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Neuroscience

ट्रांसजेनिक चूहों में neuroinflammation की bioluminescence इमेजिंग अल्फा-synuclein तंतुओं के परिधीय इनोकुलेशन के बाद

Published: April 13, 2017 doi: 10.3791/55503
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 2Centre for Prions and Protein Folding Diseases & Department of Biochemistry, University of Alberta

Summary

(M83 +/-: GFAP -luc +/-) पेरिटोनियम या टीजी की जीभ में अल्फा synuclein तंतुओं के परिधीय इंजेक्शन चूहों, जो पारिवारिक A53T उत्परिवर्तन और जुगनू luciferase के साथ मानव अल्फा synuclein व्यक्त करते हैं, तंत्रिकाविकृति विज्ञान पैदा कर सकते हैं neuroinflammation सहित, , उनके केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में।

Abstract

misfolded अल्फा synuclein की प्रिओन की तरह व्यवहार का अध्ययन करने के लिए, माउस मॉडल की जरूरत है कि अल्फा synuclein prionoids है, जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के भीतर तंत्रिकाविकृति विज्ञान कारण के तेज और आसान प्रसारित करने की अनुमति। चूहों, जो प्रिओन प्रोटीन प्रमोटर से A53T उत्परिवर्तन के साथ मानव अल्फा synuclein overexpress और जुगनू से luciferase: यहाँ हम bigenic टीजी (GFAP -luc +/- M83 +/-) में है कि intraglossal या अल्फा synuclein तंतुओं के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन का वर्णन glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन के लिए प्रमोटर (GFAP), neuropathologic रोग को उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त है। जानवरों सहज रोग से मुक्त रहेगा जब तक वे एक तक पहुँचने: समयुग्मक टीजी (M83 + / +) चूहों कि गंभीर तंत्रिका संबंधी 8 महीने, विषमयुग्मजी टीजी (GFAP -luc +/- M83 +/-) के इस दौर में शुरुआत लक्षण विकसित की तुलना में 22 महीने की उम्र। दिलचस्प बात यह है intraperitone के माध्यम से अल्फा synuclein तंतुओं के इंजेक्शन229 ± 17 दिनों की औसत ऊष्मायन समय के साथ चूहों: अल मार्ग पाँच टीजी (GFAP -luc +/- M83 +/-) के चार में पक्षाघात के साथ तंत्रिका संबंधी रोग प्रेरित किया। रोगग्रस्त पशुओं उनके दिमाग और रीढ़ की रस्सियों में फॉस्फोरिलेटेड अल्फा synuclein के गंभीर जमा दिखाया। अल्फा synuclein का संचय sarkosyl अघुलनशील थे और यूबीक्यूटिन और p62 के साथ colocalized, और एक भड़काऊ प्रतिक्रिया astrocytic gliosis और microgliosis में जिसके परिणामस्वरूप के साथ किया गया। हैरानी की बात है, जीभ में अल्फा synuclein तंतुओं के टीका पांच इंजेक्शन 285 दिनों के बाद अल्फा synuclein विकृति दिखा जानवरों का केवल एक ही साथ इस बीमारी को फैलाने में कम प्रभावी था। हमारे निष्कर्ष बताते हैं कि intraglossal मार्ग और अधिक ताकि इंट्रापेरिटोनियल मार्ग के माध्यम से के माध्यम से टीका टीजी में synucleinopathies के प्रासंगिक पहचान के साथ तंत्रिका संबंधी बीमारी प्रेरित करने के लिए उपयुक्त है (M83 +/-: GFAP -luc +/-) चूहों। इस प्रेरित प्रिओन की तरह रोगजनन के अध्ययन के लिए एक नया मॉडल प्रदान करता हैअधिक विस्तार में अल्फा synuclein prionoids द्वारा d।

Introduction

बढ़ रही है सबूत अल्फा synuclein गुण होते हैं जो विशेष रूप से आत्म-बीज के लिए अपनी क्षमता में प्रिओन प्रोटीन के समान ही हैं, और कोशिकाओं के बीच और neuronal रास्ते साथ misfolding प्रचार किया है कि नहीं है। अल्फा synuclein का यह गुण को 'प्रिओन की तरह' या 'prionoid' में जाना जाता है, और नव स्वस्थ न्यूरॉन्स 1, 2 प्रत्यारोपित करने के लिए प्रत्यारोपण के प्रयोगों, जो रोगग्रस्त न्यूरॉन्स से misfolded अल्फा synuclein की योग्यता का सुझाव में टिप्पणियों के द्वारा समर्थित है , 3, 4। इसके अलावा मस्तिष्क या परिधि, जैसे hindlimb मांसपेशी या आंतों की दीवारों, के दूरस्थ भागों में अल्फा synuclein विकृति विज्ञान के एक प्रसार में परिणामों में misfolded अल्फा synuclein का प्रत्यक्ष इंजेक्शन सीएनएस 5, 6, 7, <sup वर्ग = "xref"> 8, 9, 10। हम और अधिक विस्तार में परिधीय मार्गों के माध्यम से अल्फा synuclein prionoids के प्रसारण का विश्लेषण किया और सवाल misfolded अल्फा synuclein, एक विशेषता यह है कि पहले से सूक्ष्म जीवाणुओं के लिए लेकिन misfolded अल्फा के लिए न होता हुआ देखा एक भी intraglossal या इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के बाद सीएनएस neuroinvade सकता है कि संबोधित synuclein। जीभ में सूक्ष्म जीवाणुओं के इंजेक्शन के बाद, सीएनएस के neuroinvasion जीभ कि hypoglossal तंत्रिका, जो ब्रेन स्टेम 11 में स्थित है के नाभिक की ओर जाता है की hypoglossal तंत्रिका साथ प्रचार के माध्यम से हासिल की है। चूहों कि प्रिओन प्रमोटर से मानव अल्फा synuclein की A53T उत्परिवर्ती overexpress, और जुगनू एक GFAP प्रमोटर के नियंत्रण में luciferase द्वारा astrocytic सक्रियण नजर रखने के लिए: एक माउस मॉडल के रूप में हम टीजी (GFAP -luc +/- M83 +/-) चुना bioluminescence, पहले के मस्तिष्क में दिखाया गया हैप्रिओन संक्रमित चूहों 12। हमारे हाथ में bigenic टीजी (M83 +/-: GFAP -luc +/-) चूहों की उम्र के 23 महीने तक रोग विकसित नहीं किया के रूप में दूसरों 13 से दिखाया गया है। Intraglossal या दिमाग में विकृति और टीजी की रीढ़ की रस्सियों के साथ इंट्रापेरिटोनियल मार्ग प्रेरित तंत्रिका संबंधी रोग के माध्यम से मानव अल्फा synuclein तंतुओं के एक एकल इंजेक्शन (M83 +/-: +/- GFAP -luc) परिकल्पना समर्थन चूहों कि अल्फा synuclein prionoids सूक्ष्म जीवाणुओं के 14 के साथ महत्वपूर्ण विशेषताओं को साझा करें।

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Protocol

जानवरों सहित सभी प्रक्रियाओं उत्तर राइन-वेस्टफेलिया राज्य पर्यावरण एजेंसी (LANUV) के पशु संरक्षण समिति के अनुमोदन के साथ प्रदर्शन किया गया। पशु रखे और एक 12 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र और भोजन और पानी के लिए नि: शुल्क प्रवेश के साथ मानक शर्तों के अनुसार के लिए परवाह कर रहे थे।

1. पशु मॉडल

  1. एक दूसरे को काटना hemizygous टीजी (GFAP -luc +/-) hemizygous टीजी (M83 +/-) चूहों hemizygous bigenic टीजी (M83 +/-: GFAP -luc +/-) उत्पन्न करने के लिए के साथ चूहों चूहों 15, 16।
  2. जुगनू luciferase 12, 17 के लिए ट्रांस्जीन एन्कोडिंग मानव अल्फा synuclein की और मानक पीसीआर के साथ उपस्थिति के लिए के साथ वास्तविक समय पीसीआर संतान जीनोटाइप।
  3. छह-टू-आठ सप्ताह की आयु में जानवरों टीका।

2. Inoculum तैयारी

  1. मो तैयारTris-बफ़र खारा (टीबीएस) 20 मिमी Tris-एचसीएल (पीएच 7.2) के रूप में किया गया है में 150 मिमी NaCl युक्त बफर में A53T उत्परिवर्तन के साथ nomeric पुनः संयोजक मानव अल्फा synuclein पहले से 14 का वर्णन किया।
  2. 800 rpm और 5 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय शेकर में 3 माइक्रोग्राम / मोनोमेरिक पुनः संयोजक मानव अल्फा synuclein की μL आंदोलन द्वारा inoculations के लिए तंतुमय अल्फा synuclein तैयार करें।
  3. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में तंतु विधानसभाओं पतला इंट्रापेरिटोनियल या intraglossal inoculations के लिए 2 माइक्रोग्राम / μL के लिए 1 माइक्रोग्राम / μL के अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए।
  4. बर्फ पर (प्रत्येक नाड़ी और एक आयाम 50% करने के लिए सेट के बीच एक-दूसरे ठहराव के साथ 0.5 की अवधि के 40 दालों) 1 मिनट के लिए एक छड़ी sonicator के साथ अल्फा synuclein तंतुओं टुकड़ा। पार बोने से संदूषण से बचने के लिए। स्वच्छ sonication जांच का प्रयोग करें विभिन्न inoculum तैयार करने के लिए।

3. Intraglossal इंजेक्शन

  1. एक intrape के साथ जानवरों चतनाशून्य100 मिलीग्राम / किग्रा ketamine और 10 मिलीग्राम / किग्रा xylazine की ritoneal इंजेक्शन। जानवर के पैर की अंगुली चुटकी और पुष्टि करते हैं कि यह उचित संज्ञाहरण सुनिश्चित करने के लिए अपने hindlimb वापस लेने नहीं करता है। जबकि संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए जानवर की आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम का प्रयोग करें।
  2. ध्यान से उनके सिर अन्वेषक की ओर का सामना करना पड़ के साथ एक पृष्ठीय लेटा हुआ स्थिति में एक हीटिंग प्लेट पर चिपकने वाला टेप के साथ narcotized जानवरों को ठीक करें।
  3. sonicated अल्फा synuclein तंतुओं या पीबीएस के 5 μL के साथ एक 27 जी डिस्पोजेबल चमड़े के नीचे सिरिंज भरें।
  4. पशु के मुंह खुला रखने के लिए दाँतेदार युक्तियों के साथ एक कुंद नाक अंगूठे संदंश का प्रयोग करें, और संदंश की एक दूसरी छोटी जोड़ी ध्यान से जीभ के नीचे के हिस्से में इंजेक्शन के लिए सुलभ बनाने के लिए जीभ बाहर निकलने के लिए।
  5. दाएं या बाएं नीचे hypoglossal तंत्रिका से निकटता में जीभ के पक्ष में सिरिंज की सुई इंजेक्षन। धीरे-धीरे 5 रों के बाद inoculum इंजेक्षन। धीरे-धीरे 5 रों के बाद सुई वापस लेना सुनिश्चित करने के लिए कि inoculumऊतक प्रवेश किया है और जब तक सुई से मुकर जाना नहीं खोया है।
  6. इसके आसक्ति से पशु को छोड़ दें और पूरी तरह ठीक होने तक लगातार निगरानी के तहत हीटिंग थाली पर छोड़।

4. इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन

  1. इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के लिए, isoflurane / ऑक्सीजन 2 एल / मिनट की प्रवाह की दर और vaporizer 2% करने के लिए सेट का उपयोग कर के साथ साँस लेना द्वारा एक संज्ञाहरण कक्ष में शीघ्र ही जानवरों बेहोश करना। जानवर के पैर की अंगुली चुटकी और पुष्टि करते हैं कि यह उचित संज्ञाहरण सुनिश्चित करने के लिए अपने hindlimb वापस लेने नहीं करता है।
  2. sonicated अल्फा synuclein तंतुओं या पीबीएस के 50 μL के साथ एक 27 जी डिस्पोजेबल चमड़े के नीचे सिरिंज भरें।
  3. सीधे माउस की पेरिटोनियम में इंजेक्षन और सिर अन्वेषक से दूर का सामना करना पड़ के साथ एक पृष्ठीय स्थिति में पशु पकड़े और नीचे लगभग 45 डिग्री तक छोटी आंत या सेसम पेट की दीवार के पीछे स्थित मर्मज्ञ से बचें। जानवरों की निगरानी करें, जब तक वे बरामद कियासंज्ञाहरण से।

