Bewertung der Synapse Dichte im Hippokampus Nagetier Gehirnscheiben

Das menschliche Gehirn besteht aus ca. 10¹⁴ Synapsen. Synapse ist eng in die Entwicklung und Reifung des zentralen Nervensystems (ZNS) geregelt. Während der gesamten Entwicklung Anzahl der Synapse moduliert von Synaptogenese und beschneiden, funktioneller neuronaler Netzwerke zu bilden. Lernen und Gedächtnis werden durch die Verordnung der Synapse Anzahl und Stärke, ein Prozeß bekannt als synaptische Potenzierung und Depression¹unterstützt. Wichtig ist, ist die Stabilisierung der Reife Synapsen unerlässlich für die Aufrechterhaltung der neuronalen Netzwerk-Verbindungen. Darüber hinaus wurden Defizite in der Synapse Dichte in den frühen Stadien von neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit (AD)²gemeldet. Daher ist die Fähigkeit, genau zu identifizieren und zu bewerten Synapse Anzahl grundlegender Bedeutung für die Beurteilung der Gehirnphysiologie und Pathologie.

Die extreme Dichte und kompakte Art der Synapsen machen es schwierig, um ihre genaue Zahl in intakten Hirnareale zu schätzen. Chemische Synapsen im ZNS bestehen aus zwei Neuronen in enge Apposition, getrennt durch eine synaptic cleft³. Die präsynaptischen Terminal oder synaptische Bouton, ergibt sich aus einem Axon und besteht aus angesammelten Vesikel, die Neurotransmitter enthalten, die die Besonderheit einer Synapse zu definieren – nämlich, Glutamat und Gamma - Aminobuttersäure (GABA) für exzitatorische und hemmende Synapsen, beziehungsweise. Die Membranen der Vesikel enthalten vesikuläre Transporter spezifisch für jedes Neurotransmitter: vesikuläre Glutamat Transporter (vGlut) für Glutamat und vesikuläre GABA-Transporter (vGAT) für GABA. Die postsynaptischen Terminal ist eine sehr dichte Struktur, bestehend aus mehreren Proteinen, einschließlich Rezeptoren, Adhäsionsmoleküle und Gerüst Proteine. In exzitatorischen Synapsen ist postsynaptischen Dichte-95 Protein (PSD-95) das am häufigsten vorkommende Gerüst Protein⁴, modulierenden erregenden N-methyl-D-aspartate(NMDA-) und α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Säure (AMPA)-Rezeptor funktionieren Sie, während Gephyrin inhibitorische Rezeptoren an der inhibitorischen postsynaptischen Klemme⁵verankert. Insgesamt, die Spezifität der Proteine zu prä- und postsynaptischen Fächer Beihilfen in der Differenzierung und Identifikation von Synapse-Subtypen.

Die Auswertung der Synapse Zahl kann mit verschiedenen Techniken durchgeführt werden. Am weitesten verbreitet ist der Einsatz der Elektronenmikroskopie (EM), die die Analyse der Synapse in kompakter und intakte Hirnareale mit hoher Vergrößerung und Auflösung ermöglicht. Aber diese Technik ist sehr teuer, erfordert komplizierte Probenvorbereitung und ist sehr zeitaufwendig. Andere Techniken umfassen die Verwendung von Array-Tomographie⁶, was einen großen Nachteil ist, dass es spezielle und teure Ausrüstung erfordert um die Analyse durchzuführen. Darüber hinaus transgene Linien mit dem Ausdruck spezifischer synaptischen Marker eignen sich Bewertung Synapse Nummer⁷, aber die Generation der neuen Linien kann restriktive und kostspielig sein, und die Überexpression von Proteinen kann zu unerwünschten Ziel führen Phänotypen.

