Summary
Perifer injektion av alfa-synuklein fibriller in i bukhinnan eller tunga av Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) möss, vilka uttrycker humant alfa-synuklein med familjär A53T mutation och eldflugeluciferas, kan inducera neuropatologi, inklusive neuroinflammation , i deras centrala nervsystemet.
Abstract
För att studera prionliknande beteende felvikt alfa-synuklein, är musmodeller behövs som tillåter snabb och enkel transmission av alfa-synuklein prionoids, som orsakar neuropatologi i det centrala nervsystemet (CNS). Här beskriver vi att intraglossal eller intraperitoneal injektion av alfa-synuklein fibriller in bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) möss, vilka överuttrycker humant alfa-synuklein med A53T mutation från prionproteinpromotorn och luciferas eldfluga från promotorn för gliafibrillärt surt protein (GFAP), är tillräcklig för att inducera neuropatologisk sjukdom. I jämförelse med homozygot Tg (M83 + / +) möss som utvecklar svåra neurologiska symtom börjar vid en ålder av 8 månader, heterozygot Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) djur förblir fri från spontan sjukdom tills de når en ålder av 22 månader. Interestingly, injektion av alfa-synuklein fibriller via intraperitoneal rutt inducerad neurologisk sjukdom med förlamning i fyra av fem Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) möss med en median inkubationstid av 229 ± 17 dagar. Sjuka djur visade allvarliga fyndigheter av fosforylerat alfa-synuklein i deras hjärnor och ryggmärg. Ansamlingar av alfa-synuklein var sarkosyl-olöslig och samlokaliserades med ubikvitin och p62, och åtföljdes av en inflammatorisk respons som resulterar i astrocytisk glios och microgliosis. Överraskande, inokulering av alfa-synuklein fibriller in i tungan var mindre effektiv i att orsaka sjukdom med endast en av fem injicerade djur som visar alfa-synuklein patologi efter 285 dagar. Våra resultat visar att ympning via intraglossal vägen och mer så via den intraperitoneala vägen är lämplig för att framkalla neurologisk sjukdom med relevanta kännetecken synukleinopatier i Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) möss. Detta ger en ny modell för att studera prion-liknande patogenes framkallad av alfa-synuklein prionoids i större detalj.
Introduction
Finns det växande bevis för att a-synuklein har egenskaper som liknar de hos prionproteinet, i synnerhet i dess förmåga att själv-utsäde och utbreder felveckning mellan celler och längs nervbanorna. Denna egenskap av alfa-synuklein är även kallad 'prion-liknande' eller 'prionoid', och stöds av observationer i transplantationsexperiment, som antyder överförbar av felvikt alfasynuklein från sjuka neuroner till nyligen transplanterade friska nervceller 1, 2 , 3, 4. Även direkt injektion av felvikt alfa-synuklein i hjärnan eller periferin, t.ex. bakbensmuskeln eller tarmväggen, resulterar i en spridning av alfa-synuklein patologi till distala delar av CNS 5, 6, 7, <sup class = "xref"> 8, 9, 10. Vi analyserade överföring av alfa-synuklein prionoids via perifera rutter mer i detalj och adresserade frågan huruvida felvikt alfa-synuklein kan neuroinvade CNS efter en enda intraglossal eller intraperitoneal injektion, en funktion som tidigare hade visats för prioner men inte för felvikt alfa- synuklein. Efter injektion av prioner i tungan, är neuroinvasion av CNS uppnås via utbredning längs hypoglossalnerven av tungan som leder till kärnan hos hypoglossalnerven, som ligger i hjärnstammen 11. Som en musmodell vi valde Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) möss som överuttrycker den A53T mutanten av humant alfa-synuklein från prion promotorn, och luciferas eldfluga under kontroll av en GFAP-promotor för att övervaka astrocytisk aktivering genom bioluminescens, såsom tidigare visats i hjärnan hosprion-infekterade möss 12. I våra händer bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) möss inte utvecklar sjukdomen förrän 23 månaders ålder som har visats av andra 13. En enda injektion av humana alfa-synuklein fibriller via intraglossal eller intraperitoneal väg inducerad neurologisk sjukdom med patologi i hjärnan och ryggmärgen av Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) möss som stöder hypotesen att alfa-synuklein prionoids dela viktiga egenskaper med prioner 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden, inklusive djur utfördes med godkännande av djurskyddskommittén Nordrhein-Westfalen State miljöbyrån (LANUV). Djuren inhystes och vårdas enligt standardförhållanden med en 12 timmar ljus / mörker-cykel och fri tillgång till mat och vatten.
1. Djurmodell
- Intern korsning hemizygot Tg (GFAP -luc +/-) möss med hemizygot Tg (M83 +/-) möss för att generera hemizygota bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) möss 15, 16.
- Genotypa avkomman med realtids-PCR med avseende på närvaron av transgenen som kodar för humant alfa-synuklein och med standard-PCR för eldflugeluciferas 12, 17.
- Inokulera djuren vid en ålder av sex till åtta veckor.
2. Vaccin Framställning
- Förbered monomeric rekombinant humant alfa-synuklein med A53T mutationen i Tris-buffrad saltlösning (TBS) -buffert innehållande 150 mM NaCl i 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) såsom tidigare har beskrivits 14.
- Förbereda fibrillär alfa-synuklein för inokulationer genom omröring 3 pg / pL av monomert rekombinant humant alfa-synuklein i en omloppsskakanordning vid 800 rpm och 37 ° C under 5 dagar.
- Späd fibrill aggregaten i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att nå en slutlig koncentration av 1 pg / pl för intraperitoneal eller 2 pg / pL för intraglossal inokulationer.
- Fragmentera alfa-synuklein fibriller med en stång sonikator under en min (40 pulser av 0,5 s varaktighet med en sekunds paus mellan varje puls och en amplitud inställd på 50%) på is. För att undvika kontaminering genom tvär sådd. Använd rena sonication sonder för att förbereda olika inokulum.
3. Intraglossal Injektioner
- Söva djuren med en intraperitoneal injektion av 100 mg / kg ketamin och 10 mg / kg xylazin. Nyp djurets tå och bekräfta att det inte drar tillbaka sitt bakben för att säkerställa korrekt anestesi. Använd veterinär salva på djurets ögon för att förhindra torrhet under narkos.
- Fixa narcotized djur försiktigt med dubbelhäftande tejp på en värmeplatta i en dorsal liggande ställning med sina huvuden riktade mot undersökaren.
- Fylla en 27 G engångsinjektionsspruta med 5 mikroliter av sonikerade alfasynuklein fibriller eller PBS.
- Använd en trubbig-nosed tummen pincett med tandade tips för att hålla djurets mun, och en andra mindre pincett för att försiktigt dra ut tungan för att göra undersidan av tungan tillgängligt för injektion.
- Injicera nålen i sprutan i höger eller vänster bottensidan av tungan i närheten av den hypoglossala nerven. Långsamt injicera inokulatet efter 5 s. Sakta dra in nålen efter 5 s för att säkerställa att inokulatethar trängt in i vävnaden och inte förlorat medan dra tillbaka nålen.
- Släpp djuret från dess upptagningar och lämna den på värmeplattan under ständig övervakning tills fullständig återhämtning.
4. intraperitoneala injektioner
- För intraperitoneala injektioner, NARKOTISERA djuren inom kort i en anestesikammare genom inhalation med isofluran / syre med användning av en flödeshastighet av 2 l / min och förångaren satt till 2%. Nyp djurets tå och bekräfta att det inte drar tillbaka sitt bakben för att säkerställa korrekt anestesi.
- Fylla en 27 G engångsinjektionsspruta med 50 mikroliter av sonikerade alfasynuklein fibriller eller PBS.
- Direkt injicera i peritoneum hos musen och undvika att tränga in i tunntarmen eller blindtarmen ligger bakom bukväggen genom att hålla djuret i en dorsal position med huvudet vänt bort från undersökaren och nedåt med ungefär 45 °. Övervaka djur tills de har återhämtat sigfrån anestesi.
5. Bioluminescence Imaging
- Bild Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) möss var 2-4 veckor med hjälp av ett mareld bildsystem.
- Före avbildning inom kort söva möss i en isofluran / syrekammare med en flödeshastighet av 2 l / min och förångaren satt till 2%. Nyp djurets tå och bekräfta att det inte drar tillbaka sitt bakben för att säkerställa korrekt anestesi.
- Raka och Vaxning huvudet på möss med en hårborttagningskräm. Färg öronen i svart med en icke-irriterande markör för att blockera ospecifik bioluminiscens.
- Utspädd D-luciferin kaliumsalt, substratet för luciferas, i PBS till en 30 mg / ml stamlösning. Lagra detta i 1 ml alikvoter vid -20 ° C. Skydda den upplösta D-luciferin från exponering för ljus.
- Väga djuren före injektion. Beräkna den exakta volymen av D-luciferin för injektion av 150 mg / kg kroppsvikt. Intraperitonealt injicera D-luciferin och tillbaka djuret till anestesi kammaren.
- Starta bildprogram. Efter avbildningssystemet har nått sin driftstemperatur initialisera systemet genom att klicka på 'Initialize' knappen på kontrollpanelen.
- Välj knapparna 'Självlysande' och 'Photograph'. Ställa exponeringstiden till 60 s, binning till 'Medium', F / Stopp till '1', och EM-förstärkningen till 'Av'.
- Bekräfta att exciteringsfiltret är inställt på 'Block' och emissionsfiltret till 'Öppna', och ställ in föremål höjd till 1,50 cm.
- Tio minuter efter injektion med D-luciferin, placera djuren på värmeplattan i avbildningskammaren och säkerställa att deras nosar är korrekt placerade i anestesi utlopp. Stänga isofluran / syrgasflödet från inandningskammaren och öppna flödes för avbildning kammaren med en flödeshastighet på 0,25 L / min och en avdunstning av 2%. Stänga dörren av avbildningskammaren properly.
- Klicka på 'Acquire' -knappen för att mäta bioluminiscens, som tar 60 sekunder. Stoppa isofluran flöde och övervaka djuren tills de har helt återhämtat sig efter återkomsten dem tillbaka till sina burar.
- Använd bildbehandlingsprogram för att kvantifiera bioluminiscens. Inom 'verktygspaletten' välj 'ROI Tools'. Under 'Typ' inom "ROI Tools välj Measurement ROI".
- Inom "ROI Tools klicka på "cirklar" verktyget och välja antalet ROI att dra från rullgardinsmenyn - helst '3' för tre möss.
- I bilden, högerklicka på varje ROI och under 'Egenskaper' justera bredden och höjden till 1,25 cm. Placera varje ROI över hjärnan område som kvantifieras.
- I det övre vänstra hörnet av bilden, ställa in enheterna panelen till 'radians (fotoner)'.
- Inom 'verktygspaletten', välj 'Bildjustering' och justera minimum ochmaximum av 'färgskala', till exempel, från 0.20e6 till 1.00e6.
- Under 'File' spara data med 'Spara'.
6. Biochemical Analysis
- Isolera hjärna och ryggmärg i enlighet med etablerade protokoll 18, 19.
- Homogenisera hela hjärnan och hela ryggmärgen prover separat i PBS i närvaro av proteas och fosfatasinhibitorer (utspädda till 1x i PBS) under två 30 s cykler med 6000 rpm i en vävnadshomogenisator. Säkerställa att hjärnan och ryggmärgsprover homogeniseras till en slutlig koncentration av 20% (vikt / volym).
- Sonikera proverna två gånger och samtidigt hålla dem på is med en konstant puls av 10 s och en amplitud inställd på 50%.
- Justera homogenaten till 10% i PBS och 750 mM NaCl genom att späda dem 1: 1 med 1,5 M NaCl i PBS.
- Att separera cellrester, centrifugera homogenisaten vid 1000 xg under 5 min vid4 ° C. Håll supernatanterna för nästa steg och kassera pellets.
- Mäta proteinkoncentrationen i homogenaten med hjälp av bicinkoninsyra (BCA) analys enligt tillverkarens instruktioner. Inkubera 1,0 mg totalt protein från hjärnhomogenat eller 0,8 mg från ryggmärgshomogenat i N-laurylsarcosyl vid en slutlig koncentration av 10% (vikt / volym) under 15 min på is.
- Överlagra homogenaten på en 3 ml sackaros kudde av 10% (vikt / volym) i destillerat vatten och ultracentrifug dem vid 465 tusen xg under 1 h vid 4 ° C.
- Resuspendera pelletsen i en buffert innehållande 4% natriumdodecylsulfat (SDS), 2% β-merkaptoetanol, 192 mM glycin, 25 mM Tris, och 5% (vikt / volym) sackaros.
- Koka proverna vid 100 ° C under 5 min och föra över dem till SDS-polyakrylamidgeler för elektrofores i en morfolinetansulfonsyra (MES) buffertsystem.
- Överföra de separerade proteinerna till polyvinylidendifluorid (PVDF) membran i en semiDry läsksystem.
- Inkubera membranen i 0,4% (vol / vol) formalinlösning i PBS under 30 minuter vid rumstemperatur på en rötor med 35 varv per minut för att tvärbinda proteinerna med membranet.
- Blockera membranen i TBS-buffert innehållande 0,05% (volym / volym) Tween 20 och 5% (vikt / volym) mjölk under 1 h vid rumstemperatur.
- Inkubera blottarna med den primära antikroppen i blockeringsbuffert över natten vid 4 ° C.
- Tvätta membranen tre gånger i TBS-buffert och inkubera dem med peroxidase- eller fluorofor-konjugerad sekundära antikroppar i TBS under 1 timme vid rumstemperatur.
- Visualisera de bundna sekundära antikroppar genom kemiluminescens eller fluorescens enligt etablerade protokoll 20.
7. Immunofluorescence Analysis
- Dehydratisera de dissekerade hjärnor och ryggmärg i en vävnadsbehandlingsstation och bädda in dem i paraffin med användning av en paraffinstation.
- Skär paraffininbäddade tisstämmer med en mikrotom i 8 um tjocka koronala snitt och montera avsnitten på objektglas.
- Avparaffinera vävnadssnitt genom att inkubera dem i två separata xylener bad för 5 till 10 min och rehydrera dem genom en serie av graderade etanol bad (100%, 90%, 70%, 50%) och slutligen med H2O
- Inkubera sektionerna i 0,01 M citratbuffert (pH 6,0) under 5 min vid rumstemperatur och dessutom koka dem i 10 minuter i en mikrovågsugn.
- Låta sektionerna svalna till rumstemperatur och inkubera dem med en 3% -ig väteperoxidlösning i 30 min för att inhibera endogena peroxidaser.
- Blockera vävnadssektioner genom inkubering med 20% (vol / vol) normalt getserum, 1% (vol / vol) bovint serumalbumin (BSA) och 0,5% Triton X-100 i PBS under 1 h vid rumstemperatur.
- Inkubera sektionerna med den primära antikroppen utspädd i 1% (vol / vol) normalt getserum, 1% (vol / vol) BSA och 0,25% Triton X-100 i PBS över natt vid 4 ° C. <li> Tvätta sektionerna två gånger med 0,25% (vol / vol) Triton X-100 i PBS och en gång med PBS.
- Färga sektioner med de motsvarande fluoroforen-konjugerade sekundära antikroppar och den nukleära färgämnet DAPI utspädd i 1% (vol / vol) normalt getserum, 1% (vol / vol) BSA och PBS under 1 h vid rumstemperatur.
- Efter tvättning två gånger med 0,25% (vol / vol) Triton X-100 i PBS och en gång med PBS, täckglas objektglasen med inbäddning medier och visualisera färgning med ett konfokalt laserskanningsmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Perifer injektion av alfa-synuklein prionoids via tungan eller peritoneum inducerad neuropatologi i CNS av bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) möss (tabell 1 och figur 1). Efter en enda intraperitoneal injektion med alfa-synuklein fibriller, fyra av fem möss utvecklade neurologisk sjukdom med en median inkubationstid av 229 ± 17 dagar. Överraskande, endast en av fem möss utvecklade CNS-sjukdom efter intraglossal injektion med alfa-synuklein fibriller efter 285 dagar. Ympning med PBS inte orsakar sjukdom inom den tid av experimentet 420 dag.
Biokemisk analys med Western blotting och sondering med fosfo-specifika EP1536Y antikropp mot Ser129 av alfa-synuklein avslöjade att för båda överföringsvägar sjuka djur hade ackumulerat aggregat av fosforylerad och sarkosyl-insoluble alfa-synuklein i deras hjärnor och ryggmärg (Tabell 2 och fig 2). I kontrast, hjärna och ryggmärg PBS-injicerade och icke sjuka djur endast innehöll monomera arter av fosforylerad alfa-synuklein.
Immunofluorescerande färgning av hjärn skivor av intraperitonealt injicerad och sjuka möss med fosfo-specifika pSyn # 64-antikropp avslöjade en bred fördelning av fosforylerade alfa-synuklein insättningar i hela CNS (Tabell 2 och figur 3). Dessutom, fosforylerad alfa-synuklein insättningar samlokaliserades med ubikvitin och p62 som indikerar ett avvikande protein homeostas som kan bidra till bildandet av avlagringar.
