Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Ekkokardiografisk og histologisk undersøgelse af hjertets morfologi i mus

Published: October 26, 2017 doi: 10.3791/55843
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 1, 1
1Université Côte d’Azur, CNRS, INSERM, iBV, 2Department of Pathology, CHU Nice, 3Institute for Molecular Health Sciences, ETH Zurich

Summary

Ekkokardiografisk undersøgelse bruges ofte i mus. Dyre høj opløsning ultralyd enheder er blevet udviklet til dette formål. Denne protokol beskriver en overkommelig ekkokardiografisk procedure kombineret med histologiske morfometrisk analyser til at bestemme hjertets morfologi.

Abstract

Et stigende antal genetisk modificerede musemodeller er blevet tilgængelige i de seneste år. Desuden er antallet af farmakologiske undersøgelser udført i mus høj. Fænotypisk karakterisering af disse musemodeller kræver også undersøgelse af hjertets funktion og morfologi. Ekkokardiografi og magnetisk resonans imaging (MR) er almindeligt anvendte tilgange til at karakterisere hjertets funktion og morfologi hos mus. Ekkokardiografisk og Mr udstyr specialiseret til brug i små gnavere er dyre og kræver en dedikeret plads. Denne protokol beskriver hjerte målinger i mus ved hjælp af en klinisk ekkokardiografisk system med en 15 MHz human vaskulær sonde. Målingerne udføres på bedøvede voksne mus. Mindst tre billedsekvenser registreres og analyseres for hvert dyr i M-tilstand i visningen parasternal kort-akse. Bagefter, cardiac histologisk undersøgelse udføres, og cardiomyocyte diameter bestemmes på hæmatoxylin-eosin- eller hvedekim agglutinin (WGA)-farves paraffinsnit. Fartøj tæthed er bestemmes morphometrically efter Pecam-1 immunfarvning. Protokollen har været anvendt med succes til farmakologiske undersøgelser og forskellige genetiske dyremodeller baseline betingelser, samt efter eksperimentel myokardieinfarkt af den permanente ligatur af den venstre forreste faldende koronararterie ( LUND). Vores erfaring, ekkokardiografisk undersøgelse er begrænset til bedøvede dyr og er muligt i voksen mus vejer mindst 25 g.

Introduction

Et stort udvalg af genetisk modificerede musemodeller er tilgængelige, og antallet af farmakologiske undersøgelser i mus er høj1,2. Ekkokardiografi og Mr er almindeligt anvendte metoder til fænotypisk karakterisering af hjertets funktion og morfologi i disse mus modeller3. Præsenteres protokollen sigter mod at analysere hjertets funktion og morfologi hos voksne mus. Det kombinerer ekkokardiografisk, Histologisk, og immunhistokemiske målinger. Ekkokardiografisk undersøgelse er meget udbredt i mus4,5,6,7,8,9,10,,11, 12. Pachon et al. 11 identificeret 205 undersøgelser offentliggjort i omsætning, Omsætning forskning, American Journal of Physiology - hjerte- og kredsløbssygdomme fysiologiog Hjerte-kar-forskning mellem 2012 og 2015 brugt ekkokardiografisk undersøgelse i dyr.

Ekkokardiografi bruges til at identificere hjerte fænotyper i genmodificerede mus5,6,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22, samt at analysere hjertefunktion i kronisk overbelastning-induceret hypertrofi, myokardieiskæmi og kardiomyopati modeller i mus (gennemgik i12). Forbedret ekkokardiografi udstyr giver mulighed for den standard foranstaltningen af venstre ventrikel (LV) systolisk og diastolisk dimensioner, tissue Doppler imaging, myokardial kontrast Ekkografi og vurdering af LV regionale funktion og koronar reserve 12. ideelt set ekkokardiografisk undersøgelse bør udføres i bevidst musene at undgå de negative virkninger af anæstesi på kontraktile funktion, autonome refleks kontrol, og puls11. Ikke desto mindre, denne tilgang er begrænset af kravet om at træne dyr; vanskeligheder med at holde kropstemperaturen stabil; bevægelse artefakter; stress; meget højt cardiac frekvenser; og kravet om mindst to efterforskere at udføre eksperimentet, især hvis et stort antal dyr, der er omfattet af undersøgelsen. Interessant, rapporterede en undersøgelse ingen forskelle i ekkokardiografisk parametre i trænede og utrænede dyr19. Vi udfører ekkokardiografisk målinger i bedøvede mus. Forskellige anæstesi protokoller vil blive diskuteret nedenfor.

Selv om standardopløsning ekkokardiografi (> 10 MHz) er tilstrækkeligt at måle LV systolisk og diastolisk dimensioner og hjertefunktion hos voksne mus, metoden er begrænset i sin beskrivelse af underliggende strukturelle fænomener. Dermed, vi kombinerer i vivo målinger med histologiske og immunohistological analyser til at måle, for eksempel, cardiomyocyte diameter og fartøj tæthed. Andre histologiske og immunohistological undersøgelser, såsom fastsættelse af spredning, undersøgelse af apoptose, infarkt størrelse målinger, bestemmelse af fibrose og specifikke markør udtryk, kan også udføres på den samme type af behandlede væv, men som ikke er omfattet af denne protokol. Kombinationen af i vivo ekkokardiografisk undersøgelse med histologiske analyser giver yderligere indsigt i underliggende strukturelle ændringer. I et yderligere skridt, kan vi gennemføre disse målinger med molekylformel og ultra-undersøgelser. Histologiske analyser ikke kun komplet ekkokardiografisk undersøgelse men også blevet uundværligt når opløsningen af ekkokardiografi ikke er tilstrækkelig. Dette er især tilfældet i modeller af genmodificerede mus, der er embryonale dødbringende23,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

eksperimenter beskrevet her blev gennemført i overensstemmelse med de relevante institutionelle og franske dyrevelfærd love, retningslinjer og politikker. De er blevet godkendt af den franske etiske komité (Comité Institutionnel d ' Ethique Pour l ' dyr de Laboratoire; nummer NCE/2012-106).

1. ekkokardiografi

  1. bestemme kropsvægt af musen ved hjælp af en standard laboratorium balance mens du holder det let i halen for at sikre korrekt positionering.
  2. Bedøver dyret ved intraperitoneal (i.p.) injektion af 50 mg/kg pentobarbital 25 , 26.
    Bemærk: Andre former for anæstesi kan bruges, hvis den samme protokol bruges i hele undersøgelsen. Fordele og ulemper vil blive diskuteret nedenfor.
  3. Sæt musen tilbage i sit eget bur og vente, indtil det er unresponsive, det viser støt vejrtrækning, og bageste fod reflekser er fraværende. For at teste dette, klemme en fod lidt og observere om benet stadig trækker.
  4. Barbering i venstre side af brystkassen og det venstre armhule ved hjælp af en kommerciel gnaver shaver.
    Bemærk: Brugen af en dedikeret gnaver shaver giver mulighed for fuldstændig fjernelse af fine musen hår at undgå indblanding i ekkokardiografisk måling. Kommercielle hår fjernelse cremer eller løsninger bør undgås, da de normalt er parfumeret, som vil forstyrre dyret, når det vågner. Undgå overdreven barbering, da det øger varmetabet.
  5. Sætte den sovende dyr på en varm pad sæt til 40-42 ° C i en lavvandet venstre-sidet position, med hovedet på 12 o ' ur og hale på 6 o ' ur. Lave den venstre arm og venstre ben, hale med tape.
  6. Anvend pre varmede ekkokardiografi gel på glatbarberet brystet og lederen af transduceren.
  7. Placere transduceren parasternal-venstre, leder det til højre side af halsen at opnå en todimensional (2D) parasternal long-akse se på niveauet for den papillær muskel. Drej transducer 90° med uret for at få en kort-axis visning på papilary muskel plan. Bruge en minimal dybdeindstilling og en zoom til at maksimere billede kvalitet og frame rate. Indstille sweep hastigheden til maksimalt.
    1. At få disse indstillinger, forskellige zoom og dybde indstillinger kan anvendes afhængigt af den computer og software. Registrere 2D-styrede M-mode billeder i kort-akse Se 27. Henvise til figur 1A og B 27.
      Bemærk: Vær omhyggelig med at undgå at anvende overdreven pres på brystet, da dette kan forårsage bradykardi.
  8. Post mindst 3 serie 3 heart beat cine sløjfer for hvert dyr.
    Bemærk: For de echocardiograph software, der anvendes i denne undersøgelse, tryk på den " erhverve/Gem " knappen kun én gang. Denne metode er specifikt for echocardiograph med denne bestemt software. Andre software-pakker kan anvendes med forskellige maskiner.
  9. Efter vellykket optagelser, tørre ekkokardiografi gel fra mus thorax, varmepude og transducer. Fjern tapen fra lemmer og hale.
  10. Lad musen under observation på den hede afrivningsblok, dækket med væv for at undgå unødvendige lys eksponering og varme tab, indtil det vågner op.
  11. Sæt dyret tilbage i sit bur.
  12. Analyze indspillet M-mode billeder fra parasternal kort-axis visning til at bestemme venstre ventrikel (LV) dimensioner og funktion. Måle tykkelsen af LV forreste væg i systole og diastole (LVAWs og LVAWd), LV indre ende-systolisk og ende-diastolisk reaktionernes (LVIDs og LVIDd) og LV posterior vægtykkelse (LVPW) i systole og diastole (LVPWs og LVPWd) ved hjælp af den identifikation af grænsefladen væv-blod på de lagrede billeder.
  13. Måler de diastoliske dimensioner på tidspunktet for de tilsyneladende maksimal LV diastolisk dimensioner og LV ende-systolisk dimensioner på tidspunktet for den mest forreste systolisk udflugt af LV bageste væg. Tryk på den berøringsfølsomme skærm på de " analyser " ikonet og derefter på de " LVAWd " ikon. Placer den elektroniske caliper på grænsefladen mellem højre ventrikel hulrummet og LV forreste væg i diastole.
  14. Position den elektroniske caliper på grænsefladen mellem LV forreste væg og LV hulrum at opnå LV diastolisk forreste vægtykkelse; softwaren skifter direkte til LV indre ende-diastoliske måling.
  15. Position caliper på grænsefladen mellem LV hulrum og LV posterior væg at opnå LV indre ende-diastolisk diameter; softwaren vil skifte til LV posterior væg tykkelse måling.
  16. Position caliper på grænsefladen mellem LV posterior væg og at hjertesækken at opnå LV diastolisk posterior vægtykkelse. For LV systolisk dimensioner, skal du trykke på berøringsskærmen på den " LVAWs " ikon og holdning den elektroniske caliper på grænsefladen mellem højre ventrikel hulrummet og LV forreste væg i systolen.
  17. Position den elektroniske caliper på grænsefladen mellem LV forreste væg og LV hulrum at opnå LV systolisk forreste vægtykkelse. Gentag processen, som beskrevet ovenfor for LV indre ende-systolisk diameter og LV systolisk posterior vægtykkelse. Brug førende konventionen blev vedtaget af det amerikanske samfund ekkokardiografi til at spore endokardial og epikardielle grænser 13 , 27.
    Bemærk: LV kontraktile funktionsparametre beregnes automatisk ved hjælp af de foregående målinger. LV fraktioneret afkortning (FS) er defineret som FS (%) = [(LVIDd-LVIDs)/LVIDd] x 100. LV uddrivningsfraktion (UDDRIVNINGSFRAKTION) beregnes med formlen modificerede Teicholz hvor elementærfilen (%) = [(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd 3] x 100 12. Henvise til figur 1A og B.
  18. Gemmer data på cd'er eller USB memory sticks og lave backup kopier.
  19. Import, analysere og eksportere data ved hjælp af passende software.
    Bemærk: Efter disse grundlæggende målinger, forsøget kan afbrydes midlertidigt. Hvis udførelsen af en direkte sammenligning mellem knockout dyr og vildtype littermates, gå videre med den histologiske analyser 6. For Cre-ERT2; LOX/lox mus linjer, fortsætter den følgende dag med tamoxifen induktion ved i.p. injektion, som beskrevet 5 , 24. Hvis inducerende eksperimentelle myokardieinfarkt af ligatur af venstre koronararterie 5 , 28, kirurgi kan udføres direkte efter de ekkokardiografisk målinger, når musene er under anæstesi. Ellers kan opretholdes et minimum forsinkelse på en uge mellem to runder af anæstesi til at begrænse antallet af postoperativ dødelighed.

2. Forberedelse af hjertet prøver til histologisk vurdering

  1. ofre dyr af cervikal dislokation. Måle deres krop vægte. Desinficere bryst og underliv med en 70% alkohol vatpind.
  2. Lave et tværgående snit i huden 1 cm distale til brystbenet. Bruger stump pincet, Fjern skindet fra brystkasse, bevæger sig i retning af hovedet. Hold brystbenet let med fint pincet og åbne mellemgulvet ved at indsætte den stump ende af fine sakse.
  3. Snit brystkassen på begge sider parallelt til brystbenet. Flytte brystbenet i retning af hovedet. Find midt i brystkassen. Hold den vaskulære stammen af hjertet med den fine pincet og skære nedenfor ved hjælp af fine sakse.
  4. Åbn brystet og punktafgifter hele hjertet ud af brystkassen, måle hjertet vægten, og etablere en hjerte til kropsvægt ratio 4 , 5 , 6 , 23 , 29 , 30 < /sup >.
  5. Fix hjertet i 2 mL 10% neutrale bufferet formalin løsning i 15 mL rør natten over ved 4 ° C.
    Advarsel: fare! Arbejde med formalin løsninger skal ske i en kemisk stinkskab; bære handsker og sikkerhedsbriller.
    Bemærk: Som buffer sammensætning for formalin løsninger varierer med forskellige leverandører, bruge den samme leverandør i hele undersøgelsen.
  6. Den næste dag, skar hjerter i tværplan, i midten, og overføre dem til kassetter til paraffin indlejring, som udføres i patologi laboratorium ved hjælp af en automatiseret indlejring apparater.
  7. Udføre skæring.
    1. Afsnit paraffin blokerer på en tykkelse på 3 µm ved hjælp af en mikrotomen og flyde dem i en 40 ° C vand bad indeholdende destilleret vand.
    2. Overføre sektioner på dias. Tillad dias til tørre natten over i et 37 ° C inkubator og gemme dem på 4 ° C indtil klar til brug.
      Bemærk: Protokollen kan blive standset her indtil brugeren er klar til farvning (trin 3).
  8. Deparaffinize og rehydrere vævet dias.
    1. Objektglassene i farvning krukker med glas skær i en 55 ºC ovn i 10 min. til at smelte paraffin.
    2. Deparaffinize dias i to ændringer af 200 mL xylen eller xylol erstatning for 5 min.
      Forsigtig: Yderst brandfarlig og giftige! Arbejde i en kemisk stinkskab; bære handsker og sikkerhedsbriller.
    3. Overførsel dias til 200 mL 100% alkohol. Foretage to ændringer i 3 min og overføre én gang gennem 200 mL 95% alkohol i 3 min.
      Forsigtig: Meget brandfarlige! Holdes væk fra antændelseskilder; Ingen rygning.
    4. Skylles to gange i 200 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) i 5 min og fortsætte med trin 3, 4 eller 5.

3. Hæmatoxylin og Eosin pletter

  1. skylles dias med deres sektioner i destilleret vand.
  2. Pletten kerner med hæmatoxylin løsning for 8 min.
  3. Skyl i rindende vand i 10 min.
  4. Pletten med eosin løsning for 2 min.
  5. Dehydrate tre gange for 2 min i 100% ethanol (EtOH). Klare tre gange for 2 min i xylen eller xylol erstatning. Mount i en xylol-baserede montering medium.
  6. Fotografere dias og måle cardiomyocyte diameter på niveau med kernen i længdesnit af den interventrikulært septum. Måle mindst 100 celler pr. afsnit og tre sektioner pr. hjerte.

4. WGA farvning

  1. glassene inkuberes fremstillet af trin 2.7 med tetramethylrhodamine (eller andre fluorescerende farvestoffer)-konjugeret WGA (1: 100 i PBS) for 60 min. ved stuetemperatur i et fugtigt kammer.
  2. Vaskes tre gange med PBS i 5 min.
  3. Mount med fluorescens montering medier indeholdende DAPI. Opbevares ved 4 ° C i mørke inden analysen.
    Forsigtig: Bære øjenbeskyttelse og kompatible kemikalie-resistent handsker.
  4. Fotografere diasene.
    1. Brug et mikroskop udstyret med fluorescens epi-belysning og filter indstiller for DAPI og tetramethylrhodamine (Se Tabel af materialer). Indstille blænde til maksimum og lysstyrke til auto-eksponering.
    2. Erhverve separate billeder på 400 x forstørrelse til blå og rød kanaler. Åbne billederne i ImageJ. Justere lysstyrke og kontrast hvis nødvendigt (billede > Juster > lysstyrke/kontrast).
    3. Indstille hvert billede til 8-bit (billede > Type > 8-bit). Overlay DAPI og WGA billeder. Bruge den blå kanal for DAPI og den røde kanal nemlig WGA; angive de grønne og grå kanaler til ingen (billede > farve > flette kanaler) 31.
  5. Bestemme cardiomyocyte diametre på niveau med kernen i tværgående dele af den interventrikulært septum.
    1. Definere omfanget af billeder i ImageJ. Til dette formål, fotografere et objekt af kendt størrelse (f.eks. en hemocytometer kammer på samme forstørrelse som afsnittene med hjertet, og trin 4.4).
    2. Bruge værktøjet lineær til at tegne en streg fra start til slut i strukturen kendt (analyser > sat skala).
      Bemærk: Afstanden i pixel vil blive vist automatisk; kendt afstand og enhed af længde skal angives. Fortsætte med cardiomyocyte målinger på niveau med kernen.
    3. Trækker en lige linje fra WGA-positive membranen gennem DAPI-positive kerne til webstedet modsatte af cellemembranen WGA-positive (analyser > foranstaltning). I resultatvinduet, Sørg for at længde værdier har en meningsfuld antallet af decimaler (analyser > sæt målinger > decimaler).
    4. Måler mindst 100 celler pr. afsnit og tre sektioner pr. hjerte. Eksportere resultaterne til Microsoft Excel (Klik på resultater > fil > Gem som > .csv) 6 , 31.

5. Pecam-1 immunfarvning

  1. udføre antigen demaskering.
    1. Tilføje 1.600 mL af natrium citrat buffer (10 mM natriumcitrat, 0,05% Tween 20, pH 6.0) til en trykkoger. Placer trykkoger på kogeplade og tænde den fulde magt. Ikke sikre låget af en trykkoger på dette punkt; Du skal blot hvile det på toppen.
      Forsigtig: Hot!
    2. Når natrium citratbuffer kogende, overføre slides fra trin 2,5 til trykkoger. Sikre trykkoger låget. Så snart komfuret har nået fuld pres, vente på 7 min. Når 7 min er gået, slukke kogeplade og placere trykkoger i en tom vasken. Aktivere udgivelse trykventilen og opstille koldt vand over komfuret. Når det har de-tryk, åbne låget og løbe koldt vand ind i komfuret i 5 min. sted dias i 200 mL PBS.
      Bemærk: Alternativt, mikrobølgeovn antigen demaskering kan bruges, selv om risikoen for overophedning øges.
  2. Brug 0,3% hydrogenperoxid i methanol til at blokere endogent peroxidase aktivitet i 5 min. Skyl dias for tre gange i 2 min. hver i 200 mL PBS.
    Advarsel: Brandfarlige og giftige!
  3. Glassene inkuberes i 15 min. i fortyndet normale blokerende serum (5% normal ged serum i PBS) som også indeholder en begærlighed blok (4 dråber i 1 mL).
  4. Forsigtigt Tryk på væsken fra afsnittene og inkuberes dem med Pecam-1 antistof fra kanin, fortyndet 1:50 i PBS, som indeholder 2,5% normal ged serum og 4 dråber af biotin blok pr. mL. Glassene inkuberes natten over i et fugtigt kammer ved 4 ° C.
  5. Vaske dias tre gange i 5 min i 200 mL PBS. Inkuber sektioner med biotinylated ged anti-kanin IgG antistof fortyndet 1:200 i PBS, som indeholder 2,5% normal ged serum i 1 time ved stuetemperatur. Vask dias tre gange i 5 min i 200 mL PBS.
  6. Inkuber Tofthan sektioner med en begærlighed/biotin-baserede peroxidase system i 20 min. (reagens A og reagens B skal være kombineret 30 mins forudgående at bruge). Vask dias tre gange i 5 min i 200 mL PBS.
  7. Opløses 1 3,3 '-diaminobenzidine (DAB) og 1 urinstof hydrogenperoxid tablet i 5 mL dobbeltdestilleret vand. Inkuber sektioner med DAB løsning for ca. 3 min., nøje overvågning farveudviklingen. Farve reaktionen standses ved forsigtigt vaske diasene i 200 mL PBS.
    Forsigtig: Kræftfremkaldende; kemikalie-resistent handsker!
  8. Counterstain kerner i 6 min. med hæmatoxylin. Skyl i rindende vand i 2 min. Dehydrate tre gange for 2 min i 200 mL 100% alkohol. Fjern tre gange for 2 min hver i 200 mL xylen eller xylol erstatning. Mount i en xylol-baserede montering medium.
  9. Fotografere dias (mindst ti felter på 40 x forstørrelse fra den interventrikulært septum hvert hjerte) og måle Pecam-1 område tæthed ved hjælp af den frit tilgængelige ImageJ software 31. Brug farve deconvolution 32 plugin for DAB og hæmatoxylin og justere billedets kontrast til det samme niveau.
    Bemærk: I tilfælde af den brune og lilla/blå farve har betydelig spektrale overlapning, der kan forårsage problemer med farve deconvolution, kan man prøve forskellige mærker af hæmatoxylin løsning til at opnå klare og lyseblå nukleare farvning. Alternativt, immunofluorescens eller manuel optælling af kapillærerne kunne udføres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I figur 1viser repræsentative ekkokardiografisk optagelser nytten af ekkokardiografi til at identificere hjerte fænotyper i genmodificerede mus. Forskellen mellem en mus med normal hjertefunktion (figur 1A) og et dyr med en forstørrede venstre hjertekammer og nedsat LV funktion (figur 1B) kan let identificeres. Figur 2 viser en sammenligning af cardiomyocyte diameter målinger i dyr uden (figur 2A) og med Hjertehypertrofi (figur 2B) ved hjælp af hæmatoxylin-eosin-farvede paraffin hjerte sektioner og målinger af længdesnit i hjertet væv. Figur 3 illustrerer måling af cardiomyocyte tværgående diametre benytter WGA-farvede paraffinsnit fra hjerter af kontrol mus (figur 3A) og dyr med hjerte hypertrofi (figur 3B). Figur 4 viser nytten af Pecam-1 Immunhistokemi (DAB substrat, brun farvning) af hjertets sektioner til at bestemme fartøj tætheden af normal hjerte væv (figur 4A) og hjerter med øget angiogenese (figur 4B ).

