Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

قياس الإنفلونزا تحييد ردود الأجسام المضادة للفيروسات A(H3N2) في الأمصال البشرية قبل درياقي فحوصات باستخدام خلايا مدكك-SIAT1

Published: November 22, 2017 doi: 10.3791/56448
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Influenza Division, Centers for Disease Control and Prevention, 2Battelle

Summary

إنفلونزا تحييد الأجسام المضادة ترتبط بحماية عدوى الإنفلونزا. فحوصات درياقي قياس تحييد الأجسام المضادة في الأمصال البشرية، وغالباً ما تستخدم للأنفلونزا البشرية علم الأمصال. يصف لنا الإنزيم درياقي استخدام خلايا مدك-SIAT1 لقياس تحييد الأجسام المضادة التتر المعاصرة فيروسات A(H3N2) 3C.2a و 3C.3a عقب التطعيم ضد الإنفلونزا أو العدوى.

Abstract

تحييد الأجسام المضادة ضد هيماغلوتينين (هكتار) من فيروسات الإنفلونزا تعتبر الآلية المناعية الرئيسية التي ترتبط بحماية لعدوى الإنفلونزا. فحوصات درياقي (مينيسوتا) كثيرا ما تستخدم لقياس استجابات جسم تحييد في الأمصال البشرية بعد التطعيم ضد الإنفلونزا أو العدوى. خلايا الكلي داربي الكلاب مدين (مدك) هي الركيزة الخلية المستخدمة عادة لفحوصات دقيقة. ومع ذلك، المتداولة حاليا قد اكتسبت فيروسات الإنفلونزا A(H3N2) 3C.2a و 3C.3a تبديل مستقبلات ملزم خصوصية. ثبت خط الخلية مدك-SIAT1 مع زيادة 2، 6 α سيليك اللبن مويتيس على السطح توفر العدوى محسنة وتكرار أكثر إخﻻصا من الخلايا مدك التقليدية لهذه الفيروسات A(H3N2) المعاصرة. هنا، نحن تصف مقايسة MN استخدام الخلايا مدك-SIAT1 التي تم الأمثل للتحديد الكمي لتحييد التتر الأجسام المضادة لهذه الفيروسات A(H3N2) المعاصرة. في هذا البروتوكول، الحرارة إبطال الأمصال المحتوية على تحييد الأجسام المضادة هي أول متسلسل المخفف، ثم المحتضنة مع تسيد 10050/جيدا من فيروسات الإنفلونزا A(H3N2) للسماح للأجسام المضادة في الأمصال لربط للفيروسات. ثم تضاف إلى خليط الفيروس أضداد الخلايا مدك-SIAT1، والمحتضنة ح 18-20 في 37 درجة مئوية، 5% CO2 للسماح A(H3N2) الفيروسات تصيب خلايا مدك-SIAT1. بعد الاحتضان بين عشية وضحاها، لوحات ثابتة وهي الكمية كمية الفيروس في كل جيدا قبل مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA) المضادة الإنفلونزا باستخدام الأجسام مضادة البروتين النووي (NP). ويعرف تحييد عيار الأجسام المضادة المتبادلة لتمييع المصل أعلى يقضي على تثبيط % إيه فايف زيرو من فيروس العدوى.

Introduction

تواصل فيروسات الإنفلونزا تتسبب في معدلات الاعتلال والوفيات في البشر كل سنة. ها هو بروتين سكري السطحية الرئيسية من فيروسات الإنفلونزا. تحييد الأجسام المضادة التي تستهدف ها هي الآلية المناعية الرئيسية الذي يرتبط بالحماية من الإصابة بالإنفلونزا1،2. هيماجلوتينيشن تثبيط (مرحبا) فحوصات وفحوصات دقيقة هي نوعان من الأساليب المستخدمة على نطاق واسع لقياس استجابات جسم الإنسان سيرا بعد العدوى أو التطعيم ضد الإنفلونزا3. المقايسة مرحبا تدابير تثبيط الأضداد hemagglutination الفيروس من خلايا الدم الحمراء، ويعتبر تحليل مركب. على عكس مرحبا، مقايسة MN مباشرة قياس مستويات الأجسام المضادة في الأمصال البشرية التي تحييد عدوى الإنفلونزا في الثقافات الخلية. مدك الخلايا غالباً ما تستخدم في عزل فيروس الإنفلونزا وفحوصات MN4.

فيروسات الإنفلونزا باستمرار الخضوع للانجراف مستضدي والتحول، والحصول على طفرات في البروتينات هكتار التي يمكن أن تغير من خصوصية ملزم مستقبلات لفيروسات. منذ عام 2014، ظهرت مجموعات جديدة من الفيروسات A(H3N2) وواصل أن يعمم حتى الموسم الحالي. أن غالبية هذه الفيروسات تنتمي إلى المجموعة الوراثية 3C.2a و 3C.3a على أساس تحليل النشوء والتطور من البروتينات هكتار. العديد من الفيروسات 3C.2a المتداولة قد قللت من قدرة على هيماجلوتيناتي خلايا الدم الحمراء و ولذلك لا يمكن أن توصف ب فحوصات مرحبا5. يجب استخدام تحييد فحوصات لقياس استجابات الأجسام المضادة لهذه الفيروسات التي لا هيماجلوتيناتي6. وعلاوة على ذلك، وقد أظهرت الدراسات أن هذه الفيروسات A(H3N2) المعاصرة غيرت خصائص ربط مستقبلات مقارنة مع سابق A(H3N2) الفيروسات، وتميل إلى أن تتراكم الطفرات الثقافة تكييفها وتعدد الأشكال عند باساجيد في الخلايا في المختبر الثقافات7،،من89. بالمقارنة مع التقليدية مدكك الخلايا، مدكك-SIAT1 وخط خلية وضعتها ماتروسوفيتش et al. من خلال مستقرة من تعداء الخلايا مدك مع كدنا للبشرية α2، 6-سيالترانسفيراسي (SIAT1). هذا خط الخلية تعرب عن زيادة كميات من α2، مويتيس 6-سيليك اللبن وانخفاض كميات من α2، مويتيس حمض 3-سيليك من الأصل مدك الخلايا10. وقد أظهرت الخلايا مدك-SIAT1 لتحسين معدلات العزل للفيروسات A(H3N2) مقارنة مدك الخلايا11. ومؤخرا، لين et al. وذكرت أن للنشأة 3C.2a و 3C.3a البشرية A(H3N2) فيروسات الإنفلونزا، تحققت تكرار الفيروس أكثر إخﻻصا وأفضل فيروس العدوى عندما كانت فيروسات المستزرعة في خطوط الخلايا مدك-SIAT1 مقارنة مع مدك الخلايا7. وهكذا، الخلايا مدك-SIAT1 هي أفضل في فحوصات دقيقة لوصف استجابات الأجسام المضادة للمجموعات الأخيرة من الفيروسات A(H3N2).