Aufgrund dieser Einschränkungen und der Einfachheit halber bewerten viele Forscher Synapse Anzahl durch die Untersuchung insgesamt synaptischen Protein-Ebene. Synapse Verlust kann jedoch als strukturelle synaptischen Umbau Ergebnisse in die Zerstreuung der Pre- oder Post-synaptische Apposition, keine Verschlechterung der synaptischen Proteine vor erhebliche Änderungen im Protein, beobachtet werden. Darüber hinaus sind in AD, synaptischen Protein-Ebene reduzierten folgende Synapse Degeneration oder neuronalen Tod^8,9. Die Quantifizierung der gesamten Ebenen ermöglicht es diese Unterscheidung nicht. So gibt es eine Notwendigkeit, eine zuverlässige, zugänglich und genaue Methode für die Bewertung der Anzahl der Synapsen im Gehirn zu entwickeln.

In diesem Artikel beschreiben wir wie Sie gründlich ermitteln und bestimmen Sie die Anzahl der Synapsen mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie im Hippokampus Nagetier Gehirnscheiben. Die Synapsen sind durch die NS1 der Prä- und postsynaptischen Marker definiert, die in eine punktförmige Verteilung angezeigt. Wir zeigen die Gültigkeit dieser Technik durch das Studium der Wnt signalisieren in das Gehirn. Wnts sind wichtig für die Bildung, die Beseitigung und die Wartung von Synapsen sekretierten Proteine. Die in Vivo -Induktion des sekretierten Antagonisten der Wnt Kaskade, Dickkopf-1 (Dkk1), führt zu erregenden synaptischen Verlust unter Beibehaltung der hemmende Synapsen in der Hippocampus-¹⁰. Wir zeigen die Identifikation und Graf von erregenden und hemmenden Synapsen im Hippokampus Scheiben aus einer erwachsenen Maus mit dem Ausdruck Dkk1 und markieren Sie die Übertragbarkeit dieser Technik auf andere Arten von Gewebekultur/Vorbereitungen.

alle die Experimente mit Mäusen und Ratten wurden genehmigt und durchgeführt mit Anhang 1 Verfahren abgedeckt unter dem Innenministerium Tiere (wissenschaftliche Verfahren) Act 1986. Die künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS) Rezept finden Sie in Tabelle 1.

1. akute Hippocampal Slice Vorbereitung

1. das Gehirn der Maus so schnell wie möglich, mit einem Spatel entfernen und einer scharfen Schere schneiden den Schädel, und legen Sie sie in eiskalten, Sauerstoff (95 % O ₂, 5 % CO ₂), hoch-Saccharose ACFS (~ 100 mL).
2. Das Gehirn der Maus auf eine Petrischale platzieren und entfernen das Kleinhirn und einen kleinen Abschnitt des frontalen Kortex mit einem Skalpell vor Hemisecting hinunter die Mittellinie des Gehirns.
3. Bringen die beiden Hemisphären auf der Seite, die gerade geschnitten wurde und kleben Sie jede Hemisphäre auf die Bühne ein Vibratome.
4. Cut 200-300 µm dicken Teil der gesamten Region von Interesse. Im Falle der Hippocampus, ca. 3-4 Scheiben pro Hemisphäre gesammelt werden.
5. Mit einem Kunststoff Pasteurpipette übertragen die Scheiben zu einer Kammer in sauerstoffreichem (95 % O ₂, 5 % CO ₂) getaucht ACFS. Halten bei 34 ° C für 30 min.
   Hinweis: Die Behandlung von Scheiben mit pharmakologischen Wirkstoffen wie rekombinante Dkk1 Proteine kann in diesem Stadium durch Zugabe von den Agenten der Slice-Kammer durchgeführt werden.
6. Der Scheiben aus der Kammer mit einem Pinsel zu entfernen, legen Sie sie in einer 24-Well-Platte und fix für 20 min bis 1 h in 4 % Paraformaldehyd (PFA)/4% Saccharose bei Raumtemperatur (RT).
   Achtung: PFA ist giftig, geeignete Verschleißschutz.
7. Der Scheiben dreimal waschen mit 1 X PBS-Puffer (10 min).
   Hinweis: Das Protokoll kann angehalten werden hier für 1-2 Tage, so lange die Scheiben bei 4 ° C mit 1 X PBS-Puffer gehalten werden.

2. Immunfluoreszenz für synaptischen Marker

Hinweis: die Rezepte alle Puffer verwendet, finden Sie in Tabelle 2.

1. Ersetzen die PBS mit Blockierung/permeabilizing-Puffer (Tabelle 2) in den Slice-Brunnen und Inkubation bei RT für 4-6 h.
2. Verdünnen den polyklonalen Meerschweinchen Antikörper gegen vGlut1 bei einem 1:2,000 Verdünnung im Puffer blockiert/Permeabilisierung.
   Hinweis: vGlut1 ist ein Marker für die präsynaptischen exzitatorischen terminal Visualisierung. Zur Identifizierung der postsynaptischen erregenden Synapse, verwenden einen polyklonalen Antikörper gegen PSD-95 und verdünnter 1: 500 in der gleichen Projektmappe. Verwenden Sie ein Mindestvolumen von 300 µL in jede Vertiefung. Um die anatomische Lage des Hippocampus zu identifizieren, verwenden Sie einen Antikörper, der auch die neuronale Struktur, z. B. MAP2 oder Tubulin identifizieren kann. Trainieren Sie die korrekte Konzentrationen von allen primären Antikörper für die synaptischen Marker der Wahl (prä- und postsynaptischen) und im frischen blockieren/permeabilizing Puffer verdünnen.
3. Inkubieren Sie die Scheiben in der primären Antikörper-Lösung über Nacht (oder für 1-2 Tage) bei 4 ° C. Verwendung einer schütteln Plattform mit kräftigen Bewegung.
4. Waschen die Scheiben dreimal mit PBS-Puffer (10 min).
5. Verdünnen der entsprechenden sekundären Antikörper 1: 500 in blocking-Puffer. Beispielsweise bei Verwendung den vGlut1-Meerschweinchen-Antikörper gelten Sie einen sekundäre Antikörper, der die Meerschweinchen-Komponente (z. B. Esel anti-guinea-Pig) konjugiert zu einem bestimmten Fluorophore erkennt. Bei Verwendung den PSD-95-Kaninchen-Antikörper gelten einen sekundären Antikörper, die die Kaninchen-Komponente (z. B. Esel Anti-Kaninchen) zu einer anderen spezifischen Fluorophor konjugiert erkennt.
6. Inkubieren Sie die Scheiben in dieser Lösung für 2-3 h bei RT. Stellen Sie sicher, dass die Scheiben vor dem Licht geschützt sind, wie Sekundärantikörper lichtempfindlich sind.
7. Waschen die Scheiben dreimal mit PBS-Puffer (10 min).
8. Entfernen Sie die Scheiben von der 24-Well-Platte mit einem Pinsel sorgfältig und legen Sie sie gleichmäßig auf vorher beschrifteten Objektträger. Geben Sie einen Tropfen Eindeckmittel auf jede Scheibe und dann legen Sie vorsichtig ein Glas Deckglas auf den Scheiben. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen. Achten Sie darauf, um genug Eindeckmedium (300-400 µL), zu verwenden, da eine unzureichende Menge Scheiben trocknen führen kann.
9. Verlassen, um für ein Minimum von 1-2 Tage bei RT trocknen und halten die Folien vor Licht geschützt werden.
10. Speichern die Folien bei 4 ° C, kurzfristig, aber für die langfristige Lagerung, halten sie bei-20 ° c

3. Konfokale Bildaufnahme und Analyse

1. Imaging mit konfokale Laser-scanning-Mikroskopie.
   1. Identifizieren die Region des Hippocampus, abgebildet werden (z. B. die Cornu Ammonis 1 und 3 (CA1, CA3) oder dentate Gyrus (DG)) mittels eines 10 X oder 20 X Objektiv.
   2. Änderung auf einem 40 X oder 63 X Ölimmersion Ziel um sicherzustellen, dass die Slice-Anatomie ist intakt durch die kontinuierliche Neuriten Identifizierung und Struktur organisiert. Verwenden Sie einen neuronalen Marker, wie MAP2, als Referenz ( Abbildung 1A).
   3. Anschließend wechseln Sie in ein 60 x Ölimmersion Ziel (NA = ~1.3 - 1.4) und passen Sie die Einstellungen für jeden Kanal um optimales Signal und Kontrast zu erhalten. Stellen Sie die Intensität jeder Laser, die Sättigung der alle Pixel mit einem hohem / niedrigem Kontrast Option zu vermeiden.
      Hinweis: Diese Einstellung wird auf das Mikroskop verwendet, sondern beziehen sich auf die Tabelle der Materialien für die Laser-Energie-Einstellungen verwendet, die in Abbildung 2, Abbildung 3, und Abbildung 4. Verwenden Sie um beste Ergebnisse zu erzielen eine Auflösung von 1024 x 1024 Pixeln. Die Einstellungen sollten über die unterschiedlichen Bedingungen des gleichen Experiments konstant bleiben. Zusätzliche Zoom kann bei Bedarf angewendet werden.
   4. Die Tiefe, wo die Färbung auch ist, zu bewerten und Bild Stapel von mindestens 8 äquidistant zu erwerben (250 nm) Flugzeuge. Dann nehmen Sie 3 angrenzenden repräsentative Bilder stapeln aus der gleichen Gegend pro Scheibe.
      Hinweis: Die tiefe variieren von einem Stück zum anderen sollte aber immer ca. 2 bis 5 µm von der Oberfläche der Scheibe.
   5. Wiederholen, die Übernahme in mindestens 3 Scheiben pro Zustand und von 6-8 Tiere pro Behandlungsgruppe.
2. Bildanalyse.
   Hinweis: Verwenden Sie eine automatisierte Bildanalyse-Software (siehe die Tabelle der Materialien). Beachten Sie, dass einige Systeme eine Lizenz benötigen, während andere frei, wie ImageJ sind. Die verwendete Software muss die Bilder in 3D analysieren, indem Sie unter Berücksichtigung aller Ebenen des Stapels abgebildet. Beziehen sich auf die Tabelle der Materialien für die Details der Software in der Bildanalyse ( Abbildung 1).
   1. Verwendung eines Custom-basierte Intensität Schwelle Protokolls zur Identifizierung aller synaptischen Puncta und neuronale Marker, die manuell optimiert und in der Software ausgewählt [siehe Tabelle der Materialien für die spezifische Software verwendet in diesem Protokoll].
      Hinweis: Die Software identifiziert eine minimale und maximale Intensität für jeden Fluorophor und ordnet einen Prozentsatz der Intensität für jeden anerkannten Objekt. Beachten Sie, dass der Anteil der Intensität nach der Fluorophor verwendet wird und der Antikörper gegen die synaptischen Marker.
   2. Für synaptischen Marker, sicherzustellen, dass Größe filtert (> 0.1µm ³ und < 0.8µm ³) in der Software ausgewählt und auf das Bild angewendet. Passen Sie die Parameter um sicherzustellen, dass die ausgewählten Objekte nicht überlappen. Ausgeschlossen werden alle Objekte, die zu groß oder zu klein, um synaptische Puncta anzusehen sind (siehe Abb. 2 b).
      Hinweis: Sobald optimiert, die gleichen Grenzwerte dann gelten für alle Bilder innerhalb einer gegebenen Experiment.
   3. Zu quantifizieren, die mittlere Zahl, Intensität und Umfang der einzelnen synaptischen Puncta (Pre- oder Post-synaptic) mit der optimierten Schwelle Protokollen innerhalb der Software ausgewählt. Normalisieren Sie die Puncta Zahl, um die Lautstärke über das Bildfeld (etwa 16.928 µm ³ im hier verwendeten System). Die synaptischen Puncta Intensität auf die Intensität der Referenz neuronalen Marker zu normalisieren.
      Hinweis: Synapsen sind definiert als die Co Lokalisierung zwischen Prä- und postsynaptischen Marker. Einmal die Schwelle Protokolle für Prä- und postsynaptischen Puncta hAve wurde gegründet, sollte die Software die Co Lokalisierung der synaptischen Puncta als die Überlappung von 1 Pixel oder mehr in einer Ebene identifizieren.
      Hinweis: Für statistische Analysen bestätigen Sie, dass alle Arten von Proben Normalität und Homogenität der Varianz, folgen bzw. Lilliefords und χ2-Test bestimmt. Zeigt eine Normalverteilung und Homogenität der Varianz Proben sollten mit parametrischen Tests analysiert werden, wie unten beschrieben. Beispielsweise sollte exzitatorische synaptische Puncta Analyse durchgeführt werden, eine einfache ANOVA mit Blockierung und Replikation. Jedes einzelne Experiment sollte als ein Block betrachtet werden; in der Regel gibt es drei unabhängige Experimenten, jeweils mit 1-3 Mäuse aus jede Bedingung.

Abbildung 1: Analyse der synaptischen Puncta mit der Bildanalyse Software (A) Screenshot der Intensität Schwelle Protokoll Anpassung. Das Beispiel ist für PSD-95, in dem die ausgewählten Puncta haben eine definierte Größe der > 0,1 µm ³ und < 0,8 µm ³ und gegenwärtigen minimiert sich überlappende Objekte. Beachten Sie, dass das dargestellte Bild einer konfokalen Ebene um die einfacher Visualisierung der synaptischen Puncta und genaue Parameter-Auswahl zu ermöglichen. (B) Screenshot der Analyse von der Software (nach der Auswahl des optimierten Protokolls) ausgegeben. Ein Beispiel für rohe synaptischen Puncta Anzahl Messungen basierend auf dem Volume. Diese Werte werden dann in einem Tabellenkalkulations-Software exportiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Qualitäts-Check von der Scheibe und Parameter-Einstellungen für synaptische Puncta. (A) repräsentative konfokale Bilder (40 X Objektiv) der Region von Interesse: CA1 Stratum Radiatum (sr) und Stratum Oriens (so) einer hippocampal Scheibe sind gekennzeichnet von MAP2 Färbung. Maßstabsleiste = 2 µm. (B) konfokale Bilder (60 x Ziel und eine zusätzliche 1,3 X Vergrößerung auf der Datenerfassungs-Software) von CA1 Stratum Radiatum, mit erregenden Marker-vGlut1 (grün) und PSD-95 (rot)-von hippocampal Scheiben. Beachten Sie die Kennung des klaren Prä- und postsynaptischen Puncta. Puncta größer als 0,8 µm ³ sind von der Quantifizierung (weisse Pfeile) ausgeschlossen. Maßstabsleiste = 2 µm (C) Confocal Bilder (60 x Ziel und eine zusätzliche 1,3 X Vergrößerung auf der Datenerfassungs-Software) von CA1 Stratum Radiatum, mit erregenden Marker-vGlut1 (grün)-von Kryostat-Schnitt hippocampal Abschnitte vom gesamten Gehirn in PFA behoben. Beachten Sie die Anwesenheit von großen Löchern und unregelmäßigen, aufgehäuften vGlut1 Färbung. Maßstabsleiste = 2 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Synapse Verlust tritt früh bei neurodegenerativen Erkrankungen wie AD und der Parkinson-Krankheit2,11,12. Die molekularen Mechanismen, die diese Defizite bleiben jedoch schlecht verstanden. Mängel bei der Wnt Signalisierung wurden mit AD13,14,15,16,17. Wnts sind sekretierten Glykoproteine und spielen eine wesentliche Rolle bei der Bildung von Synapsen und die Modulation des synaptischen Übertragung18,19,20,21. Vor kurzem haben wir als wichtige Regulatoren der synaptischen Wartung in den Reifen Nervensystem10,22Wnts identifiziert. Um die Auswirkungen der Wnt signalisieren auf Synapsen im Hippocampus von genetisch veränderten Mäusen genau zu studieren, nutzten wir ein Gehirn Slice Vorbereitung und konfokalen Mikroskopie Veränderungen in Synapse zu bewerten. Wir identifizierten gesunde Scheiben, in denen die Struktur gut war, erhalten (Abbildung 2A). Darüber hinaus wurde die Auswahl der synaptischen Puncta sorgfältig definiert, mit Ausnahme von großen gefärbten Objekten, die wahrscheinlich die aggregierte Proteine (Abb. 2 b). Dieses Kriterium wurde auf alle Bilder mit den gleichen strengen Analyseparametern angewendet.

Wir verwendeten eine transgene Modellsystem, die den Ausdruck des sekretierten Wnt Antagonisten Dkk1 bei Erwachsenen induziert Mäuse (iDkk1) unter Tetracyclin kontrollieren (siehe die Tabelle der Materialien)10,22. Wir zeigten, dass die Blockade der Wnt signalisieren in den Erwachsenen Hippocampus exzitatorischen Synapse Verlust in der CA1 Stratum Radiatum Region (Abbildung 3) auslöst. Abbildung 3A zeigt repräsentative konfokale Bilder der exzitatorischen Prä- und postsynaptischen Marker (vGlut1 und PSD-95, beziehungsweise) gewonnenen hippocampal Scheiben iDkk1 Mäuse mit dem Ausdruck Dkk1 für zwei Wochen, sowie ihre jeweiligen Steuerelemente. Wir haben diese Bilder mit Volocity-Software analysiert und zeigte eine signifikante Verringerung der Zahl der exzitatorischen Synapsen, quantifiziert durch die Co Lokalisierung des vGlut1 - und PSD-95-Label Puncta in der CA1-Region des Hippocampus iDkk1 Mäusen nach der Induktion von Dkk1 für zwei Wochen (Abbildung 3 b, * p < 0,05; Kruskal-Wallis-Test; 6 Mäuse pro Genotyp). In CA1 Stratum Radiatum reduzierte sich die erregenden Synapse Puncta Anzahl pro 1.000 µm3 von 500 im Kontroll-Mäusen bis 300 bei iDkk1 Mäusen. Im Gegensatz dazu induzierte Dkk1 Ausdruck hatte keinen Einfluss auf die Anzahl der hemmenden Synapsen (gekennzeichnet durch die Co Lokalisierung zwischen den Prä- und postsynaptischen Marker vGAT und Gephyrin, beziehungsweise), wie in Abbildung 4A-B gezeigt (p > 0,05; Kruskal-Wallis-Test; 3 Mäuse pro Genotyp).

Wichtig ist, führten wir eine statistische Aussagekraft-Analyse, um die entsprechende Anzahl von Scheiben und Tieren benötigt, um diese robuste Ergebnisse generieren zu schätzen. Mit R, wir berechnet, dass etwa 35 Scheiben pro Zustand benötigt wurden (3 Bilder X 3 Scheiben X 6 Tiere = 36), eine große Effektgröße zu erkennen (f = 0,4) mit 80 % Vertrauen (Kraft = 0,8) in eine einfache ANOVA mit Blockierung und Replikation, wie in beschrieben Schritt 3.2.6.

Abbildung 3: Verlust von exzitatorischen Synapsen in hippocampal Scheiben aus iDkk1 Mäuse. (A) repräsentative konfokale Bilder der CA1 Stratum Radiatum Show exzitatorischen Synapsen, identifiziert durch Co Lokalisierung zwischen vGlut1 und PSD-95 (weisse Pfeile). Der untere Bereich repräsentiert eine höhere Vergrößerung des markierten Rechtecks. Skalieren von Balken = 2 µm. (B) der Anteil der exzitatorischen Synapsen zwischen Kontrolle und iDkk1 wurde quantifiziert mit Software, die in Tabelle Materialien erwähnt (* p < 0,05; Kruskal-Wallis-Test; 6 Mäuse pro Genotyp). Die Daten sind vertreten ± SEM Diese Zahl wurde von Referenz10geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: hemmende Synapsen sind unverändert im Hippokampus Scheiben aus iDkk1 Mäuse. (A) repräsentative konfokale Bilder von CA1 Stratum Radiatum hemmenden Synapsen durch die Co Lokalisierung zwischen vGAT und Gephyrin (weisse Pfeile) identifiziert. Der untere Bereich repräsentiert eine höhere Vergrößerung des markierten Rechtecks. Skalieren von Balken = 2 µm. (B) Prozentsatz der hemmenden Synapsen zwischen Kontrolle und iDkk1 Mäuse, wie quantifiziert mit Volocity Software (p > 0,05; Kruskal-Wallis-Test; 3 Mäuse pro Genotyp). Die Daten sind vertreten ± SEM Diese Zahl wurde von Referenz10geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tabelle 1: ACFS Zusammensetzung.

Tabelle 2: Puffer für immunofluorescent Färbung verwendet.

Die Autoren haben nichts preisgeben.