5. bioluminescence इमेजिंग

  1. छवि टीजी (M83 +/-: GFAP -luc +/-) चूहों एक bioluminescence इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर हर 2-4 सप्ताह।
  2. शीघ्र ही इमेजिंग 2 एल / मिनट की प्रवाह की दर और vaporizer 2% करने के लिए सेट के साथ एक isoflurane / ऑक्सीजन चैम्बर में चूहों anesthetize करने से पहले। जानवर के पैर की अंगुली चुटकी और पुष्टि करते हैं कि यह उचित संज्ञाहरण सुनिश्चित करने के लिए अपने hindlimb वापस लेने नहीं करता है।
  3. दाढ़ी और एक लोमनाशक क्रीम के साथ चूहों के सिर बाल हटाना। unspecific bioluminescence ब्लॉक करने के लिए एक गैर परेशान मार्कर के साथ काले रंग में कान रंग।
  4. एक 30 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान के लिए डी luciferin पोटेशियम नमक, luciferase की सब्सट्रेट, पीबीएस में पतला। -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 एमएल aliquots में संग्रहीत कर। प्रकाश के संपर्क से भंग डी luciferin को सुरक्षित रखें।
  5. इंजेक्शन से पहले जानवरों का वजन। 150 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन के इंजेक्शन के लिए डी luciferin की सही मात्रा की गणना। Intraperitoneally डी इंजेक्षन-luciferin और संज्ञाहरण चैम्बर के लिए पशु लौटने।
  6. इमेजिंग सॉफ्टवेयर शुरू करो। बाद इमेजिंग प्रणाली तक पहुँच गया है इसके ऑपरेटिंग तापमान नियंत्रण कक्ष में 'प्रारंभ' बटन पर क्लिक करके प्रणाली आरंभ कर देगा।
  7. बटन 'Luminescent' और 'तस्वीर' का चयन करें। 60 रों, 'मध्यम', एफ / बंद करने के लिए '1', के लिए binning और 'बंद करें' को ईएम लाभ के लिए जोखिम समय निर्धारित करें।
  8. पुष्टि करें कि उत्तेजना फिल्टर 'ओपन' के लिए 'ब्लॉक' और उत्सर्जन फिल्टर करने के लिए सेट कर दिया जाता है, और 1.50 सेमी के अधीन ऊंचाई निर्धारित किया है।
  9. दस मिनट डी luciferin के साथ इंजेक्शन के बाद, इमेजिंग कक्ष में हीटिंग प्लेट पर जानवरों जगह है और यह सुनिश्चित करें कि उनके muzzles सही ढंग से संज्ञाहरण आउटलेट में रखा जाता है। साँस लेना कक्ष से isoflurane / ऑक्सीजन का प्रवाह बंद कर दें और 0.25 एल / मिनट की प्रवाह की दर और 2% की वाष्पीकरण के साथ इमेजिंग चैम्बर के लिए प्रवाह को खोलें। इमेजिंग चैम्बर जनसंपर्क का दरवाजा बंदoperly।
  10. 'मोल' बटन पर क्लिक bioluminescence, जो 60 रों लेता है मापने के लिए। isoflurane प्रवाह बंद करो और जानवरों पर नजर रखने के लिए जब तक वे पूरी तरह से उन्हें अपने पिंजरों में वापस लौटने के बाद बरामद किया।
  11. bioluminescence अंदाजा लगाना इमेजिंग सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें। 'उपकरण पैलेट' के तहत 'आरओआई उपकरण' का चयन करें। के तहत 'आरओआई उपकरण' भीतर 'टाइप' 'मापन आरओआई' का चयन करें।
  12. तीन चूहों के लिए आदर्श '3' - 'आरओआई उपकरण' के भीतर "चक्र" उपकरण पर क्लिक करें और नीचे खींच मेनू से आकर्षित करने के लिए ROI की संख्या चुनें।
  13. छवि में, राइट क्लिक करें प्रत्येक लागत पर लाभ और तहत 'गुण' 1.25 सेमी चौड़ाई और ऊंचाई समायोजित करें। मस्तिष्क क्षेत्र है कि मात्रा निर्धारित है पर एक लागत पर लाभ की स्थिति निर्धारित करें।
  14. छवि के ऊपर बाएँ में, 'चमक (फोटॉन)' के लिए इकाइयों पैनल की स्थापना की।
  15. 'उपकरण पैलेट' के भीतर, का चयन 'छवि समायोजित करें' और न्यूनतम समायोजित करने और'रंग स्केल', उदाहरण के लिए की अधिकतम, 0.20e6 से 1.00e6 करने के लिए।
  16. 'फ़ाइल' के तहत 'सहेजें' के साथ डेटा को बचाने के।

6. बायोकेमिकल विश्लेषण

  1. स्थापित प्रोटोकॉल 18, 19 के अनुसार दिमाग और रीढ़ की तार को अलग।
  2. एक ऊतक homogenizer में 6,000 आरपीएम के साथ दो 30 रों चक्र में प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधक (पीबीएस में 1x करने के लिए पतला) की उपस्थिति में पूरे मस्तिष्क और अलग से पीबीएस में पूरे रीढ़ की हड्डी नमूने homogenize। सुनिश्चित करें कि मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के नमूने 20% (भार / खंड) की एक अंतिम एकाग्रता के लिए homogenized हैं।
  3. नमूने में दो बार Sonicate जबकि 10 एस की एक निरंतर नाड़ी और एक आयाम 50% करने के लिए सेट के साथ बर्फ पर उन्हें ध्यान में रखते हुए।
  4. 1 पीबीएस में 1.5 एम सोडियम क्लोराइड के साथ: उन्हें 1 कमजोर द्वारा पीबीएस और 750 मिमी NaCl में 10% homogenates समायोजित करें।
  5. सेलुलर मलबे को अलग करने के लिए, पर 5 मिनट के लिए 1,000 XG पर homogenates अपकेंद्रित्र4 डिग्री सेल्सियस। अगले चरणों के लिए supernatants रखें और छर्रों त्यागें।
  6. निर्माता के निर्देशों के अनुसार bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख का उपयोग कर homogenates में प्रोटीन एकाग्रता का आकलन करें। बर्फ पर 15 मिनट के लिए 10% (भार / खंड) की एक अंतिम एकाग्रता पर एन laurylsarcosyl में रीढ़ की हड्डी homogenates से मस्तिष्क homogenates से कुल प्रोटीन की 1.0 मिलीग्राम या 0.8 मिलीग्राम सेते हैं।
  7. आसुत जल में 10% (भार / खंड) के एक 3 एमएल सुक्रोज तकिया पर homogenates ओवरले और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 465000 XG पर उन्हें ultracentrifuge।
  8. एक बफर 4% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस), 2% β-mercaptoethanol, 192 मिमी ग्लाइसिन, 25 मिमी Tris, और 5% (भार / वॉल) सुक्रोज युक्त छर्रों Resuspend।
  9. 5 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर नमूने उबालें और एक morpholineethanesulfonic एसिड (एमईएस) बफर सिस्टम में वैद्युतकणसंचलन के लिए एसडीएस-polyacrylamide जैल पर उन्हें लोड।
  10. एक sem में polyvinylidene difluoride को अलग प्रोटीन (PVDF) झिल्ली स्थानांतरणसोख्ता प्रणाली idry।
  11. 0.4% में झिल्ली सेते (खंड / खंड) formalin पीबीएस में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक रोटर पर 35 आरपीएम के साथ पार लिंक का हल झिल्ली के साथ प्रोटीन।
  12. 0.05% (खंड / खंड) युक्त टीबीएस बफर बीच 20 और 5% (भार / वॉल) कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए दूध में झिल्ली को ब्लॉक करें।
  13. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में बफर अवरुद्ध में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग सेते हैं।
  14. टीबीएस बफर में झिल्ली तीन बार धोकर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए टीबीएस में peroxidase- या फ्लोरोफोरे-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं।
  15. स्थापित प्रोटोकॉल 20 के अनुसार chemiluminescence या प्रतिदीप्ति से बंधे माध्यमिक एंटीबॉडी कल्पना।

7. इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण

  1. एक ऊतक प्रसंस्करण स्टेशन में विच्छेदित दिमाग और रीढ़ की रस्सियों निर्जलीकरण और उन्हें एक तेल स्टेशन का उपयोग पैराफिन में एम्बेड।
  2. पैराफिन एम्बेडेड Tis कट8 माइक्रोन मोटी राज्याभिषेक वर्गों में एक सूक्ष्म साथ मुकदमा और कांच स्लाइड पर वर्गों माउंट।
  3. 10 मिनट के लिए 5 के लिए दो अलग-अलग XYLOL स्नान में उन्हें विकासशील द्वारा ऊतक वर्गों Deparaffinize और वर्गीकृत इथेनॉल स्नान (100%, 90%, 70%, 50%) की एक श्रृंखला के माध्यम से और अंत में एच 2 ओ के साथ उन्हें rehydrate
  4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 0.01 एम साइट्रेट बफर (6.0 पीएच) में वर्गों सेते हैं और इसके अलावा उन्हें एक माइक्रोवेव ओवन में 10 मिनट तक उबालें।
  5. वर्गों कमरे के तापमान को ठंडा करने और उन्हें 30 मिनट के लिए एक 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान अंतर्जात पराक्सिडेजों को बाधित करने के साथ सेते हैं।
  6. 20% (खंड / खंड) सामान्य बकरी सीरम, 1% (खंड / खंड) गोजातीय सीरम albumin (BSA), और 0.5% ट्राइटन X-100 कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीबीएस के साथ ऊष्मायन से ऊतक वर्गों को ब्लॉक करें।
  7. 1% (/ खंड खंड) सामान्य बकरी सीरम, 1% (खंड / खंड) बीएसए, और 0.25% ट्राइटन पीबीएस में X-100 में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ वर्गों सेते हैं।
    8. <li> वर्गों 0.25% (खंड / खंड) ट्राइटन X-100 पीबीएस में और एक बार पीबीएस के साथ साथ दो बार धोएं।
  8. इसी फ्लोरोफोरे-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी और परमाणु डाई DAPI 1% में पतला कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए (खंड / खंड) सामान्य बकरी सीरम, 1% (खंड / खंड) बीएसए, और पीबीएस के साथ वर्गों दाग।
  9. 0.25% (खंड / खंड) ट्राइटन X-100 पीबीएस में और एक बार पीबीएस के साथ साथ दो बार धोने के बाद, embedding मीडिया के साथ स्लाइड coverslip और एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग के साथ धुंधला कल्पना।

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Representative Results

चूहों (तालिका 1 और चित्रा 1): जीभ या bigenic टीजी की सीएनएस (GFAP -luc +/- M83 +/-) में पेरिटोनियम प्रेरित तंत्रिकाविकृति विज्ञान के माध्यम से अल्फा synuclein prionoids की परिधीय इंजेक्शन। अल्फा synuclein तंतुओं के साथ एक एकल इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के बाद, पांच चूहों के चार 229 ± 17 दिनों की औसत ऊष्मायन समय के साथ तंत्रिका संबंधी रोग का विकास किया। हैरानी की बात है, केवल पांच में से एक चूहों 285 दिनों के बाद अल्फा synuclein तंतुओं के साथ intraglossal इंजेक्शन के बाद सीएनएस रोग का विकास किया। पीबीएस के साथ टीकाकरण प्रयोग के 420 दिन की अवधि में रोग का कारण नहीं था।

पश्चिमी सोख्ता और अल्फा-synuclein की Ser129 के खिलाफ phospho विशिष्ट EP1536Y एंटीबॉडी के साथ जांच से जैव-रासायनिक विश्लेषण से पता चला कि दोनों संचरण मार्गों के लिए रोगग्रस्त पशुओं फॉस्फोरिलेटेड और sarkosyl का समुच्चय जमा किया थाउनके दिमाग और रीढ़ की रस्सियों (तालिका 2 और चित्रा 2) में -insoluble अल्फा synuclein। इसके विपरीत, दिमाग और पीबीएस इंजेक्शन और गैर रोगग्रस्त पशुओं की रीढ़ की रस्सियों केवल फॉस्फोरिलेटेड अल्फा synuclein की मोनोमेरिक प्रजातियों निहित।

phospho विशिष्ट pSyn # 64 एंटीबॉडी के साथ intraperitoneally इंजेक्शन और रोगग्रस्त चूहों के मस्तिष्क स्लाइस की Immunofluorescent धुंधला सीएनएस भर फॉस्फोरिलेटेड अल्फा synuclein जमा की एक विस्तृत वितरण का पता चला (तालिका 2 और चित्रा 3)। इसके अलावा, फॉस्फोरिलेटेड अल्फा synuclein जमा यूबीक्यूटिन और p62 एक धर्मपथ से हटनेवाला प्रोटीन समस्थिति कि जमा के गठन के लिए योगदान कर सकते हैं यह दर्शाता है के साथ colocalized।

रोगग्रस्त पशुओं में अल्फा synuclein समुच्चय के संचय neuroinflammatory परिवर्तन, जिसके द्वारा खोजा गया था के साथ किया गया थाGFAP, astrocytes कि प्रतिक्रियाशील astrogliosis प्रकट कर सकते हैं के एक मार्कर (चित्रा 4) के लिए immunofluorescence धुंधला। साथ ही, सक्रिय microglia भी आईबीए-1 के लिए immunofluorescence धुंधला द्वारा प्रचुर मात्रा में अल्फा synuclein विकृति (आयनित कैल्शियम बाध्यकारी अनुकूलक अणु 1) के साथ क्षेत्रों में पाए गए। अनुसार, bioluminescence इमेजिंग चमक में वृद्धि हुई खुलासा (> 2 × 10 6 पी / एस / सेमी 2 / sr) टीजी के दिमाग से उत्सर्जित (M83 +/-: GFAP -luc +/-) अल्फा synuclein तंतुओं के साथ इंजेक्शन चूहों, शीघ्र ही इससे पहले कि वे तंत्रिका संबंधी रोग के लक्षण विकसित की है। इसके विपरीत, पीबीएस के साथ इंजेक्शन चूहों के दिमाग चमक में कोई वृद्धि नहीं दिखा था। के बाद से luciferase अभिव्यक्ति GFAP प्रमोटर से प्रेरित है वृद्धि की चमक, प्रतिक्रियाशील astrogliosis, neuroinflammation की एक बानगी का संकेत है।

आकृति 1
चित्रा 1: चूहों: इंट्रापेरिटोनियल या intraglossal मार्ग के माध्यम से अल्फा synuclein तंतुओं के साथ इंजेक्शन bigenic टीजी (GFAP -luc +/- M83 +/-) में रोग का कारण बनता। (ए) sonicated पुनः संयोजक मानव अल्फा synuclein तंतुओं कि थे की इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ intraperitoneally और intraglossally चूहों में इंजेक्शन। uranyl एसीटेट के साथ नकारात्मक धुंधला छोटा है, छड़ के आकार का समुच्चय के कई समूहों का पता चला। स्केल सलाखों 100 एनएम =। , चूहों 229 ± 17 दिनों में तंत्रिका संबंधी रोग विकसित (बैंगनी वर्गों बंद): (बी) कापलान-मायर अस्तित्व घटता है कि चार से पांच टीजी की अल्फा synuclein तंतुओं के साथ इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन (GFAP -luc +/- M83 +/-) के बाद दिखाने जबकि पीबीएस इंजेक्शन नियंत्रण चूहों में से कोई भी 420 दिन (बैंगनी खुला वर्ग) के भीतर तंत्रिका संबंधी रोग के लक्षण विकसित की है। अल्फा synuclein तंतुओं के साथ intraglossal टीका के बाद पाँच में से एक माउस 285 दिनों के बाद निधन हो गया (हराबंद हलकों)। इसके विपरीत, पीबीएस इंजेक्शन नियंत्रण चूहों में से कोई भी तंत्रिका संबंधी रोग विकसित या अनायास मृत्यु हो गई (हरा खुला हलकों)। Breid एट अल से संशोधित। , 2016 14। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: सतही तौर पर की सीएनएस में फॉस्फोरिलेटेड अल्फा synuclein की जैव-रासायनिक विश्लेषण इंजेक्शन टीजी (M83 +/-: GFAP -luc +/-) चूहों। (ए) immunoblotting EP1536Y एंटीबॉडी के साथ, अल्फा synuclein की Ser129 पर फास्फारिलीकरण पहचानने से पता चला कि intraperitoneally इंजेक्शन और रोगग्रस्त चूहों उनके दिमाग में फॉस्फोरिलेटेड अल्फा synuclein की sarkosyl अघुलनशील समुच्चय के उच्च आणविक भार वाले प्रजातियों संचित एकघ रीढ़ की रस्सियों। नियंत्रण चूहों पीबीएस के साथ चुनौती दी फॉस्फोरिलेटेड अल्फा synuclein का समुच्चय जमा होते हैं और केवल उसकी एकलक फार्म के लिए बैंड से पता चला नहीं किया। (बी) के अल्फा synuclein तंतुओं केवल एक माउस, पशु 121, साथ intraglossal चुनौती के बाद, अपने मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में फॉस्फोरिलेटेड अल्फा synuclein की sarkosyl अघुलनशील समुच्चय से पता चला है, जबकि अन्य सभी intraglossally टीका चूहों अल्फा synuclein की जमा के बिना स्वस्थ रहे। आण्विक जनता kilodaltons में दिखाया जाता है। प्रत्येक लेन में नमूना लोड हो रहा है एक्टिन का पता लगाने के द्वारा दिखाया गया है। Breid एट अल से संशोधित। , 2016 14। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्र 3: इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण इस बात का पता चलता जमाचूहों: फॉस्फोरिलेटेड अल्फा synuclein यूबीक्यूटिन और दिमाग और रोगग्रस्त टीजी (GFAP -luc +/- M83 +/-) की रीढ़ की रस्सियों में p62 साथ colocalize। फॉस्फोरिलेटेड अल्फा synuclein के सह-धुंधला, EP1536Y एंटीबॉडी के साथ पता लगाया है, और यूबीक्यूटिन एक अलग colocalization दिमाग में, के रूप में thalamic नाभिक (ए), और रीढ़ की रस्सियों में मनाया, के रूप में ग्रे मैटर (बी) में पाया पता चला, की अल्फा synuclein तंतुओं के साथ इंट्रापेरिटोनियल चुनौती के बाद रोगग्रस्त चूहों। इसी तरह, फॉस्फोरिलेटेड अल्फा synuclein, pSyn # 64 एंटीबॉडी के साथ पता लगाया है, यह भी दिमाग (सी) और रोगग्रस्त पशुओं की रीढ़ की रस्सियों (डी) में p62 के साथ colocalized। (डी करने के लिए ए) पीबीएस इंजेक्शन स्वस्थ नियंत्रण जानवरों इन प्रोटीनों से किसी के लिए जमा या colocalization दिखाई नहीं दिया। DAPI साथ परमाणु धुंधला नीले रंग में दिखाया गया है। स्केल सलाखों = 20 सुक्ष्ममापी। Breid एट अल से संशोधित। 2016 14। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्र 4: टीजी (M83 +/-: GFAP -luc +/-) चूहों अल्फा synuclein तंतुओं के साथ परिधीय चुनौती के बाद gliosis विकसित की है। (ए) GFAP, astrocytes के एक मार्कर, के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ रोगग्रस्त पशुओं के मस्तिष्क वर्गों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण फॉस्फोरिलेटेड अल्फा synuclein, जो pSyn # 64 एंटीबॉडी के साथ ब्रेन स्टेम में पाया गया की जमा के साथ क्षेत्रों में प्रतिक्रियाशील astrogliosis का पता चला। इसके विपरीत, वहाँ पीबीएस इंजेक्शन नियंत्रण चूहों के दिमाग में कोई प्रतिक्रियाशील astrogliosis था। (बी) इसी तरह, आईबीए -1 के लिए एक एंटीबॉडी के साथ धुंधला हो जाना, microglia की एक मार्कर, microgliosis प्रदर्शन कियारोगग्रस्त पशुओं में फॉस्फोरिलेटेड अल्फा synuclein की जमा के साथ क्षेत्रों में। स्वस्थ, पीबीएस इंजेक्शन नियंत्रण चूहों के दिमाग microgliosis के लक्षण दिखाई नहीं दिया। चूहों intraperitoneally अल्फा synuclein तंतुओं (बाएं पैनल) के साथ इंजेक्शन, जो astrocytes की सक्रियता की वजह से किया गया था: (सी) Bioluminescence इमेजिंग दिमाग और टीजी (GFAP -luc +/- M83 +/-) की रीढ़ की रस्सियों से ऊंचा चमक से पता चला कुछ ही समय से पहले चूहों तंत्रिका संबंधी लक्षण विकसित की है। दिमाग और पीबीएस इंजेक्शन नियंत्रण चूहों की रीढ़ की रस्सियों में बेसल चमक समय (सही पैनल) के साथ बढ़त नहीं हुई। अल्फा synuclein तंतुओं के साथ intraglossal टीका के बाद, एक टीजी (M83 +/-: GFAP -luc +/-) माउस, पशु 121, प्रतिक्रियाशील astrogliosis के लक्षण दिखाई शीघ्र ही इससे पहले कि यह 285 दिन (केंद्र पैनल) में निधन हो गया। (डी) टीजी की इंट्रापेरिटोनियल चुनौती के बाद (M83 +/-: GFAP -luc +/-) अल्फा synuclein तंतुओं, increa साथ चूहोंजैव-प्रकाश का एसईडी स्तर (> 2 × 10 6 पी / एस / सेमी 2 / sr) चार चूहों (नीले, हरे, भूरे, और नारंगी हलकों) कुछ हफ्तों से पहले वे इस बीमारी के तंत्रिका संबंधी लक्षण विकसित के दिमाग से नापा गया। पाँच जानवरों में से एक भी जैव-प्रकाश का बढ़े स्तर से पता चला है शीघ्र ही इससे पहले कि यह 285 दिनों अल्फा synuclein तंतुओं (मैजंटा हलकों) के साथ intraglossal इंजेक्शन के बाद निधन हो गया। इसके विपरीत, स्वस्थ, पीबीएस इंजेक्शन नियंत्रण चूहों के लिए में (काला हलकों; त्रुटि सलाखों दिखाने एसडी [एन = 4]) और एक जानवर है कि अल्फा synuclein तंतुओं (लाल हलकों) के साथ इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के बाद बीमारी का विकास नहीं किया, bioluminescence संकेत बने रहे 2 एक्स 10 6 पी / एस / सेमी 2 / sr की एक सीमा से अवलोकन की अवधि के भीतर नीचे। स्केल सलाखों = 20 सुक्ष्ममापी। Breid एट अल से संशोधित। , 2016 14। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंआंकड़ा।

माउस लाइन Inoculum (माइक्रोग्राम) टीका मार्ग रोग के साथ चूहों की संख्या / कोई। चूहों की टीका अस्तित्व समय ± एसडी मतलब (दिन)
टीजी (M83 +/-: GFAP -luc +/-) मानव α-synuclein तंतुओं (50) इंट्रापेरिटोनियल 4/5 229 ± 17/420
टीजी (M83 +/-: GFAP -luc +/-) पीबीएस इंट्रापेरिटोनियल 0/5 0/420
टीजी (M83 +/-: GFAP -luc +/-) मानव α-synuclein तंतुओं (10) intraglossal 1/5 285/420
टीजी (M83 +/-: GFAP -luc +/-) पीबीएस intraglossal 0/4 0/420

तालिका 1: इनोकुलेशन प्रयोगों। * Breid एट अल से संशोधित।, 2016 14

लक्ष्य [एंटीबॉडी क्लोन] मेज़बान immunogen यदि में कमजोर पड़ने पश्चिम बंगाल में कमजोर पड़ने
एक्टिन [सी 4] माउस - - 1: 1,000
α-synuclein, phospho S129 [pSyn # 64] माउस pSer129 1: 1200 -
α-synuclein, phospho S129 [EP1536Y] खरगोश pSer129 1: 100 1: 1,000
Glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) खरगोश - 1: 200 -
आईबीए -1 खरगोश - 1: 500 -
Sequestosome -1 (p62) खरगोश - 1: 100 -
यूबीक्यूटिन [यूबीआई-1] माउस - 1: 500 -

तालिका 2: इम्यूनोफ्लोरेसेंस (IF) और पश्चिमी सोख्ता (पश्चिम बंगाल) के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी। * Breid एट अल से संशोधित।, 2016 14

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Discussion

टीजी (M83 +/-: GFAP -luc +/-) की पेरिटोनियम में अल्फा synuclein तंतुओं के परिधीय इंजेक्शन चूहों synucleinopathies की महत्वपूर्ण विशेषताओं पुनरावृत्ति करने के तंत्रिका संबंधी रोग neuroinflammation के साथ प्रेरित करने के लिए एक सतही विधि का प्रतिनिधित्व करता है। इसी तरह, जीभ इंजेक्शन ट्रांसजेनिक चूहों में अल्फा synuclein prionoids द्वारा neuroinvasion के लिए एक और मार्ग का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन कम कुशल है। हम इंजेक्शन के बाद 420 दिनों में हमारे प्रयोगों समाप्त करने के लिए चुना है और हम संभावना है कि अधिक या तंतु इंजेक्शन चूहों के सभी बाद में किसी समय बिंदु पर इस बीमारी विकसित हो सकता है बाहर नहीं कर सकते। साथ ही, टीजी (M83 +/-: GFAP -luc +/-) के उपयोग चूहों astrogliosis की गैर इनवेसिव दृश्य को सक्षम बनाता है और के पूरे जीवन काल से अधिक अल्फा synuclein की neuroinvasion की वजह से उत्तेजित प्रतिक्रियाएं की निगरानी के लिए एक सरल विधि का प्रतिनिधित्व करता है माउस।

एक महत्वपूर्ण कदम तैयारी हैinoculum की। एकत्रीकरण समय, sonication समय, endotoxins की बहुतायत, या इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया misfolded अल्फा synuclein 21 के बोने प्रवृत्ति को प्रभावित करके प्रयोग का परिणाम को प्रभावित कर सकता तंतुओं की राशि की तरह प्रतीत होता है तुच्छ कारकों। इस प्रकार यह जब इंजेक्शन के लिए तैयारी कर रहा inocula हमेशा एक ही स्थिति का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। intraglossal इंजेक्शन के लिए यह है कि न केवल hypoglossal तंत्रिका लेकिन यह भी जिह्वा-ग्रसनी तंत्रिका जैसे अन्य कपाल नसों जीभ अंदर आना और मस्तिष्क के लिए अल्फा synuclein prionoids की interneuronal परिवहन में शामिल किया जा सकता है पर विचार किया जाना है। इस प्रकार जीभ के विभिन्न क्षेत्रों को लक्षित मस्तिष्क के लिए विभिन्न प्रसार गतिकी हो सकती थी। हम सीधे hypoglossal तंत्रिका में इंजेक्षन नहीं किया था और यह संभव है कि hypoglossal तंत्रिका को लक्षित अल्फा synuclein prionoids की सीएनएस संचरण में सुधार कर सकते हैं। अल्फा synuclein तंतुओं के साथ इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के लिए यह Criti हैकैलोरी कि inoculum सही ढंग से नहीं आंत या सेसम, जो नकारात्मक neuroinvasion प्रभावित हो सकता है की तरह आंतरिक अंगों में गलती से पेरिटोनियम में इंजेक्ट किया जाता है। यह जब डी luciferin इंजेक्शन भी bioluminescence इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है। आंतरिक अंगों को डी luciferin के Mistargeting मस्तिष्क को इसके वितरण को धीमा और कम bioluminescence हो सकती थी। यह इमेजिंग के दौरान वर्दी परिणाम प्राप्त करने के लिए भी हमेशा ताजा इंजेक्शन से पहले और यह वास्तव में इमेजिंग से पहले इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के बाद 10 मिनट के लिए सेते हैं जाने के लिए डी luciferin समाधान तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है।

Bioluminescence इमेजिंग समय के साथ astrogliosis में गैर invasively उपाय परिवर्तन करने के लिए एक उपयोगी तरीका है और, इंट्रापेरिटोनियल या intraglossal इंजेक्शन के बाद न केवल लेकिन यह भी सहित उपचार के हर प्रकार के बाद लागू किया जा सकता उदाहरण के लिए, इंट्रा या नसों में इंजेक्शन के लिए। सीएन को परिधि से अल्फा synuclein prionoids के प्रसार की निगरानी करने केएस और आगामी neuroinflammation हम bigenic टीजी इस्तेमाल किया (M83 +/-: GFAP -luc +/-) चूहों। क्योंकि इन जानवरों में अल्फा synuclein की hemizygous अभिव्यक्ति समयुग्मक जानवरों उनकी आयु अप करने के लिए 22 महीने के लिए सहज रोग से मुक्त रहते हैं और अल्फा synuclein प्रसारण के लिए एक उपयुक्त आनुवंशिक पृष्ठभूमि का अध्ययन करता है 13 के लिए 40% कम सापेक्ष है। हालांकि, bioluminescence इमेजिंग के लिए माउस मॉडल के चुनाव के बारे में संशोधनों वांछनीय हो सकता है। एक दिलचस्प विकल्प monogenic टीजी (GFAP -luc +/-) का ही व्यक्त एक ट्रांस्जीन है, जो एक पृष्ठभूमि पर अल्फा synuclein तंतुओं के prionoid व्यवहार के एक आकलन के लिए अनुमति देता है अनिवार्य रूप से जहाँ तक है कि जंगली प्रकार के रूप में luciferase चूहों इस्तेमाल होता है अल्फा synuclein 14 का संबंध है। इसके अलावा, पार करने टीजी (GFAP -luc +/-) इस तरह के टीजी (SOD1 G93A) पेशीशोषी पार्श्व काठिन्य के लिए या करने के लिए टीजी (APP23) मीटर चूहों के रूप में अन्य ट्रांसजेनिक चूहों, चूहोंअल्जाइमर रोग के लिए बर्फ, अन्य रोग मॉडल 22 में neuroinflammation की इमेजिंग सक्षम बनाता है, 23।

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि इंजेक्शन की जगह के आधार पर इंजेक्शन inoculum एक निश्चित मात्रा अधिक नहीं हो सकता है। इस प्रकार जीभ में इंजेक्शन केवल पेरिटोनियम में उन है, जो सीएनएस के संचरण समय को प्रभावित कर सकता की तुलना में छोटे संस्करणों के साथ किया जा सकता है। एक और सीमा यह है कि GFAP -luc ट्रांस्जीन केवल astrogliosis का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, लेकिन microgliosis, जो neuroinflammation में उतना ही महत्वपूर्ण है की नहीं है। अन्त में, इस मॉडल के लिए कैसे अल्फा synuclein prionoids इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के बाद सीएनएस तक पहुँचने के रूप में अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं करता है।

इंजेक्शन के जरिए बहिर्जात अल्फा synuclein prionoids के आवेदन संचरण मार्ग है कि synuclei की विशेषताओं recapitulating में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी तरीका हो दिखाया गया हैnopathies। पशु मॉडल में पुनः संयोजक अल्फा synuclein तंतुओं या रोग से जुड़े माउस या मानव अल्फा synuclein प्रजातियों में से इंट्रा इंजेक्शन कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है समय 5, 7, 17, 24, 25, 26 से अधिक उनके बोने गुण और संचरण क्षमता का विश्लेषण करने के लिए। के बाद से मस्तिष्क में स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन हमेशा सर्जरी के बाद शीघ्र ही एक स्थानीय भड़काऊ प्रतिक्रिया को प्रेरित, इस संचरण मार्ग के प्रसार और मस्तिष्क समस्थिति में बदलाव की वजह से inoculum की संक्रामकता को प्रभावित कर सकता है। हाल के अध्ययनों ने परिधीय या प्रणालीगत आवेदन करने के लिए ध्यान केंद्रित करने के लिए बदल दिया है, मुख्य रूप से शल्य प्रक्रिया से बचने के लिए बल्कि परिधि, आंतों की दीवारों, कंकाल की मांसपेशी, या रक्त का विश्लेषण करने, जहां से सीएनएस को neuroinvasion सह सकता है एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में नहींmmence 6, 9, 14, 27। सूक्ष्म जीवाणुओं के लिए यह पेरिटोनियम के माध्यम से है कि प्रसारण दिखाया गया है या जीभ neuroinvasion और तंत्रिका संबंधी रोग की ओर जाता है; जीभ के संक्रमण के बाद, मस्तिष्क में hypoglossal नाभिक के केवल दो सप्ताह के भीतर फैल प्रायन स्टेम 11। के बाद से अल्फा synuclein प्रायन तरह neuroinvasive और बोने गुणों से युक्त चर्चा की गई है, हम पता चला है कि जीभ और पेरिटोनियम के माध्यम से प्रसारण अल्फा synuclein prionoids सीएनएस 14 पर आक्रमण करने के लिए आगे प्रवेश द्वार अंक प्रतिनिधित्व करते हैं। bioluminescence इमेजिंग द्वारा astrogliosis की मात्रा समय के साथ neuroinflammatory प्रक्रिया की ट्रैकिंग की सुविधा और ऊतकीय विश्लेषण करने के लिए एक गैर इनवेसिव विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है।

कैसे सीएनएस अल्फा synuclein prionoids की neuroinvasion का जवाब की गहन जानकारी प्राप्त करने के लिएऔर अन्य उपचार है कि neuroinflammation पैदा करने के लिए है, यह माउस मॉडल है कि यह भी एक ट्रांस्जीन कि प्रमोटर microglia में प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए विशिष्ट से luciferase अभिव्यक्ति ड्राइव के साथ microgliosis की गैर इनवेसिव निगरानी, जैसे की अनुमति देते हैं उत्पन्न करने के लिए फायदेमंद हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों ओल्‍गा शर्मा, टेरेसा हंदट, और तकनीकी सहायता के लिए DZNE माइक्रोस्कोपी और पशु सुविधाओं के कर्मचारियों को धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-actin antibody Merck Millipore MAB1501
anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64] Wako 015-25191
anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y] Abcam ab51253
anti-GFAP antibody Dako Z0334 01
anti-IBA-1 antibody Wako 019-19741
anti-Sequestosome-1 (p62) antibody Proteintech 18420-1-AP
anti-ubiquitin antibody [Ubi-1] Merck Millipore MAB1510
Phosphate-buffered saline (PBS) Invitrogen 14190169
Ketamine  Ratiopharm 100 mg/kg
Xylazine Ratiopharm 10 mg/kg
27 G syringe VWR 613-4900
Isoflurane  Piramal Healthcare PZN  4831850
Depilatory cream Veet
Secureline lab marker  Neolab 25040
D-luciferin potassium salt Acris LK10000 30 mg/mL stock solution
Thermomixer Eppendorf 5776671
Sonopuls Mini20 sonicator Bandelin 3648
IVIS Lumina II imaging system PerkinElmer
Living Image 3.0 Software PerkinElmer
Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice The Jackson Laboratory 004479
Standard pattern forceps Fine Science Tools 11000-16
Narrow pattern forceps Fine Science Tools 11002-12
N-laurylasarcosyl Sigma L5125-100G
Optima Max-XP ultracentrifuge  Beckman Coulter TLA-110 rotor 
Thickwall polycarbonate tubes Beckman Coulter 362305
NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels Thermo Fisher Scientific WG1401BOX
HRP conjugated antibody Cayman Cay10004301-1
IR Dye 680 conjugated antibody  LI-COR Biosciences 926-68070
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate Thermo Fisher Scientific 34075
Stella 3200 imaging system Raytest
Odyssey infrared imaging system  LI-COR Biosciences
Tween 20  MP Biomedicals TWEEN201
Triton X-100 Sigma SA/T8787
Immobilon-FL PVDF membrane Merck Millipore IPFL00010
Xylol Sigma Roth
Hydrogen peroxide Sigma SA/00216763/000500 working solution 3%
Bovine serum albumine (BSA)  Thermo Fisher Scientific A3294-100G
Goat serum Thermo Fisher Scientific PCN5000
4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific D1306 working dilution 1:50,000
Fluoromount media  Omnilab SA/F4680/000025
LSM700 confocal laser scanning microscope Carl Zeiss
HALT protease and phosphatase inhibitors Thermo Fisher Scientific  10516495
Precellys 24-Dual homogenizer  Peqlab 91-PCS24D
Alexa Fluor 488 conjugated antibody Thermo Fisher Scientific A31619
Alexa Fluor 594 conjugated antibody Thermo Fisher Scientific A11005
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 10741395
Microtome RM2255 Leica
LSM700 confocal laser scanning microscope Carl Zeiss

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 122 अल्फा-synuclein bioluminescence इमेजिंग सूजन synucleinopathy neuroinvasion पार्किंसंस रोग परिधीय प्रिओन की तरह prionoid
ट्रांसजेनिक चूहों में neuroinflammation की bioluminescence इमेजिंग अल्फा-synuclein तंतुओं के परिधीय इनोकुलेशन के बाद
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Breid, S., Bernis, M. E., Tachu, J. B., Garza, M. C., Wille, H., Tamgüney, G. Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils. J. Vis. Exp. (122), e55503, doi:10.3791/55503 (2017).

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