Abstract
A placenta é o primeiro órgão a desenvolver-se durante a embriogénese e é necessária para a sobrevivência do embrião em desenvolvimento. A placenta é composto por várias células trofoblásticas que diferenciam a partir de células trofectoderma extra-embrionárias do blastocisto de pré-implantação. Como tal, a nossa compreensão dos eventos diferenciação precoce da placenta humana é limitada por causa das restrições éticas e legais sobre o isolamento e manipulação de embriogênese humana. As células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs) são um sistema modelo robusto para investigar o desenvolvimento humano e também podem ser diferenciadas in vitro em células trofoblásticas que expressam marcadores de vários tipos de células trofoblásticas. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para diferenciar hPSCs em células trofoblásticas usando proteína morfogénica do osso 4 e inibidores das vias de sinalização / nodais Activina. Este protocolo gera vários tipos de células de trofoblasto que podem ser transfectadas com ARNsipara investigar fenótipos de perda de função ou podem ser infectados com patógenos. Além disso, hPSCs pode ser geneticamente modificado e, em seguida, diferenciaram em progenitores trofoblásticas de ganho-de-função análises. Este método in vitro de diferenciação para geração de trofoblastos humanos a partir de hPSCs supera as restrições éticas e legais de trabalhar com embriões humanos, e este sistema pode ser usado para uma variedade de aplicações, incluindo a descoberta da droga e pesquisa da célula estaminal.
Introduction
A placenta é necessário para o crescimento e sobrevivência do feto durante a gravidez e facilita a troca de gases, nutrientes, produtos residuais e hormônios entre a circulação materna e fetal. O primeiro órgão formado durante a embriogênese dos mamíferos é a placenta, que começa a desenvolver 6-7 dias pós-concepção em humanos e 3,5-4,5 dias em ratos 1, 2, 3, 4. células trofoblásticas são as células mais importantes da placenta, e estas células representam um dos primeiros eventos de diferenciação linhagem de embrião de mamífero. Eles surgem a partir de células trofectoderma extra-embrionárias exteriores do blastocisto de pré-implantação. Nosso conhecimento dos estágios iniciais do desenvolvimento da placenta é limitado por restrições éticas e logísticas sobre a modelagem de desenvolvimento humano precoce.
Durante implantação embrionária, trofoblastosinvadem o epitélio materno e diferenciam-se em células progenitoras especializados 5. Citotrofoblastos (CTBS) são mononucleated, progenitores indiferenciadas que se fundem e se diferenciam em sinciciotrofoblastos (SYNs) e trofoblastos invasivos extravilosas (EVTS), que escora a placenta ao útero. SYNs são multinucleadas, células terminalmente diferenciadas que sintetizam os hormônios necessários para sustentar a gravidez. Os eventos diferenciação precoce que geram TEVs e SYNs são essenciais para a formação da placenta, como deficiências em células trofoblásticas resultar em aborto espontâneo, pré-eclampsia, e intra-uterino restrição de crescimento 1. Os tipos de linhas de células trofoblásticas humanas que foram desenvolvidas incluem imortalizado CTBs e Coriocarcinomas, que produzem hormônios da placenta e exibição propriedades invasivas 6. As células trofoblásticas primárias de placentas primeiro trimestre humanos podem ser isolados, mas as células rapidamente DIFferentiate e parar de proliferar in vitro. Importante, transformada e linhas de células primárias têm diferentes perfis de expressão genética, indicando que linhas de células trofoblásticas tumorigênicos e imortalizadas podem não representar fielmente trofoblastos primários 7. Além disso, essas linhas não são susceptíveis de se assemelham a células progenitoras de células-tronco do trofoblasto da placenta, porque eles são derivados a partir de fases ulteriores primeiro através terceiro trimestres.
Existe uma necessidade de um sistema robusto em cultura in vitro em fase inicial de trofoblastos humanos, a fim de estudar os eventos iniciais da formação e função da placenta. células estaminais embrionárias humanas (hESCs), que compartilham propriedades, com a massa celular interna do embrião pré-implantação, são frequentemente usados para modelar o desenvolvimento humano precoce, incluindo a formação do início placenta. Ambas as células humanas pluripotentes induzidas estaminais (hiPSCs) e hESCs podem ser diferenciados em trofoblastos in vitro utilizando osso MorProteína phogenic 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Esta conversão de células pluripotentes para células trofoblásticas usando BMP4 é específico para células humanas e é amplamente utilizada para estudar o desenvolvimento da placenta humana cedo porque não exige o acesso a embriões humanos 9, 16. Recentemente, descobriu-se que a adição dos inibidores A83-01 (A) e PD173074 (P), que bloqueiam as vias de sinalização Smad2 / 3 e MEK1 / 2, aumenta a eficiência da diferenciação em células progenitoras HPSC trofectoderma-like, principalmente SYNs e TEVs, sem a ampla geração de mesoderme, endoderme, ou células ectoderma 9, 17 in vitro 9, 11. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a diferenciação in vitro de hPSCs em progenitores trofoblastos humanos utilizando meio de cultura BMP4 / A / P. Estas condições produzem número abundante de células de uma ampla variedade de aplicações, incluindo a sequência de ARN, interrupção de genes utilizando os siRNAs, infecções de agentes patogénicos, e a modificação genética utilizando transfecção mediada por lipofecção.
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Protocol
NOTA: Para a diferenciação de qualquer hESCs ou hiPSCs em progenitores trofoblásticas, hPSCs cultivadas em fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) são a transição para Alimentador livre condições para duas passagens antes de iniciar a diferenciação com BMP4 / A / P. Este processo elimina a contaminação FAE de células diferenciadas. Aqui, nós apresentamos um protocolo para a diferenciação de células estaminais embrionárias humanas, e o mesmo protocolo pode ser aplicado a hiPSCs.
1. Cultura e Recuperação de hESCs em irradiados embrionárias de camundongos Fibroblastos (MEFs) (Preparações)
- A irradiação gama, de MEFs
- Adicione 500 ml de meio para a cultura das MEFs: DMEM com 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 1x penicilina / estreptomicina (Pen / Strep), e 0,1 mM ácidos não essenciais (NEAA) amino.
- Descongelar um frasco de MEFs primárias e usar o meio MEF para a cultura das células. Expandir as MEFs primárias para 30 placas usando meio de cultura MEF.
NOTA: As concentrações de oxigénio não são críticos para este passo, assimqualquer um deles pode ser utilizado condições fisiológicas (4%) ou à temperatura ambiente (20%) dentro da incubadora. - Colher o MEFS. Use 0,25% de tripsina para remover as MEFs das placas e transferência das células para um tubo cónico. Coloque as MEFs em um instrumento de irradiação e expor as células a 3.500 cinzas.
Nota: A quantidade de tempo vai depender da actividade da fonte no interior do aparelho irradiador. - Ressuspender as MEFs irradiados com meio de cultura MEF e contar o número de células utilizando um hemocitómetro.
- Agregar as MEFs utilizando uma centrifugadora e adicionar 50% de meio de cultura de células MEF e 50% meio de congelação (80% de FBS e meio de cultura MEF 20%). Aliquota de 1 x 10 6 culas por frasco.
- Colocar os tubos MEF irradiada num -80 ° C congelador durante a noite, e depois transferi-los para o nitrogênio líquido para o armazenamento de longo prazo.
- Descongelamento MEFs congelados e hESCs para a cultura
- Adicione 500 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas: DMEM / F-12 com 20% de soro subsement, NEAA 0,1 mM, 2 mM de L-glutamina, 10 ng / ml de bFGF, ß-mercaptoetanol mM 0,1, e 1x Pen / Strep.
- Descongelar um frasco de MEFs um dia antes de descongelar os hESCs. Bata de uma placa de 6 poços com 0,1% de gelatina, utilizando-se 1 ml para cada poço. Incuba-se durante pelo menos 20 min à temperatura ambiente, e, em seguida, remover a gelatina.
- Remover um frasco de MEFs do armazenamento em azoto líquido e imerge o frasco num banho de água a 37 ° C. Assista o frasco de forma intermitente até que apenas pequenos cristais de gelo permanecem. transferir rapidamente o conteúdo do frasco a 9 ml de meio de MEF dentro de um tubo de 15 ml.
- Agregar as células por centrifugação a 200 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em meio de MEF. Alíquota da MEFs uniformemente sobre uma placa de 6 poços. Coloque a placa em um 37 ° C com baixo oxigênio (4%) incubadora durante a noite.
- Cultura de rotina de hESCs em MEFs
- Remover um frasco de células estaminais embrionárias humanas a partir de azoto líquido e rapidamente descongelar o frasco utilizando uma 37 ° C banho de água. Pipeta suavemente o hESCs para um tubo cónico de 15 ml contendo 9 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas e girar a 200 xg durante 5 min. Remover o meio e ressuspender as células com 1 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas.
