Summary
מחקרים ארוכי טווח חיוניים להבנת תהליך האבולוציה ולא על מנגנוני הסתגלות. באופן כללי, מחקרים אלה דורשות התחייבויות מעבר חיים החוקרים. . הנה, שיטה חזקה מתואר באופן דרמטי ההתקדמות איסוף נתונים המדינה-of-the-art להפיק נתוני האורך בתוך מערכות טבעיות.
Abstract
מחקרים ארוכי טווח מאפשרות זיהוי תהליכי eco-אבולוציוניים המתרחשים לאורך פרקי זמן ארוכים. בנוסף, הם מספקים מפתח בנתונים אמפיריים הנתנות ב דוגמנות חזוי לתחזית אבולוציונית תגובות של מערכות אקולוגיות טבעיות לשינויים סביבתיים בעתיד. עם זאת, לא כולל כמה מקרים חריגים, מחקרים ארוכי טווח ואספקות נדירים בגלל קשיים לוגיסטיים הקשורים עם גישה לדוגמיות טמפורלית. דינמיקה טמפורלית נלמדים לעתים קרובות במעבדה או בניסויים מבוקרים mesocosm עם מחקרים יוצאי דופן לשחזר את האבולוציה של אוכלוסיות הטבעי בטבע.
. הנה, סטנדרטי (SOP) מסופק להחיות או להחיות רדום דפניה magna, זן keystone זואופלנקטון נרחבת של המערכת האקולוגית הימית, לקדם באופן דרמטי את אוסף נתוני האורך המדינה-of-the-art מערכות טבעיות. בתחום אקולוגיה תחיית המתים הוגדרה בשנת 1999 על-ידי Kerfoot ועמיתים לעבודה, אף-על-פי הראשון ניסיונות הבקיעה diapausing זואופלנקטון ביצים תאריך חזרה בסוף שנות השמונים. מאז העיתון הזרע של Kerfoot, המתודולוגיה של לאוהדיו זואופלנקטון מינים לעתים קרובות יותר ויותר הוחל, למרות הופץ בין מעבדות רק באמצעות העברה ישירה הידע. כאן, הנוהל המתואר המספק פרוטוקול שלב אחר שלב על העשייה לאוהדיו רדום דפניה מגנה ביצים.
שני מחקרים מרכזיים ניתנים ב אשר תגובת כושר לתחייה דפניה מגנה לאוכלוסיות ההתחממות נמדד, ניצול היכולת ללמוד לאוכלוסייה היסטוריים ומודרניים באותן ההגדרות. לבסוף, נדון היישום של טכנולוגיות רצף ' הדור הבא ' בשלבים לתחייה או עדיין רדום. טכנולוגיות אלה מספקים כוח חסר תקדים בניתוח של תהליכים ומנגנונים של האבולוציה, אם חלה על אוכלוסיות שעברו שינויים בלחץ הבחירה לאורך זמן.
Introduction
מחקרים ארוכי טווח הם קריטיים להבנת תהליכים אקולוגי ואבולוציוני בטבע, בהערכת להגיב וכיצד נמשכות במהלך שינוי סביבתי1מינים. זה בגלל תהליכי eco-אבולוציונית לקרות על פני דורות, שינויים בסביבת מתקיימים לאורך זמן טווחי זמנים. יתר על כן, מחקרים ארוכי טווח לספק מפתח בנתונים אמפיריים, לשפר את הדיוק של דוגמנות חזוי לתחזית אבולוציונית תגובות של מערכות אקולוגיות טבעיות שינויים סביבתיים2. הדיוק של מודלים אלה היא קריטית כדי ליישם אסטרטגיות ניהול ושימור לשמירה על המגוון הביולוגי שירותי המערכת האקולוגית.
לא כולל כמה מקרים יוצאי דופן (למשל, גלפאגוס דארווין פרושים3 ואצות4), מחקרים ארוכי טווח מוגבלים בעיקר מינים עם זמן דור קצר, אותם ניתן להפיץ ב מעבדה5,6 , 7 , 8. לפיכך, התהליכים דינמיקה אבולוציונית לגורם המרכזי עליו מושתתת נשארים חמקמקים. בגלל קשיים לוגיסטיים הקשורים עם גישה לדוגמיות הטמפורלי, בנתונים אמפיריים נלמדים בתדירות גבוהה יותר ב מרחבית יותר בהקשר הטמפורלי, תהליכי eco-אבולוציונית טמפורלית להסיק או המודל של נתונים מרחביים. גישה זו מכונה 'מרחב-עבור-time' החלפת9, לפיה שטח מאומצת כתחליף בחקר דינמיקה אבולוציונית טמפורלית. המגבלה העיקרית ההחלפה 'מרחב-עבור-time' היא כי המחירים של הסתגלות המרחבי בקני מידה שונים נבדלים וריאציה טמפורלית מאותה אוכלוסייה; לפיכך, מסקנות בהתבסס על החלפה של זמן עם שטח הם משוחד10.
חלופה רב עוצמה המאפשר לימוד דינמיקה אבולוציונית של מערכות אקולוגיות טבעיות לאורך זמן הוא הניתוח של שינויים אקולוגיים ולא גנטי במין בהפקת שלבים רדום11. אלה שלבים רדום לארכיון ביולוגי טופס מרובדת שניתן באופן מדויק מיום ולצבור paleolimnologically מאופיין12,13. חשוב, השלבים האלה רדומים יכולים להיות החיינו ומשמשת בניסויים במעבדה, איפה את תגובתם אבולוציונית השינוי הסביבתי ניתן למדוד ישירות. אוכלוסיות ההיסטורי יכול להיות התחרו נגד צאצאיהם מפותחת המודרנית ללמוד כושר שינויים והפונקציה של גנים מתפתח בשלב עם שינוי סביבתי14,15,16.
שלבים רדום כוללים זרעים, ציסטות, נבגים, ביצה בנקים. למרות המחקרים הראשונים על החיו ביצים רדום שתחילתה בסוף שנות השמונים17ו קומץ של מחקרים החלת טכניקה זו בתחילת שנות ה-9018,19, בתחום אקולוגיה התחייה היה באופן רשמי הוקמה על ידי העיתון החלוצי של Kerfoot ועמיתים 199920. פרקטיקה זו הוחל בעיקר בתחום paleolimnological שחזורים של מים מתוקים מינים17,21,22. עם זאת, שוחד אינה זמינה עדיין. כאן, מספק תיאור צעד אחר צעד של פרוטוקול תחיית המתים שהוחל ביצים רדום של המין זואופלנקטון דפניה magna , מן הדוגמאות של שנלכד להקמת תרבויות המשובטים הוולדות. הצעדים של ה-SOP המתעכבים ברצון מינים אחרים של דפניה, כמו גם פעולות שעשויות לדרוש נוספים מיטוב, הם דנו.
דפניה הם מים מתוקים zooplankters נוכח ברוב המכריע של בתי גידול lotic23 . דפניה מינים הם גם parthenogens אל-זוויגית או מחזורי גידול. מאגנה ד הוא parthenogen מחזורית מתרבה clonally תחת תנאים סביבתיים נוחים24. כאשר התנאים הסביבתיים להתדרדר, ייצור זכר מתרחשת ומוביל רקומבינציה מינית את היווצרות של הביצים זה להיכנס למצב של תרדמה מוגן מן הסביבה על-ידי תיק כיטין שנקרא ephippium. שיעור של הביצים רדום בוקעות תנאים סביבתיים נוחים חוזרים. עם זאת, חלק גדול של הבנק הביצה הרדומה מעולם לא יש סיכוי לבקוע, ובכך לבנות את ארכיון ביולוגי לאורך זמן. שלבים רדום שישאר קבור ב המשקע של אגמים, בריכות, יכול להיות לתחייה לחקר דינמיקה אבולוציונית לאורך פרקי זמן ארוכים. כיוון ביצים רדום של magna ד הם התוצאה של רקומבינציה מינית, הן ייצוג טוב של המגוון הגנטי הטבעי של מינים25. יתר על כן, הם יכולים להישמר דרך רבייה המשובטים במעבדה. מאפיינים אלו מספקים את היתרון הייחודי של אורגניזמים דגם isogenic, תוך שמירה על המגוון הגנטי טבעי.
שני מחקרים מפתח מוצגים כדי להדגים את היתרונות של ישירות השוואת היסטוריים ומודרניים צאצאי האוכלוסייה באותו מגנה ד חווה לחץ סביבתי הבחירה לאורך זמן. מאגנה ד דגימות שהוקמו לתחייה מן האגם טבעת (דנמרק), רדוד (עומק 5m; פני 22 ha) בריכה מעורבת שחווה גידול ממוצע טמפרטורה, גלי חום שמתרחשת לאורך זמן. אוכלוסיות מגנה ד (sub) היו לתחייה לאורך זו הדרגה הזמנית המתפרסות על-פני 60 שנה (1960-2005) ולמד לחקור תגובה אבולוציונית טמפרטורה להתחממות. במחקר הראשון בניסוי גן משותף, שינויים בכושר-מקושרים על החיים תכונות נמדדו בתגובה לעלייה בטמפרטורה של C ° +6, בקו אחד עם הנבואה של הפאנל הבין-ממשלתי לשינוי האקלים 100 השנים הקרובות 26. במחקר השני, ניסוי mesocosm שימש כדי למדוד את יכולותיהם תחרותי של שלושת האוכלוסיות (sub) תחת התחממות כדור הארץ. ניסויים אלה בשילוב מראים כי בנוכחות של התחממות כדור הארץ כמו הלחץ היחיד, כל תכונות היסטוריית החיים של אוכלוסיות להציג רמה גבוהה של פלסטיות יכולות תחרותי שווה. ממצאים אלה מראים כי ההתחממות כמו מצוקה מטיל עלויות משמעותי כושר, לפחות בקרב האוכלוסייה למד כאן.
Protocol
ה-SOP הבאים מספק תיאור צעד אחר צעד של פרוטוקול המשמש כדי להחיות דפניה מגנה ביצים רדום, כולל תיאור מפורט של דגימה, בידוד של ephippia מתוך משקע ולאחר הקמתה של תרבויות המשובטים ( איור 1).
איור 1: מדריך שלב אחר שלב תחיית דפניה magna. משקעים של גידול טבעי מים מתוקים (A) נדגמים עם corer בוכנה (B). ליבת משקעים (C) הוא חתך בשכבות מצטבר של 1 או 0.5 ס מ (D). כל שכבה של משקעים מאוחסן בתוך שקית נעילת מיקוד מדגם (E) בתנאים אפל וקר (4 ° C). כל שכבה של משקעים נשקלים, sieved באמצעות הנפות גיאולוגי (1 מ מ ו- 125 µm רשת גדלים, F). רקע לבן מגשים משמשים כדי לבודד דפניה מגנה ephippia (G). Decapsulated רדום ביצים (H) הועבר צלחות פטרי, חשופים לגירויים אור וטמפרטורה לזירוז הבקיעה. הוולדות מועברים להפרדת צנצנות (אני) להקים קווי isoclonal. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
1. דגימה של משקעים ליבות
- משקע דוגמת אגמים או בריכות באמצעות corer בוכנה. פרוטוקול זה משמש ביג בן27, שפופרת הליבה של-1.5 מ' אורך בקוטר צינור פנימי של 14 ס מ. ביג בן כולל בוכנה על חבל וראש corer, שאליו מחוברים מוטות לנסוע ברכבת התחתית לתוך המשקע. תופס הליבה עזרי התמיכה של הצינור הליבה כאשר מלא של משקעים. כדי הבלטת המשקע, מסגרת שומרת את הצינור הליבה זקופה ועל נייח, ומשמש שקע בקבוק ששונה כדי לדחוף את הבוכנה כלפי מעלה במהלך תהליך ההבלטה (1 וידאו משלימים).
- בריכות רדודות של פחות מ- 1 מ' עומק, להשתמש corer הכבידה פלקסיגלס של לא יותר מ 6 ס מ מקוטר מוכנס באופן ידני המשקע.
- עבור אגמים עמוקים (> 6 מ' עומק), להשתמש ליווינגסטון בוכנה corers28 או כונן יחיד גריפית משקעים corers עם כל העזרים סירה צף מעוגן. Corer בוכנה רוד ליווינגסטון-סוג הכונן ניתן להשתמש במים עד כ- 30 מ' עמוק כדי לאסוף את הכוננים מטר רצופים של רכות אל אגם המאוחדים משקעים. Corer גריפית כונן יחיד מורכב ראש הליבה פשוט אך חזקים המתחברת צינורות סטנדרטי פוליקרבונט המוטות כונן ליווינגסטון. Corers הם דחפו לתוך המשקע עם המוטות, ומספק בוכנה היניקה לצורך ההתאוששות של משקעים (איור 2).
- לאחזור רציפה, ללא הפרעה ליבות, להשתמש vibracoring. אלה corers לעבוד על מגוון עומקי המים, באפשרותך לאחזר דגימות באורכים שונים, בהתאם פטרולוגיה משקעים. משרעת נמוכה רטט המועבר מהראש vibracore כלפי מטה דרך הקנה המצורפת או צינור ליבה liquefies משקעים, הפעלת החבית הליבה קשורה יחידת vibracore לחדור לתוך המשקעים נוזלי. איזה vibracorers קטן, קל משקל ונייד, אחרים הם יחידות כבד גדול ניתן לפרוס רק מכלי גדול. הבחירה של corers תלויה פטרולוגיה של משקעים.
- פורסים את ליבת אופקית בשכבות מצטבר של 1 ס מ או פחות באמצעות משטח המתכת השטוחים (1 וידאו משלימים). משקעים corers כמו זה המשמש כאן נועדו להפחית לחצים הידרוסטטי על שחול, הפחתת הפרעה של שכבות משקע. כאשר משתמשים אחרים corers, הקליפה החיצונית של כל אחת מהשכבות משקעים יוסרו עם מעין לשירי להב להגבלת זיהום בין שכבות.
- לאסוף את כל שכבה משקעים בשקית נפרדת דגימה (1 וידאו משלימים), לאחסן חשוך וקר (4 ° C) תנאים.
- לאסוף מינימום של 5 גר' משקעים מכל השכבות עבור תיארוך רדיומטרי. כמו תיארוך רדיומטרי הוא פרוטוקול מבוסס על תיאור מפורט של היכרויות וזמינותו, עיין פרסומים קיימים12,13.
איור 2: קריקטורה של הבוכנה גלעון הליך. בוכנה corer, צינור חלול בחותם פנימיות הזזה (הבוכנה) מייצרת שואב חלש. כאשר הבוכנה נוגע הממשק משקעים-מים, המשקל דוחף את הקנה הליבה לתוך המשקע וגורם הוואקום המשקע להיות מכוסה להיכנס ולעבור את הצינור מבלי להפריע את שכבות המשקע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
2. ניפוי של שכבות משקע
- באמצעות סולם precision, שוקלים כל שכבה משקעים לשימוש עתידי. להשתמש את שטח הפנים ואת משקל לחישוב הצפיפות מינים באגם.
- ניפוי כל שכבה משקע באמצעות שתי הנפות גיאולוגי נערמו אחד על גבי השני. המסננת הראשונה יש גודל רשת של 1 מ מ, מפריד קליי, חסרי חוליות גדולים, חלקיקי החומר, למשל זרעים, צמחים וחרקים, בין שאר המשקע. המסננת השנייה יש רשת של 125 µm, מפריד ephippia מנגה ד וחלקיקים קטנים בין שאר המשקע (2 הסרטונים משלים).
-
העברת aliquots קטן של השבר משקעים שנאספו על גבי מסננת רשת 125 µm מגש רקע לבן. בהתאם לסוג של משקעים, aliquots קטן או גדול יותר של המשקע עשוי להיות מועבר בכל מועד.
- הוסף אמצעי אחסון קטן (עד 200 מ ל) של מדיום למגש לבן דגימה מחדש להשעות את השבר משקעים שהועברו, להקל על העין הבחינה של ephippia (איור 3). המדיום נהגה resuspend המשקע יכול להיות dechlorinated מי ברז, מים קדח, משולבת29או אדם בינוני (Aachener Daphnien)30. בעתיד, המונח 'בינוני' ישמש כדי להפנות או כל הפתרונות המפורטים.
איור 3: דפניה magna ephippium. רדום דפניה מגנה ביצים מיד לאחר decapsulation. את ephippium (א), קרום ביצה הפנימי (B), את הביצים רדום (C) מוצגים. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר.
3. decapsulation של Ephippia, הבקיעה
- בעזרת פיפטה פסטר חד פעמיות או באמצעות מלקחיים microdissection, העברה ephippia בודדים כדי פטרי מלא 10 מ"ל של מדיום. להשתמש לפחות צלחת פטרי לכל שכבה של משקעים.
- תחת מיקרוסקופ סטריאו, decapsulate כל ephippia באמצעות מלקחיים microdissection על-ידי אילוץ פתח המקרה כיטין (3 הסרטונים משלים). הסרת קרום פנימי מנוחתו ביצה בעדינות, תשומת לב לא לשבש את הביצים, ומעבירים אותם אל הפטרי מלא בינונית בעזרת פיפטה של פסטר. Decapsulation מגבירה הצלחה הבקיעה מגנה ד; עם זאת, ייתכן שלא יהיה צורך או זה יכול להיות מאתגר עבור מינים אחרים- דפניה בהפקת ephippia קטנים יותר.
- לחשוף את הביצים decapsulated ספקטרום מלא יום ארוך photoperiod אור (16:8 בהירה: כהה), טמפרטורה גבוהה (20 ± 1 ° C) לזירוז הבקיעה טמפרטורה מבוקרת התקן (אינקובטור) או חדר. הבקיעה מתרחשת בין 48 שעות מספר שבועות (עד ארבע; הסרטונים משלים 4). בהעדר decapsulation, ישירות לחשוף את ephippia כדי הבקיעה גירויים (זמן photoperiod באור יום (16:8 בהירה: כהה), טמפרטורה גבוהה (20 ± 1 ° C)).
4. יצירת שורות Isoclonal magna דפניה
- להקים קווי isoclonal של הוולדות יחיד על ידי העברת הפרט מגנה ד מ שלב 3.3 להפרדת צנצנות מלאים 200 מ של מדיום באמצעות פיפטה חד פעמיות של פסטר. כל אדם שונה גנטית, להיות התוצאה של רקומבינציה מינית.
- לשמור על קווים isoclonal ללא הגבלת זמן בתנאים מניות בהיקף של 10 ± 1 ° C, 16:8 משטר בהירה: כהה, מדי שבוע נמאס 0.2 מ ג ג/L של כלורלה דלקתית או אצות אחרות (למשל, Scenedesmus obliquus). לחדש את המדיום כל השבוע... תנאי המניות עשויים להשתנות עם טמפרטורה, האכלה משטרים, ומינים.
5. מפתח מחקרים
הערה: תיאור של שני מחקרים מרכזיים מסופק שבו לתחייה D.magna (sub) משמשים אוכלוסיות מתוך ארכיון משקע של אגם טבעת (דנמרק) כדי להעריך את התגובה אבולוציונית להתחממות. שלוש אוכלוסיות (sub) שהוקמו לתחייה מתוך פרקי זמן הבאים: 1960-1970, 1970-1985, ו > 1999. מאגנה ד הבקיעה הצלחה מתוך ארכיון משקע נע בין 11 ל- 58% (איור 4). מן הצאצאים המתקבלים בכל timeperiod, תת-קבוצה אקראי נבחר עבור שני מחקרים המפתח המתוארים כאן. מחקרים אלה נועדו להעריך אוכלוסיות (sub) לתחייה מתקופות שונות לאורך מעבר הצבע החום הראה הבדלים תכונות היסטוריית החיים מקושרים-כושר (5.1) והאם היה להם יכולות שונות תחרותי (5.2). לאחר חשיפה התחממות כדור הארץ.
איור 4: הבקיעה הצלחה בארכיון משקע לטעום מן אגם טבעת. חלקם של הוולדות מוצלחת לאורך הארכיון משקע של הטבעת אגם המשמש ללימודי מפתח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
-
ניסויים גן משותף
- להעביר את הוולדות עשר לכל האוכלוסייה (sub) מתרבויות מניות לתנאים גן משותף: 16 ° C; photoperiod ארוך (16:8 בהירה: כהה השלטון); להאכיל מדי יום עם 0.8 מ ג ג/L של כלורלה דלקתית, וחידוש בינוני בכל יום שני. לשמור על הצאצאים בתנאי גן משותף במשך לפחות שני דורות (ca. 45 ימים). מצבים שכיחים גן להפחית הפרעות האפקט אימהי וסנכרן רביה אצל הוולדות.
- מתבסס העדר השני אל החדר שבוחרים להעביר הבוגרת הדור השני 500 מ"ל צנצנות מלאים בינוני עד שישחררו דגירה שני בני נוער.
- באופן אקראי להעביר קטינים בודדים של ה' 24-48, נולד מן הפסיונים השני לדור השני, צנצנות 100 מ ל מלא בינונית, נחשפים ניסיוני התנאים הבאים: 18 ° C (הנוכחי טמפרטורה באגם) ו 24 ° C (התחממות, טמפרטורה תחזית על ידי IPCC 26 השנים 100 הקרובה), 16:8 המשטר בהירה: כהה, ו הזנה יומית 0.8 מ"ג ג/ליטר של Chlorellavulgaris.
- על כל בעל חיים ניסיוניים, למדוד את הגודל בעת הפירעון עם stereomicroscope כמו המרחק בין הראש לבין הבסיס של עמוד השדרה הזנב (איור 5). לצלם כל בעל חיים, לאחר מכן לנתח את גודלו באמצעות תוכנה מתאימה התמונה.
- למדוד את גיל הבגרות: היום שבו ביצים הם נצפו בפעם הראשונה בבית הבליעה מיוחמת.
- למדוד את התמותה: מספר האנשים נכחד במהלך הניסוי.
- למדוד את פוריות: המספר הכולל של הצאצאים שוחרר ברבייה הראשון, השני המשובטים.
- למדוד את קצב גידול האוכלוסייה, באמצעות משוואת אוילר (1):
(1)
איפה lx שיעור הישרדות-גיל x, bאקס הוא המספר של neonates מיוצר לכל אדם ששרד-גיל xו- r הוא מהותי קצב הגידול הטבעי. - לבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנה זמינים מסחרית. . הנה, תשתמש R31 כדי להתוות התגובה נורמות (ביטוי פנוטיפי של גנוטיפ יחיד לרוחב סביבות) עבור כל תכונה ההיסטוריה, באמצעות החבילה ggplot2. לחשב שיעורי התמותה לכל האוכלוסייה באמצעות ניתוח הישרדות (R חבילת rms; https://cran.r-project.org/web/packages/rms/rms.pdf). לבסוף, לבצע של השונות (ANOVA, בטבלה 2) ב- R31 כדי להעריך אם השפעת הטמפרטורה על תכונות יכולה להיות מוסברת ע י האבולוציה (הבדלים בין האוכלוסיות), פלסטיות (התגובה לטיפול), או התפתחות פלסטיות (אוכלוסיה x טיפול).
-
תחרות ניסוי
- להעביר הוולדות עשר לכל האוכלוסייה מתרבויות מניות מצבים שכיחים גן: 20 ° C, זמן photoperiod (16:8 בהירה: כהה המשטר), להאכיל מדי יום עם 0.8 מ ג ג/L של כלורלה דלקתית, ולחדש בינוני בכל יום שני. לשמור על תנאים גן משותף לפחות שני דורות (ca. 45 ימים) להפחית הפרעות מתופעות אימהי.
- באופן אקראי להקצות חמישה קטינים של 24 עד 48 שעות של הפסיונים שני גדולי הדור השני אבקוע כל ניסיוני mesocosms (20 L פלסטיק aquaria מלא בינוני), ב- triplicates, על צפיפות של חיות 10/ל'
- לחשוף את mesocosms עד 24 ° C, 16:8 L:D משטר, ולא להאכיל מדי יום עם 0.8 מ ג ג'/ליטר של Chlorellavulgaris טמפרטורה מבוקרת קאמרית או חממה לקבוצות של ארבעה שבועות (> 3 דורות המשובטים).
- ללקט כל mesocosm שבועי, מרעננים 10% של המדיום כדי לדמות דינאמי האוכלוסייה דפניה עשוי להיתקל בהן בסביבה הטבעית. להטיל ליקוט על-ידי הסרת אמצעי אחסון הידוע של בינונית ובעלי חיים ממי האקווריום (1.2 L במקרה זה), ולא על-ידי החלפת האחסון שנקצרו בינוני טריים. להפעיל את המשטר culling לאחר החיות ניסיוני להגיע לבגרות (יום 10).
- בסוף השבוע הרביעי, לטעום 32 חיות מכל כל mesocosm כדי להעריך משמרות בהרכב genotypic לעומת inoculum הראשוני.
- מקום בודדים דפניה צינורות microcentrifuge ולהסיר עודפי נוזלים בעזרת פיפטה פסטר.
- פלאש להקפיא צינורות בודדים חנקן נוזלי, חנות ב-80 מעלות צלזיוס.
- לחלץ הדנ א מ בודדים באמצעות הפרוטוקולים הזמינים ואת ההוראות של היצרן.
- להגביר את ה-DNA שחולץ באמצעות מספר סימונים גנטיים מספיק לספק של גנוטיפ multilocus ייחודי לכל אבקוע. . הנה, 8 לוויינים מסודרים מתחם בתי קולנוע יחיד (M01, טבלה 1) שימשו בעקבות פרוטוקולים הוקמה32,33.
- גנוטיפ מוגבר קטעים על מנתח פרגמנט.
- לערוך ניתוח שבר עם תוכנה מסחרית או זמינה בחופשיות באמצעות תקן בגודל מתאים.
- להעריך הרכב genotypic בסוף הניסוי על ידי יחידים genotyping 32 עם סט של microsatellite לוקוסים כמו שמתואר33ו חישוב התדירות של כל גנוטיפ בסוף הניסוי לעומת inoculum הראשוני.
(1)
איור 5: נקבה בוגרת דפניה magna. למבוגרים נקבה דפניה magna parthenogenetic ביצים בבית הבליעה שבוחרים. המרחק בין הראש לבין הבסיס של עמוד השדרה הזנב משמש למדידת גודל של החיה. הקווים האדומים מסמנים את מידות גודל. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר.
Representative Results
בנתונים אמפיריים לטווח ארוך הם קריטיים להבנת דינמיקה אבולוציונית, ההתמדה של אוכלוסיות טבעי. נתונים כאלה הם בדרך כלל מאתגרת כדי לקבל בגלל קשיים לוגיסטיים הקשורים עם גישה הדרישה בביצוע לטווח ארוך כדי איסוף נתונים ודוגמאות טמפורלית. שני מפתח מחקרים שהוצגו כאן, הוכחה אמפירית של התגובה הטמפרטורה של zooplankter המרכזית של מערכות אקולוגיות מים מתוקים מסופק על פי אבולוציונית. זה מופעלת על ידי השימוש בשכבות הביצה הרדומה הבנקים לספק הזדמנות ללמוד את התגובה של אוכלוסיות היסטורי וצאצאיהם מודרניים כדי עקה בהגדרות ניסיוני משותף.
ניסוי גן משותף
הניסוי גן משותף הראה כי כל התכונות ההיסטוריה הגיבו טמפרטורה (איור 6 ו איור 7). ניתוח הנתונים ANOVA גילה כי כל האוכלוסיות (sub) להגיב לטמפרטורת דרך פלסטיות (טבלה 2), למעט התמותה, אשר אינו מגיב. ראיות של שינויים אבולוציוניים (הבדלים בין האוכלוסיות (sub)) נצפתה רק ב גידול האוכלוסיה (טבלה 2), אשר גדל באופן משמעותי בשניים מתוך השלושה אוכלוסיות (sub) ב 24 ° C (איור 6).
איור 6: ניסוי גן משותף. התגובה נורמות החיים תכונות (פוריות, בגודל בגיל בגרות), גידול האוכלוסיה (r) מוצגים עבור כל האוכלוסייה (sub) מתחת לטמפרטורה התחממות (24 ° C) לעומת גן משותף של הטמפרטורה הנוכחית המשטר (18 ° C). גידול האוכלוסיה "r" מחושבת באמצעות משוואת אוילר (1). מרווחי הביטחון מוצגים. אוכלוסיות (sub) הם לפי צבעים: כחול (i): 1960-1970; (ii) ירוק: 1970-1985; (iii) אדום: > 1999. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: תמותה. שיעורי התמותה לכל האוכלוסייה (sub) (1960-1970; 1970-1985; > 1999) מוצגים תחת התחממות כדור הארץ (24 ° C) לעומת משטרים מודרניים טמפרטורה (18 ° C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
ניסוי Mesocosm
לאחר ארבעה שבועות של בחירה, המיוצג על-ידי ההתחממות ב 24 ° C, התדירות של שלושת האוכלוסיות (sub) לא השתנה באופן משמעותי (χ2 = 0.55, P = 0.76) לעומת inoculum הראשוני (איור 8). בין 30 אחרים מחוסן בניסוי mesocosm, הרוב זוהה לאחר ארבעה שבועות של בחירה (איור 9). באופן ספציפי, 70% חוסנו אחרים היו התאושש, תואם עם ציפייה Poissonian מחלים נציג אחד לפחות של כל גנוטיפ במדגם של 32 אנשים.
איור 8: תחרות הניסוי - האוכלוסייה תדר- חציון ממוצע האוכלוסייה ואת רביעונים (25th ו 75th), מוצג עבור שלוש אוכלוסיות (sub) של magna ד לאחר ארבעה שבועות של הבחירה בניסויים תחרות mesocosm (24 ° C), לעומת תדר השווה הראשונית (ב ההתחלה). אוכלוסיות (sub) הם לפי כפי שמוצג באיור 6צבעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 9: תחרות הניסוי - גנוטיפ תדר- גנוטיפ תדרים – חציון בממוצע רביעונים (25th ו 75th), מוצגים לאחר ארבעה שבועות של חשיפה התחממות כדור הארץ (24 ° C) לעומת תדירות שווה הראשונית של אחרים (קו מנוקד). שמות בציר ה-x הם מזהה אחרים חוסנו, לקבץ לפי האוכלוסייה (sub) (כחול, 1960-1970; ירוק, 1970-1985; רד, > 1999). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| לוקוס | , | גודל הטווח (bp) | תחל (5' - 3') | תווית צבע | מוטיב חוזר | Tm | |
| B008 | HQ234154 | 150-170 | F: TGGGATCACAACGTTACACAA | ויק | (TC) 9 | 56 | |
| R: GCTGCTCGAGTCCTGAAATC | |||||||
| B030 | HQ234160 | 154 – 172 | F: CCAGCACACAAAGACGAA | חיית המחמד | (ג'י אי) 11 | 56 | |
| R: ACCATTTCTCTCCCCCAACT | |||||||
| B045 | HQ234168 | 118 – 126 | F: GCTCATCATCCCTCTGCTTC | נד | (TG) 8 | 56 | |
| R: ATAGTTTCAGCAACGCGTCA | |||||||
| B050 | HQ234170 | 234 – 248 | F: TTTCAAAAATCGCTCCCATC | 6FAM | (גה) 6 | 56 | |
| R: TATGGCGTGGAATGTTTCAG | |||||||
| B064 | HQ234172 | 135 – 151 | F: CTCCTTAGCAACCGAATCCA | 6FAM | (TC) 8 | 56 | |
| R: CAAACGCGTTCGATTAAAGA | |||||||
| B074 | HQ234174 | 196-204 | F: TCTTTCAGCGCACAATGAAT | נד | (GT) 9 | 56 | |
| R: TGTGTTCCTTGTCAACTGTCG | |||||||
| B096 | HQ234181 | 234 – 240 | F: GGATCTGGCAGGAAGTGGTA | ויק | (AC) 15 | 56 | |
| R: TTGAACCACGTCGAGGATTT | |||||||
| B107 | HQ234184 | 250 – 274 | F: GGGGTGAAGCATCAAAGAAA | חיית המחמד | (CT) 8 | 56 | |
| R: TGTGACCAGGATAAGAGAAGAGG | |||||||
טבלה 1: בתי קולנוע Microsatellite. NCBI ההצטרפות מספר (AN), המידע מולטיפלקס, הרצפים פריימר PCR, הטווח גודל ה-PCR, מוטיב חוזר, לצבוע פעם תווית של פריימר לפנים, והטמפרטורה מחזק (Tm) מוצגים.
| שיעור הצמיחה פופ (r) | Df | F | P | |
| האבולוציה (Pop) | 2 | 30.309 | < 0.001 | |
| פלסטיות (Temp) | 1 | 531.546 | < 0.001 | |
| Evol. פלסטיות (פופ x Temp) | 2 | 65.137 | < 0.001 | |
| התמותה | Df | F | P | |
| האבולוציה (Pop) | 2 | 2.234 | 0.1162 | |
| פלסטיות (Temp) | 1 | 2.679 | 0.1071 | |
| Evol. פלסטיות (פופ x Temp) | 2 | 1.8657 | 0.164 | |
| פוריות | Df | F | P | |
| האבולוציה (Pop) | 2 | 1.8852 | 0.1633 | |
| פלסטיות (Temp) | 1 | 6.8934 | 0.0117 | |
| Evol. פלסטיות (פופ x Temp) | 2 | 1.6511 | 0.203 | |
| גודל בעת הפירעון | Df | F | P | |
| האבולוציה (Pop) | 2 | 0.211 | 0.8106 | |
| פלסטיות (Temp) | 1 | 11.1361 | 0.0017 | |
| Evol. פלסטיות (פופ x Temp) | 2 | 0.6586 | 0.5225 | |
| גיל בעת הפירעון | Df | F | P | |
| האבולוציה (Pop) | 2 | 0.7811 | 0.4637 | |
| פלסטיות (Temp) | 1 | 8.0764 | 0.0066 | |
| Evol. פלסטיות (פופ x Temp) | 2 | 0.088 | 0.9159 | |
בטבלה 2: השונות (ANOVA). ניתוח השונות בדיקה אם שינויים תכונות היסטוריית החיים וכן גידול האוכלוסיה של אוכלוסיות לתחייה (sub) חשופים להתחממות מוסברים על ידי הסתגלות אבולוציונית (אוכלוסיות), פלסטיות (טיפול טמפרטורה), שלהם המונח אינטראקציה (האבולוציה של פלסטיות). משמעותי p-ערכים (p< 0.05) מוצגות בגופן מודגש.
1 וידאו משלימים: דגימה של משקעים ליבות. השימוש corer ביג בן מוצג. ביג בן הוא צינור הליבה של-1.5 מ' אורך עם קוטר צינור פנימי של 14 ס מ. זה מורכב בוכנה על חבל וראש corer, שאליו מחוברים מוטות לנסוע ברכבת התחתית לתוך המשקע. לוכד ליבה משמש לתמיכה הצינור הליבה פרוס כלי קטן. הבוכנה נדחף למטה לתוך המשקע על ידי לחץ הכבידה. מסגרת משמש כדי לתמוך את הצינור הליבה במהלך תהליך ההבלטה מתבצעות בעזרת שקע בקבוק ששונה דוחף את הבוכנה כלפי מעלה. כל שכבה משקעים על משטח המתכת השטוחים ונשתמש הועבר דגימה שקוף שקיות לאחסון לטווח ארוך [אפל וקר (4 ° C) תנאים]. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
2 וידאו משלימים: משקעים ניפוי. הציוד הדרוש עבור ניפוי משקעים הוא סולם precision, מגשים דגימה לבן, הנפות גיאולוגי. בין כל שכבה משקעים, לפחות 5 g נשמרים עבור תיארוך רדיומטרי. שארית המשקע משמש כדי לבודד ephippia. המשקע הוא sieved דרך שתי הנפות גיאולוגי, אחד עם 1 מ מ, שנייה עם 125 µm שרוחב, נערמו אחד על גבי השני. בינונית ויוצקים על מסננת רשת 1 מ מ להפריד חימר גדולים חסרי חוליות, חלקיקי החומר. בינוני שפכו על המסננת השנייה עם 125 µm רשת מפריד ד magna ephippia וחומר חלקיקי קטן. Aliquots של משקעים מועברים למגש דגימה לבן. Ephippia מגנה ד הם הבחינו לפי העין במגש רקע לבן. Ephippia של כל שכבה נאספים פטרי נפרדים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
וידאו משלים 3: Decapsulation. תחת stereomicroscope, ephippia magna ד נפתחות עם מלקחיים microdissection על ידי הפעלת לחץ על עמוד השדרה של המקרה כיטין. קרום ביצה הפנימי יוסר בעדינות ולא נח הביצים בעדינות הועבר עם פיפטה פסטר צלחת פטרי המכילות 10 מ"ל של מדיום. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
וידאו משלימים 4: הבקיעה. לאחר חשיפה ארוכה photoperiod ו 20 ° C, חידוש התפתחות העובר בין 48 שעות מספר שבועות. עם השלמת הפיתוח, העוברים להשתחרר ממעטפת הביצית, לשחות בחופשיות בטווח הבינוני. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Discussion
עקב מוליכות חום גבוהה של מים, מערכות אקולוגיות מים מתוקים הם בסיכון גבוה יותר של המגוון הביולוגי אובדן מאשר המערכות האקולוגיות יבשתי מול הכללית התחממות34 חיוני, לכן, כדי להבין את התגובה של keystone מינים של מערכות אקולוגיות אלו ולזהות מנגנוני ההתמודדות לשרוד מתח תרמי. ההבנה של מנגנונים אלה ברמות מינים והקהילה יכול לעזור לחזות כיצד מינים שמושפעים התחממות וגולש איך ההשפעה על מינים בודדים לרמות אחרות הזנה. בסופו של דבר, הבנת מנגנוני תגובות על התחממות כדור הארץ מאפשר הזיהוי של תיקונים אסטרטגיות להפחתת extinctions.
מחקרים המובאים כאן מראים כי תגובת מגנה ד בטמפרטורה pervasively מתווך על ידי פלסטיות של תכונות היסטוריית החיים ולא כי בתגובה בטמפרטורה לבד לכפות עלויות כושר ברורה, לפחות האוכלוסייה למד כאן. פלסטיות גבוהה בתכונות היסטוריית החיים נתמך על ידי הבדלים שאינם משמעותיים ביכולות מתחרות של האוכלוסיות (sub) בנוכחות התחממות כדור הארץ. עם זאת, התחרות וקהילותיהם, ניסויים אוכלוסיות מרובות ייתכן שיהיה צורך להכליל ממצאים אלה.
תחייתו של שלבים רדום מספק משאב חסר תקדים ללמוד מנגנוני הסתגלות ואת מסלולי התפתחות של זן עד שעה10. זואופלנקטון מינים תועלת זמן דור מהירה (כשבועיים), ואת הכדאיות של שלבים רדום, אשר מאפשר קדום. כדי להתחרות headtohead נגד צאצאיו משלו, או 'החוזר' האבולוציה שמתחיל ממדינות שונות בעבר. תחיית המתים אקולוגיה בעיקרו של דבר מאפשר החקירה של תוצאה אבולוציונית מיוחדת נמדדת לפי כמה אירועים קודמים. זיהוי מרכיבים גנטיים של אבולוציה אפשרית כיום בניסויים במעבדה בעזרת מיקרואורגניזמים שעבורם 'שורות אב קדמון' קפוא, להחיות אותו לניתוח השוואתי עם צאצא מפותחת שלהם6. עם זאת, אחת המגבלות העיקריות של עבודה עם מעבדה אורגניזמים הוא 'המדינה אב קדמון' הוא בסיסית שהוסטו כבר. המחקר של שלבים רדום מאפשר הדוגמאות של דגימות מן הזמן לגירושן לכל אירוע דחק (למשל, תנאים סביבתיים וטהור) וכדי למדוד מסלולים אבולוציונית מתנאי הסביבה ללא הפרעה למדינות שונות בעבר עד לתקופה המודרנית. בשנים האחרונות, המחקר של ה-DNA פולימורפיזם בשלבים זואופלנקטון לתחייה או עדיין רדום סיפקה תובנות חשובות האחרונות תהליכים דמוגרפיים, מסתגלת תרמו הגנטי של אוכלוסיות של ימינו14 , 16 , 25 , 33 , 35 , 36. עם נגישות גבוהה יותר של טכנולוגיות רצף תפוקה גבוהה, הגנום ואת transcriptome של שלבי לתחייה או עדיין רדום יכול להיות רציף, סוג ומספר שינויים גנטיים שנצבר המתפתחת אוכלוסיות מעל הזמן נמדד.
התקומה SOP המוצג כאן יש ליישומים חשובים בתחום של מולטי-טכנולוגיות על שתי רמות. טכנולוגיות רב ניתן ליישם דגימות לתחייה, המאפשר ניתוח ממצה של היסודות המולקולריים המעורבים בתגובות הסתגלות ללחץ הסביבה הבחירה. בנוסף, טכנולוגיות ניתן ליישם decapsulated אלא שלבי עדיין רדום. עד כה, היישום של טכנולוגיות רצף תפוקה גבוהה לנוח שלבים היה מוגבל על ידי הדרישה של כמות גדולה של חומר קלט. מגבלות אלה מתבצעת והרימה אותה37. עם הדרישות להורדת חומר קלט ולהתקדם בעזרת nanofluidics, רצף הגנום כולו (WGS) אפשרי עכשיו מ קטנה כמו 1 ng או כמה pg להתחיל גשמי38. השימוש של הגנום כולו הגברה (WGA) וטכניקות הגברה (של WTA) כל transcriptome, המאפשרת את העשרת של DNA ו- RNA של כמויות קטנות מאוד של רקמות, יש מהפכה39,metagenomics40 וגם רפואי מחקר41. טכנולוגיות אלה חלה על ביצים רדום decapsulated לאפשר את חריגה של מגבלות הקשורים הכדאיות של שלבים רדום של חוקרים של תקופות זמן ממושך (למשל, מאות שנים).
תחייתו של קהילות הגעה בהפקת שלבים מנוחתו מאפשר היישור של סיפורי הקהילה בשינויים ידועים של הנופים הטבעיים, או עם שינויים סביבתיים להסיק מניתוחי של משקעים orsoils2. הניתוח של הקהילה משתנה בתגובה לשינוי סביבתי מספק לנו את היכולת לכמת פידבקים eco-אבולוציונית42 שיש להם השלכות משמעותית על ההתמדה האוכלוסייה43, אינטראקציות עם מחלות44 , הקהילה הרכבה45, ושינויים במערכת האקולוגית פונקציות ושירותים46. לבסוף, תחזיות מדויקות לגבי תגובות ביולוגיות שינוי סביבתי הם הכרחיים כדי להנחות את ההגנה של המגוון הביולוגי47 מודלים הנוכחית אינם מדויקים בהקשר זה כי הם לא עשה חשבון מנגנונים ביולוגיים חשובים כגון דמוגרפיה, פיזור, האבולוציה מינים אינטראקציות. הבנה כיצד תהליכים אלה משתנים במשך הזמן ושימוש במידע זה כמו לכהן ב דוגמנות תחזית ישפר את היכולת שלנו לחזות מינים ושנה הקהילה התמדה אל מול הסביבה2.
היישום של ה-SOP המובאת כאן אינה ללא אתגרים. המגבלה העיקרית של לאוהדיו שלבים רדום הוא הצורך של ציוד מיוחד עבור הדגימה. בנוסף, התהליך כולו, מן המשקעים ניפוי להקמה של תרבויות המשובטים, דורש זמן ניכר על הידיים.
חלק מהשלבים SOP המובאת כאן המתעכבים ברצון מינים דפניה אחרים. אלה הם: דגימה, הקמת קווי המשובטים, תכנון ניסויים. עם זאת, צעדים אחרים של ה-SOP עשויים לדרוש עוד יותר אופטימיזציה המותאמים למין שנבחנה. Decapsulation לעיתים קרובות חלה על דגימות מגנה ד כדי לשפר את ההצלחה הבקיעה. עם זאת, גישה זו עשוי לא להיות מתאים דגימות קטנות יותר. הבקיעה גירויים יכול להשתנות גם בין המינים48 ובין הדגימה conspecific49. לפיכך, לאופטימיזציה אד הוק של המדרגות הבקיעה של ה-SOP עשוי להידרש לפני ליישומים אחרים. בזמן הבקיעה ההצלחה של האוכלוסייה מגנה ד לתחייה מן האגם טבעת (30.5% על פני הארכיון משקע) עולה בקנה אחד עם תוצאות קודמות49, הבקיעה הצלחה משתנה עם מצב ההשתמרות המשקע, המין 50,51, המקור הגיאוגרפי של משקעים48. מחקרים עתידיים על המנגנונים המווסתים כניסה וההתקדמות דרך השלבים של תרדמה ואסטרטגיה נדרש לזהות גירויים הבקיעה האופטימלי לצרכיו מינים שונים.
לבסוף, רקע הידע של מערכת המחקר, בפרט, נוכחותם של המינים של הריבית לאורך זמן, מומלץ. זו יכולה להיות מושגת באמצעות רשומות היסטוריות. אם רשומות היסטוריות אינן זמינות, דגימה, הקרנת משטח שכבות המשקע אגם לפני דגימה הליבה, מומלץ, למרות שזה מספק מידע רק על ההיסטוריה האחרונה.
Disclosures
המחברים אין לחשוף
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המענק מדגיש NERC (NE N016777 1). Ensis בע מ, שירותי מדעי הסביבה, המרכז לחקר שינוי סביבתי, אוניברסיטת קולג '-לונדון שנדגמו, יצאתי עם ליבת משקעים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sampling bags | Fisher Scientific | 11542783 | Sampling bag revolve round wires closure system and safety tabs sterile polyethylene with writing area clear 89µm thickness 140mm x 229mm, 720mL Fisherbrand |
| piston corer | ENSIS ltd | na | Long, heavy tube plunged into the sea, lake, pond floor to extract samples of mud sediment. Piston corers have a viariable diameter and are generally in PVC |
| precision scale | Veritas-M124A | TLP-50 | Analytical Balance |
| geological sieve | UKGE limited | SV7521 | 200 mm diameter geological sieve - 1 mm mesh |
| geological sieve | UKGE limited | SV7525 | 200 mm diameter geological sieve - 0.125 mm mesh |
| white sampling tray | nhbs | http://www.nhbs.com/title/view/159614?ad_id=1509 | Standard mulipurpose lab trays |
| pasteur pipette | Globe Scientific inc. | 138020B | Transfer Pipet, 1.7mL, General Purpose, 87mm, Bulb Draw - 0.9mL |
| stereo microscope | nikon | smz800 | Microscope with magnification range 1x -8x linked to a camera control unit |
| petri dish | EduLab | 153-533 | Sterile 90mm diameter plastic petri dish |
| glass jars | compak | Round Jam Jars 4oz | 100 mL jars |
| glass jars | compak | Atum Jars/ Bonta Jar 10oz | 200 mL jars |
| glass jars | bottlecompanysouth | 500ml Food Jam Jar With Twist Off Lid | 500 mL jars |
| statistical software R | https://cran.r-project.org/ | na | Free online GNU language and environment for statistical computing and graphics |
| microdissection forceps | Fisher Scientific | 41122405 | Fine point stainless steel forceps for microdissections |
| image software | https://imagej.nih.gov/ij/index.html | na | Open source ImageJ image processing toolkit written in Java |
| mesocosm | amazon | na | Nobby Fauna-Box III, 41 x 23 x 29 cm, 20.0 Liter |
| mirocentrifuge tubes | Sigma_Aldrick - Merck | Z606340 | premium microcentrifuge tubes 1.5 mL |
| AGENCOURT DNAdvance | Beckman Coulter | A48705 | DNA extraction kit |
| size standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | LIZ500 - Size standard compatible with ABI sequencers |
| ABI3032 sequencer | ABI | na | Sequencer used to perform fragment analysis or sanger sequencing |
References
- Lindenmayer, D. B., et al. Value of long-term ecological studies. Austral Ecol. 37 (7), 745-757 (2012).
- Orsini, L., et al. The evolutionary time machine: using dormant propagules to forecast how populations can adapt to changing environments. TREE. 28, 274-282 (2013).
- Grant, P. R., Grant, B. R. Unpredictable evolution in a 30- year study of Darwin's finches. Science. 296, 707-711 (2002).
- Lohbeck, K. T., Riebesell, U., Reusch, T. B. H. Adaptive evolution of a key phytoplankton species to ocean acidification. Nature Biosci. 5, 346-351 (2012).
- Barrick, J. E., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
- Barrick, J. E., Lenki, R. Genome dynamics during experimental evolution. Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).
- Blount, Z. D., Barrick, J. E., Davidson, C. J., Lenski, R. E. Genomic analysis of a key innovation in an experimental Escherichia coli population. Nature. 489 (7417), 513-518 (2012).
- Kawecki, T. J., et al. Experimental evolution. TREE. 27, 547-560 (2012).
- Fukami, T., Wardle, D. A. Long-term ecological dynamics: reciprocal insights from natural and anthropogenic gradients. P Roy Soc B-Biol Sci. 272, 2105-2115 (2005).
- Merila, J., Hendry, A. P. Climate change, adaptation, and phenotypic plasticity: the problem and the evidence. Evol Appl. 7 (1), 1-14 (2014).
- Evans, M. E., Dennehy, J. J. Germ banking: bet-hedging and variable release from egg and seed dormancy. Q Rev Biol. 80 (4), 431-451 (2005).
- Appleby, P. G. Chronostratigraphic techniques in recent sediments. 1, Kluwer Academic Publisher. (2001).
- Appleby, P. G., et al. PB-210 dating by low background gamma-counting. Hydrobiologia. 143, 21-27 (1986).
- Bidle, K. D., Lee, S. H., Marchant, D. R., Falkowski, P. G. Fossil genes and microbes in the oldest ice on Earth. PNAS. 104, 13455-13460 (2007).
- Geerts, A. N., et al. Rapid evolution of thermal tolerance in the water flea Daphnia. Nat Clim Change. 5, 665-668 (2015).
- Jansen, M., et al. Thermal tolerance in the keystone species Daphnia magna-a candidate gene and an outlier analysis approach. Mol Ecol. 26 (8), 2291-2305 (2017).
- Hairston, N. G. Jr, De Stasio, B. T. Jr Rate of evolution slowed by a dormant propagule pool. Nature. 336, 239-242 (1988).
- Hairston, N. G. Jr, et al. Lake ecosystems: Rapid evolution revealed by dormant eggs. Nature. 401, 446 (1999).
- Weider, L. J., Lampert, W., Wessel, M., Colbourne, J. K., Limburg, P. Long-term genetic shifts in a microcrustacean egg bank associated with anthropogenic changes in the Lake Constance ecosystem. Proc. R. Soc. Lond. B. 264, 1613-1618 (1997).
- Kerfoot, W. C., Robbins, J. A., Weider, L. J. A new approach to historical reconstruction: Combining descriptive and experimental paleolimnology. Limnol Oceanogr. 44 (5), 1232-1247 (1999).
- Cousyn, C., et al. Rapid, local adaptation of zooplankton behavior to changes in predation pressure in the absence of neutral genetic changes. PNAS. 98, 6256-6260 (2001).
- Decaestecker, E., et al. Host-parasite Red Queen dynamics archived in pond sediment. Nature. 450, 870-874 (2007).
- Miner, B. E., De Meester, L., Pfrender, M. E., Lampert, W., Hairston, N. G. Linking genes to communities and ecosystems: Daphnia as an ecogenomic model. P Roy Soc B-Biol Sci. 279 (1735), 1873-1882 (2012).
- Ebert, D. Ecology, epidemiology, and evolution of parasitism in Daphnia. , National Library of Medicine (US), National Center for Biotechnology. (2005).
- Orsini, L., et al. Temporal genetic stability in natural populations of the waterflea Daphnia magna in response to strong selection pressure. Mol Ecol. 25, 6024-6038 (2016).
- IPCC. Summary for policymakers. , Cambridge, United Kingdom and New York, NY, USA. 1-32 (2014).
- Patmore, I. R., et al. Big Ben: a new wide-bore piston corer for multi-proxy palaeolimnology. J Paleolimnol. 51 (1), 79-86 (2014).
- Wright, H. E. Jr A square-rod piston sampler for lake sediments. J Sedimentary Petrology. 37, 975-976 (1967).
- Kilham, S. S., Kreeger, D. A., Lynn, S. G., Goulden, C. E., Herrera, L. COMBO: a defined freshwater culture medium for algae and zooplankton. Hydrobiologia. 377, 147-159 (1998).
- Klüttgen, B., Kuntz, N. orbert, Ratte, H. T. Combined effects of 3,4-dichloroaniune and food concentration on life-table data of two related cladocerans, Daphnia magna and Ceriodaphnia quadrangula. Chemosphere. 32, 2015-2028 (1996).
- R: A language and environment for statistical computing. , Vienna, Austria. (2017).
- Jansen, B., Geldof, S., De Meester, L., Orsini, L. Isolation and characterization of microsatellite markers in the waterflea Daphnia magna. Mol Ecol Res. 11, 418-421 (2011).
- Orsini, L., Spanier, K. I., De Meester, L. Genomic signature of natural and anthropogenic stress in wild populations of the waterflea Daphnia magna: validation in space, time and experimental evolution. Mol Ecol. 21, 2160-2175 (2012).
- Verberk, W. C. E. P., et al. Does oxygen limit thermal tolerance in arthropods? A critical review of current evidence. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 192, 64-78 (2016).
- Frisch, D., et al. A millennial-scale chronicle of evolutionary responses to cultural eutrophication in Daphnia. Ecol Lett. 17 (3), 360-368 (2014).
- Yashina, S., et al. Regeneration of whole fertile plants from 30,000-y-old fruit tissue buried in Siberian permafrost. PNAS. 109, 4008-4013 (2012).
- Southam, A. D., Weber, R. J. M., Engel, J., Jones, M. R., Viant, M. R. A complete workflow for high-resolution spectral-stitching nanoelectrospray direct-infusion mass-spectrometry-based metabolomics and lipidomics. Nat Protoc. 12 (2), 310-328 (2017).
- Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq. Plos One. 9 (11), (2014).
- Baym, M., et al. Inexpensive Multiplexed Library Preparation for Megabase-Sized Genomes. Plos One. 10 (5), 6 (2015).
- Bourcy, C. F. A., et al. A Quantitative Comparison of Single-Cell Whole Genome Amplification Methods. Plos One. 9 (8), (2014).
- Hasmats, J., et al. Assessment of whole genome amplification for sequence capture and massively parallel sequencing. PLoS One. 9 (1), e84785 (2014).
- Becks, L., Ellner, S. P., Jones, L. E., Hairston, N. G. Jr The functional genomics of an eco-evolutionary feedback loop: linking gene expression, trait evolution, and community dynamics. Ecol Lett. 15 (5), 492-501 (2012).
- Ellner, S. P., Geber, M. A., Hairston, N. G. Does rapid evolution matter? Measuring the rate of contemporary evolution and its impacts on ecological dynamics. Ecol Lett. 14 (6), 603-614 (2011).
- Yoshida, T., Jones, L. E., Ellner, S. P., Fussmann, G. F., Hairston, N. G. Jr Rapid evolution drives ecological dynamics in a predator-prey system. Nature. 424 (6946), 303-306 (2003).
- Urban, M., et al.
- Dokulil, M. T. Eutrophication: Causes, Consequences and Control. , Springer. Netherlands. 81-88 (2014).
- Urban, M. C., et al. Improving the forecast for biodiversity under climate change. Science. 353 (6304), (2016).
- Schwartz, S. S., Hebert, P. D. N. Methods for the activation of the resting eggs of Daphnia. Freshwater Biol. 17, 373-379 (1987).
- Vanderkerhove, J., et al. Hatching of cladoceran resting eggs: temperature and photoperiod. Freshwater Biol. 50, 96-104 (2005).
- Caceres, C. E. Temporal variation, dormancy, and coexistence: a field test of the storage effect. PNAS. 94 (17), 9171-9175 (1997).
- Caceres, C. E. Interspecific variation in the abundance, production, and emergence of Daphnia diapausing eggs. Ecology. 79 (5), 1699-1710 (1998).
