Summary
C. 선 충 pH에 민감한 중요 한 염료 5 (6)-카-를 사용 하 여 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)의 소장에 lysosomal 산의 손실을 조사 하는 단계별 가이드
Abstract
선 충 류 꼬마 선 충 (C. 선 충) 널리 장 수 및 발달 경로 연구 하는 데 사용 되는 모델 시스템입니다. 이러한 연구는 동물, 앞으로 고 역 유전자 분석, 붙일 레이블된 생성 단백질의 상대적 용이성 및 초기에 microinjected도 수 형광 염료의 사용 능력의 투명도 의해 촉진 된다 배아 세포 세포 (예 9-diethylamino-5 H-benzo (a) phenoxazine-5-1 및 (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-를 그것의 음식 (E. 콜라이 긴장 OP50)에 법인 또는 [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron)입니다. 여기, 선물이 장 리소좀 얼룩 형광 pH에 민감한 염료를 사용 하 여 라이브 벌레에 lysosomal 산에서 동적, 생리 적 변화를 영상 판독을 제공. 이 프로토콜 lysosomal pH를 측정 하지 않습니다 하지만 오히려 lysosomal 산 성도에 관련 된 생리 적 변화를 평가 하는 신뢰할 수 있는 방법을 설정 하는 것을 목표로. cDCFDA는 형광 fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) 가수분해 시 세포내 esterases 변환 되는 셀 permeant 화합물 이다. 리소좀 안에 Protonation cDCF 어디 축적이 세포에서 트랩 합니다. 4.8의 그것의 낮은 pKa 때문이 염료는 효 모에는 pH 센서로 사용 되었습니다. 여기에 장 리소좀의 산도 평가 하기 위해 음식 보충으로 cDCFDA 사용 하 여 설명 C. 선 충. 이 기술은 살아있는 동물, alkalinizing 리소좀의 검출에 대 한 허용 하 고 노화와 autophagy, lysosomal 속에 대 한 연구를 포함 하는 실험적인 응용 프로그램의 광범위 한 범위를 하고있다.
Introduction
단백질의 외관은 진 핵 세포1,2,3, 그리고 대형의 생각 된다 세포 노화4 의 원리 드라이버 중에 노화의 각 인 될 널리 허용 , 5 , 6 , 7. 나이, 세포로 단백질 놓을 장애인, 단백질 집계에 증가로 이어지는 성장 증거가 있다. 세포 노화에 베이스의 붕괴 autophagy8 프로테아좀 중재 단백질 저하9의 장애를 포함 한다. 마지막으로, 돌이킬 수 없는 단백질 산화 단백질 놓을10더 혼란, 오래 된 세포에서 증가 된다.
Autophagy 처음 손상 된 단백질의 대량 저하에 대 한 비 선택 과정이 될 생각 하지만 최근 연구 결과 그 autophagy는 단백질 집계 되지 않은 역 기능 세포의 놓을에 매우 선택적 표명 의무가 다른 단백질 정리 메커니즘11통해 저하. Autophagy 과정에서 손상 되 고 집계 된 단백질은 autophagosome 라는 이중 막 소포에 격리 됩니다. 이 autophagosome 다음 리소좀, 라는 산 성 세포와 autophagosome 화물12의 저하에 이르게 퓨즈. Lysosomes autophagic 통로의 끝점을 나타내는 고 막 수리, transcriptional 제어 및 영양소 감지; 같은 다른 세포질 과정에 참여 세포질 항상성 (참고 13에서 검토 한 결과)에 그들의 중앙된 역할을 강조 합니다. 여러 연구 lysosomal 함수에는 연령에 따라 감소와 다양 한 신경 장애13사이 연결 표시. 일관 되 게, 이전 셀에 lysosomal 기능을 복원 노화 관련 고기14,15의 발병을 지연 수 있습니다. Intralumen 환경 구성의 연구 이전 셀에 lysosomal 기능의 붕괴 lysosomal 프로 테아 제16의 생산에 있는 감소 때문에 하지는 것이 좋습니다. 또는, intralysosomal 산, 그것의 효소 활동의 중요 한 요구의 손실 리소좀 중재 베이스17드롭 기초 수 있습니다 제안 되었습니다. 이 가설을 찾아보기 수 있도록, 시 약 및 복제 하 고 일관 된 방식으로 라이브 셀에 lysosomal pH에서 동적인 변화를 조사 하는 프로토콜 개발에 필수적 이다.
C. 선 충 의 창 자 벌레에서 주요 대사 조직 이며 조직의 항상성 및 수명의 중요 한 레 귤 레이 터 이다. 우리는 변화를 평가 하기 위해 분석 실험 개발 어떻게 리소좀 중재 하는 베이스를 결정 하는 벌레의 장 리소좀의 루멘의 산 성도에 노화에 기여. PH에 민감한 fluorophores에서에서 사용 된 이전 C. 선 충 장 리소좀을 표시, 하지만 아직 lysosomal pH vivo에서18. 에 있는 작은 증가 감지할 수 있는 성공적인 프로토콜을 설정 하는 노력 되지 않았습니다. 여기, 우리 OP50 음식으로 pH에 민감한 fluorophore (cDCFDA)를 통합 하는 간단 하 고 편리한 먹이 프로토콜을 사용 하 여 C. 선 충 의 장 셀에 lysosomal 산 성도의 손실을 감지 하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 제공 합니다.
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Protocol
1. 얼룩 및 장 리소좀 이미지
- 씨 선 충 성장 매체 (NGM) OP50와 플레이트
- 권장된 프로토콜19 당 NGM 접시를 준비 하 고 실 온에서 2 일 동안 건조 닫힌된 접시 허용.
- OP50 박테리아 살 균 Luria 국물 (파운드) 국물에 접종 하 고 36 h 또는 마약은 0.2 ~ 0.4까지 37 ° C에서 떨고 인큐베이터 또는 물 목욕에서 성장. OD와 세균성 문화를 사용 하지 마십시오 > 1 또는 OD < 0.2.
- NGM 접시 건조 되 면, 드롭 (~ 30 µ L)는 격판덮개의 센터에 OP50 inoculum의 장소와 다음 패치에 대략 2 cm x 2 cm 크기에서에 드롭 확산.
참고: 모든 나머지 OP50 inoculum 최대 한 달에 4 ° C에 저장할 수 있습니다. - OP50 플레이트는 inoculum (약 10 또는 15 분), 건조가 되 면 반전 하 고 36 h에 대 한 37 ° C에서 번호판을 품 어.
- 36 h 후 나중에 사용할 때까지 판 인큐베이터와 4 ° C에서 저장소에서 제거 합니다.
참고: 격판덮개는 4 ° c.에 최대 1 달 좋은 되어야 합니다.
- OP50에 cDCFDA를 보충
- 보완 하기 위해 cDCFDA OP50 격판덮개에, 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에서 10 m m cDCFDA의 작업 재고를 준비 합니다. 빛과 나중에 사용-20 ° C에서 저장소에서 보호 cDCFDA 솔루션을 유지.
- 전체 패치 cDCFDA 덮여 균일 하 게 되도록 부드럽게 2 cm x 2 cm OP50 패치, 표면에 10 mM cDCFDA 솔루션의 100 µ L를 놓습니다.
참고: 그것은 매우 중요 한 OP50의 전체 패치 cDCFDA 덮여 있다입니다. 필요한 경우, cDCFDA의 최대 150 µ L를 사용 하 여 각 접시. 그것은 또한 절대적으로 모든 cDCFDA OP50 패치에서 흐르는 음식에 통합 되지 것입니다 얼룩 강도 감소 귀 착될 것 이다 이후 cDCFDA 솔루션 OP50 패치의 국경을 넘어 확장 되지 않습니다. - OP50 번호판을 벤치 위에 어두운 상자 에서도 cDCFDA 솔루션의 모든 세균 패치에 흡수 될 때까지 (일반적으로 약 25 ~ 30 분).
- CDCFDA를 사용 하 여 웜 얼룩
- 일단은 cDCFDA는 완전히 OP50 패치를 침투 해, 접시 당 20 개 이상 벌레 놓고 14 h의 최소 20 ° C에서 거꾸로 접시를 품 어.
참고: 그것은 빛에 노출을 최소화 하기 위해 불투명 한 상자에서 cDCFDA 접시를 권장. - 섭취 량 차이 실험 제어 하 고 cDCFDA 신호를 정상화 (권장) 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) (공동 얼룩 difluoro) 붕 소 (갓 만든된 1mm 솔루션의 2.5 µ L), 산 성 pH 스펙트럼을 통해 그 형광은 크게 비 변형 acidotropic 약한 아민 염료 (시 약의 일반적인 이름에 대 한 재료의 표 참조).
이후이 부적당 한 cDCFDA 착 강도 제공할 수 있습니다 lysosomal pH의 잘못 된 해석에 게 참고: 14 h에 대 한 웜 착 색 하지 않습니다.
- 일단은 cDCFDA는 완전히 OP50 패치를 침투 해, 접시 당 20 개 이상 벌레 놓고 14 h의 최소 20 ° C에서 거꾸로 접시를 품 어.
- 현미경 검사 법에 대 한 슬라이드를 준비
- 테이프 약 3 인치 미러 (그림 1)과 같은 부드럽고 평평한 표면에 떨어져 라벨의 두 개의 병렬 스트립을 놓습니다.
- 코트 발 수 스프레이, 거울의 표면 그리고 과잉 액체를 닦아.
- 2 %agarose (증류수 H2O에서에서 해산) 완전히 액 화 될 때까지 전자 레인지에 녹여 다음 테이프의 2 개의 지구 사이 agarose의 50 µ L 드롭 놓고 슬라이드의 스트립에 수직이 되도록 신속 하 게 드롭 현미경 슬라이드 커버 테이프입니다. agarose는 경화 후 슬라이드를 뒤집어 슬라이드, 아래 원형 패드 형성 고 5mm 나트륨 아 지 드 (NaN3) agarose 패드에의 10 ~ 15 µ L를 추가 합니다.
참고: 앤3 시 토 크롬 C 억제제는 그 때 낮은 농도에서 사용, 그들은 이미징 동안 이동 하지 것입니다 벌레를 anesthetizes 역. - CDCFDA, 보충 OP50 접시에서 벌레를 선택 하 고 어떤 OP50 없이 깨끗 한 NGM 접시에 그들을 전송. 벌레는 벌레의 표면에서 제거 하는 OP50의 대부분을 허용 하는 몇 초 동안에 대 한 이동 하 고 agarose 패드 5 m m 나트륨 아 지 드를 포함 하는 벌레를 전송.
- 즉시 커버 슬립을 agarose 패드 커버. 때문에이 벌레 파열 귀 착될 수 있다 너무 많은 압력을 적용 하지 않고 부드럽게 커버 슬립을 배치 해야 합니다.
참고: OP50 박테리아 cDCFDA 보충 형광 현미경 검사 법에 의해 시각화 하는 때, 따라서 그건 나트륨 아 지 드를 포함 하는 agarose 패드에 그들을 배치 하기 전에 가능한 만큼 최고로 벌레를 청소 하는 것이 중요. C. 선 충 (를 포함 하 여 N2, 야생 유형 제어)의 이상의 6 종자를 준비 하는 경우 그것은 agarose 패드에 벌레를 건조 하지 않습니다 있도록 6의 일괄 처리에서 샘플을 준비 하는 것이 좋습니다. 일부 변종에 외 음부는 적절 하 게 계획 하는 것이 중요 하다 그래서 압력 커버 슬립으로 인해 시간의 연장된 기간 후 파열 시작 합니다.
- Confocal 현미경 검사 법
참고: 일부 현미경 형광의 가변 레벨을 보상 형광 강도 자동으로 증가 하는 내장 기능이 있습니다. 이러한 현미경 이미징 벌레 때문에 그들은 본질적으로 샘플의 형광 강도 증가 것입니다 cDCFDA, 물에 잘 작동 하지 않을 수 있습니다.- 여기/방출 파장 488/530 설정을 사용 하 여 표준 confocal 현미경 이미징 수행 cDCFDA에 대 한 nm. 단일 평면 이미지 (Z 스택을 하지) 장 리소좀의 고 강도 정량화에 대 한 초점 (최대 신호 강도)은 리소좀만 사용.
참고: 아마도 염료 여부의 차이 때문에 인 두를 직접 후부 창 자 세포의 lysosomes 유지 cDCFDA 유전자 형 이나 나이 관계 없이 강도 얼룩, 따라서 주의 해야 이미징 리소좀이이 세포에서 피하려고. - N2 첫째로 벌레 2 일 오래 된 야생 타입 포함 된 슬라이드 이미지. 이렇게 하는 동안 레이저 전력 등, 작은 구멍, 조리개 cDCFDA 강도 얼룩 하지 oversaturated 되도록 confocal 영상 매개 변수를 조정 합니다.
참고: 일단이 설정을 변경 하지 마십시오 그들 그날 영상의 전체 기간에 대 한. - 소장 (벌레 당 3 ~ 4 이미지)의 단일 평면 1024 x 1024 픽셀의 이미지 캡처는 60 배 확대 렌즈를 사용 하 여.
참고: 벌레에 cDCFDA 방출 스펙트럼 520 nm의 보고 된 형광 스펙트럼20은 장 autofluorescence (그림 3)에서 특정 신호 판독을 제공와 동시에 하나의 눈에 띄는 피크를 얻을 것입니다. - 각 채널에 대 한.tiff 파일로 원시 confocal 이미지 (.lsm 파일)를 내보냅니다.
- 다음, ImageJ를 열고 파일을 클릭 | 오픈 측정할 수에 이미지 파일을 엽니다. 이미지 로드, 일단 관심 (ROI)의 영역을 선택 ImageJ에 타원형 모양을 선택 도구를 사용 합니다.
- 그 후, 분석 클릭 | 측정 형광 강도 그 투자 수익에 대 한 척도를. 이미지 당 4-5 다른 포커스 리소좀을 선택 하 고 각 지역 관심 (ROI)의 평균 상대 형광 강도 계산.
- 각 이미지에 대 한 리소좀 사이 내장의 영역에 배경 형광 강도 측정 합니다. 배경 형광 강도 값을 lysosomal 형광 강도 값에서 뺍니다.
- 총, 약 30 ~ 50 테스트할 각 변형에 대 한 cDCFDA 강도 (6 ~ 10 동물)에 대 한 개별 정규화 된 값을 수집 합니다. 이 값을 사용 하 여 적절 한 통계 소프트웨어를 사용 하 여 상자와 수염 음모를.
참고: 얼룩 달라질 수 있습니다 상당히 온도, 보육 시간 및 동물의 전반적인 건강/나이 같은 요인에 따라 형광 강도 비교 같은 얼룩 실험 샘플 프로세스 내에서 관련만 되도록. 그것은 따라서 모든 얼룩 실험에서 컨트롤을 처리 하는 것이 중요입니다. 통계적 차이 계산 (t-테스트) 어떤 적절 한 통계 소프트웨어를 사용 하 여. - 모든 이미지는 이미지 매개 변수를 변경 하지 않도록 주의 복용 순서로 (같은 날에 스테인드) 같은 실험에서 변종.
- 여기/방출 파장 488/530 설정을 사용 하 여 표준 confocal 현미경 이미징 수행 cDCFDA에 대 한 nm. 단일 평면 이미지 (Z 스택을 하지) 장 리소좀의 고 강도 정량화에 대 한 초점 (최대 신호 강도)은 리소좀만 사용.
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Representative Results
cDCFDA 얼룩 리소좀 pH 의존 방식에서 그리고 그것의 낮은 pKa와 리소좀에 준비 통풍 관은 이상적인 pH 센서21. cDCFDA 강도 얼룩은 lysosomal pH (즉 착 강도 증가 pH 감소도)18,22에 반비례 한다. cDCFDA 신호는 일관 되 게 약 20mm 클로로퀸, lysosomal 산성화의 억제제로 치료 하는 동물의 리소좀과 웜 v ATPase, 양성자 가져오기22에 필요한 리소좀의 막에 복잡 한 단백질의 고갈 . 이들은 cDCFDA 다른 유전 배경 또는 치료에 얼룩의 상대적 수준을 평가할 때 사용 하 여 중요 한 컨트롤입니다.
우리는 또한 피트 니스에 cDCFDA 노출의 더 명백한 효과 또는 불 임 치료 웜 (데이터 표시 되지 않음)의 찾을. 이 프로토콜을 사용 하 여, post-reproductive 야생 타입 벌레의 리소좀에 산의 내 생 적인 손실을 파악. CDCFDA 형광 신호 영 (2 일 게시물 L4)의 리소좀에 강력한는 그림 3에서에서와 같이 재현 C. 선 충, 산성화 리소좀을 의미 합니다. 착 강도 감소 상당히 리소좀의 alkalinization에 오래 된 (8-하루 게시물 L4) 웜 뿐만 ( vha 유전자 인코딩 v ATPase subunits의 최저)를 통해 이러한 세포에 양성자 유입 감소 벌레 처럼 관찰. 이 방법을 사용 하 여, 우리 post-reproductive 동물 ( 그림 2, 그림 3에서 형광 이미지 다이어그램)의 소장 lysosomal 산 성도의 생리 적 손실 감지. 감소 된 cDCFDA 웜 시 리소좀과 단백질 클리어런스에 가능한 장애 지적 하루 8 (게시물-L4)의 창 자에 신호. 이것은 사실 경우, 이러한 동물 크게 축적이 인생 무대22리소좀 안에 단백질 집계입니다. 이 과정에서 루멘 탈 산성화의 역할의 유효성을 검사 하려면 우리 공동 스테인드 젊은, RNAi v ATPase 펌프 기계 (VHA 2와 VHA-8)의 두 가지 주요 구성 요소에 의해 고갈 되었습니다 했다을 따라서 해야 제대로 가져오지 양성자로 동물을 재현 lysosomes입니다. 예상 했던 대로, vha 2 vha 8 RNAi 동물 생식 단계 에서도 보여주었다 감소 cDCFDA 형광 신호 post-reproductive 야생 타입 벌레의 비교와 일치 시 리소좀 (그림 3).
그림 1: 현미경 검사 법에 대 한 슬라이드 준비. 현미경 검사 법에 대 한 간단한 단계별 회로도 준비 하기 위한 따라야 하는 단계를 보여주는 슬라이드.
그림 2: C. 선 충의 장 리소좀에 산을 pH에 민감한 염료의 사용. (주 2) 재현에 후 생식 (주 8) 벌레 장 cDCFDA 형광 강도의 패턴을 보여주는 다이어그램. 최고 다이어그램 표시 전체 웜. 대표 하는 하단에 있는 상자 확대, midgut 지역의 센터에서 창 자 루멘 다이어그램 예상. 리소좀은 창 자 세포의 세포질에 다양 한 크기의 소포로 묘사 된다. 이 도식은 그림 3 이미지와 비교 합니다.
그림 3: 이미지를 얼룩 cDCFDA. 대표 이미지를 보여주는 2 일과 하루 8 (L4 게시) C. 선 충 장 리소좀 (N2 야생 타입) cDCFDA 물 뿐만 아니라 장 리소좀 vha 2 와 vha 8 RNAi 벌레의 cDCFDA (긍정적인 제어)와 스테인드. vha 2 와 vha-8 인코딩 vacuolar ATPase (vATPase), 양성자 펌프 lysosomal 루멘의 산성화에 대 한 책임은 lysosomal 막 라이닝의 소 단위.
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Discussion
노화, 세포 및 분자 이벤트의 다양 한 기여 생활사 특성 및 유전적 요인에 의해 영향을 받습니다. 우리의 최근 연구22 생식 주기 lysosomal pH 역학의 규제를 통해 소마의 피트 니스 조절에 중요 한 역할을 건의 한다. 우리는 동물에 산 성 리소좀 보장 v ATPase 전사의 upregulation에 의해 적극적으로 재현 하는 동안 그 중재 lysosomal 베이스 승진은 보여주었다. 복제, v ATPase 식 상품의 끝 리소좀 alkalinize, 그리고 단백질 집계가이 세포에 축적.
Lysosomal 산성화 손상 장애 변경된 v ATPase 활동에 의해 발생할 수 표시 되었습니다 그리고 v ATPase 뇌의 기능 감소도 제안 되었습니다 다양 한 신경 질환23기초를. 우리의 결과 더 가설 세포 노화 및 노화24의 원인 중 장애인된 v ATPase 기능을 지원 합니다.
노화 세포에의 한 cytological 특징 오래 된 셀1,25,26,27,,2829misfolded 및 집계 된 단백질의 진보적인 형성 이다. Post-reproductive C. 선 충, 마찬가지로 집계 lysosomal 루멘을 늦게 통과 포유류 배양에서 발견 되는 유사한 단백질27,29세포. 그것은 그럴 듯 하 게 손상 된 단백질 및 세포 시 리소좀에의 지속적인 유입 다음 다른에 이르게이 리소좀의 기능 축소에서 결과 리소좀 autophagic 통로의 터미널 끝점 이기 때문에, 궁극적으로 세포 노화에 기여 하는 이벤트에 대 한 다운스트림.
여기에 설명 된 프로토콜의 라이브 장 리소좀에 상대적인 산도의 간단 하 고 재현성 평가 생성 하도록 설계 되었습니다 C. 선 충. 좁은 pH 범위 (4.5-5) 적절 한 베이스에 대 한 이러한 세포에 필요 하기 때문에 pH에 미묘한 증가 세포와 조직의 항상성17에 대 한 극적인 결과 했습니다. 형광 특성 및 cDCFDA의 낮은 pka이 순수 관련 pH 창18산 성도에 변화를 잡으려고이 염료를 수 있습니다. 리소좀 얼룩에 대 한 권장 하는 cDCFDA의 농도 변화 우리의 이미징 매개 변수 및 이미징 시스템에 기반 하는 lysosomal pH에 최고의 가능한 판독을 제공 하기 위해 최적화 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, cDCFDA 얼룩의 결과 다른 최종 사용자는 lysosomal pH 변화 수 있습니다 정확 하 게 반영 되지 cDCFDA 얼룩 패턴에 그들의 이미지 설정에 따라 달라질 수 있습니다. 만약이, 유사 이미징에 대 한 최적 농도 결정 하기 위해 cDCFDA (10 ~ 100 mM)의 농도 변화를 사용 하는 것이 최선의 조치 과정에서에서 발생 야생 타입 N2 웜 2 일과 하루 8 게시물 L4에. 이상적인 cDCFDA 농도 oversaturated 되 없이 영 (하루 2 게시물 L4) 벌레의 리소좀을 효율적으로 얼룩 하지만 또한 오래 된 (하루 8 게시물 L4) 벌레에 대 한 감소 착 강도 보여줍니다.
CDCFDA 착 색 기술의 한계 중 하나는 긴 부 화 시간 이다. 벌레는 특정 시간에 알을 품는 때 결과 ~ 24 h 후 구상 될 수 있다. C. 선 충 lysosomal pH의 실시간 판독을 제공 하는 pH에 민감한 fluorophore lysosomal 막 단백질에 태그를 사용 하 여 아마도 긴장을 개발 하는 것 보다 효율적인 것입니다.
거기에 몇 가지 다른 기술이 존재 하는 동안 C. 선 충 의 내장에서 pH를 평가 하기 위한 이러한 기술의 대부분 전체30, 으로 내장의 pH를 평가 하거나 시간이 걸리는 몸 캐비티에 주입을 필요 그리고 성가신31. cDCFDA는 대규모 유전 스크린 그 표시 변경 lysosomal pH 또는 생리학 C. 선 충 돌연변이 대 한 검색을 먹이 RNAi 라이브러리를 사용 하 여 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 방법의 중요 한 측면은 cDCFDA 사용 하 고 영 (하루 2 게시물 L4)를 포함 해야 되 고 농도 confocal 영상 모든 세션 구성에 대 한 기준으로 N2 제어 스트레인.
더 잘 이해 하려면 노화 lysosomal pH의 기여, 다른 세포 및 환경 입력에 대 한 응답에 lysosomal 산에 동적 변화 뒤에 규제 메커니즘을 해 부를 중요할 것 이다. cDCFDA 얼룩은 C. 선 충에이 연구를 확장 하는 하나의 전략으로 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 충돌의 관심을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 긴장, 자연과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC), 꼬마 유전학 센터 및 캐나다 재단 혁신 (CFI)에 대 한 자금에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 우리 박사 Exing 왕 (부 교수 감독, 광학 이미징 시설 뿐만 아니라 Lizhen 첸 박사 (셀 시스템의 부 및 해부학, UT 건강 샌 안토니오) 모든 선 충 C. 실험에 대 한 그녀의 실험실 시설의 무제한 사용 허용에 대 한 감사 하 고 싶습니다. UT 건강 샌 안토니오)를 통해 confocal 현미경 검사 법. 우리 또한 박사 마 이런 Ignatius 지원 및 비디오 촬영을 촉진 하기 위하여 격려를 제공 하는 것을 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OP50 (E. coli) | Caenorhabditis Genetics Center | Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| 5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate | ThermoFisher | C369 | Commonly known as cDCFDA |
| 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron | ThermoFisher | L7528 | Commonly known as Lysotracker Red |
| Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510) | |||
| ImageJ | Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| LB Broth powder | ThermoFisher | 22700041 | |
| Bacto Agar | Sigma | A5306-1KG | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | S71604 | |
| Cholesterol powder | Sigma | C3045 | |
| CaCl2 | Sigma | 449709 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| K3PO4 | Sigma | P5629 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover Slips | ThermoFisher | 3406 | |
| Agarose | Sigma | A6013 | |
| Incubator | |||
| Mirror or other smooth flat surface |
References
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