- Aspirar o meio MEF da placa preparado no passo 1.2.4 e adicionar 1 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas. Adicionar inibidor da rocha Y-27632 (10 uM) ao meio de células estaminais embrionárias humanas. Transfira os hESCs em MEFs.
- Colocar as células em uma incubadora a 37 ° C, baixa-oxigénio (4%) durante a noite. Substituir o meio hESC diária. Raspar células diferenciadas com uma pipeta Pasteur, visualizados sob um microscópio vertical em 4x.
- A passagem hESCs a cada 4-6 dias, dependendo da célula de confluência e o tamanho das colónias de células estaminais embrionárias humanas. Prepare um prato de MEFs no dia anterior passaging. Quando as células estão prontas para passagem, remover o meio de células estaminais embrionárias humanas e lavar bem com 1 mL de PBS.
- Adicionar 1 mg / ml de colagenase (pré-aquecido a 37 ° C), incuba-se a 37 ° C durante 5 min, e remover a colagenase. Wash as células com PBS, adicionar 1 ml de meio por poço células estaminais embrionárias humanas, e raspar manualmente as células em pequenos aglomerados usando a ponta de uma pipeta de 5 mL. Transferir os aglomerados de células em suspensão em um poço novo MEF-revestida (s).
2. Transição de hESCs de MEFs para Alimentador livre Condições em placas de Matriz Extracelular revestidas
- Prepare MEF meio condicionado (CM)
- Placa os MEFs irradiados em um frasco T75 a 90-100% de confluência; é importante que as MEFs são densamente plaqueadas. Observar as células utilizando um microscópio para determinar se eles ligado ao fundo do frasco (MEFs anexar aproximadamente 6 horas após o plaqueamento ou no dia seguinte).
NOTA: células não ligadas flutuar no meio quando observada por um microscópio. No dia seguinte, remova o meio MEF e adicione 25 ml de meio hESC falta B-FGF. - Recolhe-se o meio condicionado após 24 h de incubação. Substitua por meio fresco diariamente, por um período máximo de 12 dias. Filtra-se o CM recolhidas utilizando um filtro de 0,22 um. Antes da utilização, adicionar fresco B-FGF para a CM.
NOTA: CM podem ser congeladas a -80 ° C e armazenada durante até 1 ano. Alternativamente, armazenar o CM a 4 ° C durante 2 semanas.
- Placa os MEFs irradiados em um frasco T75 a 90-100% de confluência; é importante que as MEFs são densamente plaqueadas. Observar as células utilizando um microscópio para determinar se eles ligado ao fundo do frasco (MEFs anexar aproximadamente 6 horas após o plaqueamento ou no dia seguinte).
- Transição dos hESCs de cultura sobre os MEFs para Alimentador livre placas revestidas com matriz extracelular.
- Preparação da matriz extracelular para placas de cultura de tecidos de revestimento
- Descongelar uma alíquota de matriz extracelular em gelo (cerca de 3-4 h). Utilizando pontas gelada, uma frio, tubo de 50 ml, e meio DMEM / F12, transferência de 2 mg de matriz extracelular em 24 ml de DMEM gelado / F-12 (a diluição depende da concentração da matriz extracelular do fornecedor ).
- transferir imediatamente o tubo de 50 ml de gelo e armazená-lo a 4 ° C. Para placas de cultura de tecidos de revestimento, adicionar a quantidade apropriada de matriz extracelular diluída ao poço (por exemplo, 1 ml por poço numa placa de 6 poços). Agitar para revestir a placa e incubar a temperatura ambiente durante pelo menos 1 h.
- hESCs passagem do MEFs (como no passo 1.3), utilizando CM contendo B-FGF (10 ng / mL).
- Aspirar para remover a matriz extracelular da nova placa e adicionar CM contendo B-FGF. Transferir os aglomerados celulares raspadas da placa utilizando uma pipeta de MEF e aliquotar em que a placa revestida com a matriz extracelular. Incubar no 37 ° C incubadora de baixo oxigênio durante a noite.
- Substitua o CM com meio B-FGF diária; a quantidade de meio dependerá do tamanho do frasco de cultura. Utilizar 2 ml de meio por um de 6 poços bem. Raspar células diferenciadas com uma pipeta Pasteur.
- hESCs passagem a cada 6-7 dias, quando as colónias são brilhantes quando vistas sob o microscópio.