Ackumuleringen av alfa-synuklein aggregat i sjuka djur åtföljdes av neuroinflammatoriska förändringar, som detekterades genomimmunofluorescensfärgning för GFAP, en markör för astrocyter som kan avslöja reaktiv astroglios (Figur 4). Dessutom var aktiverade mikroglia också i regioner med riklig alfasynuklein patologi genom immunofluorescensfärgning för IBA-1 (joniserat kalciumbindande adaptormolekylen 1). I enlighet, avslöjade bioluminescens avbildning ökad radians (> 2 x 10 6 p / s / cm 2 / sr) som emitteras från hjärnan hos Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) möss injicerade med alfa-synuklein fibriller, strax innan de utvecklat tecken på neurologisk sjukdom. Däremot hade hjärnan hos möss som injicerats med PBS inte någon ökning av utstrålning. Ökad utstrålning är indikativ för reaktiv astroglios, ett kännetecken för neuroinflammation, eftersom luciferasuttryck drivs från GFAP-promotorn.
Figur 1: Injektion med alfa-synuklein fibriller via intraperitoneal eller intraglossal rutt orsakar sjukdom i bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) möss. (A) elektronmikrofotografi av sonikerade rekombinanta humana alfa-synuklein fibriller som var intraperitonealt och intraglossally injicerades i möss. Negativ färgning med uranylacetat avslöjade multipla kluster av korta, stavformade aggregat. Skalstrecken = 100 nm. (B) Kaplan-Meier överlevnadskurvor visar att efter intraperitoneal injektion med alfa-synuklein fibriller fyra av fem Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) möss utvecklade neurologiska sjukdomen i 229 ± 17 dagar (lila fyllda kvadrater), medan ingen av de PBS-injicerade kontrollmöss utvecklade tecken på neurologisk dysfunktion inom 420 dagar (lila öppna fyrkanter). Efter intraglossal ympning med alfa-synuklein fibriller en mus av fem dog efter 285 dagar (grönfyllda cirklar). I motsats, ingen av de PBS-injicerade kontrollmöss utvecklade neurologisk sjukdom eller spontant dött (gröna öppna cirklar). Modifierad från Breid et al. , 2016 14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Biokemisk analys av fosforylerad alfa-synuklein i CNS hos perifert injicerades Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) möss. (A) Immunblotting med EP1536Y antikropp, som erkänner fosforylering vid Ser129 av alfa-synuklein, visade att intraperitonealt injicerade och sjuka möss ackumulerade hög molekylvikt av sarkosyl-olöslig aggregat av fosforylerad alfa-synuklein i deras hjärnor end ryggmärgen. Kontroll möss provocerade med PBS inte ackumulera aggregat av fosforylerad alfa-synuklein och visade band endast för dess monomera form. (B) Efter intraglossal utmaning med alfa-synuklein fibriller endast en mus, djur 121, visade sarkosyl-olösliga aggregat av fosforylerad alfa-synuklein i dess hjärna och ryggmärg, medan alla andra intraglossally inokulerade möss förblev friska utan insättningar av alfa-synuklein. Molekylmassor är visade i kilodalton. Provladdning i varje bana är visad genom detektion av aktin. Modifierad från Breid et al. , 2016 14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Immunfluorescensanalys visar att avlagringar avfosforylerad alfa-synuklein samlokaliserar med ubikvitin och p62 i hjärnan och ryggmärgen av sjuka Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) möss. Co-färgning av fosforylerad alfa-synuklein, detekteras med EP1536Y antikropp och ubikitin avslöjade en distinkt colocalization i hjärnorna, såsom observerats i den talamiska kärnan (A), och ryggmärg, som detekteras i den grå substansen (B), av sjuka möss efter intraperitoneal utmaning med alfa-synuklein fibriller. På liknande sätt, fosforylerad alfa-synuklein, detekteras med pSyn # 64 antikropp, även samlokaliserades med p62 i hjärnor (C) och ryggmärg (D) av sjuka djur. (A till D) PBS-injicerade friska kontrolldjur visade inte insättningar eller colocalization för något av dessa proteiner. Nukleär färgning med DAPI visas i blått. Skalstrecken = 20 um. Modifierad från Breid et al. , 2016 14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) möss utvecklade glios efter perifer utmaning med alfa-synuklein fibriller. (A) Immunfluorescensanalys av hjärnsektioner från sjuka djur med en antikropp mot GFAP, en markör för astrocyter, avslöjade reaktiv astroglios i områden med fyndigheter av fosforylerad alfa-synuklein, som detekterades i hjärnstammen med pSyn # 64 antikropp. I motsats, fanns det ingen reaktiv astroglios i hjärnan hos PBS-injicerade kontrollmöss. (B) På liknande sätt, färgning med en antikropp mot IBA-1, en markör av mikroglia, demonstrerade microgliosisi områden med fyndigheter av fosforylerat alfa-synuklein i sjuka djur. Hjärnan hos friska, PBS-injicerade kontrollmöss visade inte tecken på microgliosis. (C) Bioluminescens avbildning avslöjade förhöjd utstrålning från hjärna och ryggmärg från Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) möss intraperitonealt injicerade med alfasynuklein fibriller (vänster panel), som orsakades genom aktiveringen av astrocyter , strax innan mössen utvecklade neurologiska symtom. I hjärnan och ryggmärgen av PBS-injicerade kontrollmöss basal radians inte ökade med tiden (höger panel). Efter intraglossal ympning med alfa-synuklein fibriller, en Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) mus, djur 121, visade tecken på reaktiv astroglios strax innan det dog vid 285 dagar (mittpanel). (D) Efter intraperitoneal utmaning av Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) möss med alfa-synuklein fibriller, ökat sjsed nivåer av bioluminescens (> 2 x 10 6 p / s / cm 2 / sr) mättes från hjärnorna hos fyra möss (blått, grönt, brunt, och orange cirklar) några veckor innan de utvecklade neurologiska tecken på sjukdom. En av fem djur visade också förhöjda nivåer av mareld strax innan det dog 285 dagar efter intraglossal injektion med alfa-synuklein fibriller (magenta cirklar). I kontrast, för friska, PBS-injicerade kontrollmöss (svarta cirklar, felstaplar visar SD [n = 4]) och ett djur som inte utvecklade sjukdom efter intraperitoneal injektion med alfa-synuklein fibriller (röda cirklar) förblev bioluminescens signalen under ett tröskelvärde av 2 x 10 6 p / s / cm 2 / sr inom observationsperioden. Skalstrecken = 20 um. Modifierad från Breid et al. , 2016 14. Klicka här för att se en större version av dennafigur.
| muslinje | Inokulum (pg) | inokulering väg | Antal möss med sjukdomen / nej. av möss inokulerade | Medelöverlevnadstiden ± SD (dagar) |
| Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) | humana a-synuklein fibriller (50) | intraperitoneal | 4/5 | 229 ± 17/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) | PBS | intraperitoneal | 0/5 | 0/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) | humana a-synuklein fibriller (10) | intraglossal | 1/5 | 285/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) | PBS | intraglossal | 0/4 0/420 |
Tabell 1: inokulering experiment. * Modifierad från Breid et al., 2016 14
| Target [antikropp klon] | Värd | immunogen | Utspädning i IF | Utspädning i WB |
| Aktin [C4] | Mus | - | - | 1: 1000 |
| α-synuklein, fosfo S129 [pSyn # 64] | Mus | pSer129 | 1: 1200 | - |
| α-synuklein, fosfo S129 [EP1536Y] | Kanin | pSer129 | 1: 100 | 1: 1000 |
| Gliafibrillärt surt protein (GFAP) | Kanin | - | 1: 200 | - |
| IBA-1 | Kanin | - | 1: 500 | - |
| Sequestosome-1 (p62) | Kanin | - | 1: 100 | - |
| Ubikitin [Ubi-1] | Mus | - | 1: 500 | - |
Tabell 2: Antikroppar använda för immunofluorescens (IF) och Western blotting (WB). * Modifierad från Breid et al., 2016 14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Perifer injektion av alfa-synuklein fibriller i peritoneum hos Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) möss representerar en enkel metod för att inducera neurologisk sjukdom åtföljs av neuroinflammation att rekapitulera viktiga egenskaper hos synukleinopatier. På liknande sätt, representerar tungan injektion annan väg för neuroinvasion genom alfa-synuklein prionoids i transgena möss, men är mindre effektiv. Vi valde att avsluta våra experiment vid 420 dagar efter injektion och vi kan inte utesluta möjligheten att mer eller alla fibrill injicerade möss kan ha utvecklat sjukdomen senare tidpunkt. Dessutom kan användningen av Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) möss möjliggör icke-invasiv visualisering av astroglios och representerar en enkel metod för övervakning av inflammatoriska svar som orsakas av neuroinvasion av alfa-synuklein över hela livslängd mus.
Ett kritiskt steg är framställningenav inokulatet. Synes triviala faktorer som aggregering tid, sonikeringstid, överflödet av endotoxiner, eller mängden av fibriller som används för injektion kan påverka resultatet av ett experiment genom att påverka ympning benägenheten hos felvikt alfasynuklein 21. Därför är det viktigt att alltid använda samma villkor när de förbereder inokulat för injektion. För intraglossal injektioner måste det anses att det inte bara hypoglossalnerven men även andra kranialnerver såsom glossopharyngeus nerven innerverar tungan och kunde vara involverade i intemeuronala transport av alfa-synuklein prionoids till hjärnan. Således inriktade på olika områden av tungan kan resultera i olika spridnings kinetik till hjärnan. Vi har inte direkt injicera i hypoglossalnerven och det är möjligt att rikta hypoglossalnerven skulle kunna förbättra CNS överföring av alfa-synuklein prionoids. För intraperitoneala injektioner med alfa-synuklein fibriller är critical att inokulatet injiceras korrekt i peritoneum och inte av misstag in i inre organ såsom tarmen eller blindtarmen, som negativt kan påverka neuroinvasion. Detta är också viktigt för mareld imaging när injicera D-luciferin. Mistargeting av D-luciferin på inre organ kan bromsa dess fördelning till hjärnan och leder till lägre bioluminiscens. För att erhålla enhetliga resultat under avbildning är det också viktigt att alltid fräscha framställa D-luciferin lösning före injektion och att låta det exakt inkubera i 10 min efter intraperitoneal injektion innan avbildning.
Bioluminescens avbildning är en användbar metod för att icke-invasivt mäta förändringar i astroglios över tiden och kan appliceras inte endast efter intraperitoneal eller intraglossal injektioner utan även efter varje typ av behandling, inklusive exempelvis, intracerebral eller intravenösa injektioner. Att övervaka spridningen av alfa-synuklein prionoids från periferin till KNS och den efterföljande neuroinflammation vi använde bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) möss. Eftersom hemizygot expression av alfa-synuklein i dessa djur är 40% lägre i förhållande till homozygota djur de förblir fria från spontan sjukdom under upp till 22 månaders ålder och som har en lämplig genetisk bakgrund för alfa-synuklein transmissionsStudier 13. Emellertid, kan modifieringar beträffande valet av musmodellen för bioluminescens avbildning vara önskvärd. Ett intressant alternativ är användningen av monogena Tg (GFAP -luc +/-) möss som uttrycker endast luciferas som en transgen, som tillåter en bedömning av prionoid beteende alfasynuklein fibriller på en bakgrund som är väsentligen vildtyp så långt som alfa-synuklein är berörda 14. Dessutom passerar Tg (GFAP -luc +/-) möss till andra transgena möss, såsom Tg (SOD1 G93A) möss för amyotrofisk lateralskleros eller Tg (APP23) mis för Alzheimers sjukdom, möjliggör avbildning av neuroinflammation i andra sjukdomsmodeller 22, 23.
En begränsning hos detta protokoll är att baserat på injektionsstället den injicerade inokulatet inte kan överskrida en viss volym. Sålunda kan endast utföras injektioner i tungan med mindre volymer än de i peritoneum, som kan påverka överföringstider till CNS. En annan begränsning är att GFAP -luc transgen tillåter endast upptäcka astroglios men inte microgliosis, vilket är lika viktigt i neuroinflammation. Slutligen har denna modell inte ge insikter om hur alfa-synuklein prionoids når CNS efter intraperitoneal injektion.
Tillämpningen av exogena alfa-synuklein prionoids via injektion har visat sig vara en användbar metod för att studera överföringsvägar som spelar en kritisk roll i rekapitulera egenskaper synucleinopathies. Intracerebrala injektioner av rekombinant alfa-synuklein fibriller eller sjukdomsassocierad mus eller humana alfa-synuklein arter i djurmodeller har använts i flera studier för att analysera deras sådd egenskaper och överföringseffektivitet över tiden 5, 7, 17, 24, 25, 26. Eftersom stereotaktiska injektioner i hjärnan inducera alltid ett lokalt inflammatoriskt svar kort efter kirurgi, kan detta överföringsrutten påverka spridning och infektiviteten av inokulatet som orsakas av en förändring av hjärnan homeostas. Nyare studier har ändrat fokus till perifera eller systemtillämpningar, inte i första hand för att undvika det kirurgiska ingreppet, utan snarare för att analysera periferin, tarmväggen, skelettmuskel, eller blod, som ett första punkt varifrån neuroinvasion till CNS kan samarbetammence 6, 9, 14, 27. För prioner har det visats att sändning genom peritoneum eller tungan leder till neuroinvasion och neurologisk sjukdom; efter tunga infektion, prioner sprids inom bara två veckor till hypoglossus kärnan i hjärnstammen 11. Eftersom alfa-synuklein har diskuterats att ha neuroinvasive och sådd egenskaper såsom prioner, visade vi att överföring via tungan och bukhinnan representerar ytterligare entré poäng för alfa-synuklein prionoids att invadera CNS 14. Kvantifiering av astroglios genom bioluminescens avbildning underlättar spårning av neuroinflammatoriska process över tid och representerar ett icke-invasivt alternativ till histologisk analys.
För att få en djupare insikt i hur CNS svarar på neuroinvasion av alfa-synuklein prionoidsoch till andra behandlingar som orsakar neuroinflammation, skulle det vara fördelaktigt att generera musmodeller som också tillåter icke-invasiv övervakning av microgliosis, t.ex. med en transgen som driver luciferas-expression från en promotor som är specifik för proteinuttryck i mikroglia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna tackar Olga Sharma, Theresa Hundt, och personalen i DZNE mikroskopi och djuranläggningar för teknisk support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-actin antibody | Merck Millipore | MAB1501 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anti-GFAP antibody | Dako | Z0334 01 | |
| anti-IBA-1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| anti-Sequestosome-1 (p62) antibody | Proteintech | 18420-1-AP | |
| anti-ubiquitin antibody [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| Ketamine | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xylazine | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| 27 G syringe | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Secureline lab marker | Neolab | 25040 | |
| D-luciferin potassium salt | Acris | LK10000 | 30 mg/mL stock solution |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 sonicator | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II imaging system | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice | The Jackson Laboratory | 004479 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| N-laurylasarcosyl | Sigma | L5125-100G | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | TLA-110 rotor | |
| Thickwall polycarbonate tubes | Beckman Coulter | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | WG1401BOX | |
| HRP conjugated antibody | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 conjugated antibody | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| Stella 3200 imaging system | Raytest | ||
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | SA/00216763/000500 | working solution 3% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | working dilution 1:50,000 |
| Fluoromount media | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | ||
| HALT protease and phosphatase inhibitors | Thermo Fisher Scientific | 10516495 | |
| Precellys 24-Dual homogenizer | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Alexa Fluor 594 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 10741395 | |
| Microtome RM2255 | Leica | ||
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss |
References
- Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T. B. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease. Nat Med. Olanow, C. W. 14 (5), 504-506 (2008).
- Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
- Hansen, C., et al. alpha-Synuclein propagates from mouse brain to grafted dopaminergic neurons and seeds aggregation in cultured human cells. J Clin Invest. 121 (2), 715-725 (2011).
- Masuda-Suzukake, M., et al.
- Holmqvist, S., et al. Direct evidence of Parkinson pathology spread from the gastrointestinal tract to the brain in rats. Acta Neuropathol. 128 (6), 805-820 (2014).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1, 38 (2013).
- Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of alpha-synuclein induces CNS alpha-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10732-10737 (2014).
- Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).
- Bartz, J. C., Kincaid, A. E., Bessen, R. A. Rapid prion neuroinvasion following tongue infection. J Virol. 77 (1), 583-591 (2003).
- Tamgüney, G., et al. Measuring prions by bioluminescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 15002-15006 (2009).
- Watts, J. C., et al. Transmission of multiple system atrophy prions to transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (48), 19555-19560 (2013).
- Breid, S., et al. Neuroinvasion of alpha-Synuclein Prionoids after Intraperitoneal and Intraglossal Inoculation. J Virol. 90 (20), 9182-9193 (2016).
- Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).
- Zhu, L., et al. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci Lett. 367 (2), 210-212 (2004).
- Bernis, M. E., et al. Prion-like propagation of human brain-derived alpha-synuclein in transgenic mice expressing human wild-type alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 3 (1), 75 (2015).
- Gunther, R., et al. Clinical testing and spinal cord removal in a mouse model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS). J Vis Exp. (61), (2012).
- Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat Protoc. 2 (1), 141-151 (2007).
- Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
- Kim, C., et al. Exposure to bacterial endotoxin generates a distinct strain of alpha-synuclein fibril. Sci Rep. 6, 30891 (2016).
- Keller, A. F., Gravel, M., Kriz, J. Live imaging of amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis: disease onset is characterized by marked induction of GFAP in Schwann cells. Glia. 57 (10), 1130-1142 (2009).
- Stöhr, J., et al. Distinct synthetic Abeta prion strains producing different amyloid deposits in bigenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209 (5), 975-986 (2012).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. 75 (3), 351-362 (2014).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1 (1), 38 (2013).
- Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).
