Summary
Tgは（M83 +/-：GFAP -Luc +/-）の腹膜または舌にα-シヌクレイン原線維の末梢注入家族A53T変異ホタルルシフェラーゼでヒトα-シヌクレインを発現するマウスは、神経炎症を含む、神経病理を誘導することができます、その中枢神経系インチ
Abstract
ミスフォールドα-シヌクレインのプリオンのような挙動を研究するために、マウスモデルは、中枢神経系（CNS）内の神経病理を引き起こすα-シヌクレインprionoids、迅速かつ簡単な伝送を可能にする必要があります。プリオンタンパク質プロモーターからA53T変異を有するヒトα-シヌクレインを過剰発現し、ホタル由来のルシフェラーゼマウス、：ここでは、バイジェニックのTg（GFAP -Luc +/- M83 +/-）にα-シヌクレイン原線維のintraglossalまたは腹腔内注射を記述しますグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）のプロモーターは、神経病理学的疾患を誘導するのに十分です。 8ヶ月の年齢で始まる深刻な神経症状を発症ホモ接合体のTg（M83 + / +）マウスと比較して、ヘテロ接合のTg（M83 +/-：GFAP -luc +/-）、彼らが到達するまでの動物は、自発的な病気の自由なまま22ヶ月の年齢。興味深いことに、intraperitone介しα-シヌクレイン線維の注射229±17日の中央値はインキュベーション時間をマウス：アルルートは4 5のTg（GFAP -luc +/- M83 +/-）で麻痺と神経疾患を誘発しました。病気にかかった動物は自分の脳や脊髄にリン酸化αシヌクレインの深刻な沈着を示しました。 α-シヌクレインの蓄積は、サルコシル不溶性であり、ユビキチンおよびP62と共局在し、そして星状細胞グリオーシスおよび小膠細胞を生じる炎症応答を伴いました。驚くべきことに、舌へのα-シヌクレイン線維の接種285日後にα-シヌクレイン病理を示す5注射した動物の一方のみで疾患を引き起こすにはあまり効果的でした。マウス。：私達の調査結果は、intraglossal経路を介して接種し、より多くのように腹腔内経路では、Tgのシヌクレイノパチーの関連する顕著な特徴（GFAP -luc +/- M83 +/-）で神経学的な病気を誘発するのに適していることを示していますこれは、誘導プリオンなどの病因を研究するための新しいモデルを提供しますより詳細にα-シヌクレインprionoidsによってDは
Introduction
α-シヌクレインは、特に自己シードする能力で、プリオンタンパク質のものと類似しており、細胞間および神経経路に沿ったミスフォールディングを伝搬特性を有することが成長の証拠があります。 α-シヌクレインのこの特性はまた、「プリオン様」または「prionoid」と呼ばれ、罹患ニューロンから新たに移植され、健康なニューロン1にミスフォールドα-シヌクレインの透過性を示唆している移植実験において観察によって支持され、2 、3、4。また、脳または周囲、 例えば後肢筋肉または腸壁の遠位部分にα-シヌクレイン病理の広がりにおける結果に誤って折り畳まれたα-シヌクレインの直接注入CNS 5、6、7、<SUPクラス= "外部参照"> 8、9、10。我々は、より詳細には、末梢経路を介してα-シヌクレインprionoidsの伝送を分析し、ミスフォールドα-シヌクレインは、単一intraglossalまたは腹腔内注射後にCNSをneuroinvadeできるかどうかを疑問に対処し、以前にプリオンのためではなく、ミスフォールドアルファのために示された機能シヌクレイン。舌へのプリオンの注入後の、CNSの神経侵入は、脳幹11に位置する舌下神経の核につながる舌の舌下神経に沿って伝播を介して達成されます。プリオンプロモーターからのヒトα-シヌクレインのA53T変異体を過剰発現マウス、及びホタルによってアストロサイトの活性化をモニターするために、GFAPプロモーターの制御下でルシフェラーゼ：マウスモデルとして、我々はTgが（GFAP -Luc +/- M83 +/-）を選択しました生物発光、以前の脳に示すように、プリオン感染マウス12。我々の手ではバイジェニックTgは（M83 +/-：GFAP -luc +/-）他13で示されているようマウスは生後23ヶ月まで、疾患を発症しませんでした。 α-シヌクレインprionoidsという仮説を支持するマウス：脳及びTgは（GFAP -Luc +/- M83 +/-）の脊髄での病理と神経疾患を誘発しintraglossalまたは腹腔内経路を介してヒトα-シヌクレイン線維の単回注射プリオン14との重要な特徴を共有します。
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Protocol
動物を含めたすべての手順は、ノルトライン=ヴェストファーレン州国家環境庁（LANUV）の動物保護委員会の承認を得て行きました。動物を飼育し、12時間の明/暗サイクル、食物および水に自由にアクセスできる標準条件に従って世話しました。
1.動物モデル
- マウス15、16：ヘミ接合バイジェニックTgは（GFAP -Luc +/- M83 +/-）を生成するためにヘミ接合のTg（M83 +/-）マウスとの交雑ヘミ接合性Tgは（GFAP -Luc +/-）マウス。
- トランスジーンエンコードヒトα-シヌクレインの存在およびホタルルシフェラーゼ12のための標準的なPCR、17でリアルタイムPCRを用いて子孫を遺伝子型。
- 6〜8週齢で動物を接種します。
2.接種材料の調製
- MOを準備20mMのTris-HCl中150mMのNaClを含むトリス緩衝生理食塩水（TBS）緩衝液（pH 7.2）中にA53T変異を有するnomeric組換えヒトα-シヌクレイン以前14に記載されているように。
- 5日間800rpmで37℃でオービタルシェーカー中のモノマーの組換えヒトα-シヌクレインの3μgの/μLを攪拌することにより接種するための繊維状α-シヌクレインを調製します。
- 腹腔内またはintraglossal接種のための2μg/μLのために1μg/μLの最終濃度に達するようにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中にフィブリルアセンブリを希釈します。
- 氷上で1分（0.5秒毎のパルス間1秒のポーズと持続時間と50％に設定された振幅の40個のパルス）用ロッドソニケーターでα-シヌクレイン線維を断片。クロスシーディングによる汚染を避けるために。別の接種物を準備するためにクリーンな超音波処理プローブを使用してください。
3. Intraglossal注射
- intrapeで動物を麻酔100mg / kgのケタミンおよび10mg / kgのキシラジンのritoneal注射。動物のつま先をつまんで、それが適切な麻酔を確保するために、その後肢を撤回しないことを確認してください。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、動物の目に獣医軟膏を使用してください。
- 慎重に調査員の方を向いて頭と背臥位での加熱プレート上に粘着テープで麻酔し、動物を修正。
- 超音波処理α-シヌクレイン原線維またはPBSの5μLと27 G使い捨て皮下注射器を充填します。
- 動物の口が開いて保持するための鋸歯状の先端を有する1鈍い鼻の親指の鉗子を使用し、鉗子の第二の小さいペアは慎重に注入するための舌の下側にアクセスできるように舌を引き出します。
- 舌下神経に近接した舌の右または左の下側に注射器の針を注入します。ゆっくりと5秒後に接種材料を注入。ゆっくり接種物ことを保証するために、5秒後に針を引っ込めます組織を貫通した針を後退しながら、失われることはありません。
- その執着から動物を放し、完全に回復するまでに一定の監視の下で加熱プレート上でそれを残します。
4.腹腔内注射
- 腹腔内注射のために、2リットル/分の流量及び2％に設定気化器を使用して、イソフルラン/酸素で吸入により麻酔チャンバー内ですぐに動物をnarcotize。動物のつま先をつまんで、それが適切な麻酔を確保するために、その後肢を撤回しないことを確認してください。
- 超音波処理α-シヌクレイン原線維またはPBS50μlの27 G使い捨て皮下注射器を充填します。
- 直接マウスの腹膜内に注入し、研究者から離れて面するヘッドと背面位置に動物を保持し、下方に約45°腹壁の背後に位置小腸もしくは盲腸を貫通避けます。彼らが回復するまで動物を監視麻酔から。
5.生物発光イメージング
- 画像のTg（M83 +/-：GFAP -luc +/-）マウス生物発光イメージングシステムを用いて、2〜4週間ごと。
- まもなく撮像2L / minの流量及び2％に設定気化器とイソフルラン/酸素チャンバ内でマウスを麻酔前。動物のつま先をつまんで、それが適切な麻酔を確保するために、その後肢を撤回しないことを確認してください。
- 脱毛クリームでマウスの頭を剃るとdepilate。非特異的生物発光をブロックする非刺激性マーカーと黒に耳を着色。
- 30mg / mLのストック溶液をPBS中のD-ルシフェリンカリウム塩、ルシフェラーゼの基質を希釈します。 -20°Cで1 mLのアリコートでこれを保管してください。溶解したD-ルシフェリンは、光への暴露から保護します。
- 注射前に、動物を計量。 150 mg / kg体重の注入のためのD-ルシフェリンの正確な量を計算します。腹腔Dを注入-luciferinと麻酔室に動物を返します。
- イメージングソフトウェアを起動します。撮像システムは、その動作温度に達した後、コントロールパネルの「初期化」ボタンをクリックすることによって、システムを初期化します。
- ボタンの発光」と「写真」を選択します。 、60秒に露光時間を設定して「中」にビニング、F /ストップ「1」に、そして「オフ」にEMゲイン。
- 励起フィルタを「開く」に「ブロック」と発光フィルタに設定されていることを確認し、1.50 cmの被写体の高さを設定します。
- D-ルシフェリンの注射後10分で、撮像チャンバ内の加熱プレート上に動物を配置し、それらのグリグリが正しく麻酔出口に配置されていることを確認。吸入室からイソフルラン/酸素の流れを閉じ、0.25リットル/分の流量及び2％の蒸発と撮像チャンバのためのフローを開きます。撮像チャンバPRのドアを閉めますoperly。
- 60秒を要する生物発光を測定するために「獲得」ボタンをクリックしてください。イソフルランの流れを停止し、彼らは完全に自分のケージに戻ってそれらを戻した後回復するまで動物を監視します。
- 生物発光を定量化するためにイメージングソフトウェアを使用してください。 「ツールパレット」の中で「ROIツール」を選択します。 「ROIのツール」内の「タイプ」の下に「測定ROI」を選択します。
- 「ROIのツール」内の「円」ツールをクリックし、プルダウンメニューから描画するROIの数を選択する - 理想的に「3」を3匹のマウスのために。
- 画像では、各ROIを右クリックして「プロパティ」は1.25センチメートルに幅と高さを調整する下。定量化された脳の領域の上に、各ROIを置きます。
- 画像の左上に、「放射（光子）」に単位パネルを設定します。
- 「ツールパレット」の中で、選択し「画像調整」と最小値を調整し、0.20e6から1.00e6に例えば「カラースケール」の最大値。
- 「ファイル」の下に「保存」を使用してデータを保存します。
6.生化学分析
- 確立されたプロトコル18、19による脳と脊髄を分離します。
- 組織ホモジナイザーで6,000rpmで有する2回の30秒サイクルで（PBS中で1倍に希釈）、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤の存在下でPBSに別々に全脳および全脊髄サンプルを均質化します。脳および脊髄サンプルを20％（重量/体積）の最終濃度に均質化されていることを確認します。
- 10秒の一定のパルスと50％に設定された振幅と氷上でそれらを維持しながら二回サンプルを超音波処理。
- PBS中の1.5 M NaClで1：それらの1に希釈することによりPBSおよび750mMのNaCl中10％ホモジネートを調整します。
- 細胞破片を分離するために、5分で1000×gでホモジネートを遠心4°C。次のステップのために上清を保持し、ペレットを捨てます。
- 製造業者の指示に従ってビシンコニン酸（BCA）アッセイを用いてホモジネート中のタンパク質濃度を測定します。氷上で15分間、10％（重量/体積）の最終濃度でN-laurylsarcosyl脊髄ホモジネートからの脳ホモジネートからの総タンパク質の1.0ミリグラムまたは0.8ミリグラムをインキュベートします。
- 蒸留水中の10％（wt / vol）の3mLのスクロースクッション上にホモジネートをオーバーレイし、4℃で1時間、465,000×gでそれらを超遠心。
- 4％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、2％βメルカプトエタノール、192 mMグリシン、25 mMトリス、5％（重量/容量）のスクロースを含有する緩衝液中にペレットを再懸濁します。
- 5分間、100℃でサンプルを沸騰およびモルホリンエタンスルホン酸（MES）緩衝液系中での電気泳動のためにSDSポリアクリルアミドゲル上にロードします。
- SEMにおけるポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜に分離されたタンパク質を転送しますidryブロッティングシステム。
- 膜と架橋タンパク質に35回転ロータに室温で30分間PBS中の0.4％（vol / vol）のホルマリン溶液中で膜をインキュベートします。
- 室温で1時間、0.05％（体積/体積）のTween 20および5％（wt / vol）のミルクを含むTBS緩衝液中で膜をブロックします。
- 4℃で一晩ブロッキング緩衝液中で一次抗体と共にブロットをインキュベートします。
- TBS緩衝液中で膜を3回洗浄し、室温で1時間、TBS中のペルオキシダーゼまたは蛍光団コンジュゲート二次抗体でそれらをインキュベートします。
- 確立されたプロトコール20に従って化学発光又は蛍光によって結合した二次抗体を可視化します。
7.免疫蛍光分析
- 組織処理ステーションでの解剖脳と脊髄を脱水し、パラフィンステーションを使用してパラフィンにそれらを埋め込みます。
- パラフィン包埋TISをカット厚さ8μmの冠状切片でミクロトームで提訴し、スライドガラス上のセクションをマウントします。
- 5〜10分間、二つの別々のキシロール浴でそれらをインキュベートすることにより組織切片を脱パラフィン化し、段階的エタノール浴のシリーズを介してそれらを再水和（100％、90％、70％、50％）、そして最後にH 2 Oで
- 室温で5分間、0.01 Mクエン酸緩衝液（pH6.0）で切片をインキュベートし、さらに電子レンジで10分間、それらを沸騰。
- セクションでは、室温まで冷却し、内因性ペルオキシダーゼを阻害する30分間3％過酸化水素溶液でそれらをインキュベートしてみましょう。
- 室温で1時間PBS中の20％（vol / vol）の正常ヤギ血清、1％（vol / vol）のウシ血清アルブミン（BSA）とのインキュベーションによって、組織切片をブロックし、そして0.5％のTriton X-100。
- 4℃で一晩、1％に希釈した一次抗体（vol / vol）の正常ヤギ血清でセクションをインキュベートし、1％（体積/体積）BSA、PBS中の0.25％トリトンX-100。 <LI> PBSで一度0.25％（vol / vol）のPBS中のTriton X-100で二回セクションを洗浄し。
- 室温で1時間、対応するフルオロフォア結合二次抗体と1％に希釈した核色素DAPI（vol / vol）の正常ヤギ血清、1％（体積/体積）BSA、PBSで切片を染色します。
- 0.25％（容量/容量）のTriton X-100 PBSで一度PBSで2回洗浄した後、包埋媒体とスライドをカバースリップおよび共焦点レーザー走査顕微鏡で染色を可視化します。
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Representative Results
マウス（ 表1及び図1）：舌又はバイジェニックTgはCNS（GFAP -Luc +/- M83 +/-）で腹膜誘導される神経病理を介してα-シヌクレインprionoidsの周辺注射。 α-シヌクレイン線維を持つ単一の腹腔内注射した後、5匹のマウスの4つが229±17日の中央値はインキュベーション時間と神経疾患を発症しました。驚くべきことに、唯一の5匹のマウスは、285日後に、α-シヌクレイン原繊維とintraglossal注入後のCNS疾患を発症しました。 PBSの接種は、実験の420日の期間内に疾患を引き起こすことはありませんでした。
ウェスタンブロッティングおよびα-シヌクレインのSer129に対するホスホ特異EP1536Y抗体でプローブすることによって生化学的分析は、両方の送信経路のために罹患動物は、リン酸化およびサルコシルの凝集体を蓄積したことを明らかにしましたその脳及び脊髄（ 表2および図2）に-insolubleα-シヌクレイン。対照的に、PBS注射及び非罹患動物の脳及び脊髄は、リン酸化アルファ - シヌクレインのモノマー種を含有していました。
ホスホ特異的pSyn＃64抗体を腹腔内注射し、罹患したマウスの脳切片の免疫蛍光染色は、CNS全体にリン酸化されたα-シヌクレイン沈着の広い分布を明らかにしました （ 表2及び図3）。また、ユビキチンとP62と共局在リン酸化αシヌクレイン沈着物は、堆積物の形成に寄与する可能性がある異常なタンパク質恒常性を示します。
罹患動物におけるα-シヌクレイン凝集体の蓄積をすることによって検出された神経炎症変化を伴っていましたGFAP、反応性アストログリオーシスを明らかにすることができる星状細胞のマーカー（ 図4）のための免疫蛍光染色。また、活性化ミクログリアはまた、IBA-1の免疫蛍光染色によって豊富なα-シヌクレイン病理（イオン化カルシウム結合アダプター分子1）を有する領域で発見されました。よれば、生物発光イメージングは増加輝きのTgの脳（M83 +/-：GFAP -Luc +/-）から放出された（> 2×10 6 P / S / cmで2 / SR）を明らかにしたα-シヌクレイン線維を注射したマウスを、彼らは、神経疾患の兆候を開発した直前に。これとは対照的に、PBSを注射したマウスの脳は、輝きの増加を示しませんでした。ルシフェラーゼ発現は、GFAPプロモーターから駆動されるため増加輝きは、反応性アストログリオーシス、神経炎症の特徴を示しています。
図1： マウス ： 腹腔内またはintraglossal経路によるα-シヌクレイン線維の注射は、バイジェニックのTg（GFAP -Luc +/- M83 +/-）で疾患を引き起こします 。 （A）腹腔内及びintraglossallyマウスに注射した超音波処理組換えヒトα-シヌクレイン原繊維の電子顕微鏡写真。酢酸ウラニルでネガティブ染色は、短い棒状の凝集体の複数のクラスタを明らかにしました。スケールバー= 100 nmの。 （B）カプラン・マイヤー生存曲線は、α-シヌクレイン線維を腹腔内注射後4 5のTg（M83 +/-：GFAP -Luc +/-）ことを示すマウスは、229±17日（紫黒四角）において神経疾患を発症しPBSを注射した対照マウスのいずれも420日（紫白四角）内の神経機能障害の徴候を発症していないのに対し。 α-シヌクレイン原繊維とintraglossal接種後5の1匹のマウスは285日後に死亡した（緑黒丸）。対照的に、PBSを注射した対照マウスのいずれも、神経疾患を発症しないか、または自然に（緑色白丸）が死亡しました。ブライドらから変更。 2016年14。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： マウス ： 末梢注入のTg（GFAP -Luc +/- M83 +/-）のCNSにおけるリン酸化アルファ-シヌクレインの生化学的分析 。 （A）イムノはEP1536Y抗体で、α-シヌクレインのSer129でのリン酸化を認識する、腹腔内注射及び罹患マウスはその脳におけるリン酸化アルファ-シヌクレインのサルコシル不溶性凝集体の高分子量種を蓄積することを示しましたD脊髄。 PBSでチャレンジ対照マウスは、リン酸化アルファ - シヌクレインの凝集体を蓄積してのみ、そのモノマー形態のためにバンドを示していませんでした。他のすべてのintraglossally接種したマウスは、α-シヌクレインの沈着せずに健康なままであった（B）α-シヌクレイン線維とintraglossalチャレンジつのみマウスの後、動物121は、その脳および脊髄におけるリン酸化アルファ-シヌクレインのサルコシル不溶性凝集体を示しました。分子量は、キロダルトンで示されています。各レーンのサンプルローディングはアクチンの検出によって示されています。ブライドらから変更。 2016年14。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：免疫蛍光分析は、の堆積を示していますマウス ：リン酸化されたα-シヌクレイン病変のTg（GFAP -Luc +/- M83 +/-）の脳及び脊髄におけるユビキチンおよびP62と共局在。視床核（A）、および脊髄で観察されるよう灰白質（B）において検出されるようEP1536Y抗体を用いて検出し、リン酸化アルファ-シヌクレインの同時染色、およびユビキチンは、脳内の別個の共局在を明らかにしたのα-シヌクレイン原繊維と腹腔内チャレンジ後の病気のマウス。同様に、pSyn＃64抗体を用いて検出されたリン酸化されたα-シヌクレインは、また、脳におけるP62（C）及び罹患動物の脊髄（D）と共局在します。 （DへのA）PBS注射健常対照動物は、これらのタンパク質のいずれかのための堆積又は共局在化を示しませんでした。 DAPIによる核染色は青色で示されています。スケールバー=20μmです。ブライドらから変更。 、2016 14。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：Tgは（M83 +/-：GFAP -Luc +/-）マウスは、α-シヌクレイン原線維と周辺チャレンジ後の神経膠症を発症しました。 （A）GFAP、星状細胞のマーカーに対する抗体で罹患動物の脳切片の免疫蛍光分析は、pSyn＃64抗体と脳幹で検出されたリン酸化されたα-シヌクレインの沈着、地域で反応性アストログリオーシスを明らかにしました。対照的に、PBSを注射した対照マウスの脳には、反応性アストログリオーシスはなかったです。 （B）同様に、IBA-1に対する抗体で染色し、ミクログリアのマーカーは、小膠細胞症を示しました罹患動物におけるリン酸化されたα-シヌクレインの沈着物を有する領域です。健康、PBSを注射した対照マウスの脳は、小膠の兆候を示しませんでした。 （C）生物発光イメージングのTgの脳と脊髄からの高められた輝きを明らかにした（M83 +/-：GFAP -Luc +/-）を腹腔内アストロサイトの活性化によって引き起こされたα-シヌクレイン線維（左パネル）を注射したマウス、マウスは神経学的症状を発症直前に。 PBSを注射した対照マウスの脳と脊髄では、基礎輝きは、時間（右パネル）で増加しませんでした。 α-シヌクレイン線維とintraglossal接種後一のTg（M83 +/-：GFAP -Luc +/-）マウス、動物121、それは285日（中央のパネル）で死亡直前の反応性アストログリオーシスの兆候を示しました。 （D）のTg（M83 +/-：GFAP -Luc +/-）の腹腔内チャレンジ後α-シヌクレイン原線維を有するマウス、increa生物発光のSEDレベルが（> 2×10 6 P / S / cmで2 / SR）は、それらが疾患の神経学的徴候を発症数週間前に4匹のマウス（青、緑、茶、オレンジ色の円）の脳から測定しました。 5匹の動物の1つは、それがα-シヌクレイン原繊維（マゼンタ円）で285日intraglossal注射の後に死亡直前に生物発光のレベルの上昇を示しました。対照的に、健康な、PBS注射コントロールマウス（黒丸;エラーバーはSDを示す[N = 4]）およびα-シヌクレイン原繊維（赤い丸）を腹腔内注射した後に疾患を発症しなかった一匹、生物発光シグナルが残りました観察期間内に2×10 6 P / S / cmで2 / SRの閾値を下回ります。スケールバー=20μmです。ブライドらから変更。 2016年14。 これの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。図。
| マウスのライン | 接種材料（μgの） | 接種ルート | 疾患を有するマウスの数/無。接種したマウスの | SD±平均生存時間（日数） |
| Tgは（M83 +/-：GFAP -luc +/-） | ヒトαシヌクレイン線維（50） | 腹腔内 | 4/5 | 229±420分の17 |
| Tgは（M83 +/-：GFAP -luc +/-） | PBS | 腹腔内 | 0/5 | 0/420 |
| Tgは（M83 +/-：GFAP -luc +/-） | ヒトαシヌクレイン線維（10） | intraglossal | 1/5 | 420分の285 |
| Tgは（M83 +/-：GFAP -luc +/-） | PBS | intraglossal | 0/4 0/420 |
表1：接種実験。 *ブライドらから変更。2016年14
| ターゲット[抗体クローン] | ホスト | 免疫原 | IFで希釈 | WBで希釈 |
| アクチン[C4] | マウス | - | - | 1：1,000 |
| αシヌクレイン、ホスホS129 [pSyn番号64] | マウス | pSer129 | 1200：1 | - |
| αシヌクレイン、ホスホS129 [EP1536Y] | ウサギ | pSer129 | 1：100 | 1：1,000 |
| グリア線維性酸性タンパク質（GFAP） | ウサギ | - | 1：200 | - |
| IBA-1 | ウサギ | - | 1：500 | - |
| Sequestosome-1（P62） | ウサギ | - | 1：100 | - |
| ユビキチン〔のUbi-1] | マウス | - | 1：500 | - |
表2：免疫蛍光（IF）とウェスタンブロッティング（WB）のために使用される抗体。 *ブライドらから変更。2016年14
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Discussion
Tgは（M83 +/-：GFAP -Luc +/-）の腹膜内へのα-シヌクレイン線維の末梢注射したマウスは、シヌクレイノパチーの重要な特性を再現するために、神経炎症を伴う神経疾患を誘発するための容易な方法を表します。同様に、舌の注射は、トランスジェニックマウスにおけるα-シヌクレインprionoidsによって神経侵入のための別のルートを表すが、あまり効率的です。私たちは、注射後420日で実験を終了することを選んだと私たちはより多くのまたはフィブリル注射したマウスのすべての後の時点で疾患を発症している可能性が可能性を排除することはできません。また、Tgは（M83 +/-：GFAP -Luc +/-）を使用したマウスは、アストログリオーシスの非侵襲的な可視化を可能にし、全体の寿命にわたってα-シヌクレインの神経侵入によって引き起こされる炎症応答を監視するための簡単な方法を表しますマウス。
重要なステップは、準備です接種材料の。集約時間、超音波処理時間、エンドトキシンの存在、または注射に使用されるフィブリルの量のような一見些細な要因は、ミスフォールドα-シヌクレイン21の播種傾向に影響を与えることにより、実験の結果に影響を与える可能性があります。したがって、注射のための接種材料を準備する際、常に同じ条件を使用することが重要です。 intraglossal注射のためには、舌下神経だけでなく、舌咽神経のような他の脳神経だけでなく舌を支配し、脳へのα-シヌクレインprionoidsのニューロン間輸送に関与することができることを考慮しなければなりません。したがって、舌の異なる領域を標的とすることは、脳に異なる拡散速度論につながる可能性があります。私たちは、直接舌下神経に注入していない、舌下神経を標的にすることは、α-シヌクレインprionoidsのCNS透過率を向上させる可能性があります。 α-シヌクレイン線維との腹腔内注射のためにそれがcritiです接種材料が正しくマイナス神経侵襲に影響を与える可能性の腸や盲腸などの内臓の中に誤って腹膜に注入していないことをCAL。 D-ルシフェリンを注入するとき、これはまた、生物発光イメージングのために重要です。内臓にD-ルシフェリンのMistargetingは、脳への分布を遅くし、より低い生物発光を生じ得ます。それを撮像中に均一な結果を得るためにも、常に新たに注射前にD-ルシフェリン溶液を調製し、それが正確に撮像する前に腹腔内注射した後10分間インキュベートさせるために重要です。
生物発光イメージングは、経時アストログリオーシスにおける非侵襲的測定値の変化に有用な方法であり、腹腔内またはintraglossal注射後だけでなく、例えば、脳内または静脈内注射を含む、治療のすべての種類の後にも適用することができます。 CNに周囲からα-シヌクレインprionoidsの広がりを監視しますマウス：Sとその後の神経炎症は、我々は、バイジェニックのTg（GFAP -luc +/- M83 +/-）を使用しました。これらの動物におけるα-シヌクレインのヘミ接合式がホモ接合動物に40％より低い相対であるため、彼らは年齢の最大22ヶ月間、自発的な疾患のないままで、α-シヌクレインの伝送研究の13に適した遺伝的背景を持っています。しかし、生物発光イメージングのためのマウスモデルの選択に関する変形が望ましい可能性があります。興味深いオプションは、限り、本質的に野生型である背景に、α-シヌクレイン線維のprionoid行動の評価を可能にする導入遺伝子としてのみルシフェラーゼを表現する単一遺伝子のTg（GFAP -luc +/-）マウスの使用でありますα-シヌクレインは14懸念されます。また、そのような筋萎縮性側索硬化症またはTgのTgは（SOD1 G93A）マウス（APP23）Mのような他のトランスジェニックマウスへのTg（GFAP -Luc +/-）マウスを交配アルツハイマー病の氷は、他の疾患モデルにおける神経炎症のイメージング22、23を可能にします。
このプロトコルの制限は、注射部位に基づいて注入接種材料が一定量を超えることができないということです。したがって、舌への注射は、CNSへの送信時間に影響を与える可能性がある、腹膜へのものよりも小さい容量で行うことができます。別の制限は、GFAP -Lucトランスジーンだけではなく、神経炎症に等しく重要である小膠細胞のアストログリオーシスの検出を可能にすることです。最後に、このモデルは、α-シヌクレインprionoidsを腹腔内注射した後、CNSに達する方法についての洞察を提供していません。
注射による外因性α-シヌクレインprionoidsのアプリケーションはsynucleiの特性を反復する上で重要な役割を果たして伝送経路を研究するための有用な方法であることが示されていますnopathies。動物モデルへの組換えα-シヌクレイン原線維または疾患に関連するマウスまたはヒトα-シヌクレイン種の脳内注射は、時間5、7、17、24、25、26上にそれらの播種特性と伝送効率を分析するためにいくつかの研究で使用されてきました。脳への定位注射はいつもすぐに手術後の局所炎症反応を誘発するので、この伝送経路は、脳の恒常性の変化によって引き起こさ接種材料の拡散や感染性に影響を与える可能性があります。より最近の研究は、主に外科手術を避けるためにではなく、CNSに神経侵襲が協力できたところから初期点として、周辺部、腸壁、骨格筋、または血液を分析するのではなく、周辺機器や全身のアプリケーションにフォーカスを変更しましたmmence 6、9、14、27。プリオンのために、腹膜を通って、その送信が示されている、または舌神経侵入及び神経疾患につながります。舌の感染後、プリオンは、脳幹11で舌下核にわずか2週間以内に広がります。 α-シヌクレインは、プリオンのような神経侵襲と播種特性を有することが検討されているので、我々は、舌および腹膜を介した送信がCNS 14に侵入するために、α-シヌクレインprionoidsためのさらなる入口点を表すことを示しました。生物発光イメージングによるアストログリオーシスの定量化は、時間の経過とともに神経炎症プロセスの追跡を容易にし、組織学的分析に非侵襲的代替物を表します。
CNSは、α-シヌクレインprionoidsの神経侵襲にどのように応答するかをより深く理解を得るためには、および神経炎症を引き起こす他の治療法には、また、ミクログリアにおけるタンパク質発現のための特定のプロモーターからのルシフェラーゼ発現を駆動する導入遺伝子と小膠の非侵襲的モニタリング、 例えばを許可するマウスモデルを生成することが有益であろう。
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Disclosures
著者は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者はオルガ・シャルマ、テレサ・ハント、および技術サポートのためのDZNE顕微鏡および動物施設のスタッフに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-actin antibody | Merck Millipore | MAB1501 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anti-GFAP antibody | Dako | Z0334 01 | |
| anti-IBA-1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| anti-Sequestosome-1 (p62) antibody | Proteintech | 18420-1-AP | |
| anti-ubiquitin antibody [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| Ketamine | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xylazine | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| 27 G syringe | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Secureline lab marker | Neolab | 25040 | |
| D-luciferin potassium salt | Acris | LK10000 | 30 mg/mL stock solution |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 sonicator | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II imaging system | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice | The Jackson Laboratory | 004479 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| N-laurylasarcosyl | Sigma | L5125-100G | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | TLA-110 rotor | |
| Thickwall polycarbonate tubes | Beckman Coulter | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | WG1401BOX | |
| HRP conjugated antibody | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 conjugated antibody | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| Stella 3200 imaging system | Raytest | ||
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | SA/00216763/000500 | working solution 3% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | working dilution 1:50,000 |
| Fluoromount media | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | ||
| HALT protease and phosphatase inhibitors | Thermo Fisher Scientific | 10516495 | |
| Precellys 24-Dual homogenizer | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Alexa Fluor 594 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 10741395 | |
| Microtome RM2255 | Leica | ||
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss |
References
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