NOTA: hES colónias cultivadas em placas revestidas com matriz extracelular crescer mais do que as células MEF-cultivadas. - Quando as células sem alimentador está pronto para a passagem, remover o meio, lavar por anúncioDing 1 ml de PBS utilizando uma pipeta, aspirado para remover o PBS, adicionar 0,5 mg / ml de dispase (pré-aquecido a 37 ° C) com uma pipeta, e incuba-se a 37 ° C durante 5 min.
- Lavam-se as células com PBS, adicionando 2 ml de PBS por poço e depois aspirar. Adicionar 1 ml de CM por poço e raspar manualmente as células em pequenos aglomerados usando a ponta de uma pipeta de 5 mL.
- Placa os aglomerados de células em suspensão em novas placas revestidas com matriz extracelular; as células devem aderir após 24 horas.
- Preparação da matriz extracelular para placas de cultura de tecidos de revestimento
3. Diferenciação de hESCs Usando BMP4 / A / P
- Prepara-se o meio de diferenciação. Uso cm (sem B-FGF) e adicionar (fresco) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 uM), e PD173074 (0,1 uM). Adicionar estes inibidores para o CM antes da utilização.
- Use hESCs livre de alimentação que crescem em placas revestidas com matriz extracelular por 1 passagem, cultivadas dentro de uma incubadora fixado em 4% de oxigênio. Após a primeira passagem em placas revestidas com matriz extracelular,permitir que as células aderir durante 24 horas. No dia seguinte, iniciar a diferenciação. Remover o CM (contendo B-FGF) e substituí-lo com CM contendo BMP4 / A / P (2 ml por poço numa placa de 6 poços). Continuar a cultura das células, utilizando os níveis de oxigénio de 4%.
- Substituir o CM contendo BMP4 / A / P (2 ml / poço, para uma placa de 6 poços) cada 2 dias. Aspirar para remover o meio velho e adicionar novo CM usando uma pipeta. No segundo dia após a adição e remoção de BMP4 B-FGF (considerado o dia diferenciação 2), a morfologia celular será alterado, aparecendo maior quando observada por um microscópio.
NOTA: indiferenciada de células que exibem bordas arredondadas brilhantes, não estará presente. - Coletar células em pontos de tempo desejados. células diferenciadas vai parar de se dividir após cerca de 2 semanas. células transfectar durante este período de tempo (veja a próxima seção).
4. A transfecção de células trofoblásticas com ARNsi ou DNA de plasmídeo
- Preparar células trofoblásticas para transfecção
- hESCs cultura para duas passagens na matriz extracelular após transferi-los a partir das MEFs (veja o passo 2.2). Use meio hESC contendo B-FGF.
- Dividir os hESCs para uma nova placa de matriz extracelular, um dia antes diferenciação. confluência celular elevada é importante, por isso dividir as células de 1: 1 para uma nova placa / poço, o que vai garantir, pelo menos, 50% de confluência no dia seguinte. Incubar as células durante a noite na incubadora de baixo oxigênio.
NOTA: hESCs não precisa ser contado durante este passo. - No dia seguinte, substituir o meio com o meio de diferenciação (CM contendo BMP4 / A / P e falta B-FGF, utilizando 2 ml / poço de uma placa de 6 poços). Remover o meio antigo por aspiração e transferir o novo meio (2 ml) usando uma pipeta. Colocar as células numa incubadora de baixo oxigénio (4% de oxigénio) durante a noite.
- Diferenciar as células até que o desejado tempo-ponto (entre os dias 1 e 14). O dia antes da transfecção, as células trypsinize usando 0,05% de tripsina durante 5 min. Placa-los para a confluência desejada (dependendo do protocolo de reagente de transfecção) para uma placa revestida com gelatina (adicionar 0,1% de gelatina a uma placa de cultura de tecidos durante 20 min e aspirado para remover). Adicionar CM contendo BMP4 / A / P (falta B-FGF) e incubar durante a noite.
- No dia seguinte, adicionar meio fresco diferenciação às células. SiRNAs transfectar utilizando um reagente de transfeco de siARN. Para ADN de plasmídeo, usar um reagente de lipofectamina apropriado.
- Seguir o protocolo do produto como se descreveu para cada um dos reagentes de transfecção. Transferir os complexos siRNA-lipofectamina a cada / placa poço de células, misture delicadamente e cultura das células durante a noite em uma incubadora de baixo oxigênio.
NOTA: Alguns reagentes de transfecção são inibidos por antibióticos, que exigem CM falta Pen / Strep. - No dia seguinte, substitua com a mídia diferenciação fresco.
- Colher as células no desejod pontos de tempo (por exemplo, 24 horas, 48 horas e 72 horas) para verificar a eficiência ruptura do gene usando RT-PCR quantitativo. Para as células de colheita, a utilização de 0,05% de tripsina, a adição de 1 ml por poço e incubar durante 5 min a 37 ° C. Adicionar 5 ml de meio de MEF por poço para neutralizar a tripsina. Girar as células a 200 xg durante 5 min e usar o sedimento de células para isolamento de ARN.
Infecção 5. Pathogen de células trofoblásticas: Infecção viral Sendai
- Prepare hESCs para a diferenciação
- hESCs cultura para duas passagens na matriz extracelular, após a transferência das MEFs (veja o passo 2.2). Use meio hESC contendo B-FGF.
- Dividir os hESCs para uma nova placa de matriz extracelular, um dia antes diferenciação. confluência celular é alta células importantes, assim divididas 1: 1 para uma nova placa / poço, o que vai garantir, pelo menos, 50% de confluência no dia seguinte. Incubar as células durante a noite em uma incubadora de baixo oxigênio (4% de oxigénio). <br /> NOTA: hESCs não precisa ser contado durante esta etapa.
- No dia seguinte, substituir o meio com o meio de diferenciação (CM contendo BMP4 / A / P e falta B-FGF) e a cultura durante a noite numa incubadora de baixo oxigénio (4% de oxigénio).
- Infecção virai de células trofoblásticas Sendai
- Um dia antes do dia desejado diferenciação, as células diferenciam trypsinize (para células individuais) usando 0,05% de tripsina durante 5 min e transferi-los para uma placa revestida com gelatina. Adicionar meio de diferenciação e incubar durante a noite em uma incubadora de baixo oxigênio.
- No dia seguinte, adicionar meio de infecção (isto irá variar dependendo do vírus). Uso CM falta de Pen / Strep contendo BMP4 / A / P, utilizando-se 0,5 ml para um poço de uma placa de 6 poços. Adicionar vírus Sendai para MOI = 1. Incubar durante 8 horas numa incubadora de baixo oxigênio.
- Se pontos de tempo adicional é necessário, remover o meio contendo vírus após 4 horas e substituí-la por BMP4 / A / P CM. coletar célulaspara isolamento de RNA usando um raspador de células.
- Determinar a eficiência da infecção virai através da realização de qRT-PCR para genes envolvidos na resposta viral 18.
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Representative Results
Visão geral de diferenciação in vitro de hPSCs
Este protocolo de diferenciação in vitro começa com hESCs indiferenciadas cultivadas em MEFs que estão a transição para Alimentador livre condições para uma passagem (Figura 1A). Enquanto nós descrevemos a diferenciação de hESCs neste protocolo, usamos esse protocolo para diferenciar com sucesso hiPSCs em células trofoblásticas. A transição para a matriz extracelular remove a maioria dos MEFs irradiados, que são indesejáveis para análises que exigem populações puras de células trofoblásticas humanas. hPSCs indiferenciadas são cultivadas em matriz extracelular e cultivados com CM contendo FGF-B até as colónias estão prontos para Passaging (aproximadamente uma semana). Isto mantém o estado pluripotente antes da indução de BMP4 / A / diferenciação mediada por P. As colônias são interrompidos em aglomerados de ~ 50-100 célulasusando dispase e passadas uma segunda vez para uma placa revestida com a matriz extracelular. No dia após Passaging, as células aderentes são pronto para induzir a diferenciação, e o meio é mudado para conter BMP4 / A / P falta B-FGF. As células diferenciadas proliferar durante cerca de 2 semanas, tempo durante o qual as células podem ser recolhidas para isolamento de ARN ou utilizados para experiências de transfecção. As alterações morfológicas parecem 1-2 dias após a diferenciação foi iniciado, e os resultados de uma experiência representativa são apresentados na Figura 1B. Note-se que as células nos dias 1-2 de diferenciação são maiores em tamanho do que as células a partir de dia 0 (Figura 1B). A colônia célula diferenciada cresce rapidamente, e essa mudança é perceptível a cada dia. Como a diferenciação prossegue, as células dividem-se e expandir-se para fora a partir do centro da colónia, que cresce numa direcção para fora (dias 3-5; Figura 1B). A porção exterior da colónia contém células maiores em comparação com o tele células no centro da colónia. As células diferenciadores tornam-se mais escura e mais plana do que as células-tronco pluripotentes cultivadas na matriz extracelular; as mudanças no brilho de células são mais aparentes quando visualizar as células com um microscópio vertical usado para cultura de células de rotina. As colónias individuais fundem em conjunto por dia diferenciação 5 (Figura 1B), com células que crescem em cima uns dos outros. Após o dia 4-5 diferenciação, as células que contêm vários núcleos estão presentes (não mostrado) (Figura 1B).
BMP4 / A / P induz a diferenciação e expressão de marcadores Trophoblast
Foram examinadas as alterações de expressão de genes durante os três primeiros dias de BMP4 / A / P diferenciação utilizando RT-PCR quantitativo (qRT-PCR). O ARN foi isolado a diferenciação dias 1, 2, e 3 e convertido em ADNc. O desaparecimento de células estaminais pluripotentes podem ser avaliadas tanto bY morfologia, visualmente usando um microscópio, e por qRT-PCR, utilizando iniciadores para genes de pluripotência. Os níveis de expressão relativos de NANOG, um marcador de células estaminais pluripotentes, é reduzida por ~ 75% após um dia de diferenciação quando as células são cultivadas com BMP4, e níveis são reduzidos em ~ 90% na presença de BMP4 / A / P ( Figura 2). Por dia diferenciação 2, os níveis de NANOG são muito baixos para células cultivadas em isoladamente ou em BMP4 / A / P BMP4 em comparação com aqueles em meio de células estaminais embrionárias humanas cm (contendo B-FGF). Este é um resultado esperado, uma vez que não se observam células indiferenciadas após dois dias de diferenciação (Figura 1B), que são mais claras e mais pequenos em tamanho em comparação com células diferenciadas. A eficiência da diferenciação mediada por células trofoblásticas para BMP4 pode ser avaliado directamente por qRT-PCR utilizando iniciadores específicos para dois marcadores trofoblásticas: KRT7 e CDX2. Ambos estes genes não são expressos em células-tronco pluripotentes humanasAs células, e os seus expressão aumenta após 2-3 dias de tratamento BMP4 (Figura 2). Usando as condições aqui descritas, os níveis de transcritos KRT7 aumentar a diferenciação no dia um em meio de BMP4 / A / P e permanece constante durante os primeiros 3 dias de diferenciação (Figura 2). Expressão KRT7 ao usar BMP4 sozinho tem um aumento de atraso por dia 2, de acordo com observações anteriores que a Activina / inibidores nodais aumentar a taxa de diferenciação de hESCs 9. Outra maneira de avaliar a eficiência de utilização destes inibidores é determinar a abundância de estado estacionário de Cdx2 e KRT7 transcritos em células tratadas só com BMP4. Níveis Cdx2 são semelhantes para os dias de diferenciação 1-3 ao usar BMP4 sozinho ou BMP4 juntamente com Activina / inibidores nodais. No entanto, os transcritos KRT7 são mais abundantes após um dia de diferenciação na presença destes inibidores, o que sugere uma maisdiferenciação rápida (Figura 2). CDX2 expressão tipicamente picos no dia 2 diferenciação para ambas as condições e diminui após o dia 3 (Figura 2). HESCs indiferenciadas não expressam quer KRT7 ou CDX2 (Figura 2), conforme o esperado. Em conclusão, as condições de BMP4 / A / P diferenciar rapidamente hESCs e expressão do marcador da placenta podem ser detectados tão cedo como o dia diferenciação 3.
Transfecções de DNA siRNAs e plasmídeo e infecções virais Usando In Vitro -derived células trofoblásticas
In vitro, as células trofoblásticas humanas derivadas podem ser transfectadas com siRNAs para destruir a expressão de genes de codificação, quer ARN ou não codificadoras. Iniciamos a diferenciação de hESCs usando BMP4 / A / P, realizados dois ciclos de transfecções siRNA (utilizando 75 pmol de siRNAs) nos dias 1 e 2 de diferenciação,e recolheram as células para isolamento de RNA. RT-PCR quantitativa é um método eficaz para determinar a eficiência knockdown para qualquer codificação ou genes não codificantes. Usando dois siRNAs complementares a diferentes regiões do ARN de comprimento, noncoding lncRHOXF1 19, obteve-se 80% knockdown de transcritos lncRHOXF1 (Figura 3A). A seguir, um siARN transfectadas (25 pmol) para o gene de codificação da proteína PRNhn L, também em dias de diferenciação 1 e 2. Observou-se uma redução de 80% nos transcritos hnRNP U seguinte duas transfecções consecutivos. Em células de trofoblasto progenitoras in vitro diferenciadas também pode ser utilizada para investigar as respostas imunes inatas. Foram realizadas infecções de diferenciação dia 2 as células utilizando vírus Sendai a uma MOI de 1 e recolhidas as células após 8 h de incubação viral. Usando qRT-PCR, foram detectados transcritos abundantes de proteína virai (SEV-NP) em células infectadas (Figura 3B), indicativos da pró viral activapagation em células trofoblásticas. Importante, as células infectadas usando (MOI = 1) não alteração na aparência e são viáveis (dados não apresentados). Em células trofoblásticas in vitro derivada pode também ser transfectadas com ADN de plasmídeo. Foi realizada transfecções usando um plasmídeo GFP e introduziu esta construção em / células tratadas com P BMP4 / A no dia diferenciação 1 e no dia 3 e fotografada para GFP no dia seguinte (Figura 4). Nós normalmente obtido 30-50% de eficiência de transfecção às 24 h pós-transfecção. Em conclusão, nas células trofoblásticas in vitro derivada pode ser utilizada para gain- e experiências de perda de função.
Figura 1: diferenciação in vitro de células estaminais pluripotentes para células trofoblásticas precoce utilizando BMP4 / A / P. (A) Representação esquemática de diferenciação BMP4 de hPSCs às células trofoblásticas usando BMP4 / A / P. (B) as imagens de campo brilhante representativos de células HUES9 durante 0, d2, e D6 de BMP4 / A / P diferenciação. Barra de escala = 50 uM. As setas indicam hESCs unicelulares que não são diferenciados. As setas destacar características morfológicas durante a diferenciação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: BMP4 / A / P diferenciação regula negativamente rapidamente a NANOG pluripotência marcador e regula positivamente genes trofoblásticas CDX2 e KRT7. análise de qRT-PCR para NANOG (marcador de pluripotência), CDX2, e KRT7 (marcadores trofoblastos). Os valores são médias de medidas em triplicado. //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: ruptura do gene e a infecção virai utilizando em células trofoblásticas humanas in vitro diferenciadas. (A) Análise de qRT-PCR de hESCs (HUES9) diferenciadas e, em seguida, transfectadas com ARNsi específicos ao longo, não codificante de ARN lncRHOXF1 (esquerda) ou o gene que codifica a proteína PRNhn L (direita) durante dois dias consecutivos. A eficiência knockdown (KD) é tipicamente 70-80%, e os resultados de uma experiência de transfecção são mostrados. (B) Análise de qRT-PCR da transcrição de proteínas virais Sendai de diferenciação dia 2 as células trofoblásticas infectados com o vírus Sendai (MOI = 1) durante 8 horas. As barras de erro representam o SEM."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig3large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Introdução de plasmídeo de ADN em células trofoblásticas humanas diferenciadas in vitro. Transfecção de ADN de plasmídeo em células de GFP diferenciação dia 1 e dia 3 trofectoderma progenitoras, visualizadas no dia seguinte. Barra de escala = 50 uM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nós apresentamos os passos básicos para a diferenciação de hESCs em progenitores trofoblastos. Este protocolo foi optimizado recentemente para diferenciar rapidamente hESCs com a adição de inibidores da Activina / Nodal sinalização, aumentar a diferenciação de células trofoblásticas e evitando a geração de células progenitoras da mesoderme, que são tipicamente observadas com o tratamento BMP4 sozinho. O sistema modelo BMP4 permite a análise das primeiras fases de especificação trophoblast linhagem humana e expansão. Além disso, este sistema modelo BMP4 também é útil para investigar a diferenciação de células trofoblásticas a sub-linhagens específicas, que não é possível utilizar linhas celulares de coriocarcinoma e linhas de células de trofoblasto extravilosas. Em células trofoblásticas in vitro derivada também pode ser utilizado para experiências de perda de função, utilizando ARNsi 19. Além disso, hESCs hiPSCs ou pode ser geneticamente modificada para a expressão induzível de transgen ES ou 19 para a inserção de genes repórter em loci endógena 20, e estas células podem ser diferenciadas em células trofoblásticas utilizando as condições descritas aqui.
