la cantidad de diferenciación diario y para eliminar colonias diferenciadas (o porciones de colonias). La presencia de células diferenciadas puede complicar el proceso de diferenciación, en particular cuando las células se transfieren a la matriz extracelular. Las células diferenciadas proliferarán rápidamente en la matriz extracelular en presencia de CM, y estas células rápidamente se hará cargo de la cultura y fuera de competencia a los hPSCs. Por lo tanto, es ideal para empezar colonias sanas, no diferenciadas de hPSCs cultivadas en MEFs antes de transferir las células a la matriz extracelular.
Importancia de la Técnica en Materia de Métodos Alternativos / Existentes
Cuando se usa este protocolo de diferenciación, los progenitores trofoblásticas resultantes son una mezcla heterogénea de tipos celulares. Trofoblastos se componen de citrofoblastos vellosos, sinciciotrofoblastos (SYN), y citrofoblastos extravillous(EVT) 27. citrofoblastos vellosidades son los progenitores que generan EVT y SYN. HPSCs BMP4 diferenciado generarán una mezcla de citrofoblastos vellosos, SYN, y EVT 9, 15, que han sido definidos por la expresión de genes o proteínas de marcadores-placentarios específica. Las distintas vías de diferenciación se distinguen por la secreción de HLA-G (característica de EVT) o gonadotropina coriónica humana (de SYN) 28, 29. Recientemente, se ha demostrado que la inhibición de la señalización de Activina / Nodal favorece la diferenciación de hESCs EVT, y la eliminación de esta inhibición favorece la diferenciación a SYN 17. De hecho, una publicación anterior encontró que el uso de BMP4 solo para diferenciar hESCs genera principalmente células SYN 26. Los datos utilizando BMP4 / A / P y medio condicionado (que carece de B-FGF) indican que hayson ambos EVT y células SYN presentes por día diferenciación 5. Si se desean poblaciones puras EVT o SYN, la purificación adicional utilizando marcadores de superficie celular, tales como HLA-G conjugados con perlas para el aislamiento de EVT, es posible 29. En conclusión, el método de cultivo descrito aquí es una forma eficaz de generar cantidades significativas de células trofoblásticas de hPSCs que se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones. Debido a que este protocolo genera tanto SYN y EVT, es un sistema modelo adecuado para el examen de la placenta humana temprana. Estas células se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones, incluyendo el descubrimiento de fármacos y la ingeniería genética.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knock Out Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | This is referred to as "serum replacement" in this protocol. |
| NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 10828-028 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-155 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| B-FGF | Millipore | GF-003 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase Type IV | Invitrogen | 17104-019 | |
| Rock inhibitor Y27632 | Calbiochem | 688000 | |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | 6001G | MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated. |
| 0.22 µm syringe filter | Millipore | SLGS033SS | |
| Heracell 150i low oxygen incubator | Heracell/VWR | 89187-192 | Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient. |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-01M | |
| A 83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| PD173074 | R&D Systems | 3044/10 | |
| RNAiMax | Invitrogen | 13778150 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | Trizol is used to isolate total RNA. |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol. |
References
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