Summary
הזרקה היקפית של סיבים-synuclein אלפא לתוך הצפק או הלשון של Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים, המבטאים אלפא-synuclein אדם עם מוטצית A53T משפחתית בלוציפראז גחלילית, יכול לגרום בנוירופתולוגיה, כולל neuroinflammation , במערכת העצבים המרכזית שלהם.
Abstract
כדי ללמוד את ההתנהגות כמו-הפריון של synuclein אלפא misfolded, מודלי עכבר נדרשים המאפשרים שידור מהיר ופשוט של prionoids אלפא-synuclein, אשר גורם בנוירופתולוגיה בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS). כאן אנו מתארים כי intraglossal או זריקה intraperitoneal של הסיבים-synuclein אלפא לתוך bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים, אשר ביטוי יתר אלפא-synuclein אדם עם מוטציה A53T מן האמרגן חלבון הפריון ו גחלילית בלוציפראז מ האמרגן עבור חלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP), מספיקה כדי לגרום למחלה neuropathologic. בהשוואה הומוזיגוטיים Tg (M83 + / +) בעכברים כי לפתח סימפטומים נוירולוגיים חמורים מתחיל בגיל של 8 חודשים, הטרוזיגוטיים Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) חיות להישאר חופשי של המחלה ספונטנית עד שהם יגיעו בגיל 22 חודשים. מעניין, הזרקה של סיבי synuclein-אלפא באמצעות intraperitoneאל מסלול מושרה מחל נוירולוגית עם שיתוק בארבעה מתוך חמש Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים עם זמן דגירה החציוני של 229 ± 17 ימים. חיות נושאים מחלות הראו פיקדונות חמורים-synuclein אלפא פוספורילציה במוחם וחוטי שדרה. הצטברויות של synuclein אלפא היו sarkosyl-מסיסות ו colocalized עם היוביקוויטין ו p62, ולוו תגובה דלקתית וכתוצאה מכך דבק astrocytic ו microgliosis. באופן מפתיע, חיסון של סיבי synuclein-אלפא לתוך הלשון היה פחות יעיל בגרימת מחלה עם רק אחד מחמש חיות מוזרקות מראות פתולוגיה-synuclein אלפא לאחר 285 ימים. הממצאים שלנו מראים כי חיסון באמצעות המסלול intraglossal ועוד זאת דרך המסלול intraperitoneal מתאים לגרום מחלה נוירולוגית עם סימני ההיכר הרלוונטיים synucleinopathies ב Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) בעכברים. זה מספק מודל חדש לחקר הפריון דמוי בפתוגנזה לגרוםפ לפי prionoids-synuclein אלפא ביתר פירוט.
Introduction
יש ראיות הולכות ומצטברים כי-synuclein אלפא יש מאפיינים דומים לאלו של חלבון הפריון, במיוחד ביכולתה-זרע עצמי להפיץ misfolding בין תאים לאורך מסלולים עצביים. מאפיין זה של synuclein אלפא גם נקרא "פריון דמוי" או "prionoid", והוא נתמך על ידי תצפיות וניסויים להשתלה, אשר מצביעים על ההדבקה של synuclein אלפא misfolded מנוירונים חולה כדי הושתל נוירונים בריאים 1, 2 , 3, 4. כמו כן הזרקה ישירה של-synuclein אלפא misfolded לתוך המוח או בפריפריה, למשל בשריר hindlimb או לדופן המעי, התוצאות התפשטות פתולוגיה אלפא-synuclein לחלקים הדיסטלי של 5 CNS, 6, 7, <sup class = "Xref"> 8, 9, 10. ניתחנו העברת prionoids-synuclein אלפא באמצעות מסלולים היקפיים בפירוט יותר התייחס לשאלה האם-synuclein אלפא misfolded עשויה neuroinvade העצבים המרכזית לאחר intraglossal יחיד או זריקה intraperitoneal, תכונה שבעבר הוכח עבור פריונים אבל לא עבור אלפא misfolded synuclein. לאחר ההזרקה של פריונים לתוך הלשון, neuroinvasion של CNS מושג באמצעות התפשטות לאורך העצב תת-הלשון של הלשון שמובילה את הגרעין של עצב תת-לשון, הנמצא בגזע המוח 11. כמו במודל של עכברים בחרנו Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים כי ביטוי יתר של מוטציה A53T של synuclein אלפא האדם מן האמרגן הפריון, ו גחלילית בלוציפראז בשליטה של האמרגן GFAP לפקח ההפעלה astrocytic ידי פליטת אור, כמו בעבר הראו במוח שלפריון נגוע עכברים 12. בידיים שלנו bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים לא לפתח מחלת עד 23 חודשים של גיל כפי שהוכח על ידי אחרים 13. זריקה אחת של סיבי-synuclein אלפא האנושי דרך intraglossal או מחלה נוירולוגית הנגרמת המסלול intraperitoneal עם פתולוגיה במוחם ואת מיתרי השדרה של Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים תומכים בהשערה כי prionoids-synuclein אלפא אפיונים חשובים עם פריונים 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים כולל חיות בוצעו באישור ועדת הגנה על בעלי חיים של הסוכנות להגנת הסביבה נורדריין וסטפליה המדינה (LANUV). בעלי חיים שוכנו ומטופל בהתאם לתנאים סטנדרטיים עם אור 12 h / מחזור כהה גישה חופשית למזון ומים.
1. מודל חיה
- Intercross hemizygous Tg (GFAP -luc +/-) עכברים עם hemizygous Tg (M83 +/-) עכברים כדי ליצור hemizygous bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) בעכברים 15, 16.
- גנוטיפ הצאצאים עם PCR בזמן אמת עבור נוכחות של אלפא-synuclein האנושי קידוד transgene ועם PCR תקן גחלילית בלוציפראז 12, 17.
- לחסן את בעלי החיים בגיל שישה עד שמונה שבועות.
2. הכנת בידוד
- כן moאלפא-synuclein אנושי רקומביננטי nomeric עם המוטציה A53T מלוחים שנאגרו טריס (TBS) מאגר המכיל 150 מ"מ NaCl ב 20 mM Tris-HCl (pH 7.2) כפי שתואר קודם לכן 14.
- הכן אלפא-synuclein סִיבִי לצורך חיסונים על ידי התססה 3 מיקרוגרם / μL של synuclein-אלפא אנושי רקומביננטי monomeric ב שייקר מסלולית ב 800 סל"ד ו 37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים.
- לדלל מכלולים הפיברילות ב פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) כדי להגיע לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / μL עבור intraperitoneal או 2 מיקרוגרם / μL עבור חיסונים intraglossal.
- שבר את סיבי synuclein-אלפא עם sonicator מוט עבור 1 דק '(40 פולסים של משך s 0.5 עם הפסקה של שנייה אחת בין כל דופק ואת משרעת מוגדרת 50%) על קרח. כדי למנוע זיהום על ידי זריעת צלב. להשתמש בדיקות sonication נקיות להכין בידוד שונה.
3. זריקות Intraglossal
- להרדים חיות עם intrapeהזרקת ritoneal של 100 מ"ג / ק"ג קטמין 10 מ"ג / ק"ג xylazine. לצבוט את הבוהן של החיה ולאשר שזה לא לסגת hindlimb שלה כדי להבטיח הרדמה תקין. השתמש במשחת וטרינר על העיניים של החיה כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
- תקן חיות מסוממות בזהירות עם דבק על גבי צלחת חימום בעמדת גב שכיבה עם ראשם פונה לכיוון החוקר.
- מלאו מזרק חד פעמי 27 G עם 5 μL של סיבים-synuclein אלפא sonicated או PBS.
- שימוש במלקחי אגודל פחוסת-חוטם אחד עם טיפים משוננים להחזיק את הפה של החיה פתוחה, וזוג נוסף קטן יותר של מלקחיים בזהירות לשלוף את הלשון כדי להפוך את הצד התחתון של הלשון נגישה עבור הזרקה.
- להזריק את המחט של המזרק לתוך הצד התחתון הימני או השמאלי של הלשון בסמיכות העצבה תת-הלשון. לאט לאט להזריק את הבידוד אחרי 5 ימים. לאט לאט חוזר בי את המחט לאחר 5 ימים כדי להבטיח כי הבידודחדרה הרקמה והוא לא איבד תוך שמבטלת את המחט.
- שחרר את החיה מן הקיבעונות שלו ולהשאיר אותו על צלחת חימום תת ניטור מתמיד עד להחלמה מלאה.
4. זריקות intraperitoneal
- עבור זריקות intraperitoneal, לְהַרְדִים החיות בקרוב תא הרדמה משאיפת עם חמצן isoflurane / באמצעות קצב הזרימה של 2 ליטר / דקה ו מאדה מוגדר 2%. לצבוט את הבוהן של החיה ולאשר שזה לא לסגת hindlimb שלה כדי להבטיח הרדמה תקין.
- מלאו מזרק חד פעמי 27 G עם 50 μL של סיבים-synuclein אלפא sonicated או PBS.
- ישירות להזריק לתוך הצפק של עכבר ולהימנע חודר למעי או cecum קטן הממוקם מאחורי קיר הבטן על ידי החזקת החיה בעמדה הגב עם הראש מול הרחק החוקר וכלפי מטה על כ 45 °. מעקב אחר בעלי חיים עד שהם התאוששומן ההרדמה.
5. הדמיה פליטת אור
- Tg תמונה (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים כל 2-4 שבועות באמצעות מערכת הדמיה פליטת אור.
- לפני ההדמיה בקרוב להרדים עכברים בתא isoflurane / חמצן עם קצב זרימה של 2 ליטר / דקה ו מאדה מוגדרת 2%. לצבוט את הבוהן של החיה ולאשר שזה לא לסגת hindlimb שלה כדי להבטיח הרדמה תקין.
- גילוח את שער ראשי העכברים עם קרם מקריח. צבע את האוזניים בשחורות בטוש לא מעצבן לחסום פליטת אור נוקבת.
- לדלל מלח אשלגן D-luciferin, המצע של luciferase, ב PBS פתרון המניות 30 מ"ג / מ"ל. בחנות זו ב 1 aliquots מ"ל ב -20 ° C. הגנו על D-luciferin מומס מחשיפה לאור.