Passos críticos dentro do Protocolo
É imperativo para omitir B-FGF (FGF2) a partir do meio de diferenciação CM para obter células progenitoras trofoblásticos de hESCs. A presença de FGF-B juntamente com BMP4 no meio de cultura aumenta a expressão da mesoderme e endoderme progenitores 16. A inclusão de B-FGF no meio de diferenciação trofoblasto é acreditado para explicar por que um estudo recente descobriu que a diferenciação mediada por BMP4 gera mesoderme e endoderme células em vez de trofoblastos 21. Está bem estabelecido que o FGF-B juntamente com Activina A e BMP4 promove endoderme e mesoderme diferenciação de uma forma dependente da dose 22,s = "xref"> 23. No rato, o desenvolvimento do epiblasto, trofectoderma e linhagens endoderme primitivos são dependentes de vias de sinalização FGF 24. Na diferenciação hESCs, a sinalização induzida por FGF-B é necessária para a formação da mesoderme BMP4 quando é utilizado para induzir a diferenciação 21, 25. Em contraste, a inibição de tanto o FGF e as vias de sinalização / Activina nodais, em conjunto com BMP4, favorece a formação syn em progenitores trofoblastos derivados de células estaminais embrionárias humanas e impede a formação de mesoderme e endoderme primitiva 26 progenitores.
Limitações da técnica
O problema mais comum com este protocolo de diferenciação HPSC para progenitores trofoblasto está associada com começando com uma população predominantemente indiferenciada de hESCs ou hiPSCs em MEFs. Porque hPSCs acumular células diferenciadas em ambas as arestas interiores e exterioresdas colónias, é importante controlar a quantidade de diferenciação diária e para remover as colónias diferenciadas (ou porções de colónias). A presença de células diferenciadas pode complicar o processo de diferenciação, em especial quando as células são transferidas para a matriz extracelular. As células diferenciadas proliferam rapidamente na matriz extracelular, na presença de CM, e estas células irão assumir rapidamente a cultura e para fora-competir o hPSCs. Portanto, é ideal para começar saudáveis colónias indiferenciadas, de hPSCs cultivadas em MEFs antes de transferir as células à matriz extracelular.
Importância da Técnica em Matéria de Existentes / Métodos Alternativos
Quando se utiliza este protocolo de diferenciação, as células progenitoras trofoblásticas resultantes são uma mistura heterogénea de tipos celulares. Trofoblastos são compostos de citotrofoblastos vilosidades, sinciciotrofoblastos (SYNs), e citotrofoblastos extravilosas(TEVs) 27. citotrofoblastos vilosidades são os progenitores que geram TEVs e SYNs. HPSCs diferenciados por BMP4 irá gerar uma mistura de citotrofoblastos vilosidades, SYNs e TEVs 9, 15, que foram definidos pela expressão do gene ou proteína de marcadores específicos da placenta. As vias de diferenciação diferentes podem ser distinguidos pela secreção de HLA-G (característica de TEVs) ou gonadotropina coriónica humana (a partir de SYNs) 28, 29. Recentemente, tem sido mostrado que a inibição da Activina / Nodal sinalização favorece a diferenciação de hESCs EVT, e a remoção desta inibição favorece a diferenciação SYN 17. Na verdade, uma publicação anterior descobriu que o uso de BMP4 sozinho para diferenciar hESCs gera principalmente células SYN 26. Os dados utilizando BMP4 / A / P e meio condicionado (falta B-FGF) indicam que existeestão ambos presentes células SYN por dia diferenciação 5. Se populações EVT puro ou SYN são desejados, a purificação adicional por meio de marcadores de superfície celular, tais como HLA-G conjugado com esferas para o isolamento de TEVs, é possível EVT e 29. Em conclusão, o método de cultura aqui descrito é uma forma eficaz para gerar quantidades significativas de células trofoblásticas de hPSCs que podem ser usados para uma variedade de aplicações. Porque este protocolo gera ambos os SYNs e TEVs, é um sistema modelo adequado para examinar a placenta humana cedo. Estas células podem ser utilizadas para uma variedade de aplicações, incluindo a descoberta da droga e da engenharia genética.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knock Out Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | This is referred to as "serum replacement" in this protocol. |
| NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 10828-028 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-155 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| B-FGF | Millipore | GF-003 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase Type IV | Invitrogen | 17104-019 | |
| Rock inhibitor Y27632 | Calbiochem | 688000 | |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | 6001G | MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated. |
| 0.22 µm syringe filter | Millipore | SLGS033SS | |
| Heracell 150i low oxygen incubator | Heracell/VWR | 89187-192 | Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient. |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-01M | |
| A 83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| PD173074 | R&D Systems | 3044/10 | |
| RNAiMax | Invitrogen | 13778150 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | Trizol is used to isolate total RNA. |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol. |
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