هنا يصف لنا مقايسة مينيسوتا استخدام خلايا مدك-SIAT1 لقياس استجابات جسم 3C.2a المعاصرة وفيروسات A(H3N2) 3C.3a في الأمصال البشرية. فيروسات تزرع في البيض أو خلايا يمكن استخدامها في هذا التحليل. الحرارة إبطال الأمصال المحتوية على تحييد الأجسام المضادة هي أول متسلسل المخفف، ثم المحتضنة مع تسيد 10050/جيدا من إنفلونزا A(H3N2) للسماح للأجسام المضادة في الأمصال لربط للفيروس. ثم تضاف إلى خليط الفيروس أضداد الخلايا مدك-SIAT1، والمحتضنة ح 18-20 في 37 درجة مئوية، 5% CO2 للسماح للفيروس A(H3N2) تصيب خلايا مدك-SIAT1، وتكرار. بعد الاحتضان بين عشية وضحاها، اللوحات ثابتة وهي الكمية كمية الفيروس في كل بئر بإليزا استخدام المضادة الإنفلونزا "التي أرستها" الأجسام المضادة. الكشف عن الحزب الوطني يشير إلى وجود الإصابة بالفيروس وعدم تحييد الأجسام المضادة. ويعرف تحييد عيار الأجسام المضادة المتبادلة لتمييع المصل أعلى يوفر ≥ 50 ٪ تثبيط فيروس العدوى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ينبغي أن تعالج جميع فيروسات الإنفلونزا وفقا لمتطلبات مستوى السلامة المناسبة (BSL-2 أو أعلى) كما هو معرف في السلامة الأحيائية على الأحياء المجهرية والمختبرات الطبية الحيوية (بمبل)12.

1-إعداد الكواشف وانطلاق المواد

  1. إعداد الخلايا مدك-SIAT1 وخلية العقيمة الثقافة المتوسطة
    1. إعداد مدك-SIAT1 خلية الثقافة المتوسطة باستخدام 500 مل من النسر المتوسط تعديل (دميم في دولبيكو) مع ارتفاع الجلوكوز، 10% v/v الحرارة إبطال المصل البقري الجنين (FBS)، 2 مم L-الجلوتامين، بيروفات صوديوم 1 مم، سلفات 1 ملغ/مل G418 (مثلاً، جينيتيسين)، و 100 يو/مليلتر البنسلين مع 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين (اختياري). تعقيم بترشيح من خلال غشاء حجم مسام 0.2 ميكرون. تتم إضافة كبريتات G418 لضمان الاستقرار بلازميد في الخلايا مدكك-SIAT1.
    2. إعداد خط الخلية مدك-SIAT1 . في 162 سم2-زراعة الأنسجة flask(s) تحتوي على 30 مل وسائط الثقافة الخلية العقيمة، البذور قوارير مع 2-2.5 × 106 مدك-SIAT1 الخلايا واحتضان في 37 درجة مئوية في 5% CO2 لمدة يومين؛ وسوف يستخدم هذا لتحديد الجرعة المعدية (تسيد) زراعة الأنسجة والمنغنيز فحوصات.
      ملاحظة: يرجى قدمت الخلايا مدك-SIAT1 د. م. ماتروسوفيتش، ماربورغ، ألمانيا10. هذا الخط خلية يمكن أيضا الحصول عليها تجارياً (انظر الجدول للمواد).
  2. تعد وسائل الإعلام نشر الفيروسات العقيمة باستخدام 500 مل من الجلوكوز عالية دميم، 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل، 0.3% ألبومين المصل البقري (BSA) جزء الخامس، و 20 ملم حبيس. تعقيم بترشيح من خلال غشاء حجم مسام 0.2 ميكرون.
  3. إعداد 0.75% (v/v) خلايا الدم الحمراء خنزير غينيا (جبربكس) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على برنامج تلفزيوني 0.01 متر، في الرقم الهيدروجيني 7.2.
  4. تعد الفيروسات معقم مخفف باستخدام دميم الجلوكوز ارتفاع 1% V الكسر الزلال البقري (BSA)، 100 يو/مليلتر البنسلين، ستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل وعيار 20 ملم حبيس. تعقيم بالترشيح بغشاء حجم مسام 0.2 ميكرون، وتعد طازجة لكل فحص.
  5. إعداد مثبت خلية الباردة الأسيتون البارد 80% في برنامج تلفزيوني (0.01 M برنامج تلفزيوني، الرقم الهيدروجيني 7.2).
  6. إعداد يغسل المخزن المؤقت باستخدام برنامج تلفزيوني (0.01 M برنامج تلفزيوني الرقم الهيدروجيني 7.2) و 0.3% (v/v) توين-20.
  7. إعداد جسم مخفف باستخدام برنامج تلفزيوني (0.01 M برنامج تلفزيوني، الرقم الهيدروجيني 7.2)، 0.3% (v/v) توين-20، و 5% الخالي من الدسم اللبن المجفف.
  8. استخدام المضادة الإنفلونزا "التي أرستها" الماوس [مونوكلونل] جسم استنساخ A1 و A3 تجمع جسم الأولية. تضعف بجسم مادة في تركيز الأمثل كما يحددها المعايرة.
  9. الماعز استخدام الماوس المضادة مفتش مترافق لحصان الفجل البيروكسيديز (HRP) جسم الثانوية. تضعف بجسم مادة في تركيز الأمثل كما يحددها المعايرة.
  10. تعد الركيزة البيروكسيديز استخدام هيدروكلوريد-فينيلينيدياميني س(العيادات الخارجية) في المخزن المؤقت لسترات الفوسفات 0.05 متر مكعب في درجة الحموضة 5. إعداد المخزن المؤقت سترات الفوسفات 0.05 متر مكعب بإذابة 12ح كبسولة 100 مل منزوع اللوحي O. حل 1 العيادات الخارجية (10 ملغ)/20 مل من الفوسفات سترات العازلة مباشرة قبل الاستخدام.
  11. استخدام 0.5 M من حمض الكبريتيك العيادات الخارجية وقف الحل. إضافة مل 28 م 18 حمض الكبريتيك المخزون إلى منزوع 972 مل ح2س في غطاء كيميائية.
  12. علاج الأمصال البشرية والحيوانية
    1. الحرارة إلغاء تنشيط الأمصال البشرية المستخدمة في فحوصات دقيقة في حمام مائي في 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل المقايسة. استخدامها على الفور أو إذا لزم الأمر، بتخزين الأمصال المذابة في 4 درجات مئوية للا تزيد عن 24 ساعة؛ إذا كانت هناك حاجة إلى فترة أطول التخزين، تخزين الأمصال المجمدة في-20 درجة مئوية أو أكثر برودة.
    2. علاج الأمصال الحيوانية المستخدمة في فحوصات دقيقة مع الإنزيم يدمر مستقبلات (استخلاص) وإلغاء تنشيط الحرارة قبل المقايسة كما يلي.
      1. ذوبان الجليد الأمصال في حمام مائي 37 ˚C ثم ضع على الجليد. مزيج 1 حجم عينة مصل الحيوان مع 3 مجلدات للتدمير. احتضان في ˚C 37 ح 18-20.
      2. الحرارة إلغاء تنشيط الأمصال استخلاص تعامل في ˚C 56 للحد الأدنى 30 6 إضافة مجلدات لبرنامج تلفزيوني، الرقم الهيدروجيني 7.2 لكل عينة لإضعاف ما قبل نهائية من 01:10. إذا لزم الأمر، بتخزين الأمصال المذابة في 4 درجات مئوية للا تزيد عن 24 ساعة؛ إذا كانت هناك حاجة إلى فترة أطول التخزين، تخزين الأمصال المجمدة في-20 درجة مئوية أو أكثر برودة.
        ملاحظة: قد تحتوي على الأمصال الحيوانية جليكانس الحامض اللعابي المختلفة التي قد ربط قد فيروسات الإنفلونزا وتحول دون ربط مكافحة الإنفلونزا على حدة-ها الأجسام المضادة. ولذلك، من الضروري استخلاص علاج جميع الأمصال الحيوانية قبل فحوصات دقيقة لإزالة هذه الاضبارات هكتار الفيروسية غير محددة في عينات مصل الدم.

2-إقرار ثقافة الخلية مدك-SIAT1

ملاحظة: يجب إجراء جميع الثقافات الخلية في سلامة بيولوجية مجلس الوزراء لمنع التلوث.

  1. صب مستنبت الخلية من المونولاير الخلية في قوارير2 162 سم. تريبسينيزي الخلايا بدهن المونولاير مع يدتا التربسين. إضافة 5 مل التربسين-يدتا لتغطية أحادي الطبقة الخلية. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 حتى ينفصل أحادي الطبقة (5-10 دقيقة). إضافة 15 مل من مدك-SIAT1 خلية ثقافة وسائل الإعلام إلى كل قارورة تحتوي على خلايا تريبسينيزيد، ماصة صعودا وهبوطاً لفصل الخلايا.
  2. استخدام هيموسيتوميتير وتريبان الأزرق لتحديد الخلية بحساب والجدوى. بذور الخلايا في قوارير زراعة الأنسجة2 سم 162 جديدة تحتوي على 30 مل من خلية ثقافة الإعلام مع 2-2.5 × 106 خلايا/flask واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لمدة يومين لاستخدامها في فحوصات تسيد والمنغنيز. بذور الخلايا في 4-5 × 106 خلايا/قارورة واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لمدة يومين لاستخدامها في نشر الفيروسات.
    ملاحظة: يمكن ضبط كثافة البذر إذا هي رغبت في فترات أقصر أو أطول من الثقافة. لانتشار الفيروس، الخلايا ينبغي أن تصل إلى ما يزيد على 100% كونفلوينسي. لفحوصات جرعة العدوى زراعة الأنسجة (تسيد) والمنغنيز، ينبغي أن الخلايا كونفلوينسي 75-95% (الشكل 1).

3-نشر فيروسات A(H3N2) في خلايا مدك-SIAT1

ملاحظة: يمكن نشر الفيروسات A(H3N2) أما في 10-11 يوم بيض الدجاجة امبريوناتيد القديمة وفقا لبروتوكول قياسي3، أو خلية مدك-SIAT1 الثقافات. خلايا SIAT1 مدك ينبغي أن تصل إلى ما يزيد على 100% كونفلوينسي لفيروس التطعيم. ويمكن تلقيح مخزونات البذور الفيروس مع تخفيف العديد من العدوى. يمكن استخدام تخفيف العدوى مع موسم الحصاد أفضل هكتار والعدوى لفحوصات دقيقة كذلك.

  1. إزالة مستنبت الخلية من أحادي الطبقة الخلية (> 100% كونفلوينسي) في قوارير2 162 سم. أغسل المونولاير مرتين مع 15 مل من برنامج تلفزيوني م 0.01 العقيمة، الرقم الهيدروجيني 7.2، وصب.
  2. 1 قارورة كعنصر تحكم تسمية وإضافة 20 مل من وسائل الإعلام في نشر الفيروسات. احتضان قارورة على 37 درجة مئوية مع شركة 5%2. ترك هذا قارورة لم يمسها وتستخدم للمقارنة بعد اليوم الأول من انتشار الفيروس.
  3. إضافة 10 مل من وسائل الإعلام نشر الفيروسات عقيمة flask(s) واحتضان جميع flask(s) في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2. ذوبان الجليد قنينة مخزون فيروس الإنفلونزا في درجة حرارة الغرفة ثم ضعه على الجليد. تضعف مع وسائل الإعلام نشر الفيروسات إلى تخفيف المستهدفة.
    ملاحظة: الهدف تخفيف يمكن تعديلها استناداً إلى التتر هكتار من مخزون فيروس. المخفف لإعداد 1: 1000 العدوى، إضافة 100 ميليلتر من الفيروس إلى 9.9 مل من وسائل الإعلام نشر الفيروسات العقيمة. عكس بلطف، إزالة 1 مل تمييع 1: 100 لمل 9 لوسائل الإعلام في نشر الفيروس العقيمة، عكس برفق للعدوى 1: 1000 المخفف. ضع على الجليد.
  4. إزالة قوارير جميع ما عدا التحكم قارورة من الحاضنة. قم بإزالة وسائط نشر الفيروس من flask(s) الخلايا SIAT1 مدك وتطعيم كل قارورة مع 10 مل فيروس المخفف. احتضان قوارير في 37 درجة مئوية، 5% CO2 لح 1، تناوب flask(s) كل 15 دقيقة.
  5. إزالة 5 مل العدوى من flask(s) واستبدل بالفيروس 15 مل نشر الوسائط التي تحتوي على 1 ميكروغرام/مل تبكك-التربسين. احتضان flask(s) عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 لح 16-18.
  6. بعد الاحتضان بين عشية وضحاها، مراقبة flask(s) تحت 100 × تكبير المجهر والبحث عن الآثار سيتوباثيك (CPE) في الخلايا. إزالة مل 15-17 من الفيروسات طافية من flask(s)، واستبدال مع مل 15-17 من الفيروسات المحضرة نشر الوسائط التي تحتوي على 2 ميكروغرام/مل تبكك-التربسين.
  7. احتضان قوارير على 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2. مراقبة التعليم المهني المستمر لأحادي الطبقة (مقارنة بقارورة مراقبة الخلية) وفحص ها بشكل دوري (كل ح 4) مع جبربك 0.75 في المائة حتى الحصاد.
    1. إعداد صفيحة microtiter 96 هكتار، حسنا. إضافة 50 ميليلتر من 0.01 م برنامج تلفزيوني، الرقم الهيدروجيني 7.2 إلى الآبار A2-A12 و B2-B12 (مكررة)، والآبار H1-H12 لعنصر التحكم.
    2. إضافة 100 ميليلتر من الفيروسات طافية A1 و A2، أداء إضعاف إضعاف مسلسل من A1 و B1 عن طريق A12 و B12. تجاهل 50 ميليلتر بعد خلط في A12 و B12. إضافة 50 ميليلتر من جبربكس 0.75 في المائة إلى صفوف أ وب ه.
    3. اضغط على اللوحة واحتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1.
      1. تحديد هكتار فيروسات طافية بإمالة لوحة microtiter 96-جيدا في 45° بزاوية 60 درجة.
      2. قراءة لوحات hemagglutination؛ ويعتبر أعلى إضعاف الفيروس الذي يحقق hemagglutination كاملة نقطة نهاية المعايرة هكتار للفيروس محددة. سجل المتبادلة لإضعاف الفيروس أعلى مع هيماجلوتينيشن كاملة كعيار هكتار من الفيروس.
        ملاحظة: ينبغي بدء "تشغيل" كرات الدم الحمراء تمت تسويتها في صف ح (عناصر) وتشكيل شكل دمعة صغيرة بسبب خطورة. الانتظار حتى كرات الدم الحمراء في السيطرة على آبار إنهاء قيد التشغيل، ثم قراءة الأزرار ربك في الفيروس معايرة الآبار. تلك التي تظهر أزرار ربك و "تشغيل"، لا تحقق هيماجلوتينيشن. قم بتحديد موقع إضعاف أعلى من الفيروسات التي تمنع hemagglutination تماما كعيار هكتار نقطة النهاية لهذا الفيروس.
  8. حصاد الفيروس عند هضاب هكتار ثقافة الفيروس أو ثقافة الفيروس يصل إلى هدف ها (على سبيل المثال، > هاو 16)، ولكن قبل الخلية يبدأ أحادي الطبقة لعرض CPE كبيرة.
    1. الطرد المركزي ثقافة الفيروس طافية على 300 غرام x لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية بيليه الحطام الخلوية. نقل المادة طافية توضيح تحتوي على الحصاد الفيروس إلى أنبوب نظيفة. الكوة المادة طافية المحتوية على الفيروس الحصاد في قنينات المبردة معقمة تستخدم مرة واحدة وتجمد فورا-70 درجة مئوية أو برودة.
      ملاحظة: يجب أن يكون مخزون الفيروسات المستخدمة لفحوصات دقيقة عيار المعدية عالية والحد الأدنى من جسيمات معيبة. إضعاف الحد الأدنى مخزون الفيروس تحقيق تسيد 1005050 ميليلتر للمقايسة مينيسوتا 1: 100.
      ملاحظة: مخزون الفيروس المستخدمة في فحوصات MN ينبغي عدم إذابة وريفروزين.

4-تحديد تسيد الفيروس

  1. يوم 1: معايرة الفيروس
    1. ذوبان الجليد قنينة فيروس في درجة حرارة الغرفة والمكان فورا على الجليد.
    2. اختبار الفيروس في تخفيف انطلاق مختلفة اثنين: 10-2 و 10-3. إضافة 100 ميليلتر من الفيروس إلى 9.9 مل من مادة ل 10-2 إضعاف الفيروس. أضف 1 مل من 10-2 إضعاف لمل 9.0 من الفيروس مادة ل 10-3 إضعاف.
    3. استخدام microtiter اثنين اللوحات (لوحة 1 على 10-2 إضعاف) ولوحة 2 ل 10-3 إضعاف، إضافة 100 ميليلتر من الفيروس مادة لجميع الآبار باستثناء العمود 1 من لوحة ميكروتيتير 96-جيدا.
    4. إجراء تخفيف10 ½log (10-2، 10-2، 5، 10-3، إلخ). إضافة ميليلتر 146 من الفيروس ابتداء من إضعاف لجميع الآبار في العمود 1 ونقل ميليلتر 46 متسلسل من العمود 1 من خلال العمود 11 (الشكل 2). نصائح ماصة التغيير بين الآبار. بعد خلط العمود 11، تجاهل النصائح مع تمييع ميليلتر 46.
    5. استخدام عمود 12 كمراقبة الخلية (CC)؛ إلا أنه يحتوي على فيروس مخفف. احتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2-
  2. يوم 1: إعداد الخلايا مدك-SIAT1
    ملاحظة: ينبغي التوصل إلى أحادي الطبقة خلية مدك-SIAT1 كونفلوينسي 75-95% لفحوصات تسيد والمنغنيز. قارورة 162-سم2 واحد في كونفلوينسي 95% ينبغي أن تسفر عن خلايا كافية إلى البذور ~ لوحات ميكروتيتير 4-5.
    1. أغسل المونولاير المتلاقية 75-95% مع 20 مل برنامج تلفزيوني لإزالة FBS في ثقافة وسائل الإعلام. تريبسينيزي الخلايا كما يلي.
      1. شطف في أحادي الطبقة مع PBS العقيمة، إضافة 7 مل التربسين-يدتا لتغطية أحادي الطبقة الخلية. تكمن في قارورة مسطحة واحتضان في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حتى ينفصل أحادي الطبقة (حوالي 5-10 دقيقة). إضافة 7 مل فيروس مادة لكل قارورة تحتوي على خلايا تريبسينيزيد.
    2. تغسل الخلايا مع فيروس مخفف لإزالة FBS.
      1. بلطف "الماصة؛" صعودا وهبوطاً لفصل الخلايا. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 مل؛ ملء الأنبوب مع فيروس مخفف.
      2. الطرد المركزي في ز 485 x 5 دقيقة صب مادة الفيروس واستبدالها جديدة 50 مل فيروس مخفف، والطرد المركزي في 485 x ز لأدنى 5 صب مادة الفيروس واستبدال مخفف فيروس جديد (10 مل/قارورة) ريسوسبيند بيليه.
    3. استخدام هيموسيتوميتير وتريبان الأزرق لتحديد عدد الخلايا والجدوى. ضبط تركيز الخلية بالفيروس مادة إلى 1.5 × 105 خلايا/مل.
    4. إضافة 100 ميليلتر المخفف مدك-SIAT1 الخلايا لكل بئر من لوحات ميكروتيتير (1.5 × 104 خلايا/البئر) وتغطي اللوحات. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 لح 18-20.
  3. يوم 2: أليسا
    1. تثبيت خلايا
      1. إزالة المتوسطة من لوحات ميكروتيتير. تغسل كل جيدا مع 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني. إضافة 300 ميليلتر الباردة الأسيتون 80% لكل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 10 إزالة مثبت وتسمح لوحات للهواء الجاف.
    2. أليسا
      1. إضافة جسم الأولية
        ملاحظة: يجب استخدام المضادة الإنفلونزا A التي أرستها [مونوكلونل] جسم في الزائدة كجسم الأولية في أليسا. تحديد إضعاف جسم المثلى لكل الكثير من الأجسام المضادة الأولية عن طريق إجراء المعايرة الأضداد في مينيسوتا. حدد تركيز الأجسام المضادة الأولية في الزائدة ومع أفضل إشارة إلى نسبة الخلفية.
        1. تمييع المضادة الإنفلونزا A التي أرستها [مونوكلونل] جسم (جسم الأولية) إلى تركيز الهدف في جسم مادة (مثل إضافة 30 ميليلتر من جسم الأولية إلى 30 مل جسم مادة لإضعاف هدف 1: 1000).
        2. غسل الأطباق 3 مرات مع 300 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي. إضافة 100 ميليلتر جسم الابتدائي المخفف لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1.
      2. إضافة الأجسام المضادة الثانوية
        ملاحظة: ماعز المضادة للماوس مفتش مترافق فجل الحصان ينبغي أن تستخدم البيروكسيديز (HRP) في الزائدة كجسم الثانوية في أليسا. تحديد إضعاف جسم المثلى لكل الكثير من الأجسام المضادة الثانوية بإجراء معايرات أضداد. حدد تركيز الأجسام المضادة الثانوية في الزائدة ومع أفضل إشارة إلى نسبة الخلفية.
        1. تمييع الماعز الماوس المضادة مترافق مفتش لبرنامج الصحة الإنجابية الأجسام المضادة (الأجسام المضادة الثانوية) لتركيز الهدف في جسم مادة (مثل إضافة 7.5 ميليلتر من جسم الثانوية إلى 30 مل جسم مادة لإضعاف 1:4000 مستهدفة).
        2. أغسل لوحات 3 مرات مع 300 ميليلتر يغسل العازلة. إضافة 100 ميليلتر جسم الثانوي المخفف لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1.
      3. قراءة اللوحة وإضافة الركازة
        1. غسل الأطباق 5 مرات مع 300 ميليلتر يغسل المخزن واضغط على مسح خالية من الوبر.
        2. إضافة 100 ميليلتر من الركازة طازجة لكل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة حتى يشبع وضع اللون والكثافة البصرية (OD) خلية مراقبة الآبار < 0.2.
        3. إضافة 100 ميليلتر لوقف الحل لجميع الآبار. قراءة OD آبار في 490 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي ميكروسكوبية.
  4. تسيد 50 حساب
    1. حساب متوسط OD490 من عناصر الخلية (عمود 12).
    2. النظر في أي اختبار جيد مع OD490 أكبر من ضعف متوسط OD490 من الآبار CC التي وصفها بأنها "إيجابية"؛ خلاف ذلك، فإنه يعتبر من "سلبية".
    3. حساب تسيد50 من الفيروس باستخدام أسلوب مونش ريد13.
      1. تحديد العدد من الإيجابيات والسلبيات في كل تمييع.
      2. حساب "تراكمية إيجابية"، "التراكمية السلبية"، "نسبة"، و "% إيجابية" كما هو موضح في الجدول 1.
      3. حساب "متناسبة مع المسافة" بين عرض تمييع > 50% إيجابيات وعرض تمييع < إيجابيات 50% باستخدام ما يلي:
        Equation 1
        ملاحظة: عامل التصحيح لتمييع سجل ½ هو 0.5. على سبيل المثال، في الجدول 1: (80 − 50)/(80 − 20) × 0.5 = 0.25
      4. حساب الفيروس تسيد50 عن طريق إضافة المسافة النسبية لإضعاف عرض > 50% إيجابية.
        ملاحظة: على سبيل المثال، في الجدول 2، تسيد50 من 10-5+(-0.25) = 10-5.25. ملاحظة هذا هو تسيد50 من الفيروس الواحد 100 ميليلتر (أو 10-5.25100 ميليلتر).
    4. حساب إضعاف الفيروس. لفحوصات دقيقة، يضعف الفيروس إلى تسيد 20050100 ميليلتر (ما يعادل 100 ميليلتر5050 تسيد كل بئر).
      ملاحظة: في المثال الوارد في الجدول 1، 1 تسيد50 هو 10-5.25 في 100 ميليلتر، وهو إضعاف لتحقيق تسيد 20050100 ميليلتر 1:891 استناداً إلى الحسابات: 200 × 10-5.25 = 10-2.95 = 1/102.95 = 1 /891

5-مينيسوتا الفحص باستخدام خلايا مدك-SIAT1

  1. يوم 1: اختبار ومراقبة الأمصال التحضير ولوحة التخطيط
    1. ذوبان الجليد الأمصال في حمام الماء 37 درجة مئوية وإزالة فورا بعد ذوبان الجليد. قاسمة كمية الأمصال التي تحتاج إلى اختبار؛ الحد أدنى من 10 ميليلتر من الأمصال الأصلي مطلوب لاختبار فيروس واحد في القميص. اختبار الأمصال في التكرارات إذا كان ذلك ممكناً.
    2. الحرارة إلغاء تنشيط الأمصال البشرية لمدة 30 دقيقة في حمام مائي 56 درجة مئوية كما هو الحال في الخطوة 1.12.1. مكان سيرا على الجليد وظيفة المنظمة الحرارة، بإضافة مخفف الفيروس الأمصال لتحقيق 01:10 إضعاف ما قبل.
    3. استخلاص علاج وتمييع الأمصال الحيوانية إلى 01:10 ﻻستخدام عناصر تحكم كل 1.12.2 مسبقاً.
      ملاحظة: يمكن تخزين الأمصال البشرية والحيوانية المذابة والمعالجة عند 4 درجة مئوية للم يعد من 24 حاء ينبغي تخزين الأمصال المجمدة في-20 درجة مئوية أو أبرد إذا أطول فترة التخزين المسبق قبل المقايسة.
    4. لاختبار مع أحد الفيروسات، قم بإضافة 100 ميليلتر 01:10 إضعاف سيرا إلى أعمدة A1 إلى A10 (الشكل 4). إضافة 50 ميليلتر من الفيروس مادة إلى صفوف ب من خلال ح، ما عدا أعمدة 11 و 12 (الشكل 4). أداء إضعاف إضعاف مسلسل من صفوف A إلى H، وتجاهل آخر 50 ميليلتر في صف ح (الشكل 4).
      ملاحظة: عندما يكون اختبار فيروسات متعددة، يمكن أن تضعف الأمصال في أنابيب عيار. تخفيف المصل، لأن الغرض من تحديد عيار المصل، في ألف جيدا 01:10، جيدا ب 01:20، وكذلك ج 01:40، 1:80 د حسنا، حسنا ه 1:160، جيدا و 1:320، 1:640 ز جيدا، كذلك ح 1:1,280 (الشكل 4).
    5. لمراقبة الفيروسات، إضافة 50 ميليلتر من فيروس مخفف لآبار A12، B12، C12 و D12 (لا سيرا). لمراقبة الخلية، إضافة 100 ميليلتر من فيروس مخفف لآبار E12 F12، G12 و H12 (أي فيروس، لا سيرا).
    6. للأمصال التحكم (على سبيل المثال، عناصر تحكم النمس سيرا)، إضافة 100 ميليلتر من مراقبة المخفف سيرا حسنا عمود 11 وإضافة 50 ميليلتر من الفيروس مادة إلى آبار B11-H11. المسلسل مخفف إلى أسفل.
    7. تغطي اللوحات، واحتضان في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حتى جاهزة لإضافة الفيروس.
  2. يوم 1: إضافة الفيروس
    1. يضعف هذا الفيروس إلى تسيد 1005050 ميليلتر مع الفيروس مادة.
    2. إضافة 50 ميليلتر الفيروس المخفف لجميع الآبار، باستثناء العمود 11 على لوحات المعايرة الخلفية (BT) وآبار مراقبة الخلية E12 F12، G12 و H12 في جميع لوحات (الشكل 4). لهذه اللوحات مع مراقبة الأمصال في العمود 11، إضافة الفيروس إلى العمود 11.
    3. يعود المعايرة (BT)
      1. وتشمل بريتيش تيليكوم في العمود 11 من مجموعة واحدة من لوحات مكررة (على سبيل المثال، لوحة 1A و 1B). إضافة 50 ميليلتر من الفيروس مادة لجميع الآبار في العمود 11. إضافة 50 ميليلتر من الفيروس في تسيد 1005050 ميليلتر للبئر الأولى (A11). مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
      2. خلط ونقل 50 ميليلتر لآبار المتعاقبة لإجراء تخفيف المسلسل إضعاف. تغيير نصائح ماصة بين الآبار لتجنب الفيروسات المرحل. تجاهل 50 ميليلتر من H11 جيدا.
      3. إضافة 50 ميليلتر من الفيروس مادة للعمود 11 إحضار وحدة التخزين النهائي إلى 100 ميليلتر. اضغط على لوحات لمزيج.
    4. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 لح 1.
    5. تؤدي إضافة خلية مدك-SIAT1 في يوم 1 وإليزا في اليوم 2 كما هو موضح في الخطوات 4.2 و 4.3 (كما هو موضح في 5.3 و 5.4)
  3. يوم 1: إضافة خلية مدك-SIAT1
    1. إعداد الخلايا مدك-SIAT1 كما هو موضح في الخطوة 4، 2. إضافة خلايا مدك-SIAT1 ميليلتر 100 في 1.5 × 105 خلايا/مل لكل بئر (1.5 × 104 خلايا/جيد). احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 لح 18-20.
  4. يوم 2: أليسا
    1. وبعد الحضانة بين عشية وضحاها، اليوم الثاني، إصلاح الخلايا مع الأسيتون البارد 80% كما هو موضح في الخطوة 4، 3.
    2. إضافة جسم الأولية
      1. أغسل لوحات 3 مرات مع 300 ميليلتر يغسل العازلة. تمييع المضادة الإنفلونزا A التي أرستها [مونوكلونل] جسم (جسم الأولية) إلى تركيز الأمثل حسبما تقرره المعايرة في جسم مخفف (مثل إضافة 30 ميليلتر من جسم الأولية إلى 30 مل جسم مادة لإضعاف هدف 1: 1000).
        ملاحظة: مطلوب 100 ميليلتر من جسم الابتدائي كل بئر. ~ 10 مل المسبق للوحة الواحدة.
      2. إضافة 100 ميليلتر جسم الابتدائي المخفف لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1.
    3. إضافة الأجسام المضادة الثانوية
      1. غسل الأطباق 3 مرات مع 300 ميليلتر يغسل العازلة. تمييع الماعز المضادة للماوس مترافق مفتش إلى HRP الأجسام المضادة (الأجسام المضادة الثانوية) لتركيز الهدف في جسم مخفف (مثل إضافة 7.5 ميليلتر من جسم الثانوية إلى 30 مل جسم مادة 1:4000 هدف.)
        ملاحظة: 100 ميليلتر من جسم الثانوية مطلوب الواحدة 96 جيدا. ~ 10 مل المسبق للوحة الواحدة.
      2. إضافة 100 ميليلتر جسم الثانوي المخفف لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1.
    4. قراءة اللوحة وإضافة الركازة
      1. غسل الأطباق 5 مرات مع 300 ميليلتر يغسل المخزن واضغط على مسح خالية من الوبر.
      2. إضافة 100 ميليلتر من الركازة طازجة لكل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة حتى تصل إلى آبار مراقبة الفيروس التطوير التنظيمي490 = 0.8-3، مع مراقبة الخلية في أدنى مستوى الخلفية OD490 < 0.2.
      3. إضافة 100 ميليلتر من الحل وقف لجميع الآبار. قراءة OD آبار في 490 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي ميكروسكوبية.
  5. تحليل البيانات
    ملاحظة: الحسابات MN مصممون لكل لوحة على حدة.
    1. تحديد عيار الأجسام المضادة تحييد كل عينة المصل.
      1. حساب وقف490 OD تحييد الفيروس 50% لكل لوح باستخدام المعادلة التالية:
        Equation 2
        ملاحظة: هنا x = 50% إنتاج الأبطال. تخفيف المصل متبادلة المقابلة لإضعاف أعلى مع OD490 يعتبر أقل من 50% الإنتاج (تثبيط % إيه فايف زيرو) عيار الأجسام المضادة الأبطال لأن عينة المصل (الشكل 5).
    2. تحقق من أن آبار مراقبة الخلية التطوير التنظيمي490 < 0.2 وآبار مراقبة الفيروس لها التطوير التنظيمي490 = 0.8-3.
    3. تحقق من العدوى الفيروس في كل مقايسة (100 x TCID50) بفيروس تي. النطاق المقبول بريتيش تيليكوم 50 أو 100 أو 200 تسيد. في حالة استخدام نفس الوقف كما هو معرف في الخطوة 4.4.2، ينبغي أن يكون إضعاف الفيروس أعلى في العمود بريتيش تيليكوم مع التطوير التنظيمي أعلاه وقف إنتاج المواد الانشطارية في آبار E11، F11، G11.
      ملاحظة: يجب أن تعطي عناصر إيجابية المصل التتر داخل 2-fold من القيم التي تم الحصول عليها في الاختبارات السابقة. OD490 من مراقبة سلبية المصل ينبغي أن تكون مشابهة للتي لوحظت بالنسبة لمكافحة الفيروسات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تحديد العدوى مخزون الفيروس هو الخطوة الأولى في التحليل MN. ويبين الشكل 2 تخطيط لوحة تحديد تسيد50 مخزون الفيروس. لمخزونات الفيروس بالعدوى غير معروف، يمكن تيتراتيد الفيروس من تخفيف ما قبل متعددة، على سبيل المثال كل 10-2 و 10-3، من أجل التقاط أفضل منحنى المعايرة لحساب العدوى الفيروس. ينبغي توحيد كمية الفيروس المستخدمة في التحليل مينيسوتا إلى تسيد 10050/well (50 ميليلتر). إضعاف الحد الأدنى مخزون الفيروس تحقيق تسيد 10050/جيدا 1: 100.


ويصف الشكل 3 الخطوات الحاسمة للمقايسة مينيسوتا استخدام خلايا مدك-SIAT1. إبطال الحرارة الأمصال المسلسل المخفف في لوحات 96-جيدا كما هو موضح في الشكل 4. ثم يتم إضافة5050 تسيد 100 ميليلتر الفيروس لكل بئر. بعد ح 1 حضانة للسماح الجسم في ربط الأمصال للفيروس، يتم إضافة 100 ميليلتر من 1.5 × 105 خلايا/مل من الخلايا SIAT1 مدك لكل بئر. لتحقيق أفضل النتائج، ينبغي أن تكون الخلايا مدك-SIAT1 في كونفلوينسي 75-95% (الشكل 1) لكل من تسيد50 وفحوصات دقيقة. ثم هي المحتضنة اللوحات ح 18-20 في 37 درجة مئوية، 5% لشركة2- بعد الاحتضان بين عشية وضحاها، يتم الكشف عن كمية الفيروس في كل بئر وكمياً أليسا NP المضادة الإنفلونزا A (الشكل 3).

كذلك يمثل التوجيه التشغيلي في كل الكمية من الإصابة بالفيروسات والنسخ المتماثل في الخلايا SIAT1 مدك حضور متسلسل المخفف الأمصال المحتوية على تحييد الأجسام المضادة. فإنه يمكن رسم ضد تخفيف سيرا (الشكل 5). ويعتبر المتبادلة لتمييع المصل أعلى تحقق تحييد % إيه فايف زيرو عيار الأجسام المضادة للعينة المصل. 5 الشكل يحتوي على أمثلة للنتائج من المرضى 2 مع الأمصال إقران اختبار ضد A(H3N2) A/هونغ كونغ/4801/2014 3C.2a الفيروس ما قبل وما بعد الإنفلونزا التطعيم. مع المريض 1 التطعيم قبل الأمصال، أيا من تخفيف الأمصال أعاق الإصابة بعدوى الفيروس (الشكل 5، منحنى الضوء الأزرق) ويعتبر ذلك السلبية (< 10). على النقيض من ذلك، أعاق سيرا بعد التلقيح من هذا المريض فيروس النسخ المتماثل، تشير إلى التطعيم التي يسببها تحييد الأجسام المضادة. الثالثة تمييع هذه الأمصال هو إضعاف أعلى تحت عتبة 50%، وبالتالي هذا المريض عيار تطعيم بعد 40 (الشكل 5، منحنى الأزرق الداكن). وبالمقارنة، يتضمن المصل من التطعيم قبل المريض الثاني الموجودة مسبقاً في تحييد الأجسام المضادة في عيار 320. بعد التلقيح، زيادة عيار إلى > 1,280. وفي هذه الحالة، في 01:10 قبل تخفيف المصل، لا عيار نهاية جسم قد تحقق. ينبغي إعادة اختبار المصل في إضعاف ما قبل أعلى من أجل تحقيق نهاية عيار.

Figure 1
الشكل 1 . ثقافة الخلية مدك-SIAT1- مدك-SIAT1 الخلايا. (أ) مدك-SIAT1 المتلاقية أحادي الطبقة (> 100% كونفلوينسي) لفيروس التطعيم؛ (ب) مدك-SIAT1 الخلايا في مرحلة سجل مع كونفلوينسي 75-95% تسيد50 وفحوصات دقيقة.

Figure 2
الشكل 2 . تخطيط لوحة تسيد. فيروس العدوى يتحدد بتسيد50. الأسهم الفيروس المخفف السابق إلى 10-2، وثم تضعف متسلسل في سجل ½ الواحدة وتمييع إلى 10-7 (عمود 1-11)، في 8 replicates الواحدة وتمييع (الصف A-H). يتم استخدام العمود 12 كعنصر التحكم فقط في الخلية. ويمكن حساب تسيد50 من مخزون فيروس استخدام أسلوب مونش ريد.

Figure 3
الشكل 3 . التخطيطي للمقايسة MN استخدام الخلايا مدك-SIAT1- التسلسل هي المخفف 50 ميليلتر من الأمصال إبطال الحرارة 2-fold إلى لوحات 96-الآبار. ثم يتم إضافة 50 ميليلتر تسيد 10050 من الفيروسات A(H3N2) لكل بئر. هي المحتضنة لوحات في 37 درجة مئوية ح 1 للسماح الربط للفيروس والأجسام المضادة. ثم يتم إضافة 1.5 × 104 SIAT1 مدك الخلايا لكل بئر. لوحات هي المحتضنة ح 18-20 في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2. بعد الاحتضان بين عشية وضحاها، لوحات يتم غسلها والثابتة، وهو كمياً كمية الفيروس في كل بئر بإليزا استخدام المضادة الإنفلونزا "التي أرستها" الأجسام المضادة. سيرا جسم التتر تحسب على أساس انقطاع المعرفة بفرض ضوابط الفيروس والخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 . تخطيط لوحة المقايسة MN. هي تضعف الأمصال إبطال الحرارة مسبقاً في 01:10، ثم التسلسل 2-fold المخفف في لوحات 96-جيدا في العمود 1-10. يتم فرض ضوابط الفيروسات (الفيروسات والخلايا فقط، لا سيرا) والخلية (الخلايا فقط، أي فيروس ولا سيرا) في عمود 12. يتم استخدام العمود 11 للأمصال المعايرة أو عنصر التحكم مرة أخرى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 . اختبار نتائج الفحص MN الأمصال البشرية ضد الفيروس A/هونغ كونغ/4801/2014 A(H3N2) باستخدام خلايا مدك-SIAT1- تم اختبار الأمصال من التطعيم ضد الإنفلونزا الموسمية قبل وبعد-2016-17 اثنين من المرضى ضد الفيروس A/هونغ كونغ/4801/2014 A(H3N2) باستخدام خلايا مدك-SIAT1. هي تحييد التتر المتبادلة لتمييع المصل أعلى يحقق تحييد الفيروسات % إيه فايف زيرو، كما هو مبين بالأسهم في كل منحنى. المريض 1: عيار التطعيم قبل < 10، بعد انتهاء التطعيم عيار 40؛ 2:pre المريض-التطعيم عيار 320، عيار التطعيم بعد > 1,280.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

والرزن مينيسوتا واحد من الاختبارات الرئيسية المستخدمة للأنفلونزا الأمصال للكشف عن استجابات الأجسام المضادة بعد الإصابة بالإنفلونزا أو التطعيم. كثيرا ما تستخدم التتر المتولدة من فحوصات دقيقة النتيجة الأولية للعديد من الدراسات السيرولوجية الإنفلونزا. فحوصات دقيقة تستخدم على نطاق واسع أيضا لتشخيص المصلية، وتقييم لقاح الاستمناع. وأجريت الدراسات المعمل بين الوكالات الدولية مقارنة MN فحوصات أجريت في مختبرات متعددة14.

على عكس مرحبا، يستهدف الإنزيم MN مباشرة قياس الأجسام المضادة الوظيفية التي يمكن تحييد الإصابة بعدوى الفيروس في خلية ثقافة. وهناك أشكال مختلفة من فحوصات MN المستخدمة في المختبرات الميدانية حول العالم. القراءة لفحوصات (أي، الحد من العدوى الفيروس حضور تحييد الأجسام المضادة) يمكن أن تستند إلى أليسا التحديد الكمي للفيروس أضداد NP، ها القياس الكمي للفيروس، أو تلطيخ المناعية لويحات الفيروس في كل بئر وبعد الإصابة بعدوى الفيروس وجود الأجسام المضادة والحضانة في خلية الثقافات14،15. أشكال مختلفة من اللوحة فلوري-على أساس الحد من تحييد فحوصات (مثلاً، فحوصات الحد من التركيز وفحوصات فيروسبوت) غالباً ما تستخدم لوصف مستضدي عدد كبير من فيروس الإنفلونزا الحقل يعزل، جزئيا بسبب الفيروس منخفضة المبلغ المطلوب في هذه فحوصات15،16. لوصف استجابات الأجسام المضادة للأنفلونزا في الأمصال البشرية، أساس أليسا 2 يوم MN المقايسة هو الذي أوصت به منظمة الصحة العالمية (WHO) شبكة مراقبة الإنفلونزا العالمية لتشخيص الإنفلونزا3المصلية. هذا الأسلوب يستخدم أيضا على نطاق واسع في الدراسات الوبائية المصلية، وتقييم الاستجابات الضد عقب التطعيم ضد الإنفلونزا. أنه أساسا بالكشف عن الأجسام المضادة للأنفلونزا هكتار سطح البروتين و وبالتالي يمكن الكشف عن الأجسام المضادة الخاصة بسلالة الوظيفية.

هنا، يمكننا وصف المقايسة MN المستندة إلى أليسا التي تستخدم الخلايا مدكك-SIAT1 2-يوم. هو الأمثل لهذا الفحص للكشف عن تحييد الأجسام المضادة للفيروسات A(H3N2) المعاصرة في الأمصال البشرية. ينبغي النظر في العديد من الخطوات الهامة عند أداء مينيسوتا فحوصات باستخدام خلايا مدك-SIAT1. أولاً، ينبغي أن باساجيد مدك-SIAT1 الخلايا في ثقافة وسائل الإعلام التي تحتوي على سلفات G418 الحفاظ على استقرار كدنا αSIAT1 البشرية في خط الخلية. سلفات G418 (مثلاً، جينيتيسين) غير مطلوب في وسائل الإعلام أثناء نشر الفيروسات وفحوصات دقيقة باستخدام خلايا مدك-SIAT1. ينبغي أن يكون الخلايا المستخدمة في فحوصات دقيقة في مرحلة النمو سجل مع كونفلوينسي 75-95%. مخزون الفيروسات جيدة، والثانية ضرورية من أجل القيام بفحوصات دقيقة ناجحة. ينبغي أن يكون مخزون فيروس العدوى مرتفعة قياسا بمعايرة50 تسيد والحد أدنى من جسيمات معيبة. ينبغي أن يكون إضعاف الحد الأدنى من مخزون فيروس لتحقيق 100 تسيد50/والفيروس مساوية أو أكبر من 1: 100. على الرغم من أن كلا من البيض وخلية باساجيد الفيروسات يمكن استخدامها في فحوصات MN، مدك-SIAT1 خط الخلية تحتفظ أفضل الاستقرار الوراثي لنشر 3C.2a و 3C.3a A(H3N2) الفيروسات7. بعد انتشار الفيروس، ينبغي أن تسلسل جينات هكتار و NA مخزون فيروس التأكد من أن أية ثقافة البيض أو الخلية يتم إدخال تكييف الطفرات في مواقع مستضدي الرئيسية التي قد تتسبب في تغييرات في أنتيجينيسيتي الفيروس المستخدمة في الفحص. ثالثا، ينبغي أن تكون كمية الفيروسات المعدية المستخدمة في كل فحص بعناية معاير والتحقق منها مع إدراج معايرة مرة أخرى لكل الفيروسات بكل مقايسة. قد الكثير من الفيروسات المستخدمة في الفحص التتر جسم اكتشاف وتقليل حساسية المقايسة. وبالمثل، سوف يسبب فيروس ضئيل جداً المستخدمة في الفحص إشارات VC ضعيفة والخلفيات عالية (CC)، ونتائج إيجابية خاطئة. وبالتالي، من المهم أن تشمل الأمصال المناسبة الرقابة الإيجابية والسلبية في فحوصات لمراقبة الأداء. عند مقارنة استجابات الأجسام المضادة للفيروسات متعددة باستخدام الأمصال نفس، أنها حاسمة لضمان أن المعايرة مرة أخرى من جميع الفيروسات ضمن نطاق مقبول.

والرزن MN استخدام الخلايا مدكك-SIAT1 حساسة ومحددة في الكشف عن استجابات جسم المعاصرة 3C.2a و 3C.3a A(H3N2) فيروسات الإنفلونزا في الأمصال البشرية، بما في ذلك antigenically جنحت A(H3N2) الفيروسات6. وقد استخدمت هذا التحليل تقييم الأمصال البشرية تطعيم لوحات للفيروسات A(H3N2) 3C.2a و 3C.3a بعد إبطال الإنفلونزا التطعيم5،17،18. بيد أنه كما الإنفلونزا الفيروسات مواصلة الحصول على الطفرات التي يمكن أن يغير أنتيجينيسيتي وخصائص ربط مستقبلات لفيروسات وتسبب الانجراف مستضدي، يلزم بذل جهود مستمرة لتحسين فحوصات الأمصال الإنفلونزا الموجودة بغية الحفاظ على الحساسية والنوعية المطلوبة لوصف فيروسات الإنفلونزا الناشئة الجديدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

واضعي التقرير لا تضارب في المصالح. النتائج والاستنتاجات الواردة في هذا المنشور هي آراء المؤلفين ولا تمثل بالضرورة آراء المراكز "السيطرة على الأمراض" والوقاية ووكالة التمويل.

Acknowledgments

ونحن نشكر الدكتور سو لو، والدكتور ليو فنغ، والسيدة أشلي بوروز من "شعبة الإنفلونزا" التابعة لمركز السيطرة على الأمراض لاستعراض دقيق وتقديم المساعدة في إعداد هذه المخطوطة. ونحن نشكر الدكتور أدريان ريبر من "شعبة الإنفلونزا" من مركز السيطرة على الأمراض لمساعدته في إعداد الرسومات في الشكل 3. وأخيراً، نشكر الدكتور م. ماتروسوفيتش، ماربورغ، ألمانيا لتوفير خلايا مدكك-SIAT1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose Life Science 11965 A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30070.03
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free Sigma-Aldrich 3117332001
L-Glutamine Life Science 25030-081
Sodium pyruvate Life Science 11360-070
Geneticin G-418 disulfate salt  Sigma-Aldrich A1720-5G  
HEPES Life Science 15630-080
Penicillin/Streptomycin Life Science 15140-122
Acetone VWR 67-64-1 Used at an 80% concentration
Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate  Sigma-Aldrich SLBF2806V
O-Phenylenediamine Dihydrochloride tablet Sigma-Aldrich SLBQ1086V 1 tablet per 100ml of cell culture grade water
Sulfuric Acid Fisher Scientific A510-P500 Used 0.5M final concentration
Ethanol, Denatured, 4L VWR EM-AX0422-3 Used at an 70% concentration
Trypsin-EDTA Life Science 1748048
RDE II "Seiken" Denka Seiken 370013
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379-500ml
Anti-NP mouse monoclonal Ab Millipore pool MAB 8257 MAB 8258
Anti-mouse IgG HRP  KPL 074-1802
96-well flat-bottom plates Thermo Scientific 3455
Plate reader Molecular Device Spectromax 384 plus
Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap Corning/VWR 3151

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reber, A., Katz, J. Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection. Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).
  2. Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. Correlates of protection against influenza infection in humans--on the path to a universal vaccine? Curr Opin in Immunol. 25, 470-476 (2013).
  3. WHO Global Influenza Surveillance Network. Manual for the labratory diagnosis and virological surveillence of influenza. , http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548090_eng.pdf (2011).
  4. Govorkova, E. A., Kodihalli, S., Alymova, I. V., Fanget, B., Webster, R. G. Growth and immunogenicity of influenza viruses cultivated in Vero or MDCK cells and in embryonated chicken eggs. Dev Biological Stand. 98, discussion 73-34 39-51 (1999).
  5. WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the northern hemisphere influenza season. , http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/201703_recommendation.pdf?ua=1 2017-2018 (2017).
  6. Levine, M. Z., et al. Neutralizing Antibody Responses to Antigenically Drifted Influenza A(H3N2) Viruses among Children and Adolescents following 2014-2015 Inactivated and Live Attenuated Influenza Vaccination. Clin Vaccine Immunol : CVI. 23, 831-839 (2016).
  7. Lin, Y., et al. The characteristics and antigenic properties of recently emerged subclade 3C.3a and 3C.2a human influenza A(H3N2) viruses passaged in MDCK cells. Influenza Other Respir Viruses. , (2017).
  8. Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment? J of Virol. 84, 6769-6781 (2010).
  9. Skowronski, D. M., et al. Mutations acquired during cell culture isolation may affect antigenic characterisation of influenza A(H3N2) clade 3C.2a viruses. Euro Surveillance. 21, 30112 (2016).
  10. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2,6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J of Virol. 77, 8418-8425 (2003).
  11. Oh, D. Y., Barr, I. G., Mosse, J. A., Laurie, K. L. MDCK-SIAT1 cells show improved isolation rates for recent human influenza viruses compared to conventional MDCK cells. J Clin Microbiol. 46, 2189-2194 (2008).
  12. US Department of Health and Human Services. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2009).
  13. Reed, H. M. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, (1938).
  14. Laurie, K. L., et al. International Laboratory Comparison of Influenza Microneutralization Assays for A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and A(H5N1) Influenza Viruses by CONSISE. Clinical Vaccine Immunol : CVI. 22, 957-964 (2015).
  15. Lin, Y., Gu, Y., McCauley, J. W. Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay. J Vis Exp : JoVE. , (2016).
  16. van Baalen, C. A., et al. ViroSpot microneutralization assay for antigenic characterization of human influenza viruses. Vaccine. 35, 46-52 (2017).
  17. WHO. Recommended composition of infleunza virus vaccines for use in the 2015-2016 northern heamisphere infleunza season. , http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/2015_16_north/en 2015-2016 (2015).
  18. WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2016-2017 northern hemisphere influenza season. , http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/201602_recommendation.pdf?ua=1 2016-2017 (2016).

Tags

الأمراض المعدية، ومسألة 129، A(H3N2) الإنفلونزا الفيروسات، مدك-SIAT1، درياقي، تسيد، تحييد الأجسام المضادة، الحصانة
قياس الإنفلونزا تحييد ردود الأجسام المضادة للفيروسات A(H3N2) في الأمصال البشرية قبل درياقي فحوصات باستخدام خلايا مدكك-SIAT1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gross, F. L., Bai, Y., Jefferson,… More

Gross, F. L., Bai, Y., Jefferson, S., Holiday, C., Levine, M. Z. Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells. J. Vis. Exp. (129), e56448, doi:10.3791/56448 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter