Summary
دليل خطوة بخطوة للتحقيق في فقدان الليزوزومية الحموضة في الأمعاء من C. ايليجانس استخدام صبغة حساسة لدرجة الحموضة الحيوية 6-كاربوكسي-2 '، اسيتات 7'-ديتشلوروفلوريسسين (كدكفدا)
Abstract
ديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) هو نموذج نظام الذي يستخدم على نطاق واسع لدراسة طول العمر والمسارات الإنمائية. ومما ييسر هذه الدراسات شفافية الحيوان، والقدرة على توجيه وعكس الاختبارات الجينية، والسهولة النسبية لتوليد البروتينات المسماة فلوريسسينتلي، واستخدام الأصباغ الفلورية التي يمكن أما أن يكون ميكروينجيكتيد في وقت مبكر الجنين أو إدماجه في غذائها (سلالةكولاي OP50) لتسمية العضيات الخلوية (مثلاً 9-ديثيلامينو-ح 5-بنزو (أ) فينوكسازيني-5-واحد و (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) ميثيليديني] ح-2-بيرل-5-يل-كابان}-N- [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). هنا، نحن نقدم استخدام صبغة حساسة لدرجة الحموضة الفلورسنت البقع lysosomes المعوية، توفير قراءات بصرية للتغيرات الفسيولوجية، ودينامية في الحموضة الليزوزومية في الديدان الحية. هذا البروتوكول ليس قياس درجة الحموضة الليزوزومية، ولكن بدلاً من ذلك يهدف إلى وضع طريقة يمكن الاعتماد عليها لتقييم التغيرات ذات الصلة الفسيولوجية في الحموضة الليزوزومية. كدكفدا هو مركب بيرمينت خلية التي يتم تحويلها إلى نيون فلوروفوري 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (تتيح) عند التحلل من استيراسيس داخل الخلايا. بروتونيشن داخل lysosomes الفخاخ تتيح في هذه العضيات، حيث يتراكم. وقد استخدمت هذه الصبغة سبب لها pKa منخفضة من 4.8، كجهاز استشعار درجة حموضة في الخميرة. هنا يصف لنا باستخدام كدكفدا كمكمل غذائي لتقييم الحموضة المعوية ليسوسوميس في C. ايليجانس. هذا الأسلوب يسمح للكشف عن ليسوسوميس الكالينيزينج في الحيوانات الحية، ، ولديها مجموعة واسعة من التطبيقات التجريبية بما في ذلك الدراسات المتعلقة بالشيخوخة، وأوتوفاجي، ونشوء حيوي الليزوزومية.
Introduction
ظهور المجاميع البروتين مقبول على نطاق واسع أن تكون السمة مميزة للشيخوخة في الخلايا حقيقية النواة1،2،3، وتشكيل التي يعتقد أن من بين السائقين مبدأ الشيخوخة الخلوية4 , 5 , 6 , 7-وهناك أدلة متزايدة على أن الخلايا العمر، تقويض البروتين البصر، مما يؤدي إلى زيادة في تجميع البروتين. انهيار بروتيوليسيس في شيخوخة الخلايا ينطوي على ضعف أوتوفاجي8 ، فضلا عن تدهور البروتين بوساطة بروتوزوم9. أخيرا، يتم زيادة أكسدة البروتين الذي لا رجعة فيه في الخلايا القديمة، وإضعاف زيادة تقويض البروتينات10.