Figure 1
Figur 1: Standard-opløsning ekkokardiografi (> 10 MHz) foranstaltning LV systolisk og diastolisk dimensioner og hjertefunktion i mus med forstørrede Hjertehypertrofi efter myokardieinfarkt versus kontroldyr.
Repræsentative ekkokardiografisk optagelser fra normale, sunde mus (A) og dyr med LV dilatation og nedsat LV funktion efter myokardieinfarkt (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + Tamoxifen mus)5 (B). LVAW, LVID og LVPW er angivet. De hvide søjler repræsenterer systolisk og diastolisk målepunkter. De svarer til markøren point for målinger og er forklaret i protokollen trin 1.12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: hæmatoxylin-eosin-farvede sektioner til at måle cardiomyocyte diametre i langs sektioneret cellerne i mus med udspilede hjerte hypertrofi og kontrol dyr. Repræsentative billeder af cardiomyocyte diametre i mus med normale cardiomyocyte størrelser (A) og dyr med øget cardiomyocyte størrelser (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + Tamoxifen mus)5 (B). De sorte streger angiver de målte diametre. Værdierne for hver måling er repræsenteret. Skalere barer = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: WGA-farvede sektioner til at måle cardiomyocyte tværgående diametre i sektioner i hjertet væv fra mus med forstørrede Hjertehypertrofi versus kontrollere dyr. Repræsentative billeder for cardiomyocyte diametre i mus med normale cardiomyocyte størrelse (A) og dyr med øget cardiomyocyte størrelser (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + Tamoxifen mus)5 (B). Kerner blev counterstained med DAPI. De hvide linjer angiver de målte diametre på niveau med kerner (blå). Værdierne for hver måling er repræsenteret. Skalere barer = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Pecam-1 immunolabeled sektioner til at analysere hjerte fartøj tæthed i kontrol mus og dyr med øget angiogenese.
Repræsentative billeder til fartøj mærkning i mus med normale kar densitet (A) og dyr med forbedret vascularization (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + Tamoxifen mus)5 (B). Kerner blev counterstained med hæmatoxylin. Pilene peger på Pecam-1-positive fartøjer. Skalere barer = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forskellige metoder er blevet udviklet for at evaluere hjertets struktur og funktion i mus, herunder ekkokardiografi, kontrast-forstærket Mr, micro CT og PET-scanning. På grund af dens omkostningseffektivitet og enkelhed er ekkokardiografi den mest anvendte teknik til funktionel analyse i mus11. I almindelighed, på grund af den lille størrelse af hjertet og den høje frekvens af puls i mus, transducere med en frekvens > 10 MHz bør anvendes, selv om vellykkede målinger er blevet rapporteret med 8 eller 9 MHz transducere4,7 . Hjertets funktion er tæt knyttet til kropstemperatur og hjertets frekvens, er det vigtigt at kontrollere disse parametre i hele undersøgelsen. Placere musen på en varmepude er afgørende for at holde kropstemperaturen på den bedøvede dyr konstant. Ideelt, en kontrolleret varmepude med en rektal sonde til at indstille kropstemperaturen til 38 ° C bør anvendes. Hvis dette ikke er tilgængelige, bør den hede afrivningsblok indstilles til to til tre grader over denne værdi. Varme lamper bør undgås, da de komplicere opgaven for investigator og risiko for overophedning dyrene.

Til kontrol af puls og hjertefunktion, er anæstesi type meget vigtigt. De fleste undersøgelser bruger isofluran, som anæstesi er let at fremkalde ved indånding i en induktion kammer (3% isofluran), kan opretholdes via en indånding maske (1-2% isofluran), og er kun af kort varighed. Andre almindeligt anvendte stoffer er 2,2,2-tribromoethanol, pentobarbital og ketamin + xylazin blander11,12. Overraskende, isofluran er blevet rapporteret at kompromittere hjertefunktion i ekkokardiografisk målinger, og denne effekt var endnu mere udtalt i ketamin + xylazin gruppe11. Ketamin alene arbejdede bedst i denne undersøgelse11. Gao mfl. rapporterede de mest reproducerbare resultater med 2,2,2-tribromoethanol12. Resultaterne var i det samme område for isofluran, 2,2,2-tribromoethanol og pentobarbital12. Også, hjerte rum var ikke anderledes i 2,2,2-tribromoethanol og pentobarbital grupper12. Hjerte et al. rapporteret lavere hjerte rum i ketamin + xylazin gruppe i forhold til 2,2,2-tribromoethanol gruppe16. I vores forsøg ved hjælp af forskellige Transgene mus stammer og pentobarbital anæstesi, de gennemsnitlige hjerte rum varierede mellem 350 og 450 bpm. Ikke desto mindre uddrivningsfraktion var > 80%, hvilket svarer til værdierne i bevidst dyr11. Ekkokardiografisk målinger under baseline betingelser fra vores laboratorium4,5,6 er i samme størrelsesorden som rapporteret et andet sted11,12,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,26 . I modsætning til pentobarbital, er ketamin, isofluran og 2,2,2-tribromoethanol kendetegnet ved hurtigt indsættende og nyttiggørelse. Således bør timingen mellem anæstesi og ekkokardiografisk målingerne være ens for alle dyr i undersøgelsen for at undgå forskellige grader af recovery fra anæstesi. Pentobarbital fungerer længere, men har Ulempen ved et lille terapeutisk vindue, hvilket gør det nødvendigt at justere dosis tæt forhold til kropsvægt. Langvarig anæstesi ved hjælp af pentobarbital har den fordel, at efter baseline ekkokardiografisk målinger, kirurgiske procedurer kan udføres uden behov for reinjektion5. Gentagne anæstesi ved hjælp af pentobarbital bør undgås, da vores erfaring, injektioner med et interval på mindre end en uge resulterede i øget postoperativ mortalitet.

Når du udfører ekkokardiografi i mus med en > 10-Mhz transducer, kvaliteten af billederne skal være tilstrækkelig til at bestemme globale LV funktion. Flere billeder skal tages for hvert dyr at reducere beat-to-beat variationer og bevægelse artefakter. Ekspert rådgivning fra en uddannet hjertespecialist eller en videnskabsmand med erfaring i ekkokardiografi i mus bør stilles i begyndelsen til at vurdere kvaliteten af billederne. De fleste ekkokardiografi maskiner beregne EF fra LV indre diameter ved hjælp af Teicholz formel11,12. Selv når LV dimensioner er let at måle, giver de en ufuldstændig vurdering af LV mængder og områder, fordi LV ikke stemmer overens med nogen ideel, forenklet geometriske form. Hverken fraktioneret afkortning eller udslyngning brøkdel fremstillet med formlen Teicholz er en perfekt parameter for at bestemme LV kontraktile funktion, da de begge er baseret på en geometrisk antagelse og beskrive kontraktilitet af kun to vægge. Uddrivningsfraktion vurderet med biplan Simpsons metode ville være mere korrekt, men det var umuligt at opnå i hvert dyr med det udstyr, der anvendes her.

Efter myokardieinfarkt, vi står over for flere problemer i forbindelse med den ekkokardiografisk billeddannelse. Først, billedkvaliteten var stærkt hæmmet af torakotomi arret. For det andet blev dyr meget mere følsomme for gentagne anæstesi. Endelig, M-mode-baserede LV lydstyrke og funktionen målinger antage, at LV geometri er homogen. Som en konsekvens, bliver brugen af disse indekser mere kontroversielle i overværelse af LV væg bevægelse abnormaliteter efter myokardieinfarkt.

I vores hænder, brug af en 15-MHz sonde lov til lejlighedsvis, men ikke systematiske, optagelse af Doppler billeder. Meget højere frekvenser er nødvendig for at bestemme LV regional funktion eller til at udføre Myokardie kontrast ekkokardiografi, som kun kan opnås med udstyr dedikeret til gnavere12.

Givet yderligere muligheder og højere opløsning af de gnaver-specifikke systemer, bør man overveje, bruge dem i fremtiden. Ulemperne er de højere omkostninger og behovet for en dedikeret plads. Disse high-end, gnaver-dedikeret echocardiographs vil blive profitabel kun hvis nok dyr er omfattet af undersøgelsen og en kritisk antal forskere bruger udstyr. Med den specielle uddannelse udbydes til disse maskiner, kan de bruges af forskere ikke ekspert i kardiologi. Kliniske ekkokardiografi udstyr giver en begrænset opløsning, som nævnt ovenfor. Ikke desto mindre er det stadig med held brugt i forskellige erfarne laboratories11,12; let kan anvendes af dygtige forskere og kardiologer; er mere mobile og mindre krævende på en dedikeret plads; og på grund af det høje antal maskiner, giver mulighed for overvejelse af forskellige muligheder for at reducere omkostninger (f.eks. leje, at opnå udstyr, der ikke er i klinisk brug eller secondhand køb).

Histologiske analyser er den første kritiske punkt at minimere tiden mellem orgel isolation og fiksering af væv. Som i denne protokol, er de fleste farvning og histologiske analyser baseret på overførte lysmikroskopi; fordybelse fiksering af hjertet væv i formalin er tilstrækkelig. Hvis et projekt fokus er mere på fluorescens mikroskopiske farvning, bør man overveje perfusion fiksering af bedøvede dyr til at fjerne de røde blod celler fra vævet, som viser lyse auto-fluorescens.

For at undgå variationer i paraffin indlejring, bruger vi en automatiseret indlejring apparater. Som smeltepunkt og hårdhed varierer mellem mærker af paraffin, anbefaler vi at bruge den samme leverandør i hele undersøgelsen. Paraffin skæring bør udføres på forhånd kølet blokke ved hjælp af en Rotationsmikrotom. Snittykkelsen skal holdes konstant. En 3-µm snittykkelse giver mulighed for klart visualisering af membran grænser i hæmatoxylin-eosin-farvede hjerte afsnit, hvilke er krævede nemlig nøjagtig måling af cardiomyocyte diameter. Som formen af cardiomyocytes er uregelmæssig, skal målingerne udføres på niveauet af kernen. WGA farvning indeholder en alternativ måde at plette cellemembranen og vil resultere i de samme værdier som hæmatoxylin-eosin pletter. Før morfometrisk analyser, man bør klart definere som en del af hjertet (dvs., venstre eller højre ventrikel gratis væg eller septum) vil blive målt og om cardiomyocyte tværsnit bestemmes i den lange eller korte akse. På grund af tværgående, spiral og langsgående retning af cardiomyocytes i hjertet er det muligt at opnå på den samme tværsnit langsgående og tværgående dele af cardiomyocytes. Om længde- eller tværgående diametre måles er et spørgsmål om konvention, så længe cellerne analyseres på niveauet af kernen.

I vores undersøgelser, vi observeret en aftale mellem de ekkokardiografisk dimensioner og hjerte til kropsvægt nøgletal og cardiomyocyte størrelser4,5,6, men histologiske målinger af cardiomyocyte størrelse ikke altid svare til værdierne i ejektionsfraktion. For eksempel, resulterer motion uddannelse i øget hjerte dimensioner, med en velbevaret uddrivningsfraktion og øget cardiomyocyte diameter. Dog er decompensated hjerteinsufficiens karakteriseret ved øget hjerte dimensioner, med en nedsat uddrivningsfraktion og øget cardiomyocyte diameter33. Desuden, vi for nylig viste, at øget hjerte fartøj tæthed på grund af endotel-specifikke overekspression af PPARβ ikke resulterer i forbedret hjertefunktion baseline betingelser, og heller ikke i øget nyttiggørelse efter myokardieinfarkt5 .

For Immunhistokemi er det vigtigt at medtage negative kontroller og udføre forskellige blokerende fremgangsmåden i protokollen. Antigen demaskering trin i protokollen er specifikke for det primære antistof anvendes. For forskellige primære antistoffer er det nødvendigt at fastlægge, om lav eller høj pH demaskering buffere resultere i et bedre signal. Forskellige fiksering teknikker kan bruges til at registrere et bestemt antigen. For eksempel, er Pecam-1 mærkning blevet rapporteret til at virke bedst på zink-fast, paraffin-embedded væv, mens den samme fiksering kræves yderligere skridt til at reducere baggrund for en thrombomodulin antistof34. Dermed, vi bruger regelmæssige formalin fiksering, hvilket er tilladt for at udvide undersøgelsen til en bred vifte af forskellige antigener. Alternativ til Pecam-1 immunfarvning, isolectin B4 er ofte bruges til at visualisere fartøjer. Udover en del i endothelial celler35etiketter isolectin B4 også glia36 og makrofager37. Derudover kan en lang række antigener anvendes til at skelne mellem arterielle og venøse endothelceller38. En elegant måde at visualisere funktionelle perfunderet fartøjer eller til at bestemme fartøj spiring eller regression er intravenøs injektion af fluorescens-tilkoblet lektin efterfulgt af en analyse af snit frosset organmateriale24. Men denne tilgang i høj grad begrænser mulighederne at opdage yderligere antigener og udføre morfometrisk analyser på grund af den forskellige kvalitet af snit frosset organmateriale.

På immunostained sektioner hvor signalet er visualiseret med DAB, kan område tæthed kvantitativt bestemmes ved hjælp af frit tilgængelige ImageJ software. Dog da signalet ikke er lineær, svarer graden af brun farvning ikke nøjagtigt til niveauet af protein udtryk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Arbejdet var støttet af den franske regering (National forskningsagentur, ANR) gennem programmet "Investeringer for the Future" LABEX SIGNALIFE (reference ANR-11-LABX-0028-01) og af tilskud til K. D. W. fra Association pour la Recherche sur le kræft, Fondation de France, og planlægge kræft Inserm. D. B. og A. V. modtaget stipendier fra Fondation pour la Recherche Médicale og byen Nice, henholdsvis. Echocardiograph og transduceren blev venligt leveret af Philips. Vi takker A. Borderie, S. Destree, M. Cutajar-Bossert, A. Landouar, A. Martres, A. Biancardini og S. M. Wagner for deres kvalificerede tekniske bistand.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamine Life Technologies, Molecular Probes W849
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody Vectorlabs BA-1000
Avidin/Biotin Blocking Kit Vectorlabs SP-2001
VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) Vectorlabs PK-6100
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vectorlabs H-1200
SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets Sigma D4168
Hydrogen peroxide solution Sigma H1009
Anti-Pecam-1 (CD31) antibody Abcam ab28364
Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100 Parker
Linear ultrasound probe, L15-7io Philips Healthcare
Echocardiograph, IE33 xMATRIX Philips Healthcare
Microscope, Leica DMi8 Leica
Fluorescence Filterset DAPI Leica 11525304
Filterset TxR Leica 11525310
Digital Camera, SPOT RT3 Color Slider Spot Imaging
Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic Software Spot Imaging
Imaging Computer Dell
Fine Scissors Fine Science Tools 14028-10
Large Scissors Fine Science Tools 14501-14
Scalpel blades Fine Science Tools 10023-00
Graefe Forceps Fine Science Tools 11650-10
Rodent shaver Harvard Apparatus 34-0243
cassettes for paraffin embedding Sakura 4155F
neutral buffered Formalin Sakura 8727
Xylene Sakura 8733
Paraffine TEK III Sakura 4511
automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIP Sakura 6032
paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5 Sakura 5229
microtome blades,Accu-Edge S35 Sakura 4685
microscopy slides, Tissue-Tek Sakura 9533
cover slips, Tissue-Tek Sakura 9582
Mounting medium Tissue-Tek Sakura 1408
slide boxes Sakura 3958
eosine solution Sakura 8703
hematoxyline solution Sakura 8711
microtome, RM2125RT Leica 720-1880 (VWR)
water bath, Leica HI1210 Leica 720-0113(VWR)
Ethanol VWR ACRO444220050
15 ml tubes VWR 734-0451
staining glass dish VWR MARI4220004
staining jars VWR MARI4200005
Incubator Binder 9010-0012
DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets Sigma D4293
PBS (10X) Thermo Fisher Scientific 70011044

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ormandy, E. H., Dale, J., Griffin, G. Genetic engineering of animals: ethical issues, including welfare concerns. Can Vet J. 52 (5), 544-550 (2011).
  2. Karl, T., Pabst, R., von Hörsten, S. Behavioral phenotyping of mice in pharmacological and toxicological research. Exp Toxicol Pathol. 55 (1), 69-83 (2003).
  3. Phoon, C. K., Turnbull, D. H. Cardiovascular Imaging in Mice. Curr Protoc Mouse Biol. 6 (1), 15-38 (2016).
  4. Wagner, N., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor beta stimulation induces rapid cardiac growth and angiogenesis via direct activation of calcineurin. Cardiovasc Res. 83 (1), 61-71 (2009).
  5. Wagner, K. D., Vukolic, A., Baudouy, D., Michiels, J. F., Wagner, N. Inducible Conditional Vascular-Specific Overexpression of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Beta/Delta Leads to Rapid Cardiac Hypertrophy. PPAR Res. 2016, 7631085 (2016).
  6. Ghanbarian, H., et al. Dnmt2/Trdmt1 as Mediator of RNA Polymerase II Transcriptional Activity in Cardiac Growth. PLoS One. 11 (6), e0156953 (2016).
  7. Meguro, T., et al. Cyclosporine attenuates pressure-overload hypertrophy in mice while enhancing susceptibility to decompensation and heart failure. Circ Res. 84 (6), 735-740 (1999).
  8. de Araújo, C. C., et al. Regular and moderate aerobic training before allergic asthma induction reduces lung inflammation and remodeling. Scand J Med Sci Sports. 26 (11), 1360-1372 (2016).
  9. Benavides-Vallve, C., et al. New strategies for echocardiographic evaluation of left ventricular function in a mouse model of long-term myocardial infarction. PLoS One. 7 (7), e41691 (2012).
  10. Colazzo, F., et al. Murine left atrium and left atrial appendage structure and function: echocardiographic and morphologic evaluation. PLoS One. 10 (4), e0125541 (2015).
  11. Pachon, R. E., Scharf, B. A., Vatner, D. E., Vatner, S. F. Best anesthetics for assessing left ventricular systolic function by echocardiography in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308 (12), H1525-H1529 (2015).
  12. Gao, S., Ho, D., Vatner, D. E., Vatner, S. F. Echocardiography in Mice. Curr Protoc Mouse Biol. 1, 71-83 (2011).
  13. Mor-Avi, V., et al. Current and evolving echocardiographic techniques for the quantitative evaluation of cardiac mechanics: ASE/EAE consensus statement on methodology and indications endorsed by the Japanese Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 24 (3), 277-313 (2011).
  14. Collins, K. A., Korcarz, C. E., Lang, R. M. Use of echocardiography for the phenotypic assessment of genetically altered mice. Physiol Genomics. 13 (3), 227-239 (2003).
  15. Rottman, J. N., Ni, G., Brown, M. Echocardiographic evaluation of ventricular function in mice. Echocardiography. 24 (1), 83-89 (2007).
  16. Hart, C. Y., Burnett, J. C., Redfield, M. M. Effects of avertin versus xylazine-ketamine anesthesia on cardiac function in normal mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (5), H1938-H1945 (2001).
  17. Moran, C. M., Thomson, A. J., Rog-Zielinska, E., Gray, G. A. High-resolution echocardiography in the assessment of cardiac physiology and disease in preclinical models. Exp Physiol. 98 (3), 629-644 (2013).
  18. Fayssoil, A., Tournoux, F. Analyzing left ventricular function in mice with Doppler echocardiography. Heart Fail Rev. 18 (4), 511-516 (2013).
  19. Schoensiegel, F., et al. High throughput echocardiography in conscious mice: training and primary screens. Ultraschall Med. 32, Suppl 1. S124-S129 (2011).
  20. Yariswamy, M., et al. Cardiac-restricted Overexpression of TRAF3 Interacting Protein 2 (TRAF3IP2) Results in Spontaneous Development of Myocardial Hypertrophy, Fibrosis, and Dysfunction. J Biol Chem. 291 (37), 19425-19436 (2016).
  21. Jara, A., et al. Cardiac-Specific Disruption of GH Receptor Alters Glucose Homeostasis While Maintaining Normal Cardiac Performance in Adult Male Mice. Endocrinology. 157 (5), 1929-1941 (2016).
  22. Kerr, B. A., et al. Stability and function of adult vasculature is sustained by Akt/Jagged1 signalling axis in endothelium. Nat Commun. 7, 10960 (2016).
  23. Wagner, N., et al. Coronary vessel development requires activation of the TrkB neurotrophin receptor by the Wilms' tumor transcription factor Wt1. Genes Dev. 19 (21), 2631-2642 (2005).
  24. Wagner, K. D., et al. The Wilms' tumour suppressor Wt1 is a major regulator of tumour angiogenesis and progression. Nat Commun. 5, 5852 (2014).
  25. Yang, X. P., et al. Echocardiographic assessment of cardiac function in conscious and anesthetized mice. Am J Physiol. 277 (5 Pt 2), H1967-H1974 (1999).
  26. Rottman, J. N., et al. Temporal changes in ventricular function assessed echocardiographically in conscious and anesthetized mice. J Am Soc Echocardiogr. 16 (11), 1150-1157 (2003).
  27. Quiñones, M. A., et al. Recommendations for quantification of Doppler echocardiography: a report from the Doppler Quantification Task Force of the Nomenclature and Standards Committee of the American Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 15 (2), 167-184 (2002).
  28. van Laake, L. W., et al. Monitoring of cell therapy and assessment of cardiac function using magnetic resonance imaging in a mouse model of myocardial infarction. Nat Protoc. 2 (10), 2551-2567 (2007).
  29. Wagner, K. D., et al. The Wilms' tumor suppressor Wt1 is expressed in the coronary vasculature after myocardial infarction. FASEB J. 16 (9), 1117-1119 (2002).
  30. Wagner, K. D., et al. RNA induction and inheritance of epigenetic cardiac hypertrophy in the mouse. Dev Cell. 14 (6), 962-969 (2008).
  31. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  32. Ruifrok, A. C., Johnston, D. A. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol. 23 (4), 291-299 (2001).
  33. Lazzeroni, D., Rimoldi, O., Camici, P. G. From Left Ventricular Hypertrophy to Dysfunction and Failure. Circ J. 80 (3), 555-564 (2016).
  34. Ismail, J. A., et al. Immunohistologic labeling of murine endothelium. Cardiovasc Pathol. 12 (2), 82-90 (2003).
  35. Benton, R. L., Maddie, M. A., Minnillo, D. R., Hagg, T., Whittemore, S. R. Griffonia simplicifolia isolectin B4 identifies a specific subpopulation of angiogenic blood vessels following contusive spinal cord injury in the adult mouse. J Comp Neurol. 507 (1), 1031-1052 (2008).
  36. Ayoub, A. E., Salm, A. K. Increased morphological diversity of microglia in the activated hypothalamic supraoptic nucleus. J Neurosci. 23 (21), 7759-7766 (2003).
  37. Maddox, D. E., Shibata, S., Goldstein, I. J. Stimulated macrophages express a new glycoprotein receptor reactive with Griffonia simplicifolia I-B4 isolectin. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (1), 166-170 (1982).
  38. dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell Tissue Res. 335 (1), 5-16 (2009).

Tags

Medicin spørgsmål 128 Transgenic mus modeller myokardieinfarkt anæstesi ekkokardiografi systolisk og diastolisk dimensioner histologi paraffinsnit WGA farvning Pecam-1 immunhistokemi morfometrisk analyser
Ekkokardiografisk og histologisk undersøgelse af hjertets morfologi i mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baudouy, D., Michiels, J. F.,… More

Baudouy, D., Michiels, J. F., Vukolic, A., Wagner, K. D., Wagner, N. Echocardiographic and Histological Examination of Cardiac Morphology in the Mouse. J. Vis. Exp. (128), e55843, doi:10.3791/55843 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter