Summary
用 pH 敏感的生命染料 5 (6)-羧基-2 ', 7 '-dichlorofluorescein 双乙酸 (cDCFDA) 研究了在线虫的肠道中溶酶体酸度损失的分步指南
Abstract
线虫秀丽线虫(C. 线虫) 是一种广泛用于研究长寿和发育途径的模型系统。这种研究通过动物的透明性、向前和反向基因检测的能力、产生荧光标记蛋白的相对容易性以及荧光染料的使用来促进, 它们可以杏仁到早期胚胎或纳入其食物 (大肠杆菌菌株 OP50) 标签细胞器 (例如9-二乙基-5 H 苯并 (a) phenoxazine-5-一和 (3-{2-[(1 H, 1 ' H-22 '-bipyrrol 5-基 kappaN (1)) methylidene]-2 H-咯-5-基 kappaN}-N-[2-(二甲基氨基) 乙基] propanamidato) (difluoro) 硼)。在这里, 我们提出使用荧光 pH 敏感染料, 染色肠道溶酶体, 提供了动态, 生理变化的溶酶体酸度在活蠕虫的视觉读数。该协议不测量溶酶体 pH 值, 而是旨在建立一个可靠的方法来评估溶酶酸度的生理相关变化。cDCFDA 是一种细胞 permeant 化合物, 转化为荧光荧光 5-(和-6) 羧基-2 ', 7 '-dichlorofluorescein (cDCF) 水解后, 细胞内酯。质子内溶酶体陷阱 cDCF 在这些细胞器中, 在那里积聚。该染料由于其4.8 的低碱性, 已被用作酵母中的 pH 传感器。在这里, 我们描述了使用 cDCFDA 作为食物补充, 以评估肠道溶酶体的酸度在线虫.这种技术允许检测活动物中的碱化溶酶体,并具有广泛的实验应用, 包括对衰老、自噬和溶酶合成的研究。
Introduction
蛋白质团聚体的出现被广泛认为是真核细胞老化的标志1,2,3, 和其形成是细胞衰老的原则驱动因素4,5,6,7. 越来越多的证据表明, 随着细胞老化, 蛋白质分解代谢被削弱, 导致蛋白质聚集的增加。衰老细胞蛋白质水解的崩溃涉及自噬8的损伤以及蛋白酶介导的蛋白质降解9。最后, 在旧细胞中增加了不可逆转的蛋白质氧化, 进一步损害了蛋白质的分解代谢10。
自噬最初被认为是一个非选择性的过程, 以大量降解受损的蛋白质, 但最近的研究表明, 自噬是高度选择性的分解代谢的蛋白质聚集和功能失调的细胞器, 不可通过其他蛋白质清除机制11进行降解。在自噬过程中, 受损和聚集的蛋白质被隔离成一个叫做 autophagosome 的双膜囊泡。这个 autophagosome 然后与称为溶酶体的酸性细胞器融合, 导致 autophagosome 货物的降解12。溶酶体代表自噬性通路的终点, 参与不同的细胞过程, 如膜修复、转录控制和养分传感;突出它们在细胞稳态中的集中作用 (在 ref 13 中复习)。一些研究表明, 年龄依赖性的溶酶体功能下降与各种神经退行性疾病的相关性为13。一贯地, 在旧的细胞中恢复溶酶函数可以延缓衰老相关表型的出现,14,15。对 intralumen 环境组成的研究表明, 早期细胞溶酶酶功能的崩溃不是由于溶酶酶蛋白酶16的产生而减少的。另外, 有人建议, intralysosomal 酸度的损失, 它的酶活性的一个关键要求, 可能是在溶酶介导的蛋白质降解17的下降。为了能够探索这一假说, 必须开发试剂和协议, 以一种可复制和一致的方式来探测活细胞中溶酶体 pH 值的动态变化。
线虫的肠道是蠕虫的主要代谢组织, 是系统性稳态和寿命的重要调节因子。我们已经开发了测定蠕虫肠道溶酶体的酸性变化的检测方法, 以确定溶酶介导的蛋白质水解如何导致衰老。虽然以前在线虫中使用了 pH 敏感的显影标记肠道溶酶体, 但还没有努力建立一个成功的协议, 可以检测溶酶体 pH体内的小增加18.在这里, 我们提供了一种协议, 可用于检测C. 线虫肠道细胞中溶酶体酸度的损失, 使用一种简单而方便的喂养协议, 将 pH 敏感的荧光 (cDCFDA) 纳入 OP50 食品中。
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Protocol
