Summary
Inyección periférica de las fibrillas de alfa-sinucleína en el peritoneo o la lengua de Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones, que expresan alfa-sinucleína humana con la mutación A53T familiar y luciferasa de luciérnaga, puede inducir la neuropatología, incluyendo la neuroinflamación , en su sistema nervioso central.
Abstract
Para estudiar el comportamiento prión de mal plegada alfa-sinucleína, se necesitan modelos de ratón que permiten la transmisión rápida y sencilla de prionoids alfa-sinucleína, que causan la neuropatología dentro del sistema nervioso central (SNC). Aquí se describe que intraglossal o inyección intraperitoneal de las fibrillas de alfa-sinucleína en bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones, que sobreexpresan la alfa-sinucleína humana con la mutación A53T desde el promotor de la proteína prión y luciferasa de luciérnaga a partir de el promotor para la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), es suficiente para inducir la enfermedad neuropatológico. En comparación con Tg homocigotos (+ / + M83) ratones que desarrollan síntomas neurológicos severos partir de una edad de 8 meses, heterocigotos Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) animales permanecen libres de la enfermedad espontánea hasta que llegan a una edad de 22 meses. Curiosamente, la inyección de las fibrillas de alfa-sinucleína a través de la intraperitoneal ruta indujo enfermedad neurológica con parálisis en cuatro de cinco Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones con una mediana de tiempo de incubación de 229 ± 17 días. animales enfermos mostraron depósitos graves de fosforilada alfa-sinucleína en el cerebro y la médula espinal. Las acumulaciones de alfa-sinucleína eran sarcosilo insoluble y colocalized con ubiquitina y p62, y fueron acompañadas por una respuesta inflamatoria que resulta en gliosis astrocítica y microgliosis. Sorprendentemente, la inoculación de las fibrillas de alfa-sinucleína en la lengua fue menos eficaz en la causa de la enfermedad, con sólo uno de los cinco animales inyectados que muestran patología alfa-sinucleína después de 285 días. Nuestros resultados muestran que la inoculación por vía intraglossal y más aún a través de la ruta intraperitoneal es adecuado para inducir la enfermedad neurológica con características pertinentes de sinucleinopatías en Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones. Esto proporciona un nuevo modelo para el estudio de la patogénesis prión inducird por prionoids alfa-sinucleína en mayor detalle.
Introduction
Hay evidencia creciente de que la alfa-sinucleína tiene características que son similares a las de la proteína priónica, en particular en su capacidad de auto-semillas y se propagan mal plegamiento entre las células y a lo largo de las vías neuronales. Esta propiedad de la alfa-sinucleína también se conoce como 'prion-como' o 'prionoid', y es apoyado por observaciones en experimentos de trasplante, que sugieren la transmisibilidad de mal plegada alfa-sinucleína de neuronas enfermas a trasplantado recién neuronas sanas 1, 2 , 3, 4. También la inyección directa de mal plegada alfa-sinucleína en el cerebro o la periferia, por ejemplo, el músculo del miembro posterior o de la pared intestinal, resulta en una extensión de la patología de la alfa-sinucleína a partes distales del CNS 5, 6, 7, <sup class = "xref"> 8, 9, 10. Se analizaron transmisión de prionoids alfa-sinucleína a través de rutas periféricas con más detalle y se dirigió a la cuestión de si mal plegada alfa-sinucleína puede neuroinvade el SNC después de una sola intraglossal o inyección intraperitoneal, una característica que anteriormente se había demostrado por priones, pero no para alfa- mal plegada sinucleína. Después de la inyección de los priones en la lengua, la neuroinvasión del SNC se logra a través de la propagación a lo largo del nervio hipogloso de la lengua que conduce al núcleo del nervio hipogloso, que se encuentra en el tronco cerebral 11. Como un modelo de ratón que elegimos Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones que sobreexpresan el mutante A53T de alfa-sinucleína humana a partir del promotor prión, y luciferasa de luciérnaga bajo el control de un promotor de GFAP para controlar la activación de astrocitos por bioluminiscencia, como se muestra anteriormente en el cerebro deratones 12 priones infectados. En nuestras manos Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) bigenic los ratones no desarrollaron la enfermedad hasta los 23 meses de edad como se ha demostrado por otros 13. Una sola inyección de fibrillas de alfa-sinucleína humanos a través de la intraglossal o enfermedad neurológica ruta inducida intraperitoneal con patología en el cerebro y médula espinal de Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones que apoyan la hipótesis de que prionoids alfa-sinucleína compartir características importantes con priones 14.
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Protocol
Todos los procedimientos, incluidos los animales se llevaron a cabo con la aprobación del comité de protección de los animales de la Agencia de Renania del Norte-Westfalia Estatal de Medio Ambiente (LANUV). Los animales fueron alojados y cuidados de acuerdo con condiciones estándar con un 12 h ciclo de luz / oscuridad y acceso libre a comida y agua.
1. Modelo animal
- Intercross hemizygous Tg (GFAP -luc +/-) ratones con ratones hemizygous Tg (M83 +/-) para generar hemizygous bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones 15, 16.
- Genotipo la progenie con PCR en tiempo real para la presencia del transgén que codifica la alfa-sinucleína humana y con PCR estándar para la luciferasa de luciérnaga 12, 17.
- Inocular a los animales a una edad de seis a ocho semanas.
2. Preparación del inóculo
- preparar monomeric alfa-sinucleína humana recombinante con la mutación A53T en tampón de solución salina tamponada con Tris (TBS) que contenía NaCl 150 mM en 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) como se ha descrito previamente 14.
- Preparar fibrilar alfa-sinucleína para inoculaciones por agitación 3 g / l de monómero alfa-sinucleína humana recombinante en un agitador orbital a 800 rpm y 37 ° C durante 5 días.
- Diluir conjuntos de fibrillas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para alcanzar una concentración final de 1 g / l para intraperitoneal o 2 g / l para inoculaciones intraglossal.
- Fragmentar las fibrillas de alfa-sinucleína con un sonicador de varilla durante 1 min (40 impulsos de 0,5 s de duración con una pausa de un segundo entre cada pulso y una amplitud ajustado a 50%) en hielo. Para evitar la contaminación por la cruz-siembra. Utilice sondas de sonicación limpios para preparar diferente inóculo.
3. Las inyecciones Intraglossal
- Anestesiar los animales con un intrapeinyección ritoneal de 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilazina. Una pizca dedo gordo del animal y confirmar que no retira su extremidad posterior para asegurar la anestesia adecuada. Utilice ungüento veterinario en los ojos del animal para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia.
- Fijar animales narcotizados cuidadosamente con cinta adhesiva sobre una placa de calentamiento en una posición de decúbito dorsal con las cabezas orientadas hacia el investigador.
- Llene una jeringa hipodérmica desechable 27 G con 5 l de fibrillas de alfa-sinucleína sonicó o PBS.
- Use una pinza de nariz chata pulgar con puntas dentadas para sostener la boca del animal abierta, y un par de segundos más pequeño fórceps para tirar con cuidado la lengua para que el lado inferior de la lengua accesible para inyección.
- Inyectar la aguja de la jeringa en la parte inferior derecha o izquierda de la lengua en la proximidad del nervio hipogloso. inyectar lentamente el inóculo después de 5 s. retraer lentamente la aguja después de 5 s para garantizar que el inóculoha penetrado en el tejido y no se pierde mientras se retrae la aguja.
- Soltar el animal de su fijaciones y dejarlo en la placa de calentamiento bajo monitorización constante hasta la recuperación completa.
4. inyecciones intraperitoneales
- Para las inyecciones intraperitoneales, narcotizar los animales en breve en una cámara de anestesia por inhalación con isoflurano / oxígeno utilizando un caudal de 2 L / min y el vaporizador se establece en 2%. Una pizca dedo gordo del animal y confirmar que no retira su extremidad posterior para asegurar la anestesia adecuada.
- Llene una jeringa hipodérmica desechable 27 G con 50! L de las fibrillas de alfa-sinucleína sonicó o PBS.
- Directamente inyectar en el peritoneo del ratón y evitar penetrar en el intestino delgado o intestino ciego situado detrás de la pared abdominal mediante la celebración de al animal en una posición dorsal con la cabeza alejado del investigador y hacia abajo en aproximadamente 45 °. Observar a los animales hasta que se recuperende la anestesia.
5. La bioluminiscencia Imaging
- Image Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones cada 2-4 semanas utilizando un sistema de imágenes de bioluminiscencia.
- Antes de la formación de imágenes poco anestesiar los ratones en una cámara de isoflurano / oxígeno con un caudal de 2 L / min y el vaporizador se establece en 2%. Una pizca dedo gordo del animal y confirmar que no retira su extremidad posterior para asegurar la anestesia adecuada.
- Afeitado y depilar las cabezas de los ratones con una crema depilatoria. Colorear los oídos en negro con un marcador no irritante para bloquear la bioluminiscencia no específica.
- Diluir sal de potasio de D-luciferina, el sustrato de la luciferasa, en PBS a una solución madre de 30 mg / mL. Almacenar esta en partes alícuotas de 1 ml a -20 ° C. Proteger el D-luciferina disuelto a partir de la exposición a la luz.
- Pesar los animales antes de la inyección. Calcular el volumen exacto de D-luciferina para la inyección de 150 mg / kg peso corporal. Intraperitonealmente inyectar D-luciferin y devolver el animal a la cámara de anestesia.
- Iniciar el software de imágenes. Después de que el sistema de imagen ha alcanzado su temperatura de funcionamiento inicializar el sistema haciendo clic en el botón 'Inicializar' en el panel de control.
- Seleccione los botones 'luminiscentes' y 'fotografía'. Ajuste el tiempo de exposición a 60 s, el binning a 'Medio', el F / parada en '1', y la ganancia EM en 'Off'.
- Confirmar que el filtro de excitación se establece en 'Bloquear' y el filtro de emisión a 'Open', y ajusta la altura sujeto a 1,50 cm.
- Diez minutos después de la inyección con D-luciferina, colocar los animales sobre la placa de calentamiento en la cámara de formación de imágenes y asegurar que sus hocicos se colocan correctamente en la salida de la anestesia. Cierre el flujo de isoflurano / oxígeno de la cámara de inhalación y abrir el flujo de la cámara de formación de imágenes con una velocidad de flujo de 0,25 L / min y una evaporación de 2%. Cerrar la puerta de la cámara de imágenes prpresenten anomalías correspondientes.
- Haga clic en el botón 'Acquire' para medir la bioluminiscencia, que tarda 60 s. Detener el flujo de isoflurano y controlar a los animales hasta que se hayan recuperado después de regresar de vuelta a sus jaulas.
- Utilice el software de imágenes para cuantificar la bioluminiscencia. Dentro de la 'paleta de herramientas' seleccionar 'Herramientas de ROI. En 'Tipo' 'dentro de las herramientas de ROI' seleccionar "Medición de ROI.
- Dentro de las 'Herramientas de ROI' clic en la herramienta "círculo" y seleccione el número de regiones de interés para dibujar en el menú desplegable - idealmente '3' para los tres ratones.
- En la imagen, haga clic en cada ROI y bajo 'Properties' ajustar la anchura y la altura a 1,25 cm. Posicionar cada ROI sobre el área del cerebro que se cuantifica.
- En la parte superior izquierda de la imagen, ajustar el panel de unidades de 'radiación (fotones).
- Dentro de la 'Paleta de herramientas', seleccione 'Ajuste de imagen' y ajustar el mínimo yel máximo de la 'Escala de Color', por ejemplo, de 0.20e6 a 1.00e6.
- En 'Archivo' guardar los datos con 'Guardar'.
6. Análisis bioquímico
- Aislar los cerebros y las médulas espinales de acuerdo con protocolos establecidos 18, 19.
- Homogeneizar de todo el cerebro y las muestras de médula espinal enteros separado en PBS en presencia de inhibidores de la proteasa y de fosfatasa (diluido a 1x en PBS) en dos 30 s ciclos con 6.000 rpm en un homogeneizador de tejidos. Asegúrese de que el cerebro y las muestras de la médula espinal se homogeneizan a una concentración final de 20% (peso / vol).
- Sonicar las muestras dos veces mientras que los mantiene en hielo con un pulso constante de 10 s y una amplitud establece en 50%.
- Ajuste los homogeneizados a 10% en PBS y NaCl 750 mM por ellos diluir 1: 1 con 1,5 M NaCl en PBS.
- Para separar los residuos celulares, centrifugar los homogenados a 1.000 xg durante 5 min a4 ° C. Mantener los sobrenadantes para los próximos pasos y desechar los pellets.
- Medir la concentración de proteína en los homogeneizados utilizando el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) según las instrucciones del fabricante. Incubar 1,0 mg de proteína total a partir de homogeneizados de cerebro o 0,8 mg de homogeneizado de médula espinal en N-laurylsarcosyl a una concentración final de 10% (peso / vol) durante 15 min en hielo.
- Superposición de los homogeneizados sobre un colchón de sacarosa al 3 ml de 10% (peso / vol) en agua destilada y ultracentrifugar ellos en 465.000 xg durante 1 hora a 4 ° C.
- Resuspender los pellets en un tampón que contenía 4% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 2% β-mercaptoetanol, glicina 192 mM, Tris 25 mM, y 5% (peso / volumen) de sacarosa.
- Hervir las muestras a 100 ° C durante 5 min y cargarlos en geles de SDS-poliacrilamida para electroforesis en un sistema de tampón de ácido morpholineethanesulfonic (MES).
- La transferencia de las proteínas separadas a difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas en un semiDry sistema secante.
- Se incuban las membranas en 0,4% (vol / vol) solución de formalina en PBS durante 30 min a temperatura ambiente en un rotor con 35 rpm para reticular las proteínas con la membrana.
- Bloquear las membranas en tampón de TBS que contiene 0,05% (vol / vol) de Tween 20 y la leche 5% (peso / vol) durante 1 h a temperatura ambiente.
- Se incuban las transferencias con el anticuerpo primario en tampón de bloqueo durante la noche a 4 ° C.
- Se lavan las membranas tres veces en tampón TBS y se incuban con anticuerpos secundarios peroxidasa o fluoróforo conjugado en TBS durante 1 h a temperatura ambiente.
- Visualizar los anticuerpos secundarios unidos por quimioluminiscencia o fluorescencia de acuerdo con protocolos establecidos 20.
Análisis 7. La inmunofluorescencia
- Deshidratar los cerebros diseccionados y las médulas espinales en una estación de procesamiento de tejidos e insertarlos en parafina utilizando una estación de parafina.
- Cortar el tis embebido en parafinademanda a con un microtomo en 8 micras secciones coronales gruesas y montar las secciones sobre portaobjetos de vidrio.
- Desparafinar las secciones de tejido mediante su incubación en dos baños xilol separados por 5 a 10 min y rehidratar ellos a través de una serie de baños de etanol graduado (100%, 90%, 70%, 50%) y finalmente con H 2 O.
- Incubar las secciones en tampón de 0,01 M de citrato (pH 6,0) durante 5 min a temperatura ambiente y, además, hervir durante 10 min en un horno microondas.
- Deje que las secciones se enfríen a temperatura ambiente y se incuban con una solución de peróxido de hidrógeno al 3% durante 30 min para inhibir peroxidasas endógenas.
- Bloquear las secciones de tejido por incubación con 20% (vol / vol) de suero de cabra normal, 1% (vol / vol) de albúmina de suero bovino (BSA), y 0,5% de Triton X-100 en PBS durante 1 h a temperatura ambiente.
- Incubar las secciones con el anticuerpo primario diluido en 1% (vol / vol) de suero de cabra normal, 1% (vol / vol) de BSA, y 0,25% de Triton X-100 en PBS durante la noche a 4 ° C. <li> Lavar las secciones dos veces con 0,25% (vol / vol) Triton X-100 en PBS y una vez con PBS.
- Tinción de las secciones con los anticuerpos secundarios fluoróforo conjugado correspondientes y la DAPI colorante nuclear diluido en 1% (vol / vol) de suero de cabra normal, 1% (vol / vol) de BSA, y PBS durante 1 h a temperatura ambiente.
- Después de lavar dos veces con 0,25% (vol / vol) Triton X-100 en PBS y una vez con PBS, los portaobjetos cubreobjetos con medio de incrustación y visualizar la tinción con un microscopio de escaneo láser confocal.
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Representative Results
Inyección periférica de prionoids alfa-sinucleína a través de la lengua o el peritoneo inducida neuropatología en el SNC de bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones (Tabla 1 y Figura 1). Después de una única inyección intraperitoneal con fibrillas de alfa-sinucleína, cuatro de cinco ratones desarrollaron enfermedad neurológica con una mediana de tiempo de incubación de 229 ± 17 días. Sorprendentemente, sólo uno de los cinco ratones desarrollaron enfermedad del SNC después de la inyección intraglossal con fibrillas de alfa-sinucleína después de 285 días. La inoculación con PBS no causó la enfermedad dentro del período de 420 días del experimento.
El análisis bioquímico mediante transferencia de Western y de sondeo con el anticuerpo EP1536Y-fosfo específica contra Ser129 de la alfa-sinucleína reveló que para ambas rutas de transmisión de animales enfermos habían acumulado agregados de fosforilada y sarcosilo-insoluble alfa-sinucleína en sus cerebros y las médulas espinales (Tabla 2 y Figura 2). En contraste, los cerebros y las médulas espinales de los animales inyectados con PBS y no enfermas solamente contenían especies monoméricas de alfa-sinucleína fosforilada.
La tinción inmunofluorescente de secciones de cerebro de ratones por vía intraperitoneal inyectado y enfermo con el pSyn anticuerpo # 64-fosfo específico reveló una amplia distribución de los depósitos alfa-sinucleína fosforilados en todo el SNC (Tabla 2 y Figura 3). Por otra parte, los depósitos fosforilada alfa-sinucleína colocalized con ubiquitina y p62 que indica una homeostasis aberrante de proteínas que podrían contribuir a la formación de depósitos.
La acumulación de agregados de alfa-sinucleína en animales enfermos fue acompañado por cambios neuroinflamatorios, que fue detectado portinción de inmunofluorescencia para GFAP, un marcador de astrocitos que pueden revelar astrogliosis reactiva (Figura 4). Además, microglia activada también se encontraron en regiones con abundante patología alfa-sinucleína por tinción con inmunofluorescencia para IBA-1 (ionizado adaptador de molécula de unión a calcio 1). De conformidad, imágenes de bioluminiscencia reveló aumento de luminosidad (> 2 × 10 6 p / s / cm 2 / sr) emitida desde los cerebros de Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones inyectados con fibrillas de alfa-sinucleína, poco antes de que desarrollaron signos de enfermedad neurológica. En contraste, los cerebros de los ratones inyectados con PBS no mostraron ningún aumento de luminosidad. Aumento de la radiancia es indicativo de astrogliosis reactiva, un sello de la neuroinflamación, ya que la expresión de la luciferasa es impulsada desde el promotor de GFAP.
Figura 1: Inyección con fibrillas de alfa-sinucleína a través de la ruta intraperitoneal o intraglossal causa la enfermedad en bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones. (A) Micrografía electrónica de las fibrillas de alfa-sinucleína humana recombinante sonicadas que eran por vía intraperitoneal y intraglossally inyecta en ratones. La tinción negativa con acetato de uranilo reveló varios clústeres de agregados cortas, en forma de barra. Barras de escala = 100 nm. (B) de Kaplan-Meier de supervivencia muestran que después de la inyección intraperitoneal con fibrillas de alfa-sinucleína cuatro de cinco Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones desarrollaron enfermedad neurológica en 229 ± 17 días (púrpura cuadrados cerrados), mientras que ninguno de los ratones de control inyectados con PBS desarrolló signos de disfunción neurológica dentro de 420 días (cuadrados abiertos púrpuras). Después de la inoculación intraglossal con fibrillas de alfa-sinucleína un ratón de cinco murió después de 285 días (verdecírculos cerrados). En contraste, ninguno de los ratones de control inyectados con PBS desarrolló enfermedad neurológica o espontáneamente muerto (círculos abiertos verdes). Modificado de Breid et al. , 2016 14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El análisis bioquímico de fosforilados alfa-sinucleína en el SNC de periféricamente inyecta Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones. (A) La inmunotransferencia con el anticuerpo EP1536Y, reconociendo la fosforilación en Ser129 de la alfa-sinucleína, mostró que intraperitonealmente inyectado y ratones enfermos acumula especies de alto peso molecular de los agregados Sarkosyl insoluble de fosforilados alfa-sinucleína en sus cerebros unad médulas espinales. Los ratones de control inoculados con PBS no se acumulan agregados de alfa-sinucleína fosforilada y mostraron bandas sólo por su forma monomérica. (B) Después de la exposición intraglossal con fibrillas de alfa-sinucleína sólo un ratón, animal 121, mostró agregados sarcosil-insolubles de fosforilada alfa-sinucleína en su cerebro y la médula espinal, mientras que todos los demás ratones intraglossally inoculados permanecieron sanos sin depósitos de alfa-sinucleína. Las masas moleculares se muestran en kilodaltons. carga de la muestra en cada carril se muestra mediante la detección de la actina. Modificado de Breid et al. , 2016 14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de inmunofluorescencia muestra que los depósitos defosforilada alfa-sinucleína colocalize con ubiquitina y p62 en los cerebros y las médulas espinales de enferma Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones. Co-tinción de fosforilados alfa-sinucleína, que se detectó con el anticuerpo EP1536Y, y ubiquitina revelaron una colocalización distinta en el cerebro, como se observa en el núcleo talámico (A), y la médula espinal, tal como se detecta en la materia gris (B), de ratones enfermos después de la exposición intraperitoneal con fibrillas de alfa-sinucleína. Del mismo modo, fosforilada alfa-sinucleína, que se detectó con el anticuerpo pSyn # 64, también colocalized con p62 en el cerebro de (C) y las médulas espinales (D) de animales enfermos. (A a D) PBS-inyectado animales de control sanos no mostró depósitos o colocalización para cualquiera de estas proteínas. tinción nuclear con DAPI se muestra en azul. Barras de escala = 20 m. Modificado de Breid et al. , 2016 14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones desarrollaron gliosis después de la estimulación periférica con fibrillas de alfa-sinucleína. (A) El análisis de inmunofluorescencia de secciones de cerebro de animales enfermos con un anticuerpo contra GFAP, un marcador de astrocitos, reveló astrogliosis reactiva en las zonas con depósitos de fosforilada alfa-sinucleína, que se detecta en el tronco cerebral con el anticuerpo pSyn # 64. En contraste, no hubo astrogliosis reactiva en los cerebros de los ratones de control inyectados con PBS. (B) De manera similar, la tinción con un anticuerpo para IBA-1, un marcador de microglía, demostró microgliosisen áreas con depósitos de fosforilados alfa-sinucleína en animales enfermos. Los cerebros de los ratones de control sanos, inyectados con PBS no mostraron signos de microgliosis. (C) Imágenes de bioluminiscencia reveló luminosidad elevada de los cerebros y las médulas espinales de Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones por vía intraperitoneal inyectados con fibrillas de alfa-sinucleína (panel izquierdo), que fue causada por la activación de los astrocitos , poco antes de los ratones desarrollaron síntomas neurológicos. En los cerebros y las médulas espinales de ratones de control inyectados con PBS el resplandor basal no aumentó con el tiempo (panel derecho). Después de la inoculación intraglossal con fibrillas de alfa-sinucleína, una Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratón, animal 121, mostró signos de astrogliosis reactiva poco antes de que murió a los 285 días (panel central). (D) Después de la exposición intraperitoneal de Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones con alfa-sinucleína fibrillas, Increaniveles de sed de bioluminiscencia (> 2 × 10 6 p / s / cm 2 / sr) se midieron a partir de los cerebros de los cuatro ratones (azul, verde, marrón, y círculos de color naranja) algunas semanas antes de que desarrollaron signos neurológicos de la enfermedad. Uno de los cinco animales también mostraron niveles elevados de bioluminiscencia poco antes de que murió 285 días después de la inyección intraglossal con fibrillas de alfa-sinucleína (círculos magenta). En contraste, para, los ratones de control inyectados con PBS sanos (círculos negros; las barras de error muestran SD [n = 4]) y un animal que no desarrollan la enfermedad después de la inyección intraperitoneal con fibrillas de alfa-sinucleína (círculos rojos), la señal de bioluminiscencia se mantuvo debajo de un umbral de 2 x 10 6 p / s / cm 2 / sr dentro del período de observación. Barras de escala = 20 m. Modificado de Breid et al. , 2016 14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de estafigura.
| línea de ratones | Inóculo (g) | vía de inoculación | No. de ratones con enfermedad / no. de ratones inoculados | tiempo de supervivencia ± DE Media (días) |
| Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) | fibrillas -sinucleína humanos (50) | intraperitoneal | 4/5 | 229 ± 17/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) | PBS | intraperitoneal | 0/5 | 0/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) | fibrillas -sinucleína humanos (10) | intraglossal | 1/5 | 285/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) | PBS | intraglossal | 0/4 0/420 |
Tabla 1: experimentos de inoculación. * Modificado de Breid et al., 2016 14
| Target [clon de anticuerpo] | Anfitrión | inmunógeno | La dilución en SI | La dilución en BM |
| Actina [C4] | Ratón | - | - | 1: 1000 |
| α-sinucleína, fosfo S129 [pSyn # 64] | Ratón | pSer129 | 1: 1200 | - |
| α-sinucleína, fosfo S129 [EP1536Y] | Conejo | pSer129 | 1: 100 | 1: 1000 |
| proteína ácida fibrilar glial (GFAP) | Conejo | - | 1: 200 | - |
| IBA-1 | Conejo | - | 1: 500 | - |
| Sequestosome-1 (p62) | Conejo | - | 1: 100 | - |
| La ubiquitina [Ubi-1] | Ratón | - | 1: 500 | - |
Tabla 2: Los anticuerpos utilizados para inmunofluorescencia (IF) y Western Blot (WB). * Modificado de Breid et al., 2016 14
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Discussion
Inyección periférica de las fibrillas de alfa-sinucleína en el peritoneo de Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones representa un método fácil para inducir la enfermedad neurológica acompañada de la neuroinflamación recapitular características importantes de sinucleinopatías. Del mismo modo, la inyección lengua representa otra ruta para la neuroinvasión por prionoids alfa-sinucleína en ratones transgénicos, pero es menos eficiente. Hemos elegido para poner fin a los experimentos en 420 días después de la inyección y no podemos excluir la posibilidad de que más o todos los ratones inyectados fibrillas pueden haber desarrollado la enfermedad en un momento posterior. Adicionalmente, el uso de Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones permite la visualización no invasiva de la astrogliosis y representa un método sencillo para el control de las respuestas inflamatorias provocadas por la neuroinvasión de alfa-sinucleína largo de toda la vida útil de la ratón.
Un paso crítico es la preparacióndel inóculo. Factores aparentemente triviales como el tiempo de agregación, tiempo de sonicación, la abundancia de endotoxinas, o la cantidad de fibrillas usada para la inyección podría influir en el resultado de un experimento al afectar la propensión siembra de mal plegada alfa-sinucleína 21. Por lo tanto es importante utilizar siempre las mismas condiciones en la preparación de inóculos para inyección. Para las inyecciones intraglossal que tiene que tener en cuenta que no sólo el nervio hipogloso, sino también otros nervios craneales como el nervio glosofaríngeo inervan la lengua y podrían estar implicados en el transporte interneuronal de prionoids alfa-sinucleína en el cerebro. Por lo tanto dirigidos a diferentes áreas de la lengua puede resultar en diferentes cinéticas de propagación al cerebro. No nos inyectamos directamente en el nervio hipogloso y es posible que la orientación del nervio hipogloso podría mejorar la transmisión del SNC prionoids alfa-sinucleína. Para las inyecciones intraperitoneales con fibrillas de alfa-sinucleína es critiCal que el inóculo se inyecta correctamente en el peritoneo y no accidentalmente en órganos internos como el intestino o el intestino ciego, lo que podría afectar negativamente a la neuroinvasión. Esto también es importante para la formación de imágenes de bioluminiscencia cuando la inyección de D-luciferina. Mala focalización de D-luciferina a los órganos internos podría ralentizar su distribución en el cerebro y dar lugar a la bioluminiscencia inferior. Para obtener resultados uniformes durante la formación de imágenes también es crítica para siempre recién preparar la solución de D-luciferina antes de la inyección y para dejar que exactamente se incuba durante 10 min después de la inyección intraperitoneal antes de formación de imágenes.
Imágenes de bioluminiscencia es un método útil para medir los cambios de forma no invasiva en astrogliosis lo largo del tiempo y se puede aplicar no sólo después intraperitoneal o inyecciones intraglossal sino también después de cada tipo de tratamiento incluyendo, por ejemplo, intracerebral o inyecciones intravenosas. Para supervisar la difusión de prionoids alfa-sinucleína desde la periferia hacia el CNRatones: S y la neuroinflamación subsiguiente utilizamos bigenic Tg (GFAP -luc +/- M83 +/-). Dado que la expresión hemizygous de alfa-sinucleína en estos animales es 40% inferior respecto a los animales homocigotos que permanecen libres de enfermedad espontánea de hasta 22 meses de edad y tiene un fondo genético adecuado para la transmisión alfa-sinucleína estudia 13. Sin embargo, las modificaciones con respecto a la elección del modelo de ratón para imágenes de bioluminiscencia puede ser deseable. Una opción interesante es el uso de monogénica (-luc GFAP +/-) ratones Tg que expresan sólo luciferasa como un transgén, que permite una evaluación de la conducta prionoid de las fibrillas de alfa-sinucleína en un fondo que es esencialmente de tipo salvaje como la medida de lo alfa-sinucleína se refiere a 14. Por otra parte, cruzando Tg (GFAP -luc +/-) ratones a otros ratones transgénicos, tales como Tg (SOD1 G93A) ratones para la esclerosis lateral amiotrófica o para Tg (APP23) mhielo para la enfermedad de Alzheimer, permite obtener imágenes de la neuroinflamación en otros modelos de enfermedad 22, 23.
Una limitación de este protocolo es que basado en el sitio de la inyección del inóculo inyectado no puede exceder de un cierto volumen. De este modo las inyecciones en la lengua solamente se pueden realizar con volúmenes más pequeños que aquellos en el peritoneo, lo que puede afectar los tiempos de transmisión para el SNC. Otra limitación es que el transgén -luc GFAP sólo permite la detección de astrogliosis pero no de microgliosis, que es igualmente importante en la neuroinflamación. Por último, este modelo no proporciona puntos de vista en cuanto a cómo prionoids alfa-sinucleína alcanzan el sistema nervioso central después de la inyección intraperitoneal.
La aplicación de prionoids alfa-sinucleína exógenos mediante inyección ha demostrado ser un método útil para estudiar las vías de transmisión que juegan un papel crítico en la recapitulación de características de synucleinopathies. Las inyecciones intracerebrales de fibrillas de alfa-sinucleína recombinantes o ratón asociado a la enfermedad o especies de alfa-sinucleína humanos en modelos animales se han utilizado en varios estudios para analizar sus propiedades de siembra y la eficiencia de transmisión en el tiempo 5, 7, 17, 24, 25, 26. Desde inyecciones estereotácticas en el cerebro siempre inducen una respuesta inflamatoria local poco después de la cirugía, esta ruta de transmisión podría influir en la difusión y la infectividad del inóculo causada por una alteración de la homeostasis cerebral. Estudios más recientes han cambiado el foco a aplicaciones periféricas o sistémicos, no principalmente para evitar el procedimiento quirúrgico, sino más bien para analizar la periferia, la pared intestinal, músculo esquelético, o de la sangre, como un punto inicial desde donde neuroinvasión al SNC podría commence 6, 9, 14, 27. Para los priones se ha demostrado que la transmisión a través del peritoneo o la lengua conduce a la neuroinvasión y enfermedad neurológica; después de la infección lengua, repartidas por priones sólo dos semanas para el núcleo hipogloso en el tronco cerebral 11. Desde la alfa-sinucleína se ha discutido tener neuroinvasiva y de siembra propiedades como priones, demostramos que la transmisión a través de la lengua y el peritoneo representan más puntos de entrada para prionoids alfa-sinucleína para invadir el SNC 14. La cuantificación de la astrogliosis por imágenes de bioluminiscencia facilita el seguimiento del proceso de neuroinflammatory con el tiempo y representa una alternativa no invasiva para el análisis histológico.
Para obtener una visión más profunda de cómo el sistema nervioso central responde a neuroinvasión de prionoids alfa-sinucleínay para otros tratamientos que causan la neuroinflamación, sería beneficioso para generar modelos de ratón que también permiten la monitorización no invasiva de microgliosis, por ejemplo con un transgén que dirige la expresión de la luciferasa de un promotor específico para la expresión de proteínas en microglia.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Olga Sharma, Theresa Hundt, y el personal de las instalaciones de microscopía y animales DZNE de apoyo técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-actin antibody | Merck Millipore | MAB1501 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anti-GFAP antibody | Dako | Z0334 01 | |
| anti-IBA-1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| anti-Sequestosome-1 (p62) antibody | Proteintech | 18420-1-AP | |
| anti-ubiquitin antibody [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| Ketamine | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xylazine | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| 27 G syringe | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Secureline lab marker | Neolab | 25040 | |
| D-luciferin potassium salt | Acris | LK10000 | 30 mg/mL stock solution |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 sonicator | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II imaging system | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice | The Jackson Laboratory | 004479 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| N-laurylasarcosyl | Sigma | L5125-100G | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | TLA-110 rotor | |
| Thickwall polycarbonate tubes | Beckman Coulter | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | WG1401BOX | |
| HRP conjugated antibody | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 conjugated antibody | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| Stella 3200 imaging system | Raytest | ||
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | SA/00216763/000500 | working solution 3% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | working dilution 1:50,000 |
| Fluoromount media | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | ||
| HALT protease and phosphatase inhibitors | Thermo Fisher Scientific | 10516495 | |
| Precellys 24-Dual homogenizer | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Alexa Fluor 594 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 10741395 | |
| Microtome RM2255 | Leica | ||
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss |
References
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