Summary
Iniezione periferica di fibrille alfasinucleina nel peritoneo o linguetta di Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi che esprimono umana alfasinucleina con la mutazione A53T familiare e luciferasi di lucciola, può indurre neuropatologia, compreso neuroinflammation , nel loro sistema nervoso centrale.
Abstract
Per studiare il comportamento prione-come misfolded alfasinucleina, sono necessari modelli murini che permettono la trasmissione veloce e semplice di prionoids alfa-sinucleina, che causano neuropatologia all'interno del sistema nervoso centrale (CNS). Qui si descrive che intraglossal o iniezione intraperitoneale di fibrille alfasinucleina in bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi che iperesprimono alfasinucleina umano con la mutazione A53T dal promotore proteina prionica e luciferasi di lucciola da il promotore di proteina acida fibrillare gliale (GFAP), è sufficiente per indurre la malattia neuropatologiche. In confronto a omozigote Tg (M83 + / +) topi che sviluppano gravi sintomi neurologici che cominciano ad un'età di 8 mesi, eterozigote Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) gli animali rimangono liberi da malattia spontanea fino a raggiungere un all'età di 22 mesi. È interessante notare che l'iniezione di fibrille alfasinucleina tramite l'intraperitoneal percorso indotta malattia neurologica con paralisi in quattro dei cinque Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi con un tempo di incubazione medio di 229 ± 17 giorni. animali malati hanno mostrato gravi depositi di fosforilata alfa-sinucleina nel cervello e midollo spinale. Accumuli di alfa-sinucleina erano sarcosile insolubile e colocalized con ubiquitina e P62, e sono accompagnati da una risposta infiammatoria conseguente gliosi astrocitaria e microgliosis. Sorprendentemente, l'inoculazione di fibrille alfasinucleina nella lingua era meno efficace nel causare malattia con uno solo dei cinque animali iniettati mostrano alfasinucleina patologia dopo 285 giorni. I nostri risultati mostrano che l'inoculazione per via intraglossal e ancora di più per via intraperitoneale è idoneo ad indurre la malattia neurologica con caratteristiche rilevanti del sinucleinopatie a Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi. Ciò fornisce un nuovo modello per lo studio patogenesi prioni come indurred entro prionoids alfa-sinucleina in maggiore dettaglio.
Introduction
V'è una crescente evidenza che l'alfa-sinucleina ha caratteristiche che sono simili a quelli della proteina prionica, in particolare nella sua capacità di auto-seme e propagano misfolding tra cellule e lungo percorsi neuronali. La struttura, di alfa-sinucleina è indicato anche come 'prioni-like' o 'prionoid', ed è supportata da osservazioni in esperimenti di trapianto, che suggeriscono la trasmissibilità di misfolded alfa-sinucleina da neuroni malati a appena trapiantato neuroni sani 1, 2 , 3, 4. Anche l'iniezione diretta di misfolded alfasinucleina nel cervello o la periferia, per esempio il muscolo arti posteriori o parete intestinale, provoca una diffusione di alfasinucleina patologia a parti distali del SNC 5, 6, 7, <sup class = "xref"> 8, 9, 10. Abbiamo analizzato trasmissione di prionoids alfa-sinucleina tramite percorsi periferici in maggior dettaglio e affrontato la questione se misfolded alfasinucleina può neuroinvade del SNC dopo una singola iniezione intraperitoneale o intraglossal, una caratteristica che in precedenza era stato mostrato per prioni ma non per alfa misfolded sinucleina. Dopo l'iniezione dei prioni nella lingua, neuroinvasione del SNC avviene tramite propagazione lungo il nervo ipoglosso della lingua che conduce al nucleo del nervo ipoglosso, che si trova nel tronco cerebrale 11. Come un modello murino abbiamo scelto Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi che sovraesprimono il mutante A53T di umana alfasinucleina dal promotore prione, e luciferasi di lucciola sotto il controllo di un promotore GFAP per monitorare attivazione degli astrociti da bioluminescenza, come precedentemente indicato nel cervello diprioni infetti topi 12. Nelle nostre mani bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) i topi non hanno sviluppato la malattia fino a 23 mesi di età, come è stato dimostrato da altri 13. Una singola iniezione di fibrille alfasinucleina umani tramite l'intraglossal o rotta indotta malattia neurologica intraperitoneale con patologia nel cervello e midollo spinale di Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mice sostengono l'ipotesi che prionoids alfa-sinucleina condividere caratteristiche importanti con prioni 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure tra cui animali sono stati eseguiti con l'approvazione del Comitato per la protezione degli animali di Reno-Westfalia Agenzia North State Environment (LANUV). Gli animali sono stati alloggiati e curati secondo condizioni standard con 12 h ciclo luce / buio e libero accesso a cibo e acqua.