أوتوفاجي كان يعتقد في البداية أن يكون عملية غير انتقائية لتدهور الجزء الأكبر من البروتينات التالفة، ولكن الدراسات الأخيرة أشارت إلى أن أوتوفاجي انتقائي للغاية لتقويض المجاميع البروتين واختلال العضيات التي لا قابلة للتحلل عن طريق آليات إزالة البروتين الأخرى11. أثناء عملية أوتوفاجي، هي المحتبس البروتينات التالفة ومجمعة في حويصلة غشاء مزدوج يسمى في أوتوفاجوسومي. ثم الصمامات هذه أوتوفاجوسومي مع العضيات الحمضية التي تسمى lysosomes، الأمر الذي يؤدي إلى تدهور من البضائع أوتوفاجوسومي12. تمثل نقطة النهاية لمسار أوتوفاجيك lysosomes والمشاركة في العمليات الخلوية المختلفة مثل التحكم النسخي وإصلاح الغشاء والاستشعار المغذيات؛ تسليط الضوء على دورها المركزي في التوازن الخلوية (إعادة النظر في الرقم 13). وأظهرت العديد من الدراسات وجود ارتباط بين انخفاض تعتمد على العمر وظيفة الليزوزومية و اضطرابات الأعصاب المختلفة13. دأبت، استعادة وظيفة الليزوزومية في خلايا كبار السن يمكن أن تؤخر ظهور المتصلة بالشيخوخة تعمل14،15. وتوحي الدراسات التكوين للوسط إينترالومين أن انهيار الدالة الليزوزومية في خلايا كبار السن ليس سبب انخفاضا في إنتاج البروتياز الليزوزومية16. وبدلاً من ذلك، اقترح أن فقدان إينتراليسوسومال الحموضة، مطلبا جوهريا لنشاطها الأنزيمي، قد تكمن وراء انخفاض يحلول بوساطة بروتيوليسيس17. لتكون قادرة على استكشاف هذه الفرضية، من الضروري تطوير الكواشف وبروتوكولات للتحقيق التغيرات الدينامية في تعويض درجة الحموضة في الخلايا الحية بطريقة متسقة وقابلة للتكرار.
الأمعاء من C. ايليجانس الأنسجة الأيضية الرئيسية في الديدان ومنظم حاسمة للتوازن المنهجي وعمر. لقد قمنا بتطوير فحوصات لتقييم التغييرات في حموضة التجويف lysosomes المعوية الديدان لتحديد كيف بوساطة يحلول proteolysis يسهم في الشيخوخة. على الرغم من أن فلوروفوريس حساسة لدرجة الحموضة قد استخدمت سابقا في C. ايليجانس بمناسبة ليسوسوميس المعوية، لم يكن هناك بعد محاولة لوضع بروتوكول ناجحة التي يمكن الكشف عن زيادات صغيرة في الأس الهيدروجيني الليزوزومية في فيفو18. هنا، نحن نقدم بروتوكول التي يمكن استخدامها للكشف عن فقدان الليزوزومية الحموضة في الخلايا المعوية من C. ايليجانس استخدام بروتوكول تغذية بسيطة ومريحة الذي يشتمل فلوروفوري حساسة لدرجة الحموضة (كدكفدا) في الغذاء OP50.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-وصمة عار والصورة lysosomes المعوية
- لوحات البذور وسائط النمو السلكية (NGM) مع OP50
- إعداد لوحات NGM وفقا للبروتوكول الموصى بها19 والسماح لوحات مغلقة لتجف لمدة يومين في درجة حرارة الغرفة.
- تلقيح البكتيريا OP50 إلى مرق مرق لوريا (رطل) عقيمة وتنمو في حمام حاضنة أو الماء تهتز عند 37 درجة مئوية لمدة 36 ح أو حتى التوجيه التشغيلي بين 0.2 و 0.4. تجنب استخدام ثقافة بكتيرية مع OD > 1 أو OD < 0.2.
- مجرد لوحات NGM جافة، ضع قطره (~ 30 ميليلتر) من العدوى OP50 في وسط اللوحة ومن ثم امتد الانخفاض إلى تصحيح تقريبا التي 2 سم × 2 سم في الحجم.
ملاحظة: يمكن تخزين أي العدوى OP50 المتبقية في 4 درجات مئوية لتصل إلى شهر. - عكس لوحات OP50 بمجرد العدوى قد المجففة (حوالي 10 أو 15 دقيقة)، ومن ثم احتضان اللوحات في 37 درجة مئوية ح 36.
- بعد 36 ساعة، إزالة اللوحات من الحاضنة ومخزن في 4 درجات مئوية حتى استخدامها في وقت لاحق.
ملاحظة: يجب أن تكون اللوحات جيدة لمدة تصل إلى شهر واحد في 4 درجات مئوية.
- المكمل كدكفدا إلى OP50
- لتكملة كدكفدا على لوحات OP50، إعداد رصيد عامل من كدكفدا 10 ملم في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]). يبقى الحل كدكفدا محمية من الضوء ومخزن في-20 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.
- بلطف ضع 100 ميليلتر من محلول كدكفدا 10 ملم على سطح التصحيح OP50 2 سم × 2 سم، مثل تصحيح كامل موحد مغطاة كدكفدا.
ملاحظة: من المهم جداً أن تتناول تصحيح كامل من OP50 مع كدكفدا. إذا لزم الأمر، استخدم يصل إلى 150 ميليلتر من كدكفدا لكل لوحة. من المحتم أيضا أن الحل كدكفدا لا يتعدى حدود التصحيح OP50، ﻷن أي كدكفدا الذي يتدفق من التصحيح OP50 لن يتم تضمينها في المواد الغذائية، وسوف يسفر عن انخفاض كثافة المصبوغة. - ضع لوحات OP50 في مربع الظلام على أعلى مقاعد البدلاء حتى يمتص كل حل كدكفدا في التصحيح البكتيرية (عادة حوالي 25 إلى 30 دقيقة).
- تلوين الديدان باستخدام كدكفدا
- مرة واحدة وقد ساد كدكفدا تماما التصحيح OP50، ضع الديدان لا يزيد عن 20 للوحة الواحدة واحتضان لوحات مقلوب في 20 درجة مئوية للحد ني ح 14.
ملاحظة: من المستحسن وضع لوحات كدكفدا في مربع مبهمة لتقليل التعرض للضوء. - للتحكم في كمية الاختلافات بين التجارب وتطبيع إشارات كدكفدا، (مستحسن) وصمة عار التعاون مع 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) ( ديفلورو) البورون (2.5 ميليلتر من حل تقدم طازجة 1 ملم)، صبغ أمين ضعيفة أسيدوتروبيك الأسفار التي غير متغيرة إلى حد كبير على مدى الطيف الأس الهيدروجيني الحمضية (انظر الجدول للمواد للأسماء الشائعة من الكواشف).
ملاحظة: لا وصمة عار الديدان لأقل من 14 ح هذا قد توفر كثافة المصبوغة كدكفدا غير كافية وتعطي تفسيراً كاذبة للأس الهيدروجيني الليزوزومية.
- مرة واحدة وقد ساد كدكفدا تماما التصحيح OP50، ضع الديدان لا يزيد عن 20 للوحة الواحدة واحتضان لوحات مقلوب في 20 درجة مئوية للحد ني ح 14.
- تحضير الشرائح للفحص المجهري
- وضع الشريطين موازية لوسم الشريط حوالي 3 بوصة عن بعضها البعض على سطح مستو سلس، مثل مرآة (الشكل 1).
- معطف السطح من النسخة المتطابقة مع رذاذ طارد المياه، وتمحو السائل الفائض.
- تذوب [اغروس] 2% (حله في المقطر ح2س) في فرن ميكروويف حتى المسال تماما، ثم ضع قطره 50 ميليلتر من [اغروس] بين الشريطين من الشريط وتغطية بسرعة الانخفاض مع شريحة مجهر، أن الشريحة من عمودي إلى الشرائط من الشريط. بعد وقد توطد [اغروس]، تشكل منصة دائرية تحت الشريحة، اقلب الشريحة وإضافة 10 إلى 15 ميليلتر من أزيد الصوديوم 5 مم (نان3) على لوحة المفاتيح [اغروس].
ملاحظة: نان3 مثبط السيتوكروم ج أنه عندما تستخدم بتركيزات منخفضة، أنيسثيتيزيس الديدان عكسية حيث أنه سوف لا تتحرك أثناء التصوير. - اختيار الديدان من لوحة OP50 تكملة مع كدكفدا، ونقلها إلى لوحة NGM نظيفة دون أي OP50. السماح للديدان للتحرك لبضع ثوان للسماح لمعظم OP50 المراد إزالتها من على سطح أرض الديدان، وثم نقل الديدان إلى لوح [اغروس] يتضمن أزيد الصوديوم 5 ملم.
- تغطية لوحة المفاتيح [اغروس] كشف الغطاء فورا. تأكد من وضع بكشف الغطاء بلطف دون تطبيق الكثير من الضغوط، حيث يمكن أن ينتج هذا الديدان تتضاعف.
ملاحظة: البكتيريا OP50 تكملة مع كدكفدا فلوريس عندما تصور بالفحص المجهري، ومن ثم من المهم لتنظيف الديدان على أفضل وجه ممكن قبل وضعها على اللوحة [اغروس] يتضمن أزيد الصوديوم. إذا كان الاستعداد أكثر من 6 سلالات من C. ايليجانس (بما في ذلك N2، مراقبة نوع البرية)، من المستصوب إعداد العينات على دفعات 6، ضمانا لأن الديدان لم تجف على منصة [اغروس]. في بعض السلالات، يبدأ الفرج للتمزق بعد فترات طويلة من الوقت بسبب الضغط من كشف الغطاء، ولذلك فمن المهم التخطيط وفقا لذلك.
- مجهر [كنفوكل]
ملاحظة: بعض المجاهر لديها ميزة مضمنة تلقائياً زيادة كثافة الأسفار لتعويض مستويات متغيرة من الأسفار. قد لا تعمل هذه المجاهر جيدا للتصوير الديدان ملطخة كدكفدا، نظراً لطبيعتها ستزيد كثافة العينات الأسفار.- تنفيذ التصوير على الميكروسكوب [كنفوكل] قياسية باستخدام موجات الإثارة/الانبعاثات المحددة إلى 488/530 نانومتر كدكفدا. التقاط صور طائرة واحدة (لا مداخن-Z) من lysosomes المعوية واستخدم فقط ليسوسوميس التي في التركيز (شدة الإشارة القصوى) لتقدير كثافة.
ملاحظة: ربما بسبب الاختلافات في توافر صبغ، lysosomes الخلايا المعوية الخلفي مباشرة إلى البلعوم الحفاظ على كدكفدا تلطيخ كثافة بغض النظر عن النمط الوراثي أو العمر، ومن ثم ينبغي الحرص على تجنب التصوير lysosomes في هذه الخلايا. - صورة الشريحة التي تحتوي على نوع البرية القديمة يوم 2 N2 الديدان أولاً. عند القيام بذلك، قم بتعديل معالم التصوير [كنفوكل] مثل طاقة الليزر، والثقب، وفتحه لضمان أن لا يتم oversaturated كدكفدا تلطيخ كثافة.
ملاحظة: بمجرد تعيين هذه الإعدادات، لا تغييرها لكامل مدة التصوير لهذا اليوم. - التقاط الصور 1024 × 1024 بكسل لطائرة واحدة من الأمعاء (3 إلى 4 صور كل دودة) استخدام 60 X عدسة التكبير.
ملاحظة: سوف تسفر عن طيف انبعاث كدكفدا في الديدان ذروة بارز واحد في 520 nm تزامنت مع به الأسفار عنها الطيف20، توفير قراءات إشارة محددة التي تختلف عن أوتوفلوريسسينسي المعوية (الشكل 3). - تصدير الصور [كنفوكل] الخام (ملفات.lsm) كملفات.tiff لكل قناة.
- بعد ذلك، فتح إيماجيج وانقر فوق ملف | فتح لفتح ملف الصورة كمياً. بمجرد أن يتم تحميل الصورة، استخدم أداة التحديد الشكل البيضاوي في إيماجيج لتحديد منطقة للفائدة (العائد على الاستثمار).
- وبعد ذلك، انقر فوق تحليل | مقياس لقياس كثافة الأسفار لأن العائد على الاستثمار. حدد 4 – 5 مختلفة lysosomes التركيز في كل صورة وحساب كثافة متوسط fluorescence النسبية لكل منطقة للفائدة (ROI).
- لكل صورة، وقياس كثافة fluorescence الخلفية في منطقة الأمعاء بين ليسوسوميس. طرح قيم الكثافة fluorescence الخلفية من قيم الكثافة fluorescence الليزوزومية.
- وفي المجموع، جمع حوالي 30 إلى 50 قيم طبيعية الفردية لكثافة كدكفدا (6 إلى 10 الحيوانات) لكل سلالة يجري اختبارها. استخدام هذه القيم لرسم مربع والخط الطولي مؤامرة باستخدام أي البرامج الإحصائية المناسبة.
ملاحظة: تلطيخ يمكن أن تختلف اختلافاً كبيرا تبعاً لعوامل مثل درجة الحرارة ووقت الحضانة والصحة/سن عموما من الحيوانات مثل أن المقارنات كثافة الأسفار فقط ذات الصلة ضمن عملية العينات في نفس التجربة المصبوغة. ولذلك من المهم أن عملية المراقبة في كل تجربة المصبوغة. حساب الاختلافات الإحصائية (t-الاختبارات) باستخدام أي من البرامج الإحصائية المناسبة. - صورة جميع سلالات من نفس التجربة (الملون في نفس اليوم) في التسلسل، مع الحرص على عدم تغيير أي من المعلمات التصوير.
- تنفيذ التصوير على الميكروسكوب [كنفوكل] قياسية باستخدام موجات الإثارة/الانبعاثات المحددة إلى 488/530 نانومتر كدكفدا. التقاط صور طائرة واحدة (لا مداخن-Z) من lysosomes المعوية واستخدم فقط ليسوسوميس التي في التركيز (شدة الإشارة القصوى) لتقدير كثافة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كدكفدا البقع lysosomes بطريقة تعتمد على درجة الحموضة، و pKa منخفضة وامتصاص جاهزة في ليسوسوميس يجعل استشعار الرقم الهيدروجيني مثالي21. كدكفدا تلطيخ كثافة يتناسب عكسيا مع18،الليزوزومية الأس الهيدروجيني (أي المصبوغة يزداد كثافة كانخفاض الأس الهيدروجيني)22. كدكفدا إشارات ضعيفة دائماً في lysosomes الحيوانات تعامل مع 20 مم لدواء الكلوروكين، مثبط لتحميض الليزوزومية، والديدان المستنفد من الخامس-ATPase، البروتين المعقدة في غشاء ليسوسوميس ما مطلوب للاستيراد بروتون22 . وهذه عناصر هامة لاستخدامها عند تقييم المستويات النسبية لتلطيخ في الخلفيات الوراثية أو العلاجات الأخرى كدكفدا.
كما نجد أية تأثيرات العلني من التعرض كدكفدا على اللياقة البدنية أو الخصوبة من الديدان المعالجة (البيانات لا تظهر). باستخدام هذا البروتوكول، حددنا فقدان ذاتية للحموضة في lysosomes الأنثوية البرية نوع الديدان. وكما هو مبين في الشكل 3، إشارة الأسفار كدكفدا قوية في ليسوسوميس للشباب (اليوم 2 وظيفة L4) استنساخ C. ايليجانس، مما يدل على lysosomes المحمضة. كثافة المصبوغة يقلل إلى حد كبير عند الغدق lysosomes، كما لوحظ في الديدان (بعد 8 أيام L4) القديمة، وكذلك كما هو الحال في الديدان حيث يتم تقليل تدفق بروتون في هذه العضيات (عن طريق ضربة قاضية للجينات vha ترميز مفارز الخامس-ATPase). باستخدام هذا الأسلوب، ونحن كشف عن فقدان فسيولوجية الليزوزومية الحموضة في الأمعاء للحيوانات الأنثوية (الرسم البياني في الشكل 2، الصور الفلورية في الشكل 3). إشارة كدكفدا انخفاض في الأمعاء يوم 8 (وظيفة-L4) الديدان وأشار إلى ليسوسوميس الكالينيزيد، وضعف ممكنة في إزالة البروتين. وهذا هو في الواقع الحالة، كما تتراكم هذه الحيوانات إلى حد كبير المجاميع البروتين داخل ليسوسوميس في هذه المرحلة الحياة22. للتحقق من صحة دور التجويف التحمض دي في هذه العملية، ونحن شارك الملون الشباب، استنساخ الحيوانات التي قد تم استنفادها في [رني] من اثنين من المكونات الأساسية لآلية ضخ ATPase الخامس (VHA-2 وفى-8) و لذلك يجب أن لا يتم استيراد البروتونات إلى بشكل صحيح ليسوسوميس. كما هو متوقع، vha-2 و vha-8 الحيوانات [رني]، حتى في المرحلة الإنجابية، أظهرت انخفاض كدكفدا fluorescence إشارات مماثلة لتلك التي تلي البرية نوع الديدان ومتسقة مع ليسوسوميس الكالينيزيد (الشكل 3).
رقم 1: تحضير الشرائح للفحص المجهري. تخطيطي خطوة بخطوة بسيطة تبين الخطوات الواجب اتباعها لتحضير الشرائح للفحص المجهري.
الشكل 2: استخدام الأصباغ حساسة لدرجة الحموضة للتحقيق الحموضة في الأمعاء ليسوسوميس من C. ايليجانس. رسم تخطيطي يوضح أنماط كدكفدا المعوية fluorescence كثافة في استنساخ (اليوم 2) والديدان الإنجابية فيما بعد (اليوم الثامن). إظهار المخططات الأعلى كله الديدان. التكبير المربعين في الأسفل تمثل، المتوقعة رسومات تخطيطية لمنطقة الأمامي، التجويف المعوي في المركز. Lysosomes يصور حويصلات ذات أحجام مختلفة في السيتوبلازم للخلايا المعوية. قارن هذه التخطيطية مع الصور رقم 3 .
الشكل 3: تلوين الصور كدكفدا. صور الممثل تظهر اليوم 8 (وظيفة L4) واليوم 2 C. ايليجانس lysosomes المعوية (نوع البرية N2) ملطخة كدكفدا، فضلا عن ليسوسوميس المعوية الديدان [رني] vha-2 و vha-8 ملطخة كدكفدا (التحكم بإيجابية). vha-2 و vha-8 ترميز مفارز ATPase رغوي (فاتباسي)، مضخة البروتون بطانة غشاء الليزوزومية هي المسؤولة عن التحمض التجويف الليزوزومية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مجموعة متنوعة من الأحداث الجزيئية والخلوية تسهم في الشيخوخة، متأثر بسمات تاريخ الحياة والعوامل الوراثية. لدينا الدراسة الأخيرة22 تشير إلى أن دورة الإنجابية دوراً هاما في السيطرة على اللياقة البدنية سوما من خلال تنظيم ديناميات الليزوزومية الأس الهيدروجيني. أظهرنا أن يتعزز هذا proteolysis الليزوزومية بوساطة حين استنساخ الحيوانات بنشاط قبل upregulation نسخ الخامس-ATPase، الذي يكفل بدوره lysosomes الحمضية. عند نهاية الاستنساخ، قطرات التعبير الخامس-ATPase، الكالينيزي lysosomes، وتتراكم المجاميع البروتين في هذه الخلايا.
أظهرت الاضطرابات التي تنال من التحمض الليزوزومية بسبب تغيير الخامس-ATPase النشاط، وتناقص الدالة الخامس-ATPase في المخ وقد اقترح أيضا تكمن وراء أمراض الأعصاب المختلفة23. النتائج التي توصلنا إليها كذلك تدعم فرضية أن وظيفة البصر الخامس-ATPase من بين أسباب الشيخوخة الخلوية والشيخوخة24.
واحد مميزة الخلوية لخلايا الشيخوخة هو التشكيل التدريجي من البروتينات تجمعات ومجمعة في القديمة الخلايا1،25،،من2627،،من2829. كما هو الحال في C. ايليجانس، تلي الخلايا بروتين مماثلة توجد المجاميع في التجويف الليزوزومية الراحل مثقف الثدييات مرور27،29. منذ lysosomes هي نقطة النهاية الطرفية المسار أوتوفاجيك، فمن المعقول أن التدفق المستمر للبروتينات التالفة والعضيات في ليسوسوميس الكالينيزيد النتائج في انهيار هذه lysosomes، الوظيفية مما يؤدي بعد ذلك إلى الآخر أحداث المصب التي تسهم في نهاية المطاف إلى الشيخوخة الخلوية.
تم تصميم البروتوكول هو موضح هنا لتوليد بتقييم بسيط واستنساخه للحموضة نسبي في lysosomes المعوية من العيش C. ايليجانس. لأن طائفة ضيقة الأس الهيدروجيني (4.5 – 5) مطلوب في هذه العضيات على بروتيوليسيس السليم، زيادات خفية في الأس الهيدروجيني عواقب وخيمة للخلايا والأنسجة والتوازن17. خصائص الأسفار و pka منخفضة من كدكفدا تسمح هذه الصبغة لالتقاط التغييرات في الحموضة في هذه النافذة ذات الصلة فسيولوجيا الأس الهيدروجيني18. تم تحسين تركيز كدكفدا الموصى بها لتلطيخ lysosomes لتوفير قراءات إمكانية أفضل للتغيرات في درجة الحموضة الليزوزومية استناداً إلى المعلمات التصوير ونظام التصوير. وحتى مع ذلك، قد تختلف النتائج من تلطيخ كدكفدا للمستخدمين النهائيين مختلفة استناداً إلى الإعداد التصوير أن الأس الهيدروجيني الليزوزومية قد لا بدقة تنعكس التغييرات في نمط المصبوغة كدكفدا. إذا حدث هذا، أفضل مسار للعمل سيكون لاستخدام تتراوح تركيزات كدكفدا (10 إلى 100 ملم) لتحديد تركيز الأمثل لتصوير الاختلافات في الديدان البرية نوع N2 في اليوم الثاني واليوم 8 وظيفة L4. أن تركيز كدكفدا المثالي هو الذي البقع lysosomes للديدان الصغار (بوست يوم 2 L4) كفاءة دون يجري oversaturated ولكنه يظهر أيضا انخفاض كثافة المصبوغة القديمة (بوست يوم 8 L4) الديدان.
واحد أوجه قصور أسلوب المصبوغة كدكفدا هو وقتها حضانة طويلة. عندما يتم المحتضنة الديدان في نقطة زمنية معينة، يمكن تصور النتائج إلا بعد ح ~ 24. وسيكون أكثر فعالية لتطوير سلالة من C. ايليجانس التي تنص قراءات في الوقت الحقيقي للأس الهيدروجيني الليزوزومية، يفترض أن استخدام فلوروفوري حساسة لدرجة الحموضة من معلم لبروتين غشاء الليزوزومية.
في حين يوجد عدد قليل من تقنيات مختلفة لتقييم درجة الحموضة في الأمعاء من C. ايليجانس، معظم هذه التقنيات أما تقييم درجة حموضة الأمعاء ك أسرة30، أو تتطلب حقن في تجويف الجسم، وتستغرق وقتاً طويلاً و مرهقة31. يمكن بسهولة تطبيق كدكفدا للشاشات الوراثية واسعة النطاق باستخدام التغذية [رني] مكتبات للبحث عن طفرات C. ايليجانس أن إظهار تغيير الرقم الهيدروجيني الليزوزومية أو علم وظائف الأعضاء. الجوانب الحرجة فقط لهذا الأسلوب هي تركيز كدكفدا المستخدمة والتأكد من تضمين شاب (بوست يوم 2 L4) N2 التحكم سلالة كنقطة مرجعية لتكوين التصوير [كنفوكل] أثناء كل دورة.
لفهم أفضل لمساهمة الأس الهيدروجيني الليزوزومية إلى الشيخوخة، سيكون من المهم تشريح آليات تنظيمية وراء التغيرات الدينامية في الحموضة الليزوزومية استجابة لمدخلات الخلوية والبيئية المختلفة. تلوين كدكفدا قد تستعمل كاستراتيجية واحدة لتوسيع نطاق هذا البحث في C. ايليجانس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر مركز علم الوراثة كاينورهابديتيس السلالات، والعلوم الطبيعية ومجلس البحوث الهندسية (مقدمة)، والمؤسسة الكندية للابتكار (CFI) للتمويل. ونود أن نشكر الدكتور تشين ليزين (إدارة أنظمة الخلية والتشريح، UT الصحة سان أنطونيو) للسماح بالاستخدام غير المقيد لها مرافق مختبر لجميع التجارب التي C. ايليجانس ، فضلا عن الدكتور وانغ اكسينج (المدير المعاون، مرفق التصوير الضوئي ، UT الصحة سان أنطونيو) للحصول على المساعدة مع الفحص المجهري [كنفوكل]. ونود أيضا أن نشكر الدكتور مايرون إغناطيوس لتقديم الدعم والتشجيع لتسهيل تصوير فيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OP50 (E. coli) | Caenorhabditis Genetics Center | Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| 5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate | ThermoFisher | C369 | Commonly known as cDCFDA |
| 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron | ThermoFisher | L7528 | Commonly known as Lysotracker Red |
| Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510) | |||
| ImageJ | Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| LB Broth powder | ThermoFisher | 22700041 | |
| Bacto Agar | Sigma | A5306-1KG | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | S71604 | |
| Cholesterol powder | Sigma | C3045 | |
| CaCl2 | Sigma | 449709 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| K3PO4 | Sigma | P5629 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover Slips | ThermoFisher | 3406 | |
| Agarose | Sigma | A6013 | |
| Incubator | |||
| Mirror or other smooth flat surface |
References
- Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants. Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).
- Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. Autophagy for the avoidance of neurodegeneration. Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).
- Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
- Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
- Cuervo, A. M., et al. Autophagy and aging: the importance of maintaining "clean" cells. Autophagy. 1 (3), 131-140 (2005).
- Harrington, A. J., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Caenorhabditis elegans as a model system for identifying effectors of alpha-synuclein misfolding and dopaminergic cell death associated with Parkinson's disease. Methods. 53 (3), 220-225 (2011).
- Muchowski, P. J. Protein misfolding, amyloid formation, and neurodegeneration: a critical role for molecular chaperones? Neuron. 35 (1), 9-12 (2002).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. Age-related decline in chaperone-mediated autophagy. J Biol Chem. 275 (40), 31505-31513 (2000).
- Tonoki, A., et al. Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process. Mol Cell Biol. 29 (4), 1095-1106 (2009).
- Squier, T. C. Oxidative stress and protein aggregation during biological aging. Exp Gerontol. 36 (9), 1539-1550 (2001).
- Sarkar, S., et al. Small molecules enhance autophagy and reduce toxicity in Huntington's disease models. Nat Chem Biol. 3 (6), 331-338 (2007).
- Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).
- Boya, P. Lysosomal function and dysfunction: mechanism and disease. Antioxid Redox Signal. 17 (5), 766-774 (2012).
- Kim, D. K., et al. Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function. Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).
- Vila, M., Bove, J., Dehay, B., Rodriguez-Muela, N., Boya, P. Lysosomal membrane permeabilization in Parkinson disease. Autophagy. 7 (1), 98-100 (2011).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. How do intracellular proteolytic systems change with age? Front Biosci. 3, d25-d43 (1998).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. When lysosomes get old. Exp Gerontol. 35 (2), 119-131 (2000).
- Gachet, Y., Codlin, S., Hyams, J. S., Mole, S. E. btn1, the Schizosaccharomyces pombe homologue of the human Batten disease gene CLN3, regulates vacuole homeostasis. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5525-5536 (2005).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Preston, R. A., Murphy, R. F., Jones, E. W. Assay of vacuolar pH in yeast and identification of acidification-defective mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (18), 7027-7031 (1989).
- Pringle, J. R., et al. Fluorescence microscopy methods for yeast. Methods Cell Biol. 31, 357-435 (1989).
- Baxi, K., Ghavidel, A., Waddell, B., Harkness, T. A., de Carvalho, C. E. Regulation of Lysosomal Function by the DAF-16 Forkhead Transcription Factor Couples Reproduction to Aging in Caenorhabditis elegans. Genetics. 207 (1), 83-101 (2017).
- Colacurcio, D. J., Nixon, R. A. Disorders of lysosomal acidification-The emerging role of v-ATPase in aging and neurodegenerative disease. Ageing Res Rev. 32, 75-88 (2016).
- Kang, H. T., et al. Chemical screening identifies ATM as a target for alleviating senescence. Nat Chem Biol. 13 (6), 616-623 (2017).
- Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death. Nature. 431 (7010), 805-810 (2004).
- Brunk, U. T., Terman, A. The mitochondrial-lysosomal axis theory of aging: accumulation of damaged mitochondria as a result of imperfect autophagocytosis. Eur J Biochem. 269 (8), 1996-2002 (2002).
- Gerland, L. M., et al. Autolysosomes accumulate during in vitro CD8+ T-lymphocyte aging and may participate in induced death sensitization of senescent cells. Exp Gerontol. 39 (5), 789-800 (2004).
- Poon, H. F., Vaishnav, R. A., Getchell, T. V., Getchell, M. L., Butterfield, D. A. Quantitative proteomics analysis of differential protein expression and oxidative modification of specific proteins in the brains of old mice. Neurobiol Aging. 27 (7), 1010-1019 (2006).
- Yin, D. Biochemical basis of lipofuscin, ceroid, and age pigment-like fluorophores. Free Radic Biol Med. 21 (6), 871-888 (1996).
- Nehrke, K. A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span. J Biol Chem. 278 (45), 44657-44666 (2003).
- Chakraborty, K., Leung, K., Krishnan, Y. High lumenal chloride in the lysosome is critical for lysosome function. Elife. 6, (2017).