1. 染色和图像肠道溶酶体
- OP50 种子线虫生长培养基 (NGM) 板
- 根据建议的协议19准备 NGM 板, 并允许在室温下将密封板干燥2天。
- 将 OP50 细菌接种到无菌 Luria 汤 (磅) 汤中, 在37摄氏度或36小时的水浴中生长, 或直到外径介于0.2 和0.4 之间。避免使用细菌培养 > 1 或 od < 0.2。
- 一旦 NGM 板干燥, 将一滴 (~ 30 µL) 的 OP50 接种到板的中心, 然后把下降到一个补丁大致是2厘米 x 2 厘米的大小。
注: 任何剩余的 OP50 接种可以储存在4摄氏度, 长达一个月。 - 在接种干燥后反转 OP50 板 (大约10或15分钟), 然后将37摄氏度的板材孵化为36小时。
- 36小时后, 从孵化箱中取出盘子, 储存在4摄氏度, 直到以后使用。
注: 板材应在4摄氏度的1月内良好。
- 补充 cDCFDA 到 OP50
- 在 OP50 板上补充 cDCFDA, 在二甲基亚砜 (亚砜) 上制备10毫米 cDCFDA 的工作库存。保持 cDCFDA 解决方案免受光照和存储在-20 摄氏度后使用。
- 轻轻地将100µL 10 毫米 cDCFDA 溶液放到2厘米 x 2 厘米 OP50 贴片的表面, 这样整个贴片都被 cDCFDA 均匀覆盖。
注意: 这是非常重要的, 整个补丁的 OP50 覆盖 cDCFDA。如果需要, 使用多达150µL 的 cDCFDA 为每个板块。cDCFDA 解决方案也必须不超出 OP50 补丁的边界范围, 因为从 OP50 修补程序流出的任何 cDCFDA 不会被纳入食物中, 而且会导致染色强度降低。 - 将 OP50 板放在工作台顶部的一个黑盒子里, 直到所有的 cDCFDA 溶液都被吸收到细菌斑块 (通常约25到30分钟)。
- 使用 cDCFDA 染色蠕虫
- 一旦 cDCFDA 完全渗透到 OP50 补丁, 每板放置不超过20蠕虫和孵化的板块反转在20°c 至少14小时。
注意: 建议将 cDCFDA 板放在不透明的盒子中, 以尽量减少光的照射。 - 为了控制实验之间的摄入差异和规范 cDCFDA 信号, (推荐) 与 3-{2-[(1 H) 的 co 染色, 1 ' H-22 '-bipyrrol 5-基 kappaN (1)) methylidene]-2 H-咯-5-基 kappaN} N [2-(二甲基氨基) 乙] propanamidato) (difluoro) 硼 (2.5 µL 的新鲜制成的1毫米溶液), acidotropic 弱胺染料, 其荧光主要是非变异的酸性 pH 谱 (参见材料表的常用试剂名称)。
注意: 不要将蠕虫染色少于14小时, 因为这可能会提供不充分的 cDCFDA 染色强度, 并对溶酶体 pH 值作假解释。
- 一旦 cDCFDA 完全渗透到 OP50 补丁, 每板放置不超过20蠕虫和孵化的板块反转在20°c 至少14小时。
- 准备用于显微镜的幻灯片
- 将两条带标签的磁带贴在平滑的平坦表面上, 如镜像 (图 1), 其间隔约为3英寸。
- 将镜面表面涂上防水喷雾剂, 并擦拭多余液体。
- 熔融2% 琼脂糖 (溶解在蒸馏 H2O), 直到完全液化, 然后在两条胶带之间放置一个50µL 滴琼脂糖, 用显微镜滑动迅速覆盖下降, 这样, 幻灯片垂直于带磁带。在琼脂糖凝固后, 在滑块下形成一个圆形垫, 翻转滑块, 将10到15µL 的5mM 钠叠氮化物 (NaN3) 添加到琼脂糖垫上。
注意: NaN3是一种细胞色素 C 抑制剂, 当用于低浓度时, 可逆 anesthetizes 蠕虫, 以便它们在成像过程中不会移动。 - 从 OP50 板中提取蠕虫补充 cDCFDA, 并将其转移到一个干净的 NGM 板没有任何 OP50。允许蠕虫移动大约几秒钟, 允许大部分 OP50 从蠕虫表面移除, 然后将蠕虫转移到含有5毫米叠氮化钠的琼脂糖垫上。
- 立即用盖子滑盖琼脂糖垫。一定要轻轻地放置在不施加太多的压力, 因为这可能导致蠕虫爆裂的封面滑动。
注: OP50 细菌辅以 cDCFDA 荧光显微镜下可视化, 因此, 重要的是要尽可能最好地清洁蠕虫之前, 把它们放在含有叠氮化钠的琼脂糖垫。如果准备6多株线虫(包括 N2、野生型控制), 最好在6批次中制备样品, 以确保蠕虫不会在琼脂糖垫上干燥。在某些菌株中, 由于来自盖板的压力, 外阴在延长的时间内开始破裂, 因此有必要进行相应的计划。
- 共焦显微术
注: 某些显微镜具有内置功能, 可自动增加荧光强度, 以补偿可变水平的荧光。这种显微镜对 cDCFDA 染色的蠕虫可能无法正常工作, 因为它们本身就会增加样品的荧光强度。- 在标准共焦显微镜上进行成像, 使用激发/发射波长设置为 cDCFDA 488/530 nm。采用单平面图像 (不是 Z 栈) 的肠道溶酶体, 只使用集中 (最大信号强度) 的溶酶体进行强度量化。
注: 也许是由于染料的可用性不同, 肠细胞溶酶体直接后咽后保持 cDCFDA 染色强度, 无论基因型或年龄, 因此应注意避免这些细胞的成像溶酶体。 - 图像的幻灯片包含2天老野生类型 N2 蠕虫首先。在这样做的同时, 调整共焦成像参数, 如激光功率, 针孔, 光圈, 以确保 cDCFDA 染色强度不饱和。
注意: 设置了这些设置后, 不要在当天的整个映像期间更改它们。 - 使用60X 放大透镜捕获单个小肠平面的 1024 x 1024 像素图像 (每个蠕虫的3到4个图像)。
注: 蠕虫的 cDCFDA 发射光谱将产生一个单一的突出峰值在520毫微米与它报告的荧光光谱20, 提供一个特定的信号读数, 有别于肠道自发荧光 (图 3)。 - 将原始共焦图像 (. lsm 文件) 导出为每个通道的. tiff 文件。
- 接下来, 打开 ImageJ, 然后单击文件 |打开以打开要量化的图像文件。图像加载后, 使用 ImageJ 中的 "椭圆形状选择" 工具选择感兴趣的区域 (ROI)。
- 此后, 单击分析 |测量以量化该 ROI 的荧光强度。选择第4-5 不同的聚焦溶酶每个图像和计算平均相对荧光强度每个区域的利益 (ROI)。
- 对于每个图像, 测量溶酶体之间肠道区域的背景荧光强度。从溶酶体荧光强度值中减去背景荧光强度值。
- 总计, 收集大约30到50个单独规范化的价值为 cDCFDA 强度 (6 到10动物) 为每株被测试。使用这些值绘制一个框和晶须图, 使用任何适当的统计软件。
注: 染色可能因温度、潜伏期和动物整体健康/年龄等因素的不同而有很大差异, 因此荧光强度比较仅在样品过程中与同一染色试验有关。因此, 在每个染色实验中处理控制是很重要的。使用任何适当的统计软件计算统计差异 (t测试)。 - 图像的所有菌株从同一实验 (当天染色) 顺序, 注意不要改变任何成像参数。
- 在标准共焦显微镜上进行成像, 使用激发/发射波长设置为 cDCFDA 488/530 nm。采用单平面图像 (不是 Z 栈) 的肠道溶酶体, 只使用集中 (最大信号强度) 的溶酶体进行强度量化。
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Representative Results
cDCFDA 渍溶酶在 ph 依赖性的方式, 它的低 pKa 和准备吸收入溶酶使它成为理想的 pH 传感器21。cDCFDA 染色强度与溶酶体 ph 值成反比 (即染色强度随 pH 值的降低而增加)18,22。cDCFDA 信号在动物溶酶体中一直很弱, 在20毫米的氯喹, 一个溶酶体酸化抑制剂, 和在蠕虫耗尽的 v-atp 酶, 蛋白质复合体的膜上的溶酶, 质子导入所需的22.这些是在评估其他遗传背景或治疗中 cDCFDA 染色的相对水平时使用的重要控制。
我们还发现, cDCFDA 暴露对被处理的蠕虫的适用性或肥力没有明显的影响 (未显示数据)。利用这一协议, 我们确定了在繁殖后野生型蠕虫的溶酶体中内源性的酸性损失。如图3所示, cDCFDA 荧光信号在年轻 (2 天后 L4) 再生的溶酶体中具有健壮性, 标志着酸化溶酶. 染色强度大大减少后, 碱化的溶酶体, 如观察到老 (8 天后 L4) 蠕虫和蠕虫的质子流入这些细胞器减少 (通过击倒的vha基因编码 v-atp 亚基)。利用这种方法, 我们检测到生殖动物肠道内溶酶体酸度的生理损失 (图2,图 3中的荧光图像)。在8天 (post-L4) 蠕虫的肠道减少的 cDCFDA 信号指的是碱化溶酶体和蛋白质清除可能的损害。事实是这样的, 因为这些动物在这个生命期22中大量积累了溶酶体内的蛋白质聚集物。为了验证腔内去酸化在这个过程中的作用, 我们共同染色的年轻, 繁殖的动物, 已耗尽的 rna 的两个核心组成部分的 v-atp 酶泵机械 (VHA-2 和 VHA-8), 因此不应该正确地进口质子到溶 酶 体。如预期的那样, vha-2和vha-8 rna 干扰动物, 即使在生殖阶段, 也显示了 cDCFDA 荧光信号的减少, 与繁殖后野生型蠕虫类似, 与碱化溶酶体一致 (图 3)。
图 1: 准备用于显微镜的幻灯片.一个简单的分步示意图, 显示了为显微镜准备幻灯片要遵循的步骤。
图 2: 利用 pH 敏感染料对线虫肠道溶酶体的酸性进行探针检测。图示显示肠道 cDCFDA 荧光强度在繁殖 (2 天) 和繁殖后 (8 天) 蠕虫的模式。顶部图显示整个蠕虫.在底部的盒子代表放大, 投影图中肠区, 肠道腔在中心。溶酶体被描述为小肠细胞细胞质中不同大小的囊泡。将这些原理图与图 3图像进行比较。
图 3: cDCFDA 染色图像.有代表性的图像显示2天和8天 (后 L4) C. 线虫肠道溶酶体 (N2 野生型) 染色 cDCFDA 以及vha-2和vha-8的肠道溶酶酶染色 cDCFDA (阳性对照)。vha-2和vha-8编码泡 atp (vATPase) 的子单元, 该质子泵排在溶酶体膜上, 负责溶酶腔的酸化。
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Discussion
各种细胞和分子事件导致衰老, 受生命史特征和遗传因素的影响。我们最近的研究22表明, 生殖周期通过调节溶酶体 pH 动态, 在控制躯体健康方面起着重要作用。我们表明, 溶酶介导的蛋白质水解是促进, 而动物积极繁殖的 v-atp 酶转录上调, 这反过来确保酸性溶酶。繁殖结束后, v-atp 酶表达下降, 溶酶体 alkalinize, 蛋白质聚集积累在这些细胞。
损害溶酶体酸化的障碍已被证明是由改变的 v-atp 酶活性, 并提出了在大脑中的 v atp 功能下降的基础上的各种神经退行性疾病的基础23。我们的研究结果进一步支持这种假说, 即受损的 v atp 酶功能是细胞衰老和衰老的原因之一24。
衰老细胞的一个细胞学标志是在老细胞中逐渐形成错误折叠和聚集蛋白 1, 25, 26, 27, 28, 29.与后生殖性的线虫一样, 在晚期哺乳动物培养细胞的溶酶体腔中发现类似的蛋白质聚集物,27,29。由于溶酶体是自噬性通路的终点, 因此, 被破坏的蛋白质和细胞器不断涌入碱化溶酶体会导致这些溶酶酶的功能崩溃, 进而导致其他最终导致细胞衰老的下游事件。
此处描述的协议旨在生成一个简单而又可重复的评估活的C. 线虫肠道溶酶体的相对酸度。由于在这些细胞器中需要一个狭窄的 ph 值范围 (4.5–5) 来进行适当的蛋白质水解, ph 值的细微增加会对蜂窝和组织稳态17产生戏剧性的影响。cDCFDA 的荧光特性和低酸值使得这种染料能够在生理相关的 pH 值窗口18中捕捉酸度的变化。对染色溶酶体推荐的 cDCFDA 浓度进行了优化, 以根据我们的成像参数和成像系统, 为溶酶体 pH 值的变化提供最佳的读数。即便如此, cDCFDA 染色的结果可能会因不同的最终用户而异, 因为它们的成像设置使溶酶体 pH 值的变化可能无法准确地反映在 cDCFDA 染色模式中。如果发生这种情况, 最好的做法是使用不同浓度的 cDCFDA (10 到100毫米), 以确定最佳浓度的野生型 N2 蠕虫在2天和 8 L4 后的影像变异。理想的 cDCFDA 浓度是一种在不饱和的情况下有效地染色年轻 (2 天后 L4) 蠕虫的溶酶体, 但也显示了老 (8 天 L4) 蠕虫的染色强度下降。
cDCFDA 染色技术的局限性之一是其培养时间长。当蠕虫在特定的时间点孵化时, 结果只能在24小时后才被可视化。更有效的方法是开发一种线虫的菌株, 它提供了溶酶体 ph 值的实时读数, 推测是使用了一种 ph 敏感的荧光, 它被标记为溶酶体膜蛋白。
虽然有几种不同的方法来评估在线虫的肠道 ph 值,大多数这些技术要么评估肠道的 ph 值为一个整体30,或需要注入到体腔, 这是耗时的和繁琐的31。cDCFDA 可以很容易地应用于大规模的基因筛, 使用喂食 rna 干扰库搜索C. 线虫突变体, 显示改变的溶酶体 pH 值或生理学。此方法的唯一关键方面是使用的 cDCFDA 浓度, 并确保包括一个年轻的 (2 天后 L4) N2 控制应变作为一个基准, 以配置共聚焦成像在每一次会议。
为了更好地理解溶酶酶的 pH 值对衰老的贡献, 重要的是在不同的细胞和环境输入的作用下, 解剖溶酶体酸度动态变化背后的调控机制。在线虫中, cDCFDA 染色可作为一种推广此项研究的策略。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们要感谢秀丽遗传学中心的菌株, 自然科学和工程研究理事会 (NSERC) 和加拿大创新基金会 (CFI) 供资。我们要感谢关丽珍博士 (细胞系统和解剖学部, UT 健康圣安东尼奥) 允许不受限制地使用她的实验室设施为所有C. 线虫实验和 Exing 博士 (副主任, 光学成像设备, UT 健康圣安东尼奥) 为协助与共焦显微术。此外, 我们亦多谢何议员提供支持和鼓励, 以协助拍摄影片。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OP50 (E. coli) | Caenorhabditis Genetics Center | Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| 5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate | ThermoFisher | C369 | Commonly known as cDCFDA |
| 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron | ThermoFisher | L7528 | Commonly known as Lysotracker Red |
| Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510) | |||
| ImageJ | Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| LB Broth powder | ThermoFisher | 22700041 | |
| Bacto Agar | Sigma | A5306-1KG | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | S71604 | |
| Cholesterol powder | Sigma | C3045 | |
| CaCl2 | Sigma | 449709 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| K3PO4 | Sigma | P5629 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover Slips | ThermoFisher | 3406 | |
| Agarose | Sigma | A6013 | |
| Incubator | |||
| Mirror or other smooth flat surface |
References
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