- לשקול את החיות לפני ההזרקה. חשב את נפח המדויק של D-luciferin עבור הזרקה של 150 מ"ג / ק"ג משקל גוף. Intraperitoneally להזריק D-luciferin ולהחזיר את בעל החיים בתא הרדמה.
- הפעל את תוכנת ההדמיה. לאחר מערכת ההדמיה הגיעה טמפרטורת ההפעלה שלה לאתחל את המערכת על ידי לחיצה על הכפתור "האתחול" בלוח הבקרה.
- בחר את "אור פלורסנט" ו "צילום" הכפתורים. קבע את זמן החשיפה כדי 60 s, binning אל "בינונית", ה- F / Stop ל "1", ואת רווח EM ל "כבוי".
- ודא מסנן עירור מוגדר "בלוק" ואת מסנן פליטה ל'פתח ', ולהגדיר את גובה בכפוף 1.50 ס"מ.
- עשר דקות לאחר הזרקה עם D-luciferin, למקם את החיות לצלחת החימום בחדר ההדמיה ולהבטיח כי חרטומם ממוקם כראוי לשקע ההרדמה. סגור את זרימת isoflurane / חמצן מבית הבליעה שאיפה לפתוח את הזרימה עבור חדר ההדמיה עם קצב זרימה של 0.25 L / min ו אידוי של 2%. סגור את הדלת של יחסי ציבור לחדר ההדמיהoperly.
- לחץ על הכפתור "רוכש את" כדי למדוד את פליטת האור, אשר לוקח 60 s. עצור את זרימת isoflurane ולנטר את החיות עד שהם התאוששו לחלוטין לאחר שחזר אותם בחזרה לכלובים שלהם.
- השתמש בתוכנת ההדמיה לכמת את פליטת האור. בעמוד התווך "Palette Tool" לבחור "כלים ROI". תחת "סוג" בתוך "כלי ROI" בחר "ROI המדידה".
- בעמוד התווך "כלים ROI" על הכלי "המעגל" ובחר את מספר ROIs לצייר מהתפריט לנתץ - אידיאלי "3" במשך שלושה עכברים.
- בתמונה, לחיצה ימנית על כל ROI ותחת "מאפיינים" להתאים את הרוחב והגובה של 1.25 ס"מ. מיקום כל ROI על האזור במוח היא לכמת.
- בפינה הימנית העליונה של התמונה, להגדיר בלוח יחידות "זוהר (פוטונים)".
- בעמוד התווך "Palette Tool", ובחר "תמונה כוונן" ולהתאים את המינימוםהמקסימום של "סולם צבעים", למשל, מן 0.20e6 כדי 1.00e6.
- תחת "קובץ" לשמור את הנתונים עם "שמור".
6. ניתוח ביוכימיים
- לבודד את המוח ואת מיתרי השדרה פי פרוטוקולים הוקמה 18, 19.
- Homogenize כולו מוח ודגימות חוט השדרה כולו בנפרד PBS בנוכחות מעכבי פרוטאז ו phosphatase (מדולל ל X 1 ב PBS) בשני 30 מחזורים של עם 6000 סל"ד ב homogenizer רקמות. ודא כי המוח ודגימות וחוט השדרה הומוגני לריכוז סופי של 20% (wt / כרך).
- Sonicate דגימות פעמיים תוך שמירה על אותם על הקרח עם דופק קבוע של 10 s ו משרעת מוגדר 50%.
- התאם את homogenates כדי 10% ב PBS ו 750 מ"מ NaCl ידי דילול אותם 1: 1 עם 1.5 M NaCl ב PBS.
- כדי להפריד את הפסולת התאית, צנטריפוגות homogenates ב 1000 XG במשך 5 דקות ב4 ° C. שמור את supernatants לקראת השלבים הבאים וזורקים כדורי.
- למדוד את ריכוז החלבון homogenates באמצעות חומצה bicinchoninic assay (BCA) על פי הוראות היצרן. דגירה 1.0 מ"ג של חלבון סך homogenates המוח או 0.8 מ"ג מן homogenates חוט השדרה ב N-laurylsarcosyl בריכוז סופי של 10% (wt / כרך) במשך 15 דקות על הקרח.
- מכסים את homogenates על כרית סוכרוז 3 מ"ל של 10% (wt / כרך) במים מזוקקים ultracentrifuge אותם 465,000 XG עבור 1 ש 'ב 4 מעלות צלזיוס.
- Resuspend את כדורי במאגר המכיל סולפט dodecyl 4% נתרן (SDS), 2% β-mercaptoethanol, 192 גליצין מ"מ, 25 מ"מ טריס, ו 5% (wt / כרך) סוכרוז.
- מרתיח את הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דק 'ומעלה אותם על ג'ל SDS-polyacrylamide אלקטרופורזה בתוך חומצת morpholineethanesulfonic מערכת חיץ (MES).
- העברת חלבונים מופרדים כדי polyvinylidene difluoride (PVDF) ממברנות בתוך SEMidry סופג מערכת.
- דגירה ממברנות ב 0.4% (כרך / כרך) פתרון פורמלין PBS עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר על הרוטור עם 35 סל"ד כדי צולבות הקישור החלבונים עם הממברנה.
- חסום את ממברנות ב TBS חיץ המכיל 0.05% (כרך / כרך) Tween 20 ו 5% (wt / כרך) חלב 1 שעות בטמפרטורת החדר.
- דגירה כתם עם הנוגדן הראשוני חסימת חיץ בין הלילה ב 4 ° C..
- שטפו את ממברנות שלוש פעמים TBS חיץ דגירה אותם עם נוגדנים משני peroxidase- או fluorophore מצומדות ב TBS עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר.
- דמיינו את הנוגדנים משני מחויב chemiluminescence או פלואורסצנטי פי פרוטוקולים הוקמו 20.
7. ניתוח Immunofluorescence
- מייבשים את המוח גזור מיתרי השדרה בתחנת עיבוד רקמות ולהטביע אותם פרפין באמצעות תחנת פרפין.
- חותכים את TIS פרפין-מוטבעתובעת עם microtome ב 8 חלקי העטרה עבים מיקרומטר ו הר בסעיפים בשקופיות זכוכית.
- Deparaffinize בסעיפי הרקמות ידי דוגרים להם שתי אמבטיות xylol נפרדות במשך 5 עד 10 דקות ו רעננותם אותם באמצעות סדרה של אמבטיות אתנול מדורגים (100%, 90%, 70%, 50%) ולבסוף עם H 2 O.
- דגירת מקטעי חיץ ציטראט 0.01 M (pH 6.0) עבור 5 דקות בטמפרטורת חדר ובנוסף להרתיח אותם 10 דקות במיקרוגל.
- תנו חלקים להתקרר לטמפרטורת החדר דגירה אותם עם פתרון חמצן 3% עבור 30 דקות כדי לעכב peroxidases אנדוגניים.
- חסום את הסעיפים רקמה על ידי הדגירה עם 20% (כרך / כרך) בסרום עז נורמלי, 1% (כרך / כרך) אלבומין בסרום שור (BSA), ו 0.5% טריטון X-100 ב PBS עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר.
- דגירה החלקה עם הנוגדן העיקרי מדולל 1% (כרך / כרך) בסרום עז נורמלי, 1% (כרך / כרך) BSA, ו 0.25% Triton X-100 ב PBS הלילה בשעה C ° 4. <li> לשטוף את הסעיפים פעמיים עם 0.25% (כרך / כרך) טריטון X-100 ב PBS ופעם עם PBS.
- הכתם בסעיפים עם נוגדנים משני fluorophore מצומדות המקביל ואת DAPI צבע גרעיני מדולל 1% (כרך / כרך) בסרום עז נורמלי, 1% (כרך / כרך) BSA, ו PBS עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר.
- לאחר שטיפת פעמיים עם 0.25% (כרך / כרך) טריטון X-100 ב PBS ופעם עם PBS, coverslip השקופיות עם התקשורת הטבעה ולדמיין מכתים עם מיקרוסקופ סורק לייזר confocal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הזרקה היקפית של prionoids-synuclein אלפא באמצעות הלשון או בנוירופתולוגיה מושרה הצפק ב CNS של bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים (לוח 1 ואיור 1). לאחר הזרקת intraperitoneal יחידה עם סיבים-synuclein אלפא, ארבעה מתוך חמישה עכברים פתחו מחל נוירולוגית עם זמן דגירה החציוני של 229 ± 17 ימים. באופן מפתיע, רק אחד מחמישה עכברים פיתחו מחלת CNS לאחר הזרקת intraglossal עם הסיבים-synuclein אלפא לאחר 285 ימים. חיסון עם PBS לא לגרום למחלה בתוך תקופת 420 יום של הניסוי.
ניתוח ביוכימיים ידי המערבי סופג ו חיטוט עם נוגדן ספציפי EP1536Y-phospho נגד Ser129 של אלפא-synuclein גילה כי הן דרכי העברתו חיות מחלות המהוות צברו אגרגטים של פוספורילציה sarkosylsynuclein-אלפא -insoluble במוחם וחוטי השדרה (לוח 2 ואיור 2). לעומת זאת, המוח ואת מיתרי השדרה של PBS-מוזרק ובעלי חיים שאינם חולים בלבד הכלול מינים monomeric של synuclein אלפא פוספורילציה.
מכתים Immunofluorescent של פרוסות מוח של עכברים שהוזרקו וחולי intraperitoneally עם נוגדן pSyn 64 # ספציפי-phospho גילה התפלגות רחבה של פיקדונות אלפא-synuclein פוספורילציה ברחבי CNS (לוח 2 ואיור 3). יתר על כן, פיקדונות אלפא-synuclein פוספורילציה colocalized עם היוביקוויטין ו p62 מציין הומאוסטזיס חלבון סוטה שעשויות לתרום להיווצרות של פיקדונות.
הצטברות של אגרגטים אלפא-synuclein בחיות חולות לווה בשינויים neuroinflammatory, אשר זוהה על ידימכתים immunofluorescence עבור GFAP, סמן של האסטרוציטים שיכולים לחשוף astrogliosis תגובתי (איור 4). בנוסף, מיקרוגליאה מופעל נמצא גם באזורים עם פתולוגיה אלפא-synuclein בשפע ידי מכתים immunofluorescence עבור רשות שידור-1 (מיונן מולקולת מתאם מחייב סידן 1). בהתאם, הדמיה פליטת אור חשף גדל זוהר (> 2 × 10 6 p / s / ס"מ 2 / sr) הנפלטת מן המוח של Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים שהוזרק עם הסיבים-synuclein אלפא, זמן קצר לפני שהם פיתחו סימני מחלה נוירולוגית. לעומת זאת, המוח של עכברים שהוזרקו עם PBS לא הראה שום עלייה זוהרת. זוהר מוגבר מעיד על astrogliosis תגובתי, סימן ההיכר של neuroinflammation, מאז ביטוי luciferase הוא מונע מן האמרגן GFAP.
איור 1: הזרקת עם הסיבים synuclein-אלפא באמצעות intraperitoneal או מסלול intraglossal גורם המחלה bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) בעכברים. (א) מיקרוסקופ אלקטרונים של הסיבים-synuclein אלפא אנושי רקומביננטי sonicated שהיו intraperitoneally ואת intraglossally הזריקו לעכברים. מכתים שלילי עם אצטט uranyl חשף אשכולות מרובים של אגרגטים קצר, בצורת מוט. ברים בקנה מידה = 100 ננומטר. (B) עקומות הישרדות קפלן-מאייר מראים כי לאחר הזרקת intraperitoneal עם הסיבים-synuclein אלפא ארבעה מחמשת Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים פיתחו מחלה נוירולוגית ב 229 ± 17 ימים (סגול נסגר ריבועים), בעוד שאף אחד העכברים המלאים המוזרקים PBS פתח סימנים של תפקוד נוירולוגים בתוך 420 ימים (ריבועים פתוחים סגולים). לאחר חיסון intraglossal עם סיבים-synuclein אלפא עכבר אחד מחמש מת לאחר 285 ימים (ירוקבחוגים סגורים). לעומת זאת, אף אחד עכברי השליטה הזריק PBS פתח מחל נוירולוגית או מת באופן ספונטני (עיגולים פתוחים וירוקים). השתנה מן ואח Breid. , 2016 14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: ניתוח ביוכימיים של synuclein אלפא פוספורילציה של מערכת העצבים המרכזית של שולי מוזרק Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) בעכברים. (א) Immunoblotting עם נוגדן EP1536Y, הכרה זירחון על Ser129 של synuclein אלפא, הראה כי מוזרק intraperitoneally ועכברים חולה שנצבר מינים גבוה בעל משקל מולקולרי של אגרגטים sarkosyl-מסיסים של synuclein אלפא פוספורילציה במוחםמיתרי השדרה ד. עכברים בקרת תיגר עם PBS לא לצבור אגרגטים של synuclein אלפא פוספורילציה הראה להקות רק עבור טופס monomeric שלה. (ב) לאחר אתגר intraglossal עם סיבים-synuclein אלפא רק אחד עכבר, חית 121, הראה אגרגטים sarkosyl-מסיסים של synuclein אלפא פוספורילציה המוח שלה וחוט שדרה, ואילו כל העכברים intraglossally המחוסנים האחרים נותרו בריאים ללא הפקדות של synuclein אלפא. המונים מולקולריים מוצגים kilodaltons. טעינת מדגם בכל נתיב מוצגת על ידי זיהוי של אקטין. השתנה מן ואח Breid. , 2016 14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: ניתוח Immunofluorescence מראה כי הפקדות שלאלפא-synuclein פוספורילציה colocalize עם היוביקוויטין ו p62 במוחם וחוטי השדרה של חולה Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) בעכברים. Co-מכתים של אלפא-synuclein פוספורילציה, זוהה עם הנוגדן EP1536Y, ו היוביקוויטין חשפו colocalization מובחנת במוחם, כפי שנצפתה גרעין התלמוס (א), ואת מיתרי השדרה, כפי שזוהו בחומר האפור (B), של עכברים חולים לאחר אתגר intraperitoneal עם סיבים-synuclein אלפא. באופן דומה, אלפא-synuclein פוספורילציה, זוהה עם הנוגדן # 64 pSyn, גם colocalized עם p62 במוח (C) ומוליכים השדרה (D) של חיות חולות. (A עד D) חיות בריאות-מוזרק PBS לא הראה פיקדונות או colocalization לכל החלבונים הללו. מכתים גרעיני עם DAPI מוצג בכחול. ברים בקנה מידה = 20 מיקרומטר. השתנה מן ואח Breid. , 2016 14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים פתחו דבקים לאחר אתגר היקפי עם סיבים-synuclein אלפא. (א) ניתוח immunofluorescence של חלקים במוח של חיות חולות עם נוגדן נגד GFAP, סמן של האסטרוציטים, חשף astrogliosis תגובתי באזורים עם פיקדונות של synuclein אלפא פוספורילציה, אשר התגלו בגזע המוח עם נוגדן # 64 pSyn. לעומת זאת, לא היה astrogliosis תגובתי במוחות של עכברים שליטה הזריק PBS. באופן דומה (B), צביעה עם נוגדן ל IBA-1, סמן של המיקרוגליה, הפגין microgliosisבאזורים עם פיקדונות של synuclein אלפא פוספורילציה בחיות חולות. המוח של בריאה, עכברי שליטה הזריקו PBS לא הראה סימנים של microgliosis. (ג) פליטת אור הדמיה חשף זוהר גבוהות מן המוח ואת מיתרי השדרה של Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים שהוזרק intraperitoneally עם הסיבים אלפא-synuclein (פאנל משמאל), אשר נגרם על ידי הפעלה של האסטרוציטים , זמן קצר לפני העכברים פיתחו תסמינים נוירולוגים. במוחם ואת מיתרי השדרה של עכברים שליטה הזריק PBS מזיו הבסיסי אינו גדל עם הזמן (פאנל מימין). לאחר חיסון intraglossal עם הסיבים synuclein-אלפא, אחד Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) העכבר, החיה 121, הראה סימנים של astrogliosis תגובתי זמן קצר לפני שהוא נפטר ב 285 ימים (פאנל במרכז). (ד) לאחר האתגר intraperitoneal של Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים עם הסיבים synuclein-אלפא, increaרמות SED של פליטת אור (> 2 × 10 6 p / s / ס"מ 2 / sr) נמדדו ממוחם של ארבעה עכברים (כחול, ירוק, חום, ועיגולים כתום) כמה שבועות לפני שהם פיתחו סימנים נוירולוגיים של המחלה. אחת מחמשת החיות גם הראו רמות גבוהות של פליטת אור זמן קצר לפני שהוא מת 285 ימים לאחר הזרקת intraglossal עם הסיבים אלפא-synuclein (עיגולים מג'נטה). לעומת זאת, עבור בריאים, עכברי שליטה הזריק PBS (עיגולים שחורים; ברים שגיאים להראות SD [n = 4]) ובעלי חיים אחד שלא לפתח מחלה לאחר זריקת intraperitoneal עם סיבים-synuclein אלפא (עיגולים אדומים), אות פליטת האור נשארת מתחת לסף של 2 x 10 6 p / s / ס"מ 2 / sr בתוך תקופה של התבוננות. ברים בקנה מידה = 20 מיקרומטר. השתנה מן ואח Breid. , 2016 14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של זהדמות.
| קו מאוס | בידוד (מיקרוגרם) | מסלול חיסון | מס של עכברים עם מחלה / לא. של עכברים מחוסנים | Mean הישרדות הזמן ± SD (ימים) |
| Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) | סיבים α-synuclein אדם (50) | intraperitoneal | 4/5 | 229 ± 17/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) | PBS | intraperitoneal | 0/5 | 0/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) | סיבים α-synuclein אדם (10) | intraglossal | 1/5 | 285/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) | PBS | intraglossal | 0/4 0/420 |
טבלה 1: ניסויים חיסון. * השתנה מן ואח Breid., 2016 14
| יעד [שיבוט נוגדן] | מארח | אימונוגן | דילול ב IF | דילול ב WB |
| תקטין [C4] | עכבר | - | - | 1: 1000 |
| α-synuclein, phospho S129 [pSyn # 64] | עכבר | pSer129 | 1: 1200 | - |
| α-synuclein, phospho S129 [EP1536Y] | אַרנֶבֶת | pSer129 | 1: 100 | 1: 1000 |
| חלבון חומצי גליה fibrillary (GFAP) | אַרנֶבֶת | - | 1: 200 | - |
| רשות השידור-1 | אַרנֶבֶת | - | 1: 500 | - |
| Sequestosome-1 (p62) | אַרנֶבֶת | - | 1: 100 | - |
| יוביקוויטין [Ubi-1] | עכבר | - | 1: 500 | - |
טבלה 2: נוגדנים המשמשים immunofluorescence (IF) ומערב סופג (WB). * השתנה מן ואח Breid., 2016 14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הזרקה היקפית של סיבים-synuclein אלפא לתוך הצפק של Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים מייצגים שיטה קלילה כדי לגרום פגיעה עצבית מלווית neuroinflammation לשחזר מאפיינים חשובים של synucleinopathies. באופן דומה, הזרקת הלשון מייצגת נתיב אחר neuroinvasion ידי prionoids-synuclein אלפא בעכברים טרנסגניים אבל הוא פחות יעיל. בחרנו לסיים את הניסויים שלנו בכתובת 420 ימים לאחר הזרקה ואנחנו לא יכולים לשלול את האפשרות כי יותר או כל העכברים שהוזרקו הפיברילות עשוי פתחה מחלה בנקודת זמן מאוחר יותר. בנוסף, שימוש Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים מאפשר הדמיה לא פולשנית של astrogliosis ומייצג שיטה פשוטה למעקב אחר תגובות דלקתיות הנגרמות על ידי neuroinvasion של synuclein אלפא מעל טווח החיים של עכבר.
שלב קריטי הוא הכנהשל הבידוד. לכאורה גורמים טריוויאליים כמו זמן צבירה, זמן sonication, שפע של אנדוטוקסינים, או את כמות הסיבים המשמשים להזרקת יכול להשפיע על תוצאות ניסוי על ידי המשפיע על הנטייה זריעת-synuclein אלפא misfolded 21. לכן חשוב תמיד להשתמש באותם התנאים בעת הכנת inocula להזרקה. עבור זריקות intraglossal זה חייב להיחשב כי לא רק העצב תת-הלשון אלא גם עצבי גולגולת אחרים כמו עצב הלשון והלוע המעצבבים את הלשון ואת יכולה להיות מעורבת להובלת איטרניורונאליים של prionoids-synuclein אלפא למוח. לפיכך מיקוד באזורים שונים של הלשון יכולה לגרום קינטיקה מתפשטת שונה למוח. אנחנו לא להזריק ישירות לתוך עצב תת-הלשון ולא מן הנמנע כי מיקוד עצב תת-הלשון יכול לשפר שידור CNS של prionoids אלפא-synuclein. עבור זריקות intraperitoneal עם סיבים-synuclein אלפא הוא critiקאל כי הבידוד הוא מוזרק בצורה נכונה לתוך הצפק ולא בטעות לתוך איברים פנימיים כמו המעי או cecum, אשר עלולים להשפיע באופן שלילי neuroinvasion. זה חשוב גם עבור הדמיה פליטת אור כאשר מזריקים D-luciferin. Mistargeting של D-luciferin לאיברים פנימיים יכול להאט ההפצה שלה למוח ולגרום פליטת אור נמוך. כדי להשיג תוצאות אחידות במהלך הדמיה זה גם קריטי תמיד טרי להכין את פתרון D-luciferin לפני הזרקה וכדי לתת לזה בדיוק דגירה של 10 דק 'לאחר זריקת intraperitoneal לפני ההדמיה.
הדמיה פליטת אור היא שיטה שימושית לשינויים מידה הלא פולשני ב astrogliosis לאורך זמן יכול להיות מיושם לא רק אחרי intraperitoneal או זריקות intraglossal אך גם לאחר כל סוג של טיפול כולל, למשל, תוך-מוחי או זריקות תוך ורידי. כדי לפקח הפצת prionoids אלפא-synuclein מהפריפריה אל CNS ואת neuroinflammation שהתפתח השתמשנו bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) בעכברים. בגלל ביטוי hemizygous של synuclein אלפא בחיות הללו הוא 40% ביחס נמוך לבעלי חיים הומוזיגוטיים הם נשארים ללא מחלה ספונטנית עד 22 חודשים של גיל ויש להם רקע גנטי מתאים לשידור-synuclein אלפא לומד 13. עם זאת, שינויים לגבי בחירת מודל העכבר עבור הדמית פליטת אור יכולים להיות רצויים. אפשרות מעניינת היא השימוש monogenic Tg (GFAP -luc +/-) בעכברים המבטאים רק luciferase כמו transgene, המאפשר הערכה של התנהגות prionoid של הסיבים-synuclein אלפא על רקע זה הוא למעשה wild-type ככל -synuclein אלפא עוסקת 14. יתר על כן, חציית Tg (GFAP -luc +/-) עכברים עכברים טרנסגניים אחרים, כגון Tg (SOD1 G93A) עכברים עבור טרשת לרוחב amyotrophic או Tg (APP23) מ 'קרח עבור מחלת אלצהיימר, מאפשר הדמיה של neuroinflammation במודלי מחלה אחרים 22, 23.
מגבלה של פרוטוקול זה היא כי מבוסס על זריקת הבידוד המוזרק לא יכול לחרוג נפח מסוים. לכן זריקות לתוך הלשון יכולות להתבצע רק עם כמויות קטנות יותר מאלה לתוך הצפק, אשר עשוי להשפיע פעמי הולכה אל CNS. מגבלה נוספת היא כי transgene GFAP -luc רק מאפשר זיהוי של astrogliosis אבל לא של microgliosis, וזה לא פחות חשוב neuroinflammation. לבסוף, מודל זה אינו מספק תובנות לגבי האופן synuclein-אלפא prionoids להגיע CNS לאחר הזרקת intraperitoneal.
היישום של prionoids אלפא-synuclein אקסוגניים באמצעות הזרקה הוכח להיות שיטה יעילה ללמוד מסלולי שידור כי לשחק תפקיד קריטי משחזר מאפיינים של synucleinopathies. זריקות תוך-מוחיות של סיבי אלפא-synuclein רקומביננטי או העכבר הקשורים למחלה או מינים-synuclein אלפא אדם לתוך מודלים של בעלי החיים שמשו במספר מחקרים לנתח מאפייני הזריעה שלהם ויעילות הילוכים לאורך זמן 5, 7, 17, 24, 25, 26. מאז זריקות stereotactic לתוך המוח תמיד לגרום לתגובה דלקתית מקומית זמן קצר לאחר ניתוח, מסלול שידור זה עלול להשפיע על הפצת הדבקה של הבידוד נגרם על ידי שינוי של הומאוסטזיס המוח. מחקרים מאוחרים יותר שינו את המיקוד ליישומים היקפיים או מערכתיים, לא בעיקר כדי למנוע את ההליך כירורגי אלא לנתח את הפריפריה, את דופן המעי, שרירי שלד, או דם, כנקודה ראשונית מהמקום שבו neuroinvasion אל CNS יכול לשתףmmence 6, 9, 14, 27. עבור פריונים הוכח שידור שבאמצעות הצפק או הלשון מובילה neuroinvasion ומחלות נוירולוגיות; לאחר הדבקת לשון, פריונים להתפשט בתוך שבועות בלבד לגרעין hypoglossal במוח גזע 11. מאז-synuclein אלפא נדון כבעלי תכונות neuroinvasive וזריעה כמו פריונים, הראינו כי תמסורת באמצעות הלשון ואת הצפק מייצגת נקודות כניסה נוספות prionoids-synuclein אלפא לפלוש CNS 14. כימות astrogliosis ידי הדמית פליטת אור מקלות על המעקב של תהליך neuroinflammatory לאורך זמן ומהווה חלופה לא פולשנית ניתוח היסטולוגית.
כדי להשיג תובנות עמוקות יותר כיצד CNS מגיב neuroinvasion של prionoids אלפא-synucleinו לטיפולים אחרים שגורמים neuroinflammation, זה יהיה מועיל ליצור מודלי עכבר כי גם לאפשר ניטור פולשני של microgliosis, למשל עם transgene שמניע ביטוי luciferase מן אמרגן ספציפי עבור ביטוי חלבון שריר כלשהו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים אולגה שארמה, תרזה Hundt, והצוות של מתקני מיקרוסקופיה ובעלי חיים DZNE לקבלת תמיכה טכנית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-actin antibody | Merck Millipore | MAB1501 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anti-GFAP antibody | Dako | Z0334 01 | |
| anti-IBA-1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| anti-Sequestosome-1 (p62) antibody | Proteintech | 18420-1-AP | |
| anti-ubiquitin antibody [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| Ketamine | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xylazine | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| 27 G syringe | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Secureline lab marker | Neolab | 25040 | |
| D-luciferin potassium salt | Acris | LK10000 | 30 mg/mL stock solution |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 sonicator | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II imaging system | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice | The Jackson Laboratory | 004479 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| N-laurylasarcosyl | Sigma | L5125-100G | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | TLA-110 rotor | |
| Thickwall polycarbonate tubes | Beckman Coulter | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | WG1401BOX | |
| HRP conjugated antibody | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 conjugated antibody | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| Stella 3200 imaging system | Raytest | ||
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | SA/00216763/000500 | working solution 3% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | working dilution 1:50,000 |
| Fluoromount media | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | ||
| HALT protease and phosphatase inhibitors | Thermo Fisher Scientific | 10516495 | |
| Precellys 24-Dual homogenizer | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Alexa Fluor 594 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 10741395 | |
| Microtome RM2255 | Leica | ||
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss |
References
- Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T. B. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease. Nat Med. Olanow, C. W. 14 (5), 504-506 (2008).
- Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
- Hansen, C., et al. alpha-Synuclein propagates from mouse brain to grafted dopaminergic neurons and seeds aggregation in cultured human cells. J Clin Invest. 121 (2), 715-725 (2011).
- Masuda-Suzukake, M., et al.
- Holmqvist, S., et al. Direct evidence of Parkinson pathology spread from the gastrointestinal tract to the brain in rats. Acta Neuropathol. 128 (6), 805-820 (2014).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1, 38 (2013).
- Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of alpha-synuclein induces CNS alpha-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10732-10737 (2014).
- Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).
- Bartz, J. C., Kincaid, A. E., Bessen, R. A. Rapid prion neuroinvasion following tongue infection. J Virol. 77 (1), 583-591 (2003).
- Tamgüney, G., et al. Measuring prions by bioluminescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 15002-15006 (2009).
- Watts, J. C., et al. Transmission of multiple system atrophy prions to transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (48), 19555-19560 (2013).
- Breid, S., et al. Neuroinvasion of alpha-Synuclein Prionoids after Intraperitoneal and Intraglossal Inoculation. J Virol. 90 (20), 9182-9193 (2016).
- Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).
- Zhu, L., et al. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci Lett. 367 (2), 210-212 (2004).
- Bernis, M. E., et al. Prion-like propagation of human brain-derived alpha-synuclein in transgenic mice expressing human wild-type alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 3 (1), 75 (2015).
- Gunther, R., et al. Clinical testing and spinal cord removal in a mouse model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS). J Vis Exp. (61), (2012).
- Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat Protoc. 2 (1), 141-151 (2007).
- Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
- Kim, C., et al. Exposure to bacterial endotoxin generates a distinct strain of alpha-synuclein fibril. Sci Rep. 6, 30891 (2016).
- Keller, A. F., Gravel, M., Kriz, J. Live imaging of amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis: disease onset is characterized by marked induction of GFAP in Schwann cells. Glia. 57 (10), 1130-1142 (2009).
- Stöhr, J., et al. Distinct synthetic Abeta prion strains producing different amyloid deposits in bigenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209 (5), 975-986 (2012).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. 75 (3), 351-362 (2014).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1 (1), 38 (2013).
- Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).
