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Bioengineering

डीएनए Semiflexible पॉलिमर का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी उपकरण के रूप में नैनोट्यूब

Published: October 25, 2017 doi: 10.3791/56056
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1, 1,2, 1, 1, 1,2, 2, 1
1Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Institute of Experimental Physics I, Universität Leipzig
* These authors contributed equally

Summary

Semiflexible पॉलिमर अद्वितीय यांत्रिक गुण है कि बड़े पैमाने पर रहने वाले सिस्टम द्वारा लागू कर रहे हैं प्रदर्शित करते हैं । हालांकि, इस तरह बहुलक कठोरता के रूप में गुणों से दुर्गम है के बाद से, पर व्यवस्थित अध्ययन । इस पांडुलिपि का वर्णन कैसे इस सीमा प्रोग्राम डीएनए नैनोट्यूब द्वारा दरकिनार है, रेशा कठोरता के प्रभाव पर प्रयोगात्मक अध्ययन को सक्षम करने ।

Abstract

जटिल के यांत्रिक गुणों, बहुलक आधारित नरम बात है, ऐसे कोशिकाओं या गैर बहुलक नेटवर्क के रूप में, न तो लचीला पॉलिमर के शास्त्रीय फ्रेम और न ही कठोर छड़ के में समझा जा सकता है । अंतर्निहित रेशा उनके गैर लुप्त रीढ़ की जकड़न, जो हठ लंबाई (एलपी) के माध्यम से मात्रा है, लेकिन वे भी मजबूत थर्मल उतार चढ़ाव के अधीन हैं के कारण फैला हुआ रहते हैं । उनके परिमित झुकने कठोरता थोक नेटवर्क के अद्वितीय, गैर तुच्छ सामूहिक यांत्रिकी की ओर जाता है, कम मात्रा भागों में स्थिर पाड़ों के गठन को सक्षम करने, जबकि बड़े मेष आकार प्रदान करते हैं । इस अंतर्निहित सिद्धांत प्रकृति में प्रचलित है (जैसे, कोशिकाओं या ऊतकों में), उच्च आणविक सामग्री को कम करने और इस तरह प्रसार या सक्रिय परिवहन की सुविधा. उनके जैविक निहितार्थ और जैव संगत hydrogels में संभावित तकनीकी अनुप्रयोगों के कारण, semiflexible पॉलिमर काफी अध्ययन के अधीन किया गया है । हालांकि, सुबोध की जांच चुनौतीपूर्ण बनी रही क्योंकि वे प्राकृतिक पॉलिमर पर भरोसा करते हैं, जैसे actin रेशा, जो स्वतंत्र रूप से स्वरित्र नहीं हैं । इन सीमाओं के बावजूद और सिंथेटिक, यांत्रिक स्वरित्र, और semiflexible पॉलिमर की कमी के कारण, actin रेशा आम मॉडल प्रणाली के रूप में स्थापित किया गया था । एक प्रमुख सीमा है कि केंद्रीय मात्रा एलपी स्वतंत्र रूप से macroscopic थोक संरचनाओं पर इसके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए देखते नहीं किया जा सकता है । इस सीमा संरचनात्मक रूप से प्रोग्राम डीएनए नैनोट्यूब को रोजगार, रेशा कठोरता के नियंत्रित परिवर्तन को सक्षम करने से हल किया गया था । वे टाइल आधारित डिजाइन, जहां आंशिक रूप से पूरक किस्में के एक असतत सेट एक असतत परिधि के साथ एक अंगूठी संरचना में संकरण के माध्यम से गठित कर रहे हैं । ये छल्ले सुविधा चिपचिपा समाप्त होता है, लंबाई में कई माइक्रोन रेशा में प्रभावी बहुलकीकरण को सक्षम करने, और प्राकृतिक के रूप में बहुलकीकरण कैनेटीक्स समान पॉलिमर प्रदर्शन । उनके प्रोग्राम यांत्रिकी के कारण, इन ट्यूबों बहुमुखी हैं, उपंयास उपकरण एकल अणु पर एलपी के प्रभाव के रूप में के रूप में अच्छी तरह से थोक पैमाने पर अध्ययन करने के लिए । actin रेशा के विपरीत, वे सप्ताह से अधिक स्थिर रहते हैं, उल्लेखनीय अध कि बिना, और उनके हैंडलिंग तुलना सीधी है ।

Introduction

जटिल उनके अद्वितीय यांत्रिक गुणों द्वारा सक्षम व्यवहार के कारण, semiflexible पॉलिमर बुनियादी रहते मामले के निर्माण ब्लॉकों रहे हैं । लचीला पॉलिमर के विपरीत, semiflexible पॉलिमर एक फैलाया विंयास उनके गैर लुप्त रीढ़ की जकड़न के कारण को अपनाने, जबकि अभी भी मजबूत थर्मल उतार चढ़ाव के अधीन शेष1। इस प्रकार, विशुद्ध रूप से stochastic मॉडल अपने व्यवहार के लिए लागू नहीं किया जा सकता है, के रूप में पूरी तरह से लचीला या कठोर पॉलिमर के चरम के साथ । तथाकथित कीड़ा की तरह चेन मॉडल2,3,4 एलपी, जो रेशा4के साथ स्पर्श-स्पर्श सहसंबंध का क्षय निरंतर है के माध्यम से इस कठोरता को बढ़ाता था । एलपी रेशा के समोच्च लंबाई (एलसी) के लिए तुलनीय है, तो बहुलक semiflexible1माना जाता है । एक तंबू के डंडे के अनुरूप, नेटवर्क या बंडलों में उनकी व्यवस्था कम मात्रा भागों में पूरे सामूहिक प्रणाली स्थिर, असामांय viscoelastic गुण के लिए अग्रणी5,6,7, 8,9. इन संरचनाओं बड़े जाल पर उच्च लोच प्रदान10आकार, यांत्रिक अखंडता को बनाए रखने जबकि अभी भी प्रसार और सक्रिय परिवहन प्रक्रियाओं की सुविधा. यह गुण cytoskeleton या extracellular मैट्रिक्स जैसे जैविक प्रणालियों के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है, लेकिन यह भी व्यापक रूप से खाद्य अभियांत्रिकी1,11,12में प्रयोग किया जाता है ।

उनके महत्व से परे रहने वाले मामले में जा रहे हैं, यह व्यापक इन संरचनाओं के भौतिक गुणों की जांच के लिए उपकरण के लिए biomimetic सामग्री या उपंयास hydrogels विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है । semiflexible पॉलिमर के संदर्भ में, इस तरह के एलपी और एक वर्णनात्मक सैद्धांतिक ढांचे के विकास के रूप में एकल रेशा गुणों से उत्पन्न नेटवर्क के सामूहिक गुणों के व्यवस्थित निर्धारण का तात्पर्य है । अग्रणी अध्ययन में, सेलुलर, बहुलक actin semiflexible पॉलिमर के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में स्थापित किया गया था और अभी भी व्यापक रूप से माना जाता है सोने के मानक5,13,14,15 , 16 , 17. हालांकि, संपूर्ण अध्ययन इस प्रणाली के साथ सीमित है क्योंकि वे इस प्रोटीन के निहित गुणों के लिए बाध्य कर रहे हैं । विभिंन सैद्धांतिक दृष्टिकोण गैर तुच्छ यांत्रिक व्यवहार के एकल रेशा स्तर पर एक विवरण के निर्माण के उद्देश्य से है और विशेष रूप से अलग रैखिक लोचदार पठार कतरनी मापांक, जी की निर्भरता के लिए पूर्वानुमान स्केलिंग के लिए नेतृत्व किया है 0 (यानी, नेटवर्क की "लोच"), एकाग्रता के संबंध में (ग) और एलपी6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. जबकि एकाग्रता स्केलिंग actin-आधारित या अन्य मॉडल प्रणालियों के साथ प्रयोगों में आसानी से सुलभ है और सैद्धांतिक भविष्यवाणियों कड़ाई से सत्यापित किया गया है13,16,24, 25, lp के संबंध में स्केलिंग का प्रयोग दुर्गम बना हुआ है । यह, तथापि, के बाद से एक प्रमुख सीमा है पी भी एक स्वतंत्र चर है कि semiflexible पॉलिमर की मात्रा को परिभाषित है ।

यह केंद्रीय, प्राकृतिक actin के फिक्स्ड एलपी या अंय जैविक रूप से प्राप्त पॉलिमर जैसे कोलेजन के द्वारा लगाया हाल ही में टाइल-आधारित डीएनए ट्यूबों को रोजगार, जो उनके यांत्रिक गुणों में स्वरित्र है द्वारा हल किया गया है 9 , 26 , 27 , 28. ट्यूबों के आर्किटेक्चर में मामूली बदलाव (उदाहरण के लिए, इकाई की अंगूठी के भीतर घटक डीएनए किस्में के विभिंन नंबरों) एलपी, जो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है के लिए अलग मूल्यों उपज, या तो एक उतार-चढ़ाव ट्यूब का विश्लेषण करके या कई का पालन ट्यूबों के घुमावदार विंयास का मूल्यांकन करके, जैसा कि पहले9,28वर्णित है । इन विश्लेषणों से पता चला कि एलपी मूल्यों के विभिंन ट्यूब आबादी के परिमाण के एक से अधिक आदेश पर भिंन है और है कि विभिंन मूल्यांकन तकनीक अनुरूप परिणाम9,28उपज ।

आश्चर्य की बात है, रैखिक लोचदार पठार कतरनी मापांक जी0 एकाग्रता और एलपी के संबंध में के समग्र स्केलिंग सभी पिछले सैद्धांतिक दृष्टिकोण के साथ असंगत होने की सूचना दी गई है 9, विशेष रूप से एक बहुत मजबूत प्रदर्शन से एलपीपर निर्भरता की भविष्यवाणी की । इन निष्कर्षों को semiflexible पॉलिमर के केंद्रीय गुणों का अध्ययन करने के लिए एक नए मॉडल प्रणाली के मूल्य पर जोर दिया । n-कुण्डल डीएनए ट्यूब रोजगार नाटकीय रूप से इन जांचों के दायरे व्यापक । न केवल एलपी बुनियादी सामग्री को बदलने के बिना स्वतंत्र रूप से विविध सकता है, लेकिन डीएनए के निहित प्रोग्राम प्रकृति crosslinks या काइनेटिक स्विचन प्रक्रियाओं के रूप में अतिरिक्त तत्वों, के व्यवस्थित परीक्षा सक्षम कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, इन ट्यूबों पानी में घुलनशील है और, सबसे अधिक प्रोटीन के विपरीत में, कई हफ्तों के लिए पर्याप्त पीएच और ईओण की शर्तों में स्थिर, बिना पता लगाने योग्य गिरावट9।

इन ट्यूबों को इकट्ठा करने के लिए, डीएनए oligonucleotides का एक असतत सेट का उपयोग किया जाता है, जिनमें से प्रत्येक दो डोमेन है कि शेयर पूरक आधार अनुक्रम दो पड़ोसी किस्में (विशिष्ट दृश्यों के कारण, एक भी किनारा संरचनाओं जैसे हेयर पिन के रूप में नहीं कर सकते हैं) शामिल हैं । पूरक अनुक्रम एक चक्रीय तरीके में संकरण, संलग्न बनाने, n परस्पर डबल पेचदार क्षेत्रों (आंकड़ा 1a और बी) के आधा अतिव्यापी छल्ले । ये छल्ले एक असतत व्यास पर फार्म (चित्रा 1C), और उनके आधे अतिव्यापी विंयास उजागर अक्षीय चिपचिपा एक और अंगूठी के चिपचिपा छोर के पूरक समाप्त होता है । मिलान oligonucleotides के इस चयनात्मक इसके अलावा छल्ले के stacking ट्रिगर, आकार n (nएचटी) के रेशा डीएनए कुंडलित ट्यूबों के प्रभावी बहुलकीकरण के लिए अग्रणी । उनके समोच्च लंबाई आम तौर पर लंबाई में कई माइक्रोन उपाय है, और उनकी लंबाई वितरण actin रेशा के लिए तुलनीय है9,26,27,28. यह इसी तरह के डीएनए नैनोट्यूब के लिए दिखाया गया है कि वे वास्तव में actin रेशा और microtubules के उन लोगों के समान बहुलकीकरण कैनेटीक्स प्रदर्शनp class = "xref" > 29. व्यक्तिगत डीएनए की संख्या n के आधार पर बुनियादी अंगूठी संरचना बनाने किस्में, एनएचटी वास्तुकला, साथ ही इसकी परिधि और व्यास, नियंत्रित किया जा सकता है विविध । अधिक डीएनए किस्में के छल्ले की परिधि बढ़ जाती है का उपयोग करना/, और इसी वास्तु परिवर्तन उच्च एलपी मूल्यों (चित्रा 1C), एक उच्च कठोरता के लिए इसी यांत्रिक गुणों बदलाव । mesoscopic स्केल पर, ये बड़ा एलपी मान उच्च कठोरता ( चित्रा 1 डी और ई) के कारण कम तुला अनुरूपता में अनुवाद ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. तैयारी n HTs

< p class = "jove_content" > नोट: यहां, n अलग एकल डीएनए एक निश्चित आकार का कुंडलित ट्यूबों के गठन में शामिल किस्में की संख्या का अर्थ है । के लिए n = 8, आठ अलग एकल डीएनए किस्में एक इकाई की अंगूठी बनाते हैं ।

  1. एक उपयुक्त डीएनए संश्लेषण सेवा से डीएनए अनुक्रम (HPLC शुद्धता ग्रेड या उच्चतर) की खरीद या उच्च गुणवत्ता वाले संश्लेषण और शुद्धि (अनुकरणीय अनुक्रम तालिका 1 में दिया) प्रदर्शन.
  2. पुनर्स्थगित lyophilized oligonucleotides शुद्ध पानी में और आगे resuspension कंपनी से संबंधित मैनुअल में दिए गए चरणों का पालन करें । २०० के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पानी की मात्रा को समायोजित करें & #181; M.
  3. एक डीएनए किस्में की सांद्रता निर्धारित करने के लिए वितरक द्वारा दिए गए मूल्यों को सत्यापित करने के लिए ( उदाहरण के लिए, २६० एनएम पर यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से ) के बाद से सटीक stoichiometry विधानसभा प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है । oligonucleotides की एकाग्रता की गणना, खाते में विशिष्ट दाढ़ वजन और प्रत्येक एकल असहाय डीएनए oligonucleotide.
    के लिए विलुप्त गुणांक ले जा नोट: विलुप्त गुणांक मान स्वाभाविक रूप से भिन्न अनुक्रम के लिए भिन्न होते हैं और व्यावसायिक रूप से खरीदे गए डीएनए के दस्तावेज़ीकरण में कहा गया है. वे भी निकटतम-पड़ोसी मुक्त रूप से उपलब्ध ऑनलाइन उपकरण के एक नंबर का उपयोग कर मॉडल के अनुसार गणना की जा सकती है । स्पेक्ट्रोमीटर की रेखीय श्रेणी के साथ अनुपालन करने के लिए, एकाग्रता निर्धारण के लिए उपयोग किया गया नमूना कमजोर पर विचार करें.
    4. एक micropipette का उपयोग
  4. , डीएनए किस्में मिश्रण-एक ही एकाग्रता में-एक thermocycler के लिए उपयुक्त कंटेनर में ( जैसे, a २०० & #181; L पीसीआर ट्यूब) वांछित n HTs (अंतिम बफर शर्तों: 1xTE (10 मिमी Tris और 1 मिमी EDTA, पीएच 8) फार्म करने के लिए और १२.५ मिमी MgCl 2 ).
    नोट: अंतिम डीएनए एन एचटी नमूनों से मिलकर n -1 कतरास, यू 1 & #8722; भ n & #8722; 1 , व वन T n कतरा. प्रति कतरा एकाग्रता उप-micromolar से अधिक से अधिक 10 & #181; m, उपयोगकर्ता की आवश्यकताओं के आधार पर भिन्न हो सकते हैं ( उदा., & #60; 1 & #181; बाद के कमजोर पड़ने के लिए मीटर प्रति किनारा एकल रेशा या उच्च सांद्रता के निरीक्षण के लिए परीक्षा के लिए घने नेटवर्क यांत्रिकी).
  5. संकरण ने n HTs में एक thermocycler (विकार के लिए 10 मिनट पर ९० & #176; c, के साथ ६५ & #176 को बाद में तुरंत छोड़ दें; c; धीमे तापमान में कमी से ६५ & #176; c से ५५ & #176; c, पूरक आधार युग्मन के साथ-30 मिनट के लिए-०.५ K के 20 तापमान चरणों में प्रत्येक; और ५५ & #176; ग से 20 & #176; ग) से शीघ्र गिरा; see < सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्र 2a .
    नोट: ६५ & #176; C से धीमे घटाएं चरण औसत ट्यूब लंबाई बढ़ाने के लिए लंबा हो सकता है; हालांकि, बाद में त्वरित ड्रॉप करने के लिए 20 & #176; C बहुलक ट्यूबों के एकत्रीकरण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है.
  6. स्टोर के संकरित n HTs पर 3 सप्ताह तक 4 & #176; ग बिना detectable ह्रास के ।
    नोट: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए, लेबल n HTs (आंशिक रूप से) संशोधित U1-U1 (Cy3 तालिका 1 ) के साथ प्रतिस्थापन द्वारा संकरे हैं । अब अवलोकन समय के लिए, स्थापित विरोधी ब्लीचिंग एजेंटों के अलावा सलाह दी जाती है ।
  7. ध्यान से वांछित अंतिम एकाग्रता के लिए नमूना पतला ( जैसे, 4 & #181; नेटवर्क या एकल-रेशा टिप्पणियों के लिए 20 एनएम के लिए एम) नमूना बफ़र का उपयोग कर, यदि आवश्यक हो तो. संभव त्रुटि स्रोतों को कम करने के लिए, वांछित अंतिम एकाग्रता पर नमूने इकट्ठा ।
< p class = "jove_title" > 2. कतरनी Rheology

  1. गतिशील कतरनी rheometer के लिए एक उपयुक्त ज्यामिति (थाली-प्लेट या शंकु-प्लेट) चुनें । छोटे खंडों के लिए ( अर्थात, नीचे २०० & #181; L), कोन-प्लेट ज्यामिति का प्रयोग करें ।
  2. गतिशील कतरनी rheometer.
    3. पर नमूना लोड
  3. Passivate संभावित वाष्पीकरण प्रभाव को रोकने के लिए निम्न चरणों का उपयोग करके नमूना और वातावरण का हवा-पानी इंटरफेस.
    1. नमूना बफर स्नान के २.५ मिलीलीटर के साथ नमूना चारों ओर ।
    2. एक surfactant बस micelle एकाग्रता के नीचे जोड़ें ।
    3. एक हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग करने के लिए एक लिपिड के साथ नमूना चारों ओर से बचने के लिए हवा के साथ नमूने के सीधे संपर्क.
  4. एक गीला स्पंज के साथ सुसज्जित टोपी के साथ नमूना चैंबर सील और, यदि संभव हो तो, एक अतिरिक्त पानी स्नान के साथ (नमूना के साथ संपर्क में नहीं) आगे वाष्पीकरण को दबाने के लिए.
  5. कक्ष के तापमान पर rheometer-विशिष्ट सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके माप प्रारंभ करें; वैकल्पिक रूप से, भिन्न तापमान पर माप निष्पादित करें, जैसे ३७ & #176; C (यदि शारीरिक स्थितियों की आवश्यकता हो).
    नोट: नमूना ठंडा अक्सर आसपास के हवा से पानी भाप के संघनित्र के साथ है, जबकि हीटिंग बढ़ाया वाष्पीकरण की ओर जाता है । दोनों प्रभाव अनियंत्रित नमूना की एकाग्रता बदल सकते हैं, तो एक श्रृंखला में सभी माप एक स्थिर तापमान पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।
  6. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए equilibrate नमूना अनुमति देते हैं । समय विकास एक समय झाडू के साथ नजर रखी जा सकता है (प्रति मिनट एक डेटा बिंदु; तनाव & #947; = 5%; कव च = 1 Hz).
  7. वांछित परीक्षण प्रोटोकॉल के साथ यांत्रिक गुणों को मापने । आवृत्ति राज्यभर ( f -राज्यभर) की एक श्रृंखला के साथ शुरू क्योंकि वे नमूना बरकरार छोड़ देते हैं और अधिक माप के लिए अनुमति देते हैं ।
    नोट: इसके अलावा, कम f -राज्यभर से पहले और लंबे समय तक माप के बाद किया जाना चाहिए (जैसे लंबी f -एक बहुत उच्च संकल्प के साथ राज्यभर) सत्यापित करने के लिए कि नमूना पूर्ण माप प्रोटोकॉल भर में अपरिवर्तित बनी रही.
    1. प्रदर्शन एक अल् च -झाडू ( उदा, & #947; = 5%; f = ०.०१ हर्ट्ज से 30 हर्ट्ज; प्रति दशक 5 डेटा अंक).
    2. प्रदर्शन एक दीर्घ च -झाडू ( उदा., & #947; = 5%; f = ०.००१ हर्ट्ज से 30 हर्ट्ज; 21 प्रति दशक डेटा अंक); माप समय कम करने के लिए आवश्यक नहीं है, तो कम आवृत्ति शासन का लोप किया जा सकता है ।
    3. प्रदर्शन एक अल् च -झाडू.
    4. प्रदर्शन a & #947;-झाडू ( उदा., f = 1 हर्ट्ज; & #947; = ०.०१२५% से १००%; प्रति दशक 20 डेटा अंक).
      नोट: पहले लघु f -स्वीप का उपयोग करें, क्योंकि यह आमतौर पर पिछले f -राज्यभर के साथ असंगत है क्योंकि नेटवर्क आमतौर पर & #947 के दौरान टूटना;-झाडू या प्लेटों से अलग । वैकल्पिक रूप से, उपयोग & #947;-रैंप ( उदा., = ०.०२५ s -1 , t = ६० s); हालांकि, रैंप आमतौर पर मोटर मोड बदलने की आवश्यकता है, तो बाद में लघु f -झाडू ूःतुत किया जाएगा ।
  8. बिन और/या एक गाऊसी कर्नेल के साथ कच्चे डेटा चिकनी ।
< p class = "jove_title" > 3. डीएनए के प्रतिदीप्ति-असिस्टेड एनालिसिस एनीलिंग

  1. तैयार 8 aliquots के 12 & #181; L का उपयोग कर प्रत्येक नमूने के लिए 1-4 & #181; मी डीएनए प्रति कतरा, १२.५ mM MgCl 2 में 1x ते बफर, और 1x न्यूक्लिक एसिड जेल से सना एक 10, 000x DMSO शेयर. कोई डीएनए के साथ एक नकारात्मक नियंत्रण बनाओ, लेकिन न्यूक्लिक एसिड जेल दाग शामिल हैं ।
  2. एक वास्तविक समय पीसीआर प्लेट के लिए aliquots हस्तांतरण और चिपकने वाली फिल्म के साथ सील ( उदा, एक ९६ अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेट).
    नोट: उच्च तापमान थर्मल एनीलिंग प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया नमूने लुप्त हो जाएगा । इस प्रकार, सुनिश्चित करें कि कुओं कसकर चिपकने वाली फिल्म के साथ बंद कर रहे है पानी के वाष्पीकरण और एकाग्रता में वृद्धि को रोकने के लिए, विशेष रूप से दीर्घकालिक प्रयोगों के दौरान ।
  3. गैस बुलबुले को दूर करने के लिए कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए १०० x g पर प्लेट केंद्रापसारक; यदि गैस के बुलबुले का विस्तार, कुओं का विश्लेषण नहीं किया जा सकता है ।
  4. एक वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर प्रणाली में सील प्लेट लोड ।
  5. एक एनीलिंग प्रोग्राम चलाते हैं । ९० & #176 पर डीएनए को विकृत कर दें; 10 मिनट के लिए सी. तापमान को जल्दी छोड़ दें ७२ & #176; सी. फिर, तापमान में कमी से धीरे ०.५ & #176; C हर 30 मिनट. सिग्नल खोखली होने के बाद, तापमान में तेजी लाएं रैंप ।
    नोट: ७२ & #176; C पर्याप्त रूप से वास्तविक संकरण तापमान से ऊपर है; इस प्रकार, संकेत एक व्यापक तापमान रेंज आवश्यक तापमान रेंज निर्धारित करने के लिए उपयुक्त पर दर्ज की गई है ।
  6. सुनिश्चित करें कि साइकिल चालक के ढक्कन कम से १०० करने के लिए तपता & #176; सी चिपकने वाला फिल्म पर सुखाया नमूना के संघनित्र को रोकने के लिए ।
    7. विधानसभा के दौरान
  7. , ४८८ एनएम में एक आर्गन आयन लेजर के साथ नमूनों को उत्तेजित और ५५० एनएम पर प्रतिदीप्ति का पता लगाने जब एक न्यूक्लिक एसिड जेल दाग का उपयोग कर (या वर्णक्रम के समान) । अंय रंगों के लिए, एक उपयुक्त उत्तेजना/उत्सर्जन संयोजन चुनें । निर्मित कैमरे का उपयोग कर समग्र सिग्नल गुणवत्ता में वृद्धि करने के लिए जितनी बार संभव हो प्रतिदीप्ति संकेत को मापने.
    नोट: यहां, माप हर 9 एस
    8. लिया गया
  8. यदि पूर्व निर्धारित पिघलने और एनीलिंग कार्यक्रमों को लागू कर रहे हैं, प्रदान की सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए डेटा का विश्लेषण । यदि नहीं, तो फ्लोरोसेंट संकेत के सापेक्ष परिवर्तन प्राप्त करने के लिए प्रत्येक तापमान कदम के लिए मतलब मूल्य से पिछले मतलब मूल्य घटाना ।
< p class = "jove_title" > 4. AFM इमेजिंग

  1. सट मीका ( उदा., मीका & #34; V1 & #34;) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चिपकने वाला टेप अनुलग्न करके और उसे रिप कर रहा है; मीका की ऊपरवाला परत निकल जानी चाहिए ।
  2. एक micropipette का उपयोग कर, जमा पूर्व n एचटी का गठन मिलीग्राम 2 + में हौसले से सट मीका पर तह बफर युक्त और इसे 10 मिनट के लिए व्यवस्थित ।
  3. कम 3-s अंतराल में नमूने स्पिन एक छोटी सी मेज पर २,००० x g पर शेष तरल को दूर करने के लिए केंद्रापसारक । कई n HTs अभी भी मीका सतह से जुड़ा होना चाहिए ।
  4. एक उच्च कठोरता ( जैसे, ५४ एनएम -1 ) के साथ एक ब्रैकट टिप का उपयोग करें और आंतरिक AFM सॉफ्टवेयर के साथ अपनी प्रतिध्वनि आवृत्ति का निर्धारण ।
  5. कम स्कैन दरों पर मोड दोहन में हवा में AFM के साथ ऊंचाई प्रोफ़ाइल रिकॉर्ड ( उदा, 1 लाइन/ n HTs.
    6. के लिए हानिकारक या स्थान बदलने से बचने के लिए

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Representative Results

एक तापमान रैंप के माध्यम से डीएनए नैनोट्यूब के विधानसभा (चित्रा 2) इन कृत्रिम semiflexible पॉलिमर के रूप में एक बहुत ही विश्वसनीय तरीका है । इन पॉलिमर उनके स्वाभाविक रूप से होने वाले समकक्षों, जैसे actin रेशा के लिए तुलनीय विशेषताओं है, लेकिन उनके यांत्रिक गुणों को नियंत्रित किया जा सकता है के बाद से एक बहुत व्यापक प्रयोगात्मक ढांचा प्रदान9,27 . जैसे कि, वे नेटवर्क में व्यवस्थित किया जा सकता है (चित्रा 3) और विशेष रूप से एक थोक संरचनाओं और संपत्तियों पर रेशा कठोरता के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए अनुमति देते हैं । के रूप में चित्रा 4में दिखाया गया है, इन नेटवर्क उपभेदों के लिए एक रैखिक तनाव के शासन को प्रदर्शित 10% है, जो बारीकी से actin रेशा के नेटवर्क की विशेषताओं जैसा दिखता है । इस शासन के भीतर, रैखिक कतरनी rheology आसानी से लागू किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, डीएनए नैनोट्यूब नेटवर्क के लोचदार और चिपचिपा प्रतिक्रिया निर्धारित करने के लिए अलग आवृत्तियों पर जांच की9. इन परीक्षणों से पता चलता है कि उन नेटवर्क मुख्यतः लोचदार व्यवहार (चित्रा 5) । इसके विपरीत में प्रोटीन के साथ माप करने के लिए, इन ट्यूबों के नमूने के हवा पानी इंटरफेस पर स्वभाव नहीं है और इसलिए, परिष्कृत passivation रणनीतियों (चित्रा 6) की आवश्यकता है. इसलिए, नमूनों की हैंडलिंग बल्कि सीधा है और बहुत मजबूत साबित किया है, कम नमूना-नमूना विविधताओं के साथ सुसंगत परिणाम उपज ।

हालांकि, के सवाल है कि मुक्त "चिपचिपा समाप्त होता है" एक ट्यूब के दोनों सिरों पर एक असहाय डीएनए के अंत में अनचाहे पैदा कर सकते हैं, stochastic संकरण घटनाओं बनी रही । इस चिंता का पता करने के लिए, पूरक "अंत कैप" दृश्यों ट्यूब के सिरों को कवर नमूना करने के लिए जोड़ा गया संकरण प्रक्रिया पूरी होने के बाद । हालांकि, चित्रा 7 दिखाता है कि रेशा के सिरों कैपिंग कोई पता लगाने का प्रभाव है और ट्यूब समाप्त होता है नेटवर्क9में किसी भी क्षणिक crosslinking प्रभाव प्रेरित नहीं है । चिपका घटनाओं केवल एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते है जब नमूना भी मोटे तौर पर संभाला है और ट्यूबों कठोर pipetting के कारण तोड़ । ये टूटना अंक वास्तव में crosslinking प्रभाव पैदा करने के लिए, इस तरह के तनाव stiffening (चित्रा 8) के रूप में प्रणाली के गैर रेखीय प्रतिक्रियाओं के लिए अग्रणी दिखाई देते हैं ।

यदि नमूनों को सावधानीपूर्वक तैयार किया जाता है, तो इनका प्रभाव परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि या तो रेशा एकाग्रता (फिगर 9A) या रेशा कठोरता (फिगर 9B)9 के साथ मिलकर नेटवर्क के यांत्रिक गुणों पर semiflexible पॉलीमर्स । पहली बार के लिए, रेशा कठोरता और नेटवर्क लोच के बीच मात्रात्मक संबंध का अध्ययन किया गया था प्रयोग और व्यवस्थित, एक रैखिक शक्ति कानून व्यवहार है, जो प्रमुख सैद्धांतिक भविष्यवाणियों विरोधाभासों उपज । ये परिणाम वर्णन करता है कि डीएनए नैनोट्यूब एक नया, बहुमुखी उपकरण semiflexible पॉलिमर के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए कर रहे हैं, जो पूर्व में प्रयोग किया जाता9,27दुर्गम थे. अब, विभिंन सिद्धांतों का परीक्षण किया जा सकता है, तंतुओं के हठ लंबाई एलपी पर निर्भरता के बारे में बयानों को शामिल । इसके अतिरिक्त, बहुत मौलिक प्रभाव, जैसे कि reptation (चित्र 10), ट्यूब को रोजगार के द्वारा विभिंन दृष्टिकोण से जांच की जा सकती है कि कठोरता में बदलती हैं ।

नाम अनुक्रम
U1: a1 *-b1 *-a2-b2 GGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT
U1-Cy3: a1 *-b1 *-a2-b2 Cy3-TTGGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT
U2: a2 *-b2 *-a3-b3 GGATCTAAAGG-ACCAGATACA-CCACTCTTCC-TGACATCTTGT
U3: a3 *-b3 *-a4-b4 GGAAGAGTGG-ACAAGATGTCA-CCGTGAGAACC-TGCAATGCGT
U4: a4 *-b4 *-a5-b5 GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCGCACGACC-TGTTCGACAGT
U5: a5 *-b5 *-a6-b6 GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCAACGATGCC-TGATAGAAGT
U6: a6 *-b6 *-a7-b7 GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-ATGCACCTCC-AGCTTTGAATG
U7: a7 *-b7 *-a8-b8 GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-AACGGTAACTA-TGACTTGGGA
U8: a8 *-b8 *-a9-b9 TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-AACACTAGAC-ACATGCTCCTA
U9: a9 *-b9 *-a10-b10 GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CGAGACTACAC-CCTTGCCACC
U10: a10 *-b10 *-a11-b11 TGTAGTCTCGG-GTGGCAAGGG-TACTACCGCT-CCATTAAGAAT
U11: a11 *-b11 *-a12-बी १२ AGCGGTAGTA-ATTCTTAATGG-ATCCGTCTATC-TACACTATCA
U12: a12 *-बी १२ *-a13-b13 ATAGACGGATT-GATAGTGTAG-AGACGAAATC-AGCAGAACTAA
U13: a13 *-b13 *-a14-b14 GATTTCGTCT-TTAGTTCTGCT-CTGCGAAGTAA-TCAGCCGAGC
टी-4: a4 *-b4 *-a1-b1 GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T5: a5 *-b5 *-a1-b1 GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T6: a6 *-b6 *-a1-b1 GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T7: a7 *-b7 *-a1-b1 GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T8: a8 *-b8 *-a1-b1 TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T9: a8 *-b8 *-a1-b1 GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T10: a10 *-b10 *-a1-b1 GTGTAGTCTCG-GGTGGCAAGG-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T14: a14 *-b14 *-a1-b1 TTACTTCGCAG-GCTCGGCTGA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
अंत कैप A1 CCTAATCGCC
कैप A2 समाप्त करना CCTTTAGATCC
अंत कैप A3 CCACTCTTCC
अंत कैप A4 CCGTGAGAACC
अंत कैप A5 CCGCACGACC
अंत कैप A6 CCAACGATGCC
अंत कैप A7 ATGCACCTCC
एंड कैप A8 AACGGTAACTA
अंत कैप B1 * ACGCTAAGCCA
अंत कैप B2 * ACCAGATACA
अंत कैप B3 * ACAAGATGTCA
अंत कैप B4 * ACGCATTGCA
अंत कैप B5 * ACTGTCGAACA
अंत कैप बी-6 * ACTTCTATCA
अंत कैप B7 * CATTCAAAGCT
अंत कैप B8 * TCCCAAGTCA

तालिका 1: चित्र 1C में प्रदर्शित nHTs के संकरण के लिए डीएनए अनुक्रम का उदाहरण है , जो nHTs9पर पिछले अध्ययनों में उपयोग किया गया था, class = "xref" > 26,27,28. दृश्यों का दिया सेट सात अलग ट्यूब आर्किटेक्चर (जैसे, a1 hybridizes पूरक अनुक्रम a1 *) के विधानसभा के लिए अनुमति देता है । अंय ट्यूब यहां नहीं दिया आर्किटेक्चर भी कतरा के अतिरिक्त या उपcyclization के साथ किनारा एन यू1के साथ के अनुसार के साथ गठन किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: ट्यूब विधानसभा और वास्तुकला । (क) एक 4HT चार अलग ४२-mers के गठन की विधानसभा की योजनाबद्ध । 10-11 ठिकानों के सतत बारी डोमेन के माध्यम से संकरण आसंन एकल असहाय डीएनए किस्में, लंबे काले ticks द्वारा संकेत (छोटे काले ticks संकरी ठिकानों से संकेत मिलता है) । यह आधा चौंका देने वाली आकृति सुविधाओं चिपचिपा धुरी के साथ दोनों पक्षों पर समाप्त होता है, अक्षीय विकास को सक्षम करने, तीर से संकेत दिया । सीमा किस्में U1 और टी-4 भी पूरक डोमेन सुविधा और इस प्रकार एक बंद अंगूठी फार्म, के रूप में सही तीर से संकेत दिया । ध्यान दें कि इस स्केच एक 2d प्रतिनिधित्व है; संकरी अवस्था में कतरास फार्म डबल helices और सभी कुर्सियां बनती हैं । (ख) अर्ध-दो डबल छायांकित सुदूर परत में कवर helices के साथ एक 4HT tetramer के 3 डी योजनाबद्ध । पूरक डोमेन के लिए डबल helices फार्म और एक इकाई लंबाई तत्व प्रति एक बार ट्यूब के दोनों आसंन डबल helices से जुड़े हुए हैं । एक U2 किनारा स्पष्टता के लिए मोटा तैयार है । (ग) सात अलग ट्यूब वास्तुकला के उदाहरण दिए गए हैं, कतरा संख्या के साथ 4 एचटी से लेकर 14 एचटी और एलपी से लेकर १.२ 26 µm. (डी और ई) महामारी-फ्लोरोसेंट छवियों की Cy3-लेबल, adsorbed 5 एचटी और 10 एचटी अलग घुमावदार आकृति के माध्यम से विभिंन stiffnesses वर्णन । लाल ओवरले छवि विश्लेषण के माध्यम से पाया रेशा समोच्च है, अंत करने के लिए अंत दूरी आर और समोच्च लंबाई एलसी। चित्रा Schuldt एट अल9से अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: तापमान रैंप और डीएनए नैनोट्यूब के इसी विधानसभा । (क) डीएनए नैनोट्यूब एक thermocycler में लगभग 11 ज. (ख) एक वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर प्रणाली में कई अलग तापमान कदम युक्त प्रोटोकॉल के माध्यम से इकट्ठे हुए हैं, दाग किस्में के फ्लोरोसेंट संकेत के सापेक्ष परिवर्तन नव गठित दोहरे फंसे डीएनए के लिए एक उपाय है, जबकि तापमान रैंप के माध्यम से जा रहा है । डीएनए नैनोट्यूब के प्रकार के आधार पर, विधानसभा दर अलग कर सकते हैं । अधिक जटिल बनाने संरचना, व्यापक विधानसभा, संभवतः के बाद से अधिक किस्में (और इसलिए अलग दृश्यों और स्थानीय एनीलिंग तापमान के साथ अधिक क्षेत्रों) के लिए उपयुक्त पदों पर संकरण की जरूरत है, एक प्रक्रिया है जो द्वारा संचालित है stochastic थर्मल उतार चढ़ाव । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3:8HTs के एक उलझ नेटवर्क के प्रतिनिधि AFM छवि पर 4 µ एम । 8HTs एक अभ्रक की सतह को अवशोषित के एक अनुरूप नेटवर्क की ऊंचाई प्रोफ़ाइल हवा में दोहन मोड का उपयोग कर दर्ज की गई थी । AFM छवियों नेटवर्क के एक 2d प्रक्षेपण कल्पना लेकिन डेटा के विश्वसनीय निष्कर्षण के लिए अनुमति नहीं है (उदा, 3 डी मामले के लिए जाल आकार) ट्यूबों के रूप में के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नेटवर्क एक 2d विंयास में संकुचित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: रेखीय श्रेणी. तनाव माप (G' = 1 हर्ट्ज) एक व्यापक रैखिक लोचदार पठार प्रकट, जैसे crosslinking प्रभाव के संकेत के बिना गैर रेखीय व्यवहार के रूप में प्रकट तनाव कठोर. एक विशेषता तनाव से ऊपर (प्रत्येक nएचटी के लिए अलग), लोचदार पठार मापांक बंद टूट जाता है अचल । त्रुटि सलाखों के सभी प्रदर्शन माप का मतलब मूल्य के मानक विचलन प्रतिनिधित्व करते हैं । चित्रा Schuldt एट अल9से अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: एक उलझ 6HT नेटवर्क के ठेठ आवृत्ति निर्भरता । डीएनए ट्यूबों के नेटवर्क परिमाण के चार आदेश पर एक व्यापक लोच पठार, लागू आवृत्ति के आधार पर दिखाते हैं । एक बहुलक नेटवर्क के लिए अपेक्षित के रूप में, जटिल कतरनी मापांक के लोचदार भाग (g) चिपचिपा भाग (जी' ') से काफी अधिक है । चित्रा Schuldt एट अल9से अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6: कोई एयर-लिक्विड इंटरफ़ेस प्रभाव. फ्रीक्वेंसी राज्यभर (f-राज्यभर; γ = 5%) 8 µ मीटर पर 8HT नमूनों में से पता चला है कि हवा में वाष्पीकरण और जमाना प्रभाव के प्रभाव-पानी इंटरफ़ेस नगण्य हैं । अलग equilibration बार, के रूप में अच्छी तरह के रूप में दो तरीके काफी इंटरफ़ेस (सर्फेक्टेंट और लिपिड), पर clustering प्रोटीन कम करने के लिए जाना जाता था । विधि से स्वतंत्र, वाष्पीकरण या सतह लोच द्वारा कठोर प्रभावों का कोई संकेत दर्ज किया गया । यहां, जी ' लोचदार मापांक और जी का प्रतिनिधित्व करता है ' ' चिपचिपा मापांक (डैश्ड लाइनों) का प्रतिनिधित्व करता है । चित्रा Schuldt एट अल9से अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7: अंत संशोधन का कोई प्रभाव नहीं. लोचदार पठार मापांक निरंतर रहता है जब उनके संबंधित पूरक दृश्यों के साथ 8HTs के चिपचिपा मुक्त सिरों कैपिंग । चित्रा Schuldt एट अल9से अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8: माप पर अनुरूप डीएनए नेटवर्क की हैंडलिंग प्रक्रियाओं का प्रभाव. कैसे संकरण के बाद अनुरूपित नेटवर्क संभाल रहे है पर निर्भर करता है, माप अलग हो सकता है । इस उदाहरण में, डीएनए नैनोट्यूब के pipetting के दौरान कतरनी प्रवाह काफी विविध किया गया है, और ट्यूबों अगर संभाला भी मोटे तौर पर टूट गया । टूटना के बीच अवांछित बातचीत की ओर जाता है उजागर, पूरक एकल correlating टूट या टूटना क्षेत्रों, जो लोच में वृद्धि करने के लिए सुराग और गैर रेखीय प्रभाव लाती है, एसउच के रूप में तनाव सख्त (बड़े उपभेदों, हरे रंग की वक्र के लिए लोच की वृद्धि) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्रा 9: डीएनए नैनोट्यूब एलपी निर्भरता के अध्ययन को सक्षम. (क) एनHTs के साथ semiflexible पॉलिमर के नेटवर्क का अध्ययन बढ़ती एकाग्रता (एकाग्रता झाडू) के साथ प्रणाली के यांत्रिक प्रतिक्रिया की जांच में सक्षम बनाता है, actin के रूप में इस तरह के आधार पर अध्ययन के अनुरूप. (ख) इसके अतिरिक्त, ट्यूबों के विभिंन आर्किटेक्चर अंतर्निहित रेशा के अलग एलपी के संबंध में यांत्रिक प्रतिक्रिया के निर्धारण की सुविधा है, जो स्वाभाविक रूप से होने वाली के साथ व्यवहार्य है semiflexible पॉलीमर्स । इस प्रयोजन के लिए, A से डेटा को, lpके संबंध में लोचदार पठार मापांक के पैमानों को संबोधित करने के लिए पुनर्प्लॉटेड है । त्रुटि सलाखों के सभी प्रदर्शन माप का मतलब मूल्य के मानक विचलन प्रतिनिधित्व करते हैं । चित्रा Schuldt एट अल9से अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 10
चित्र 10: Reptation और मेष का आकार. reptating रेशा के प्रतिदीप्ति छवियों रिकॉर्डिंग (एकल लेबल डीएनए 8HT एक unlabeld नेटवर्क में एंबेडेड; c = 14 µ m) नेटवर्क में रेशा के उलझ प्रकृति सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । किसी भी crosslinking प्रभाव इस एक आयामी प्रसार में बाधा होगा । इनसेट: Reptation विश्लेषण के लिए सांद्रता के साथ जाल आकार स्केलिंग का निर्धारण किया जा सकता है, जो अच्छी तरह से actin माप की तुलना करता है और सैद्धांतिक भविष्यवाणियों के साथ सहमत है30। त्रुटि सलाखों के सभी प्रदर्शन माप का मतलब मूल्य के मानक विचलन प्रतिनिधित्व करते हैं । चित्रा Schuldt एट अल9से अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

ठीक से गठित नेटवर्क प्राप्त करने के लिए, डीएनए नैनोट्यूब कोडांतरण एक महत्वपूर्ण कदम है । संश्लेषण प्रक्रिया के दौरान त्रुटियाँ नकारात्मक ट्यूब गुणवत्ता प्रभाव; इसलिए, यह अनुशंसित है कि HPLC या oligonucleotides को शुद्ध करने के लिए अधिक सख़्त प्रक्रिया का प्रयोग किया जाए । के बाद से असतत के गठन के बजाय समग्र डीएनए नैनोट्यूब, साथ ही साथ उनकी लंबाई वितरण, सेट के भीतर n घटक oligonucleotides के equimolar stoichiometry पर निर्भर करता है, यह आवश्यक है कि सांद्रता reमापने के लिए खरीदी किस्में, के बाद से दिए गए मूल्यों को वास्तविक एकाग्रता से काफी भिंन हो सकते हैं । यह किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा २६० एनएम के एक अवशोषक तरंग दैर्ध्य पर । हम यह नोट करना चाहेंगे कि आणविक भार और विलुप्त गुणांक भिन्न दृश्यों के बीच भिन्न होते हैं; इसलिए, मानों को एकाग्रता में अवशोषित अनुवाद करने के लिए प्रत्येक डीएनए oligonucleotide के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए । छोटे नमूना मात्रा, जैसे एक NanoDrop के लिए अनुकूलित उपकरणों का उपयोग करते समय, प्रत्येक माप बिंदु कई बार लिया जाना चाहिए और औसत । स्पेक्ट्रोमीटर का पता लगाने की रेखीय श्रेणी के साथ अनुपालन । यदि आवश्यक हो तो एकाग्रता के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया अंश पतला । थोड़ी सी अशुद्धियों सही stoichiometry और ट्यूब के गठन की गुणवत्ता पर एक बड़ा प्रभाव हो सकता है; इसलिए, एकल किस्में के pipetting के रूप में संभव के रूप में सटीक होना चाहिए । बाद में, अंतिम नमूना समाधान अच्छी तरह से धीरे से pipetting नमूना ऊपर और नीचे thermocycler में रखने से पहले मिश्रित किया जाना चाहिए । यदि किस्में दृश्य के लिए फ्लोरोसेंट रंजक के साथ संशोधित किया गया है, सभी कदम एक प्रत्यक्ष प्रकाश से परिरक्षण वातावरण में किया जाना चाहिए, और बाद में स्थापित विरोधी ब्लीचिंग एजेंटों के अतिरिक्त (यानी, ऑक्सीजन सफाई प्रणालियों, जैसे ग्लूकोज oxidase/catalase) की सिफारिश की है । एकल किनारा सही बफर स्थितियों में मिलाया गया है के बाद, एक तापमान रैंप संरचनाओं (चित्र 2a) संकरण करने के लिए लागू किया जाता है. यह तापमान पैटर्न पहले से निर्धारित महत्वपूर्ण संकरण तापमान, जहां डीएनए डबल helices रूप में इस प्रकार है । कई तरीकों डीएनए संकरण कैनेटीक्स (यानी, देशी डीएनए यूवी अवशोषक31, calorimetry३२, या फ्लोरोसेंट रंजक३३) का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया है । उत्तरार्द्ध विधि में, रंजक intercalate डबल helices में, अत्यधिक फ्लोरोसेंट जटिल रंगों से चमकीले रंग का गठन । वे आंशिक रूप से दोहरे फंसे नहीं बल्कि एकल-असहाय डीएनए३४के लिए बाध्य । इसलिए, इस तरह के रंजक प्रणाली३५ में डीएनए nanostructure स्व-विधानसभा पर नजर रखने के लिए लागू किया गया है और आदर्श विधानसभा की स्थिति की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

शुरू में, इस तरह के पूर्वनिर्धारित और अप्रत्याशित द्वैध के रूप में नमूना के भीतर किसी भी दोहरे-फंसे डीएनए, एक उच्च तापमान (९० डिग्री सेल्सियस) में विकृत कर रहे है अवांछित आधार बाँधना से बचने के लिए । तापमान में क्रमिक रूप से कमी ( चित्र 2aके समान) डीएनए किस्में के थर्मल गति कम कर देता है, आधार कतरन घटनाओं को सक्षम करने के. नि: शुल्क ऊर्जा के ंयूनतम होने के कारण, डीएनए किस्में अपने पूरक अनुक्रम में तरजीह संकरण । जब एक dsDNA-विशिष्ट intercalating डाई लागू किया जाता है, उच्च फ्लोरोसेंट परिसरों के गठन के साथ चमक बढ़ जाती है, जो बारी में नव गठित दोहरे फंसे डीएनए३४के लिए एक मात्रात्मक उपाय है । 4HTs और 8HTs के गठन के लिए प्रतिदीप्ति संकेत के सापेक्ष परिवर्तन की साजिश है चित्रा बीमें है । इस सापेक्ष परिवर्तन प्रत्येक तापमान के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता औसत और बाद में पिछले तापमान के औसत मूल्य घटाकर द्वारा गणना की है । कम तापमान के साथ, एक ऊंचा प्रतिदीप्ति (चित्रा बी) का पता लगाया जा सकता है, और इस वक्र के शिखर तापमान पर प्रकाश डाला गया जहां बड़े पैमाने पर संकरण घटनाओं होते हैं । curves की बूंद तीव्रता एक पठार तक पहुंचने मूल्यों को दर्शाता है । डीएनए के निर्माण और इसकी जटिलता के आधार पर (जैसे, डीएनए किस्में के एक छोटे या बड़े सेट), चोटी तेज हो सकता है (चित्रा बी, नीला वक्र) या व्यापक (चित्रा बीसी, हरी वक्र). जब संभव हो, यह हर नए डिजाइन संरचना के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए यह सुनिश्चित करने के लिए कि तापमान रैंप के धीरे से कम हिस्से रेंज जहां संकर dsDNA क्षेत्रों के गठन के माध्यम ट्यूबों के गठन होने वाली है शामिल हैं । उपयुक्त तापमान शासन के बाद निर्धारित किया जाता है, nanostructures सफलतापूर्वक बहुत संकीर्ण तापमान पर्वतमाला में इकट्ठे हो सकते हैं (चित्र बी, नीला वक्र), या यहां तक कि isothermally३५. ध्यान दें कि आवधिक जाली में एकाधिक डीएनए किस्में के संकरण सहकारी एनीलिंग प्रभाव३५,३६, जो आगे डीएनए एनीलिंग समर्थन लाती है । यह विचार किया जाना चाहिए कि intercalating रंजक पेचदार बारी विंयास प्रति अपने मानक १०.५ आधार जोड़े से परे डीएनए helices खिंचाव, इस प्रकार ट्यूबों के समग्र ज्यामिति फेरबदल । इसलिए, यह ९०० डीएनए आधार जोड़े३५प्रति एक अणु से अधिक डाई एकाग्रता बढ़ाने के लिए उचित नहीं है. इसके अलावा, शिखर विधानसभा तापमान वास्तविक इष्टतम एनीलिंग तापमान से विचलित हो सकता है । उच्च परिशुद्धता प्राप्त करने के लिए और ट्यूब गठन के लिए सबसे अच्छी हालत निर्धारित करने के लिए, डीएनए संकरण agarose जेल ट्रो के साथ डबल की जाँच की जानी चाहिए, जो कई धीरे बदलते तापमान कदम के दौरान जांच की जानी चाहिए. डीएनए नैनोट्यूब के मामले के लिए, हम एक तीन कदम प्रोटोकॉल की स्थापना की । सबसे पहले, नमूना एक किस्में में डीएनए स्वभाव करने के लिए ९० ° c करने के लिए गर्म है । बाद में, एक व्यापक तापमान रेंज (प्रतिदीप्ति संकेत के विधानसभा शिखर के आसपास) शामिल है । हमारे मामले में, 10 डिग्री सेल्सियस की एक श्रृंखला शामिल है, ६५ डिग्री सेल्सियस से ५५ डिग्री सेल्सियस से लेकर-०.५ ° c हर 30 मिनट के साथ । अंतिम चरण में, तापमान तेजी से कमरे के तापमान के लिए छोड़ देना चाहिए-या, के रूप में हमारे मामले में, 20 डिग्री सेल्सियस-मध्यवर्ती तापमान (चित्रा 2a) पर किसी भी प्रतिकूल बातचीत को रोकने के लिए. आमतौर पर, thermocyclers ठंडा तापमान से नमूनों गर्मी । इसलिए, यह अंतिम नमूना एकाग्रता बढ़ जाती है, जो विधानसभा के दौरान नमूना में तरल के वाष्पीकरण को सीमित करने के लिए तदनुसार ढक्कन के तापमान को समायोजित करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

यदि nHTs उचित रूप से गठित कर रहे हैं, वे विशुद्ध रूप से उलझ नेटवर्क में व्यवस्था (चित्रा 3), अलग ट्यूबों के बीच crosslinking प्रभाव पैदा कर बातचीत के बिना । Crosslinks शायद न बिगड़ा डीएनए एक ट्यूब के साथ दोषों से विस्तार या चिपचिपा समाप्त होता है, जो पूरक एकल के साथ जोड़ी को मुक्त किया जाएगा क्षेत्रों से परिणाम होगा, पड़ोसी ट्यूबों पर असहाय क्षेत्रों । इन प्रभावों को ऐसे तनाव को सख्त (बड़े उपभेदों के लिए जीबढ़ती) के रूप में रैखिक गुण, प्रेरित होता है, लेकिन वे उलझ नेटवर्क में अनुपस्थित रहे है (चित्रा 4) । प्रदर्शित γ-राज्यभर में सामान्य रूप से rheological मापन के लिए उपयुक्त रेखीय तनाव शासनों का भी पता चलता है. एक निश्चित सीमा के ऊपर, नेटवर्क टूटना या rheometer, जो अचल नुकसान प्रणाली की प्लेटों के साथ संपर्क खो देता है । इसलिए, लागू उपभेदों रैखिक शासन में होना चाहिए विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने के लिए । आमतौर पर, 5% का एक तनाव शोर शासन के ऊपर अच्छी तरह से डेटा उपज के लिए पर्याप्त है । उच्च उपभेदों लागू किया जा सकता है; हालांकि, वे आसानी से टूटना थ्रेशोल्ड दृष्टिकोण, और परिणाम falsifi जा सकता हैगैर रेखीय शासन में मापने के कारण एड.

Rheological माप प्रतिलिपि और व्याख्यात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए एक सावधान, नमूने के अनुरूप तैयार करने और ध्यान से माप प्रोटोकॉल माना जाता है की आवश्यकता होती है । केंद्रीय बिंदु को rheometer प्लेटों के बीच एक पूरी तरह यादृच्छिक, आइसोट्रोपिक नेटवर्क स्थापित करने के बाद से इन नेटवर्क ज्यादातर केवल प्रतिलिपि संरचना है । इस प्रकार, बल्कि लंबे समय equilibration बार (आमतौर पर लगभग 2 घंटे, कभी भी अधिक) किसी भी आदेश प्रभाव है कि कतरनी प्रेरित संरेखण के कारण नमूने के pipetting के दौरान हो बिखरने की जरूरत है । पूर्व परीक्षण प्रयोगों समय विकास की रिकॉर्डिंग के लिए सिफारिश कर रहे हैं (समय झाडू) equilibration के दौरान प्रणाली के क्रम में आवश्यक समय सीमा निर्धारित करने के लिए. एक बार संकेत आगे परिवर्तन के बिना पठारों तक पहुंचने, प्रणाली equilibrated है । एक बार equilibration शर्तों का निर्धारण किया गया है, एक तनाव रैंप या एफ या γ-झाडू के रूप में वांछित परीक्षण, निष्पादित किया जा सकता है । उपभेदों के एक व्यापक स्पेक्ट्रम परीक्षण अंततः नेटवर्क या प्लेटों के लिए कनेक्शन को नष्ट कर सकते हैं । हालांकि, अगर परीक्षण टूटना दहलीज के नीचे उपभेदों के लिए सीमित हैं, तनाव रैंप और राज्यभर संभावित उंर बढ़ने या हिस्टैरिसीस प्रभाव की जांच करने के लिए दोहराया iteratively जा सकता है । f-स्वीप के मामले में, माप समय काफी भिंन हो सकता है । परीक्षण कम आवृत्तियों नाटकीय रूप से प्रयोगों को लंबे समय तक, के बाद से एक दोलन कई मिनट लग सकते हैं. ध्यान दें कि, एनHTs के मामले में, एफ-राज्यभर पता चलता है कि लोचदार मापांक जी' चिपचिपा मापांक जी' से अधिक है ' ' परिमाण के लगभग एक आदेश है, जो इन प्रणालियों के प्रमुख लोचदार प्रतिक्रिया दिखाता है द्वारा ( चित्रा 5) । आम तौर पर, विभिंन प्रकार के प्रयोगों के साथ किया जा सकता है लघु f-झाडू से पहले और बाद मुख्य प्रयोग सत्यापित करने के लिए कि प्रणाली के माप से ही परेशान रहे । हालांकि, कुछ मशीनों के माप के विभिन्न प्रकार के लिए अंतर्निहित मोटर मोड बदलने के लिए, विशेष रूप से गतिशील प्रयोगों (जैसे, दोलनों के लिए एफ-झाडू) से एक स्थिर तनाव रैंप के लिए बदल रहा है. यह परिवर्तन अक्सर सहज बड़े उपभेदों नेटवर्क को नष्ट करने और बाद में माप तड़के के साथ है । इस प्रकार, यह इस्तेमाल किया rheometer के विनिर्देशों की जांच करने के लिए सिफारिश की है ।

actin-आधारित सिस्टम पर Rheology प्रयोगों के एक नाटकीय प्रभाव प्रकट प्रोटीन विकार प्रणाली के हवा-पानी इंटरफेस पर होने वाली. विकृत प्रोटीन एक दूसरे के लिए विशेष रूप से पालन, जिससे एक घने जेल है कि अत्यधिक पूरे सिस्टम के यांत्रिक गुणों पर हावी कर सकते है गठन । आसपास की हवा के साथ नमूने के सीधे संपर्क को रोकने के लिए, passivation तकनीक है कि नमूना के पानी की सामग्री के वाष्पीकरण को भी दबाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । तीन संभावित तरीके हैं: (i) नमूने के रूप में एक ही बफर के साथ नमूना चैंबर आसपास; (ii) सर्फेक्टेंट का उपयोग कर अपने hydrophobic और हाइड्रोफिलिक डोमेन के कारण इंटरफेस को कवर करने के लिए (ध्यान रखा जाना चाहिए, के बाद से कुछ सर्फेक्टेंट बहुलक अनुरूपता के साथ हस्तक्षेप); या (iii) सर्फेक्टेंट के रूप में इसी तरह के प्रभाव के साथ अधिक जैविक रूप से संगत लिपिड, रोजगार । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि nHTs अंतरफलक पर विकार प्रभाव के अधीन नहीं पाए गए थे, और परिणाम passivation विधि (चित्रा 6) है, जो त्रुटि का एक प्रमुख संभावित स्रोत समाप्त के स्वतंत्र हैं । आम तौर पर, नमूना चैंबर हमेशा एक टोपी के साथ बंद किया जाना चाहिए, जो नम स्पंज के साथ सुसज्जित किया जा सकता है चैंबर में नमी बढ़ाने के लिए, वाष्पीकरण दबा.

के रूप में संक्षेप में पहले वर्णित है, डीएनए में एक संभावित त्रुटि स्रोत-आधारित सिस्टम, जैसे कि ख़राब एकल-असहाय डीएनए दोष पर या नैनोट्यूब, जो अतिरिक्त crosslinking प्रभाव का कारण हो सकता है के अंत में एक unpaired डीएनए है । इस संभावना की जांच और/या समाप्त करने के लिए, पूरक लघु किस्में इन चिपचिपा समाप्त होता है टोपी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, हमारी अपनी जांच से पता चला कि असहाय किस्में के अलावा की शुरुआत की एनHTs पर कोई प्रभाव नहीं था, और उलझ नेटवर्क के व्यवहार (चित्रा 7) अपरिवर्तित रहे । हालांकि, चिपचिपा पूरक दृश्यों के साथ समाप्त होता कैपिंग अंय डीएनए के लिए उपयोगी हो सकते है आधारित (और अधिक जटिल) के लिए अवांछित बातचीत को दबाने प्रणालियों । इसके अतिरिक्त, nHTs के नमूनों को ध्यान से pipetted किया जाना चाहिए (उदा., कमजोर कदम और नमूना तैयारी के लिए) किसी भी तोड़ने या ट्यूबों के अन्य नुकसान को रोकने के लिए. यदि समाधान भी मोटे तौर पर pipetted है, ट्यूबों तोड़ बेकाबू, दोष बिंदुओं पर चिपचिपा समाप्त होता है की बड़ी संख्या को उजागर, ट्यूबों और प्रणाली में संभावित crosslinking के बीच अवांछित बातचीत करने के लिए अग्रणी । यह संकेत के साथ हस्तक्षेप और stiffening प्रभाव की ओर जाता है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में गैर रेखीय प्रभाव जैसे तनाव सख्त है, जो γ में दिखाई हो जाता है-झाडू (चित्रा 8) । इस प्रकार, pipetting उलझ समाधान केवल धीरे किया जाना चाहिए और एक नहीं बल्कि बड़े व्यास के साथ पिपेट सुझावों का उपयोग (एक पिपेट टिप के अंत में कटौती उचित है) ट्यूबों पर कतरनी बलों को कम करने के लिए ।

अंत में, डीएनए nHTs एक उपयुक्त और उच्च अनुकूलनीय मॉडल प्रणाली semiflexible पॉलिमर और थोक इन तंतुओं से गठित नेटवर्क का अध्ययन करने के लिए, यांत्रिक स्वरित्र hydrogels के एक नए वर्ग का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । यदि नलियों को ध्यान से तैयार किया जाए तो इनका प्रयोग विभिन्न मामलों में रेशा के एलपी के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए कया जा सकता है. उलझ नेटवर्क के थोक rheological माप, उदाहरण के लिए, पता चलता है कि सैद्धांतिक रूप से की भविष्यवाणी की निर्भरता के साथ लोचदार मापांक की एकाग्रता और lपी के साथ असंगत है प्रयोग स्केलिंग व्युत्पंन कानून (चित्र 9)9. यह अध्ययन इस बात पर जोर देता है कि अंतर्निहित पॉलिमर की जकड़न को बढ़ाते हुए किसी नेटवर्क की लोच को बढ़ाया जा सकता है । परंपरागत रूप से, एक hydrogel की कठोरता में वृद्धि या तो समाधान के लिए और अधिक बहुलक जोड़ने के द्वारा या crosslinks (शारीरिक या रासायनिक) पड़ोसी पॉलिमर के बीच३७,३८उत्प्रेरण द्वारा हासिल किया गया था । हालांकि, एक उच्च आणविक सामग्री भी एक कम मेष आकार है, जो 3 डी सेल संस्कृति जैसे अनुप्रयोगों को सीमित कर सकते है के साथ जुड़ा हुआ है । Crosslinks, दूसरी ओर, अंतर्निहित नेटवर्क वास्तुकला के भीतर जटिल रूपात्मक परिवर्तन पैदा कर सकते हैं, जो आगे यांत्रिक गुणों की ट्यूनिंग सटीक३९पेचीदा । nHTs के नेटवर्क का उपयोग करना, तथापि, इन मापदंडों का एक पूरा युग्मन के लिए अनुमति देता है, जिससे stiffening प्रभाव पूरी तरह से अंतर्निहित तंतु की कठोरता को बदलने के द्वारा प्रेरित किया जा सकता है, जबकि जाल का आकार अपरिवर्तित छोड़ने । इसके अलावा, ट्यूब आर्किटेक्चर विशेष रूप से ऐसे crosslinking, के रूप में चुनिंदा अतिरिक्त प्रभाव को एकीकृत करने के लिए बदल दिया जा सकता है, जो इसी तरह उलझ नेटवर्क में, प्रयोग के लिए सैद्धांतिक भविष्यवाणियों परीक्षण करने के लिए आगे संभावनाएं बनाता है पैरामीटर्स जैसेl नेटवर्क के लिए p या crosslink आकार और सामर्थ्य । सामांय में, प्रोग्राम वास्तुकला आवेदनों की गुंजाइश व्यापक, न केवल थोक में एलपीनिर्भर प्रभाव के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी एकल-अणु स्तर पर । लेबल ट्यूबों के अध्ययन के लिए नेटवर्क में एंबेड किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, एलपी की निर्भरता ट्यूब में एक रेशा के एक आयामी गति पर-की तरह प्रतिशोधन, सामांयतः reptation (चित्रा 10)9के लिए भेजा । यदि यह प्रसार प्रस्ताव दिखाई दे रहा है, यह भी नेटवर्क के उलझ प्रकृति सत्यापित करता है, क्योंकि यह crosslinking प्रभाव से दबा दिया जाएगा । अंतर्निहित गतिशीलता का विश्लेषण भी जाल आकार नेटवर्क का पता चलता है । इसके अलावा, इन ट्यूबों के लिए कठोरता और chirality के गठन पर अंतर्निहित ट्यूबों की निर्भरता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है४०,४१,४२,४३, ४४ , ४५ या उच्च-क्रम संरचनाओं, जैसे स्टार जैसे asters४६,४७,४८,४९,५०, जो crosslinking प्रभाव द्वारा प्रेरित किया जा सकता है या के माध्यम से आणविक भीड़ का वातावरण२७.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम DFG द्वारा धन स्वीकार (1116/17-1) और प्राकृतिक विज्ञान के लिपजिग स्कूल "BuildMoNa" (GSC १८५) । इस काम Fraunhofer आकर्षित परियोजना ६०१ ६८३ के माध्यम से समर्थन किया गया है । टी. एच. यूरोपीय सामाजिक कोष (ESF-१०००७७१०६) से धन स्वीकार करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM cantilever ACTA AppNano
AFM - NanoWizard 3 JPK Instruments
CCD camera Andor iXon DV887
DMSO Sigma-Aldrich D2650
DNA oligonucleotides Biomers.net For sequences see Table 1
DNA Cy3-labeled oligonucleotides Biomers.net For sequence see Table 1
EDTA Sigma-Aldrich E-9884
Epi-fluorescence micro-scope Leica DM-IRB
MgCl2 Sigma-Aldrich M-8266
Mica "V1", 12 mm round Plano GmbH 50-12
MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific Inc. 4346907
MicroAmp® Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific Inc. 4306311
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Inc.
100x objective Leica5 506168
Purified water Merk Millipore - Milli-Q & Elix
Sapphire PCR tubes Greiner Bio-One 683271
TProfessional Standard PCR Thermocycler Core Life Sciences Inc. 070- Standard
7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 4351405
Rheometer TA Instruments ARES
SYBR® Green I nucleic acid gel stain Thermo Fisher Scientific Inc. S7567
Tris Sigma-Aldrich T4661
Triton X-100 Sigma-Aldrich Co. X-100 Suppresses evaporation of sample at air-water interface

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References

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इंजीनियरिंग १२८ अंक Rheology semiflexible पॉलिमर हठ लंबाई डीएनए ट्यूबों, actin hydrogel नेटवर्क
डीएनए Semiflexible पॉलिमर का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी उपकरण के रूप में नैनोट्यूब
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