1. Modello Animal
- Intercross emizigote Tg (GFAP -Luc +/-) topi con emizigote topi Tg (M83 +/-) per generare emizigote bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mouse 15, 16.
- Genotipo progenie con PCR in tempo reale per la presenza del transgene codifica alfasinucleina umana e con PCR standard per luciferasi di lucciola 12, 17.
- Inoculare gli animali ad un'età di sei-otto settimane.
2. Preparazione dell'inoculo
- preparare monomeric ricombinante alfa-sinucleina umana con la mutazione A53T in tampone salina tamponata con Tris (TBS) contenente 150 mM NaCl in 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) come è stato descritto in precedenza 14.
- Preparare fibrillare alfa-sinucleina per vaccinazioni agitando 3 ug / ml di monomerico ricombinante alfa-sinucleina umana in un agitatore orbitale a 800 rpm e 37 ° C per 5 giorni.
- Diluire assiemi fibrille in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per raggiungere una concentrazione finale di 1 mg / mL per intraperitoneale o 2 mg / mL per vaccinazioni intraglossal.
- Frammentare le fibrille alfasinucleina con un sonicatore asta per 1 min (40 impulsi di durata di 0,5 s con una pausa di un secondo tra ogni impulso e ampiezza impostata al 50%) su ghiaccio. Per evitare la contaminazione da cross-semina. Utilizzare sonde sonicazione puliti per preparare inoculo diverso.
3. Intraglossal Iniezioni
- Anestetizzare gli animali con un'intrapeiniezione ritoneal di 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg xilazina. Pinch punta dell'animale e confermare che non ritira la sua arti posteriori per garantire la corretta anestesia. Utilizzare veterinario pomata sugli occhi dell'animale per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
- Fissare animali narcotizzati accuratamente con nastro adesivo su una piastra riscaldante in una dorsale posizione supina con la testa rivolte verso l'investigatore.
- Riempire una siringa ipodermica monouso 27 G con 5 ml di fibrille alfasinucleina sonicata o PBS.
- Utilizzare una pinza pollice smussato dal naso con punte zigrinate per tenere bocca dell'animale aperta, ed una seconda coppia minore di pinze per tirare fuori attentamente la linguetta per rendere il lato inferiore della linguetta accessibile per iniezione.
- Iniettare l'ago della siringa nella parte inferiore destra o sinistra della lingua in prossimità del nervo ipoglosso. Iniettare lentamente l'inoculo dopo 5 s. Lentamente ritrarre l'ago dopo 5 s per garantire che l'inoculoè penetrato il tessuto e non si perde mentre ritraendo l'ago.
- Rilasciare l'animale dalle sue fissazioni e lasciarlo sulla piastra di riscaldamento sotto costante monitoraggio fino al recupero completo.
4. iniezioni intraperitoneali
- Per le iniezioni intraperitoneali, narcotizzare gli animali brevemente in una camera anestesia per inalazione con isoflurano / ossigeno utilizzando una portata di 2 L / min e il vaporizzatore impostato a 2%. Pinch punta dell'animale e confermare che non ritira la sua arti posteriori per garantire la corretta anestesia.
- Riempire una siringa ipodermica monouso 27 G con 50 ml di fibrille alfasinucleina sonicata o PBS.
- Direttamente iniettare nel peritoneo del mouse e non penetrare tenue o cieco situato dietro la parete addominale tenendo l'animale in una posizione dorsale con la testa rivolta verso l'investigatore e verso il basso a circa 45 °. Monitorare gli animali fino a quando non hanno recuperatodall'anestesia.
5. Bioluminescenza Imaging
- Immagine Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi ogni 2-4 settimane con un sistema di imaging bioluminescenza.
- Prima di imaging breve anestetizzare topi in una camera di isoflurano / ossigeno con una portata di 2 L / min e il vaporizzatore impostato a 2%. Pinch punta dell'animale e confermare che non ritira la sua arti posteriori per garantire la corretta anestesia.
- Shave e depilare le teste dei topi con una crema depilatoria. Colorare le orecchie in nero con un indicatore non irritante per bloccare bioluminescenza non specifico.
- Diluire sale di potassio D-luciferina, il substrato di luciferasi, in PBS ad una / soluzione stock di 30 mg mL. Conservare questo in 1 aliquote mL a -20 ° C. Proteggere il D-luciferina disciolto dall'esposizione alla luce.
- Pesare gli animali prima dell'iniezione. Calcolare il volume esatto di D-luciferina per iniezione di 150 mg / kg di peso corporeo. Intraperitoneale iniettare D-luciferin e restituire l'animale alla camera di anestesia.
- Avviare il software di imaging. Dopo che il sistema di imaging ha raggiunto la sua temperatura di esercizio inizializzare il sistema facendo clic sul pulsante 'Initialize' nel pannello di controllo.
- Selezionare i pulsanti 'luminescenti' e 'fotografia'. Impostare il tempo di esposizione a 60 s, il binning a 'Media', l'F / Stop per '1', e il guadagno EM 'Off'.
- Confermare che il filtro di eccitazione è impostato 'Block' e il filtro per le emissioni di 'aperto', e impostare l'altezza soggetto a 1,50 cm.
- Dieci minuti dopo l'iniezione con D-luciferina, collocare gli animali sulla piastra di riscaldamento nella camera di imaging e garantire che il muso siano correttamente inseriti nella presa anestesia. Chiudere il flusso isoflurano / ossigeno dalla camera di inalazione e aprire il flusso per la camera di imaging con una portata di 0,25 L / min e un'evaporazione del 2%. Chiudere la porta della camera di imaging properly.
- Fare clic sul pulsante 'Acquire' per misurare la bioluminescenza, che prende 60 s. Arrestare il flusso isoflurano e monitorare gli animali fino a quando non hanno completamente recuperato dopo di loro il ritorno alle loro gabbie.
- Utilizzare il software di imaging per quantificare la bioluminescenza. All'interno del 'Tool Palette' selezionare 'Strumenti ROI. Sotto 'Tipo' all'interno dei 'Strumenti ROI' selezionare 'misurazione del ROI'.
- All'interno dei 'Strumenti ROI' clic sullo strumento "cerchio" e selezionare il numero di ROI per disegnare dal menu a discesa - idealmente '3' per tre topi.
- Nell'immagine, fare clic destro ciascuna ROI e sotto 'Proprietà' regolare la larghezza e l'altezza di 1,25 cm. Posizionare ogni ROI su tutta l'area del cervello che viene quantificato.
- In alto a sinistra dell'immagine, impostare il pannello unità 'radianza (fotoni).
- All'interno del 'tavolozza degli strumenti', selezionare 'Regolazione immagine' e regolare il minimo eil massimo della 'scala a colori', per esempio, da 0.20e6 a 1.00e6.
- In 'File' salvare i dati con 'Salva'.
6. Le analisi biochimiche
- Isolare il cervello e il midollo spinale secondo i protocolli stabiliti 18, 19.
- Omogeneizzare intero cervello e del midollo spinale interi campioni separatamente in PBS in presenza di inibitori di proteasi e fosfatasi (diluito in PBS a 1x) in due cicli di 30 s con 6.000 rpm in un omogeneizzatore tessuto. Assicurarsi che il cervello e il midollo spinale campioni omogeneizzazione ad una concentrazione finale del 20% (peso / volume).
- Sonicare i campioni due volte mentre il loro mantenimento ghiaccio con una costante di impulso di 10 s ed un'ampiezza impostata al 50%.
- Regolare le omogenati al 10% in PBS e 750 mM NaCl diluendo loro 1: 1 con 1,5 M NaCl in PBS.
- Per separare i detriti cellulari, centrifugare le omogenati a 1.000 xg per 5 minuti a4 ° C. Mantenere i supernatanti per i passaggi successivi e scartare il pellet.
- Misurare la concentrazione di proteine nei omogenati utilizzando il dosaggio dell'acido bicinconinico (BCA) secondo le istruzioni del produttore. Incubare 1,0 mg di proteina totale da omogenati cerebrali o 0,8 mg di omogenati midollo spinale in N-laurylsarcosyl ad una concentrazione finale del 10% (p / v) per 15 min in ghiaccio.
- Sovrapporre le omogenati su un cuscino 3 ml di saccarosio del 10% (peso / volume) in acqua distillata e ultracentrifuga a 465.000 xg per 1 ora a 4 ° C.
- Risospendere il pellet in un tampone contenente 4% di solfato di sodio dodecil (SDS), 2% β-mercaptoetanolo, 192 mM glicina, 25 mM Tris, e 5% (p / v) di saccarosio.
- Bollire i campioni a 100 ° C per 5 min e caricarli su gel di SDS-poliacrilammide per elettroforesi in un sistema tampone acido morpholineethanesulfonic (MES).
- Trasferire le proteine separate per polivinilidene difluoruro (PVDF) membrane in un semiDry sistema assorbente.
- Incubare le membrane a 0,4% (vol / vol) soluzione di formalina in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente su un rotore a 35 rpm per reticolare le proteine con la membrana.
- Bloccare le membrane in tampone TBS contenente 0,05% (vol / vol) di Tween 20 e 5% (p / v) di latte per 1 ora a temperatura ambiente.
- Incubare le macchie con l'anticorpo primario in tampone bloccante notte a 4 ° C.
- Lavare le membrane tre volte in tampone TBS e incubare con anticorpi secondari perossidasi o fluoroforo-coniugato in TBS per 1 ora a temperatura ambiente.
- Visualizza gli anticorpi secondari legati per chemiluminescenza o fluorescenza secondo i protocolli stabiliti 20.
Analisi 7. immunofluorescenza
- Disidratare il cervello sezionato e il midollo spinale in una stazione di lavorazione dei tessuti e incorporarli in paraffina utilizzando una stazione di paraffina.
- Tagliare il TIS inclusi in paraffinasues con un microtomo a 8 micron sezioni coronali spesse e montare sezioni di vetrini.
- Deparaffinare le sezioni di tessuto incubandoli in due bagni xilolo separate per 5 a 10 min e reidratare attraverso una serie di bagni graduata di etanolo (100%, 90%, 70%, 50%) ed infine con H 2 O.
- Incubare le sezioni in 0,01 M tampone citrato (pH 6,0) per 5 minuti a temperatura ambiente e inoltre li bollire per 10 minuti in un forno a microonde.
- Lasciare che le sezioni raffreddare a temperatura ambiente e incubare con una soluzione di perossido di idrogeno al 3% per 30 minuti per inibire le perossidasi endogene.
- Bloccare le sezioni di tessuto di incubazione con 20% (vol / vol) siero di capra normale, 1% (vol / vol) siero albumina bovina (BSA), e 0,5% Triton X-100 in PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
- Incubare le sezioni con l'anticorpo primario diluito in 1% (vol / vol) siero di capra normale, 1% (vol / vol) BSA, e 0,25% Triton X-100 in PBS notte a 4 ° C. <li> Lavare sezioni due volte con 0,25% (vol / vol) Triton X-100 in PBS e una volta con PBS.
- Macchiare le sezioni con i corrispondenti anticorpi secondari coniugati fluoroforo e il colorante nucleare DAPI diluito in 1% (vol / vol) siero di capra normale, 1% (vol / vol) BSA, e PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
- Dopo lavaggio due volte con 0,25% (vol / vol) Triton X-100 in PBS e una volta con PBS, coprivetrino per i vetrini con mezzi di incorporamento e visualizzare la colorazione con un microscopio confocale a scansione laser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Iniezione periferica prionoids alfa-sinucleina tramite la lingua o il peritoneo indotta neuropatologia nel SNC di bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mice (Tabella 1 e Figura 1). Dopo una singola iniezione intraperitoneale con fibrille alfasinucleina, quattro dei cinque topi sviluppato malattia neurologica con un tempo di incubazione medio di 229 ± 17 giorni. Sorprendentemente, uno dei cinque topi hanno sviluppato malattie del SNC dopo l'iniezione intraglossal con fibrille alfa-sinucleina dopo 285 giorni. Inoculazione con PBS non ha causato la malattia entro il periodo di 420 giorni dell'esperimento.
analisi biochimica mediante Western blotting e accostamento con l'anticorpo specifico EP1536Y-fosfo contro Ser129 di alfasinucleina rivelato che per entrambi i percorsi di trasmissione animali malati avevano accumulato aggregati di fosforilata e sarcosile-insoluble alfa-sinucleina nel cervello e il midollo spinale (Tabella 2 e Figura 2). Al contrario, il cervello e il midollo spinale di animali PBS-iniettati e non malate contenessero solo specie monomeriche di fosforilata sinucleina alfa.
Immunofluorescenza colorazione di fette di cervello di topi per via intraperitoneale iniettato e malata con il Psyn # 64 di anticorpi specifici per fosfo rivelato una vasta distribuzione dei depositi di alfa-sinucleina fosforilata in tutto il sistema nervoso centrale (Tabella 2 e Figura 3). Inoltre, i depositi fosforilata sinucleina alfa colocalized con ubiquitina e P62 indica un omeostasi proteina aberrante che possono contribuire alla formazione di depositi.
L'accumulo di aggregati sinucleina alfa in animali malati è stata accompagnata da cambiamenti neuroinfiammatori, che è stato rilevato dalcolorazione immunofluorescenza per GFAP, un marker di astrociti che possono rivelare astrogliosi reattiva (Figura 4). Inoltre, microglia attivati sono stati trovati anche in regioni con abbondante patologia alfasinucleina da immunofluorescenza per IBA-1 (ionizzato adattatore molecola legante il calcio 1). In accordo, l'imaging bioluminescenza rivelato un aumento radianza (> 2 × 10 6 p / s / cm 2 / sr) emesso dal cervello di Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi iniettati con fibrille alfa-sinucleina, poco prima hanno sviluppato segni di malattia neurologica. Al contrario, cervello di topi iniettati con PBS non hanno mostrato alcun aumento della luminosità. Accresciuta radianza è indicativo di astrogliosi reattiva, una caratteristica della neuroinfiammazione, poiché l'espressione della luciferasi è guidato dal promotore GFAP.
Figura 1: Iniezione con fibrille alfasinucleina via intraperitoneale o rotta intraglossal provoca malattia in bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi. (A) al microscopio elettronico di fibrille alfasinucleina sonicati ricombinanti umani che erano intraperitoneale e intraglossally iniettato in topi. colorazione negativa con acetato di uranile rivelato più cluster di brevi aggregati astiformi. Barre di scala = 100 nm. Curve di sopravvivenza (B) Kaplan-Meier mostrano che dopo l'iniezione intraperitoneale con fibrille alfa-sinucleina quattro dei cinque Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi sviluppato malattia neurologica in 229 ± 17 giorni (Stato viola quadrati chiusi), mentre nessuno dei topi di controllo PBS-iniettati sviluppato segni di disfunzione neurologica entro 420 giorni (quadrati aperti viola). Dopo l'inoculazione intraglossal con fibrille alfa-sinucleina un mouse su cinque è morto dopo 285 giorni (verdecerchi chiusi). Al contrario, nessuno dei topi di controllo PBS-iniettati sviluppato malattia neurologica o spontaneamente morto (cerchi aperti verdi). Modificato da Breid et al. 2016 14. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: analisi biochimica della fosforilata sinucleina alfa nel sistema nervoso centrale di perifericamente iniettato Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi. (A) immunoblotting con l'anticorpo EP1536Y, riconoscendo fosforilazione a Ser129 di alfa-sinucleina, ha mostrato che intraperitoneale iniettata e topi malati accumulato specie ad alto peso molecolare di aggregati insolubili di Sarkosyl fosforilata sinucleina alfa nel cervello und midollo spinale. topi di controllo stimolati con PBS non accumulano aggregati di fosforilata sinucleina alfa e mostravano bande solo per la sua forma monomerica. (B) Dopo sfida intraglossal con fibrille alfasinucleina un solo topo, animale 121, mostrato aggregati sarcosile-insolubili di fosforilata sinucleina alfa nel suo cervello e del midollo spinale, mentre tutti gli altri topi intraglossally inoculati rimaste sano senza depositi di alfa-sinucleina. masse molecolari sono mostrati in kilodalton. caricamento del campione in ogni corsia è dimostrato dal rilevamento di actina. Modificato da Breid et al. 2016 14. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi immunofluorescenza mostra che i depositi difosforilata alfa-sinucleina colocalize con ubiquitina e P62 nel cervello e midollo spinale di malati Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi. Co-colorazione di fosforilata alfasinucleina, rilevata con l'anticorpo EP1536Y e ubiquitina rivelato un colocalizzazione distinto nel cervello, come osservato nel nucleo talamico (A), e midollo spinale, come rilevato nella materia grigia (B), di topi malati dopo la sfida intraperitoneale con fibrille alfa-sinucleina. Analogamente, fosforilata alfasinucleina, rilevata con l'anticorpo Psyn # 64, colocalizzava anche con p62 nel cervello (C) e midollo spinale (D) di animali malati. (Da A a D) PBS iniettato animali sani di controllo non ha mostrato depositi o colocalizzazione per qualsiasi di queste proteine. colorazione nucleare con DAPI è mostrata in blu. Barre di scala = 20 um. Modificato da Breid et al. , 2016 14. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi sviluppato gliosi dopo la stimolazione periferica con fibrille alfa-sinucleina. (A) Analisi immunofluorescenza di sezioni cerebrali di animali malati con un anticorpo contro GFAP, un marker di astrociti, rivelato astrogliosi reattivo in aree con depositi di fosforilata sinucleina alfa, che sono stati rilevati nel tronco cerebrale con il # 64 anticorpo Psyn. Al contrario, non vi era alcuna astrogliosi reattivo nei cervelli dei topi di controllo PBS-iniettati. (B) Analogamente, colorazione con un anticorpo di IBA-1, un indicatore di microglia, dimostrato microgliosisin aree con depositi di fosforilata sinucleina alfa in animali malati. Cervello dei topi di controllo, PBS-iniettati sani non hanno mostrato segni di microgliosis. (C) l'imaging bioluminescenza rivelato elevata radianza dal cervello e midollo spinale di Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi iniettati con intraperitoneale fibrille alfasinucleina (riquadro a sinistra), che è stato causato dall'attivazione di astrociti , poco prima che i topi ha sviluppato sintomi neurologici. Nel cervello e midollo spinale di topi di controllo PBS-iniettati lo splendore basale non è aumentata con il tempo (pannello di destra). Dopo l'inoculazione intraglossal con fibrille alfa-sinucleina, una Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topo, animale 121, ha mostrato segni di astrogliosi reattiva poco prima che morì a 285 giorni (diagramma centrale). (D) Dopo sfida intraperitoneale di Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi con alfa-sinucleina fibrille, maggilivelli sed di bioluminescenza (> 2 × 10 6 p / s / cm 2 / sr) sono stati misurati dal cervello di topi quattro (blu, verde, marrone, e cerchi arancione) alcune settimane prima che sviluppassero segni neurologici della malattia. Uno dei cinque animali anche mostrato livelli elevati di bioluminescenza poco prima morto 285 giorni dopo l'iniezione intraglossal con fibrille alfasinucleina (cerchi magenta). Al contrario, per, topi di controllo PBS-iniettati sani (cerchi neri; barre di errore mostrano SD [n = 4]) e un animale che non hanno sviluppato la malattia dopo l'iniezione intraperitoneale con fibrille alfa-sinucleina (cerchi rossi), il segnale di bioluminescenza rimasto sotto di una soglia di 2 x 10 6 p / s / cm 2 / sr entro il periodo di osservazione. Barre di scala = 20 um. Modificato da Breid et al. 2016 14. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questafigura.
| linea di topi | Inoculo (mg) | via di inoculazione | Numero di topi con malattia / n. di topi inoculati | Tempo medio di sopravvivenza ± SD (giorni) |
| Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) | fibrille umani alfa-sinucleina (50) | intraperitoneale | 4/5 | 229 ± 17/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) | PBS | intraperitoneale | 0/5 | 0/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) | fibrille umani alfa-sinucleina (10) | intraglossal | 1/5 | 285/420 |
| Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) | PBS | intraglossal | 0/4 0/420 |
Tabella 1: esperimenti di inoculazione. * Modificato da Breid et al., 2016 14
| Target [clone di anticorpo] | Ospite | immunogeno | Diluizione in IF | Diluizione in WB |
| Actina [C4] | Topo | - | - | 1: 1.000 |
| α-sinucleina, fosfo S129 [Psyn # 64] | Topo | pSer129 | 1: 1200 | - |
| α-sinucleina, fosfo S129 [EP1536Y] | coniglio | pSer129 | 1: 100 | 1: 1.000 |
| Proteina acida fibrillare gliale (GFAP) | coniglio | - | 1: 200 | - |
| IBA-1 | coniglio | - | 1: 500 | - |
| Sequestosome-1 (P62) | coniglio | - | 1: 100 | - |
| Ubiquitina [Ubi-1] | Topo | - | 1: 500 | - |
Tabella 2: Gli anticorpi utilizzati per immunofluorescenza (IF) e Western blotting (WB). * Modificato da Breid et al., 2016 14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Iniezione periferica di fibrille alfasinucleina nel peritoneo di Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi rappresenta un metodo facile per indurre la malattia neurologica accompagnato da neuroinflammation ricapitolare caratteristiche importanti synucleinopathies. Analogamente, iniezione lingua rappresenta un altro percorso per neuroinvasione da prionoids alfa-sinucleina in topi transgenici ma è meno efficiente. Abbiamo scelto di interrompere i nostri esperimenti a 420 giorni dopo l'iniezione e non possiamo escludere la possibilità che, più o tutti i topi iniettati fibrille possono aver sviluppato la malattia in un punto secondo momento. Inoltre, l'uso di Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mice permette la visualizzazione non invasiva di astrogliosis e rappresenta un metodo semplice per monitorare risposte infiammatorie causate dalla neuroinvasione di alfasinucleina sull'intera durata del topo.
Un punto critico è la preparazionedell'inoculo. Fattori apparentemente banale come il tempo di aggregazione, il tempo sonicazione, l'abbondanza di endotossine, o la quantità di fibrille utilizzato per l'iniezione potrebbe influenzare l'esito di un esperimento modificando la propensione semina di misfolded alfa-sinucleina 21. Quindi è importante usare sempre le stesse condizioni durante la preparazione inoculi iniettabile. Per le iniezioni intraglossal si deve considerare che non solo il nervo ipoglosso ma anche altri nervi cranici quali il nervo glossofaringeo innervano la lingua e potrebbero essere coinvolte nel trasporto di interneuronale prionoids alfa-sinucleina al cervello. Così il targeting diverse zone della lingua potrebbero provocare diverse cinetiche di diffusione al cervello. Non abbiamo iniettare direttamente nel nervo ipoglosso ed è possibile che il targeting del nervo ipoglosso potrebbe migliorare la trasmissione di CNS prionoids alfa-sinucleina. Per le iniezioni intraperitoneali con fibrille alfasinucleina è Critical che l'inoculo viene iniettato correttamente nel peritoneo e non accidentalmente in organi interni come l'intestino o cieco, che potrebbero incidere negativamente neuroinvasione. Questo è importante anche per l'imaging bioluminescenza l'iniezione D-luciferina. Mistargeting di D-luciferina agli organi interni potrebbe rallentare la sua distribuzione al cervello e provocare bioluminescenza inferiore. Per ottenere risultati uniformi durante l'imaging è anche fondamentale per sempre fresco preparare la soluzione D-luciferina prima dell'iniezione e lasciarla esattamente incubare per 10 minuti dopo l'iniezione intraperitoneale prima di imaging.
Imaging bioluminescenza è un metodo utile per cambiamenti misura non invasivo in astrogliosis nel tempo e può essere applicata non solo dopo intraperitoneale o iniezioni intraglossal ma anche dopo ogni tipo di trattamento comprendente, per esempio, intracerebrale o iniezioni endovenose. Per monitorare la diffusione di prionoids alfa-sinucleina dalla periferia al CNS e la conseguente neuroinflammation abbiamo usato bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi. Perché l'espressione emizigote di alfa-sinucleina in questi animali è inferiore del 40% rispetto agli animali omozigoti rimangono liberi da malattia spontanea per un massimo di 22 mesi di età e hanno un background genetico adatto per la trasmissione di alfa-sinucleina studia 13. Tuttavia, le modifiche per quanto riguarda la scelta del modello di topo per l'imaging bioluminescenza può essere desiderabile. Un'opzione interessante è l'uso di monogenica (-Luc GFAP +/-) Tg topi che esprimono solo luciferasi come un transgene, che permette una valutazione del comportamento prionoid di fibrille alfa-sinucleina su uno sfondo che è essenzialmente di tipo selvatico per quanto alfasinucleina riguarda 14. Inoltre, attraversando Tg (GFAP -Luc +/-) topi per altri topi transgenici, come Tg (SOD1 G93A) topi per la sclerosi laterale amiotrofica o Tg (APP23) mghiaccio per la malattia di Alzheimer, permette l'imaging di neuroinfiammazione in altri modelli di malattia di 22, 23.
Una limitazione di questo protocollo è quello basato sul sito di iniezione dell'inoculo iniettato non può superare un certo volume. Così iniezioni nel linguetta possono essere eseguite solo con i volumi più piccoli di quelli nel peritoneo, possono influenzare i tempi di trasmissione al SNC. Un'altra limitazione è che il transgene -Luc GFAP consente solo rilevamento di astrogliosis ma non di microgliosis, che è altrettanto importante in neuroinfiammazione. Infine, questo modello non fornisce intuizioni su come prionoids alfa-sinucleina raggiungono il sistema nervoso centrale dopo l'iniezione intraperitoneale.
L'applicazione di esogeni prionoids alfa-sinucleina tramite iniezione ha dimostrato di essere un metodo utile per studiare percorsi di trasmissione che svolgono un ruolo critico nel ricapitolare caratteristiche synucleinopathies. Iniezioni intracerebrali di fibrille sinucleina alfa ricombinante o di topo associata a malattia o specie alfasinucleina umani in modelli animali sono stati utilizzati in numerosi studi per analizzare le proprietà semina e l'efficienza di trasmissione nel tempo 5, 7, 17, 24, 25, 26. Poiché iniezioni stereotassica nel cervello inducono sempre una risposta infiammatoria locale subito dopo l'intervento chirurgico, questa via di trasmissione potrebbe influenzare la diffusione e l'infettività del inoculo causata da un'alterazione dell'omeostasi cervello. Studi più recenti hanno cambiato la messa a fuoco per applicazioni periferiche o sistemiche, non in primo luogo per evitare l'intervento chirurgico, ma piuttosto di analizzare la periferia, la parete intestinale, muscolo scheletrico, o di sangue, come un punto di partenza da dove neuroinvasione al SNC potrebbe commence 6, 9, 14, 27. Per prioni è stato dimostrato che la trasmissione attraverso il peritoneo o la lingua porta a neuroinvasione e neurologiche; dopo l'infezione lingua, i prioni diffusione nella solo due settimane al nucleo ipoglosso nel cervello stelo 11. Poiché alfasinucleina è stata discussa avere neuroinvasive e semina immobili come prioni, abbiamo dimostrato che la trasmissione attraverso la lingua ed il peritoneo rappresentano ulteriori punti di ingresso per prionoids alfa-sinucleina di invadere lo SNC 14. Quantificazione di astrogliosis mediante imaging bioluminescenza facilita il monitoraggio del processo neuroinflammatory nel tempo e rappresenta un'alternativa non invasiva per l'analisi istologica.
Per ottenere una visione più profonda come il CNS risponde neuroinvasione di prionoids alfa-sinucleinae ad altri trattamenti che provocano neuroinflammation, sarebbe utile per generare modelli murini che consentono anche il monitoraggio non invasivo della microgliosis, ad esempio con un transgene che guida l'espressione della luciferasi da un promotore specifico per l'espressione proteica in microglia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Olga Sharma, Theresa Hundt, e il personale delle DZNE microscopia ed animali strutture per il supporto tecnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-actin antibody | Merck Millipore | MAB1501 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anti-GFAP antibody | Dako | Z0334 01 | |
| anti-IBA-1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| anti-Sequestosome-1 (p62) antibody | Proteintech | 18420-1-AP | |
| anti-ubiquitin antibody [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| Ketamine | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xylazine | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| 27 G syringe | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Secureline lab marker | Neolab | 25040 | |
| D-luciferin potassium salt | Acris | LK10000 | 30 mg/mL stock solution |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 sonicator | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II imaging system | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice | The Jackson Laboratory | 004479 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| N-laurylasarcosyl | Sigma | L5125-100G | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | TLA-110 rotor | |
| Thickwall polycarbonate tubes | Beckman Coulter | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | WG1401BOX | |
| HRP conjugated antibody | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 conjugated antibody | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| Stella 3200 imaging system | Raytest | ||
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | SA/00216763/000500 | working solution 3% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | working dilution 1:50,000 |
| Fluoromount media | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | ||
| HALT protease and phosphatase inhibitors | Thermo Fisher Scientific | 10516495 | |
| Precellys 24-Dual homogenizer | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Alexa Fluor 594 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 10741395 | |
| Microtome RM2255 | Leica | ||
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss |
References
- Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T. B. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease. Nat Med. Olanow, C. W. 14 (5), 504-506 (2008).
- Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
- Hansen, C., et al. alpha-Synuclein propagates from mouse brain to grafted dopaminergic neurons and seeds aggregation in cultured human cells. J Clin Invest. 121 (2), 715-725 (2011).
- Masuda-Suzukake, M., et al.
- Holmqvist, S., et al. Direct evidence of Parkinson pathology spread from the gastrointestinal tract to the brain in rats. Acta Neuropathol. 128 (6), 805-820 (2014).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1, 38 (2013).
- Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of alpha-synuclein induces CNS alpha-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10732-10737 (2014).
- Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).
- Bartz, J. C., Kincaid, A. E., Bessen, R. A. Rapid prion neuroinvasion following tongue infection. J Virol. 77 (1), 583-591 (2003).
- Tamgüney, G., et al. Measuring prions by bioluminescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 15002-15006 (2009).
- Watts, J. C., et al. Transmission of multiple system atrophy prions to transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (48), 19555-19560 (2013).
- Breid, S., et al. Neuroinvasion of alpha-Synuclein Prionoids after Intraperitoneal and Intraglossal Inoculation. J Virol. 90 (20), 9182-9193 (2016).
- Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).
- Zhu, L., et al. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci Lett. 367 (2), 210-212 (2004).
- Bernis, M. E., et al. Prion-like propagation of human brain-derived alpha-synuclein in transgenic mice expressing human wild-type alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 3 (1), 75 (2015).
- Gunther, R., et al. Clinical testing and spinal cord removal in a mouse model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS). J Vis Exp. (61), (2012).
- Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat Protoc. 2 (1), 141-151 (2007).
- Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
- Kim, C., et al. Exposure to bacterial endotoxin generates a distinct strain of alpha-synuclein fibril. Sci Rep. 6, 30891 (2016).
- Keller, A. F., Gravel, M., Kriz, J. Live imaging of amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis: disease onset is characterized by marked induction of GFAP in Schwann cells. Glia. 57 (10), 1130-1142 (2009).
- Stöhr, J., et al. Distinct synthetic Abeta prion strains producing different amyloid deposits in bigenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209 (5), 975-986 (2012).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. 75 (3), 351-362 (2014).
- Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1 (1), 38 (2013).
- Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).
