Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Bedömningen av lysosomala alkalisering i tarmen av Live Caenorhabditis elegans

Published: April 13, 2018 doi: 10.3791/57414
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, University of Saskatchewan

Summary

En steg för steg guide till probe förlust av lysosomala surhet i inälvan av C. elegans med det pH-känsliga vitala färgämnet 5 (6) - karboxi - 2', 7'-dichlorofluorescein diacetat (cDCFDA)

Abstract

Nematoden Caenorhabditis elegans (C. elegans) är en modell som ofta används för att studera livslängd och utvecklingsmässiga vägar. Sådana studier underlättas av insyn i djuret, förmågan att framåt och bakåt genetiska analyser, den relativa lätthet av generera fluorescently märkta proteiner och användningen av fluorescerande färger som antingen kan vara microinjected i början embryot eller införlivad med sin mat (E. coli stam OP50) att märka cellulära organeller (t.ex. 9-dietylamino-5 H-bens (a) phenoxazine-5-en och (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} - N - [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Här presenterar vi en fluorescerande pH-känsliga färgämnet som fläckar intestinal lysosomer, som ger en visuell avläsning av dynamiska, fysiologiska förändringar i lysosomala surhetsgraden i levande maskar. Detta protokoll mäter inte lysosomal pH, men snarare syftar till att fastställa en tillförlitlig metod för att bedöma fysiologisk relevanta varianter i lysosomala surhetsgrad. cDCFDA är en cell-diffusionskoefficient förening som konverteras till fluorescerande fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) vid hydrolys av intracellulära esteraser. Protonation inuti lysosomerna fällor cDCF i dessa organeller, där det ackumuleras. På grund av dess låga pKa av 4.8, har denna färg använts som en pH-sensor i jäst. Här beskriver vi användningen av cDCFDA som ett kosttillskott att bedöma surheten i intestinal lysosomer i C. elegans. Denna teknik möjliggör detektering av alkalinizing lysosomer i levande djur, och har ett brett sortiment av experimentella tillämpningar inklusive studier på åldrande, autofagi och lysosomala biogenes.

Introduction

Utseendet på protein aggregat är allmänt accepterat för att vara ett signum för åldrande i eukaryota celler1,2,3, och bildandet av som tros vara bland princip förare av cellulära åldras4 , 5 , 6 , 7. det finns växande bevis för att som cellerna ålder, proteinkatabolism är nedsatt, vilket leder till en ökning av protein aggregering. Kollapsen av proteolys i åldrande celler innebär en försämring av autofagi8 samt proteasom-medierad protein nedbrytning9. Slutligen, irreversibla protein oxidation ökar i gamla celler, ytterligare försämrar protein katabolism10.

Autofagi var ursprungligen tänkt att vara en icke-selektiv process för bulk nedbrytningen av skadade proteiner, men senare studier har visat att autofagi är mycket selektiv att katabolismen av protein aggregat och dysfunktionella organeller som inte mottaglig för nedbrytning via andra protein clearance mekanismer11. Under processen av autofagi är skadade och aggregerade proteiner binds i en dubbel-membran vesikler kallas autophagosome. Denna autophagosome sedan säkringar med sura organeller kallas lysosomer, vilket leder till nedbrytning av autophagosome Last12. Lysosomer representerar slutpunkten av den autophagic vägen och delta i olika cellulära processer såsom membran reparation, transkriptionell kontroll och näringsämnen avkänning; belysa deras central roll i cellernas homeostas (ses i ref. 13). Flera studier har visat en association mellan en åldersberoende minskning av lysosomala funktion och olika neurodegenerativa sjukdomar13. Konsekvent, kan återställa lysosomal funktion i äldre celler fördröja uppkomsten av åldersrelaterade fenotyper14,15. Studier av sammansättningen av den intralumen miljön tyder på att kollapsen av lysosomala funktion i äldre celler inte är på grund av en minskning i produktionen av lysosomala proteaser16. Alternativt har det föreslagits att förlust av intralysosomal syra, ett avgörande krav på dess enzymatiska aktivitet, kan ligga bakom nedgången i lysosomen-medierad proteolys17. För att kunna utforska denna hypotes, är det nödvändigt att utveckla reagenser och protokoll sond dynamiska förändringar i lysosomal pH i levande celler i ett reproducerbart och konsekvent sätt.

Inälvan av C. elegans är de större metabola vävnaden i worms och det är en viktig regulator av systemisk homeostas och livslängd. Vi har utvecklat analyser för att utvärdera förändringar i surhetsgraden i lumen av intestinal lysosomer av maskar att avgöra hur Lysosomen-medierad proteolys bidrar till åldrandet. Ännu om pH-känsliga fluorophores har använts tidigare i C. elegans för att markera intestinal lysosomer, har inte varit ett försök att upprätta en framgångsrik protokoll som kan upptäcka små ökningar i lysosomal pH i vivo18. Här, tillhandahåller vi ett protokoll som kan användas för att upptäcka förlust av lysosomala surhet i C. elegans intestinala celler med ett enkelt och bekvämt utfodring protokoll som innehåller en pH-känsliga fluorophore (cDCFDA) i OP50 mat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. färga och bild intestinal lysosomer

  1. Utsäde nematoder tillväxt medier (NGM) plattor med OP50
    1. Förbereda NGM plattor enligt den rekommenderade protokoll19 och tillåta stängda plattorna torka i 2 dygn i rumstemperatur.
    2. Inokulera OP50 bakterier in i sterila Luria buljong (LB) buljong och växa i en skakande inkubator eller vattenbad vid 37 ° C för 36 h eller tills OD är mellan 0,2 och 0,4. Undvik att använda en bakterieodling med OD > 1 eller OD < 0,2.
    3. När NGM plattor är torra, placera en droppe (~ 30 µL) av OP50 inokulatet på mitten av tallriken och sedan sprida drop in ett plåster ungefär som är 2 cm x 2 cm i storlek.
      Obs: Alla återstående OP50 inokulum kan lagras vid 4 ° C i upp till en månad.
    4. Invertera OP50 plattorna när inokulatet har torkat (ungefär 10-15 min), och sedan Inkubera plattorna vid 37 ° C för 36 h.
    5. Efter 36 h, ta bort plattorna från inkubator och store vid 4 ° C fram till senare användning.
      Obs: Plattorna ska vara bra för upp till 1 månad vid 4 ° C.
  2. Komplettera cDCFDA till OP50
    1. För att komplettera cDCFDA på OP50 plattor, förbereda ett fungerande lager av 10 mM cDCFDA i dimetyl sulfoxid (DMSO). Förvara cDCFDA lösningen skyddas från ljus och förvaras vid-20 ° C för senare användning.
    2. Placera försiktigt 100 µL 10 mM cDCFDA lösning på ytan av 2 cm x 2 cm OP50 plåstret, sådan att hela plåstret är jämnt täckt med cDCFDA.
      Obs: Det är mycket viktigt att hela plåstret av OP50 är täckt med cDCFDA. Om det behövs, använda upp till 150 µL av cDCFDA för varje platta. Det är också viktigt att cDCFDA lösningen inte omfattar utanför gränserna för OP50 plåstret, eftersom alla cDCFDA som flödar ut ur OP50 plåstret inte kommer att införlivas i maten, och kommer att resultera i minskad färgning intensitet.
    3. Placera OP50 plattorna i en ruta på bänk tills all cDCFDA lösning absorberas i bakteriell plåstret (vanligtvis ca 25-30 min).
  3. Färgning maskar använder cDCFDA
    1. När cDCFDA har helt genomsyrade OP50 plåstret, placera inte mer än 20 maskar per platta och inkubera plattorna inverterad vid 20 ° C i minst 14 h.
      Obs: Det rekommenderas att placera cDCFDA plattorna i en ogenomskinlig kartong för att minimera exponering för ljus.
    2. Att styra för intag skillnader mellan experiment och normalisera cDCFDA signaler, rekommenderas () samtidig fläcken med 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) ( difluor) boron (2,5 µL av en nybryggd 1 mM lösning), en acidotropic svag Amin färgämne vars fluorescens är till stor del icke-variant över det sura pH-spektrumet (se Tabell av material för vanliga namn av reagenser).
      Obs: Inte fläcken maskar för mindre än 14 h eftersom detta kan ge otillräcklig cDCFDA färgning intensitet och ge en falsk tolkning av lysosomala pH.
  4. Förbereda bilder för mikroskopi
    1. Placera två parallella remsor av märkning tejp ungefär 3 inches isär på en jämn, plan yta, till exempel en spegel (figur 1).
    2. Täck ytan av spegeln med vattenavvisande spray, och torka av överskott vätska.
    3. Smält 2% agaros (löses i destillerat H2O) i mikrovågsugn tills helt flytande, och sedan placera en 50 µL droppe agaros mellan två remsor av tejp och snabbt täcka droppe med ett objektglas, så att bilden är vinkelrät mot remsor av tejp. Efter agarosen stelnat, bildar en cirkulär pad under bilden vänds bilden och tillsätt 10 till 15 µL av 5mM natriumazid (NaN3) på agaros pad.
      NaN3 är en hämmare av cytokrom C att när används i låga koncentrationer, reversibelt anesthetizes maskar så att de inte kommer att flytta under imaging.
    4. Plocka maskar från OP50 plattan kompletteras med cDCFDA och överföra dem till en ren NGM tallrik utan någon OP50. Tillåta maskar att flytta några sekunder så att de flesta av OP50 tas bort från ytan av maskar, och sedan överföra maskar till agaros pad 5 mM natriumazid.
    5. Omedelbart täcka agaros pad med ett täckglas. Var noga med att placera försiktigt täckglaset utan att tillämpa för mycket tryck, eftersom detta kan resultera i worms spricker.
      Obs: OP50 bakterier kompletteras med cDCFDA fluorescerar när visualiseras genom mikroskopi, därför är det viktigt att rengöra maskar som bäst som möjligt innan du placerar dem på agaros pad natriumazid. Om prepping mer än 6 stammar av C. elegans (inklusive N2, vildtyp kontroll), är det lämpligt att bereda proverna i partier av 6, för att säkerställa att maskarna inte torkar på agaros pad. I vissa stammar börjar vulvan brista efter längre tid på grund av påtryckningar från täckglaset, så det är viktigt att planera därefter.
  5. Konfokalmikroskopi
    Obs: Vissa Mikroskop har en inbyggd funktion som automatiskt ökar fluorescensintensiteten att kompensera för varierande nivåer av fluorescens. Sådan Mikroskop kanske inte fungerar bra för imaging maskar som färgas med cDCFDA, eftersom de ökar sin natur fluorescensintensiteten hos prover.
    1. Utföra bildbehandling på ett standard confocal Mikroskop med excitation/utsläpp våglängder inställd på 488/530 nm för cDCFDA. Ta ett plan bilder (inte Z-stackar) av intestinal lysosomer och använda endast lysosomer som är i fokus (maximal signalintensitet) för intensitet kvantifiering.
      Obs: Kanske på grund av skillnader i dye tillgänglighet, lysosomer intestinala celler direkt bakre till svalget upprätthålla cDCFDA färgning intensitet oavsett genotyp eller ålder, därför bör man undvika imaging lysosomer i dessa celler.
    2. Bild i bilden som innehåller 2 dagar gamla vildtyp N2 maskar först. Samtidigt göra det, justera confocal imaging parametrar såsom lasereffekt, pinhole och bländare för att säkerställa att den cDCFDA färgning intensitet inte är övermättad.
      Obs: När dessa är inställda, ändra inte dem för hela den tid av imaging för den dagen.
    3. Fånga bilder 1024 x 1024 pixlar i ett enda plan av inälvan (3 till 4 bilder per mask) använder en 60 X förstoring linsen.
      Obs: Den cDCFDA emissionsspektrum i maskar kommer att ge en enda framstående peak på 520 nm sammanfaller med dess rapporterade fluorescens spektrum20, som tillhandahåller en viss signal avläsning som skiljer sig från intestinal autofluorescens (figur 3).
    4. Exportera rå confocal bild (.lsm filer) som TIFF-filer för varje kanal.
    5. Nästa, öppna ImageJ och klicka på fil | Öppna att öppna en bildfil till kvantifieras. När bilden har lästs in använda oval form markeringsverktyget i ImageJ välja en region av intresse (ROI).
    6. Därefter klicka på analysera | Åtgärd att kvantifiera fluorescensintensiteten för att ROI. Välj 4 – 5 olika i fokus lysosomer per bild och beräkna den genomsnittliga relativa fluorescensintensiteten hos varje region av intresse (ROI).
    7. För varje bild, Mät fluorescensintensiteten bakgrund i en region i tarmen mellan lysosomer. Subtrahera bakgrunden fluorescens intensitetsvärdena från lysosomala fluorescens intensitetsvärdena.
    8. Totalt, samla cirka 30 till 50 individuella normaliserade värden för cDCFDA intensitet (6 till 10 djur) för varje stam som testas. Använda dessa värden för att rita en ruta och morrhår tomt med någon lämplig statistisk programvara.
      Obs: Färgning kan variera avsevärt beroende på faktorer som temperatur, inkubationstiden och övergripande hälsa/ålder på djur så att fluorescens intensitet jämförelser endast är relevanta inom prover processen i samma färgning experiment. Det är därför viktigt att bearbeta kontroller i varje färgning experiment. Beräkna statistiska skillnader (t-tester) använda någon lämplig statistisk programvara.
    9. Bild alla stammar från samma experiment (målat samma dag) i sekvens, noga med att inte ändra någon av parametrarna imaging.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

cDCFDA fläckar lysosomer på ett sätt som pH-beroende, och dess låga pKa och redo upptag i lysosomer gör det en perfekt pH-sensor21. cDCFDA färgning intensitet är omvänt proportionell mot lysosomal pH (dvs färgning intensitet ökar när pH minskar)18,22. cDCFDA signaler är genomgående svaga i lysosomer av djur som behandlats med 20 mM av klorokin, en hämmare av lysosomala försurning och maskar utarmat av v-ATPas, protein komplex på membranet i lysosomer som krävs för proton import22 . Dessa är viktiga kontroller att använda vid bedömningen av de relativa nivåerna av cDCFDA färgning i andra genetiska bakgrunder eller behandlingar.

Här finner vi också inga uppenbara effekter av cDCFDA exponering på fitness eller fertiliteten hos behandlade maskar (inga data anges). Använder det här protokollet, identifierat vi en endogen förlust av syra i lysosomer av post-reproductive vildtyp maskar. I figur 3 visas cDCFDA fluorescens signalen är robust i lysosomer av unga (2 dagars post L4) reproducera C. elegans, betecknar surgjord lysosomer. Färgning intensitet minskar avsevärt vid alkalisering av lysosomer, som observerats i gamla (8-dagars post L4) maskar samt som maskar där proton tillströmningen till dessa organeller reduceras (via Nedslagning av vha gener som kodar för v-ATPas subenheter). Med den här metoden upptäckt vi en fysiologisk förlust av lysosomala surhet i inälvan av post-reproductive djur (diagram i figur 2, fluorescens bilder i figur 3). Den reducerade cDCFDA signal i tarmarna av dag 8 (post-L4) maskar pekade alkalinized lysosomer och en möjlig nedskrivning protein clearance. Detta är i själva fallet, som dessa djur betydligt ansamlas protein aggregat inuti lysosomerna detta liv scenen22. För att validera en roll av lumen avsyrning i denna process, målat vi tillsammans unga, reproducera djur som hade utarmat av RNAi av två grundläggande komponenter av v-ATPas pump maskiner (VHA-2 och VHA-8) och därför bör inte korrekt importera protons in lysosomer. Som förväntat, vha-2 och vha-8 RNAi djur, även vid könsmoget Stadium, visade minskad cDCFDA fluorescens signaler jämförbara med post-reproductive vildtyp maskar och överensstämmer med alkalinized lysosomer (figur 3).

Figure 1
Figur 1: förbereda bilder för mikroskopi. En enkel steg för steg Schematisk visar de steg som skall följas för att förbereda bilder för mikroskopi.

Figure 2
Figur 2: Användning av pH-känsliga färgämnen sond surhetsgraden i intestinal lysosomer av C. elegans. Diagram som visar mönster av intestinal cDCFDA fluorescensintensiteten i återgivning (dag 2) och efter reproduktiv (dag 8) maskar. De övre diagrammen visar hela maskar. Rutorna i botten Föreställ inzoomad, projiceras diagram av regionen midgut, intestinala lumen i mitten. Lysosomer är avbildad som blåsor av varierande storlek i cytoplasman i intestinala celler. Jämför dessa Schematiskt diagram med figur 3 bilder.

Figure 3
Figur 3: cDCFDA färgning bilder. Representativa bilder visar dag 2 och dag 8 (inlägget L4) C. elegans intestinal lysosomer (N2 vildtyp) färgas med cDCFDA samt intestinal lysosomer av vha-2 och vha-8 RNAi maskar färgas med cDCFDA (positiv kontroll). VHA-2 och vha-8 koda subenheter av den vakuolär ATPas (vATPase), protonpumpen foder lysosomala membranet som ansvarar för försurning av lysosomala lumen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En mängd olika cellulära och molekylära händelser bidra till åldrande, livshistoria drag och genetiska faktorer. Vår senaste studie22 antyder att den reproduktiva cykeln spelar en viktig roll i att kontrollera av soma genom reglering av lysosomala pH dynamics lämplighet. Vi visade att lysosomala-medierad proteolys främjas medan djur aktivt återskapa genom uppreglering av v-ATPas transkription, som i sin tur garanterar sura lysosomer. Vid slutet av reproduktion, v-ATPas uttryck droppar, lysosomer alkalinize och protein aggregat ansamlas i dessa celler.

Sjukdomar som försämrar lysosomala försurning har visat sig bero på förändrad v-ATPas aktivitet och minskar v-ATPas funktion i hjärnan har också föreslagits att ligga till grund för olika neurodegenerativa sjukdomar23. Våra resultat ytterligare stöd för hypotesen att nedsatt v-ATPas funktion är bland orsakar av cellulära åldras och åldrande24.

En Cytologisk kännetecken för åldrande celler är progressiv bildandet av felveckning och aggregerade proteiner i gamla celler1,25,26,27,28,29. Liksom i post-reproductive C. elegansceller liknande protein aggregat finns i lysosomala lumen sen passage däggdjur odlade27,29. Eftersom lysosomer terminal slutpunkten av den autophagic vägen, är det rimligt att en kontinuerlig tillströmning av skadade proteiner och organeller i alkalinized lysosomer resulterar i funktionella kollapsen av dessa lysosomer, vilket sedan leder till andra nedströms händelser som i slutändan bidrar till cellulära åldras.

Protokollet beskrivs här har utformats för att generera en enkel och reproducerbar bedömning av relativa surhetsgraden i intestinal lysosomer av levande C. elegans. Eftersom ett snävt pH-område (4,5 – 5) krävs i dessa organeller för korrekt proteolys, få subtila ökningar pH dramatiska konsekvenser för cellulär och vävnad homeostas17. Fluorescens egenskaper och lågt pka av cDCFDA tillåter denna färg att fånga förändringar i syra i detta fysiologiskt relevanta pH fönster18. Koncentrationen av cDCFDA rekommenderas för färgning lysosomer har optimerats för att ge den bästa möjliga avläsningen av förändringar i lysosomal pH utifrån vår imaging parametrar och bildsystem. Även så, kan resultaten av cDCFDA färgning variera för olika användare baserat på deras imaging setup så att lysosomal pH-förändringar inte kanske återspeglas korrekt i mönstret cDCFDA färgning. Om detta händer, det bästa tillvägagångssättet skulle vara att använda varierande koncentrationer av cDCFDA (10 till 100 mM) för att bestämma den optimala koncentrationen för imaging variationer i vildtyp N2 maskar på dag 2 och dag 8 post L4. Den idealiska cDCFDA koncentrationen är en som fläckar lysosomer av ung (dag 2 post L4) maskar effektivt utan att vara överöstes men visar också en minskad färgning intensitet för gamla (dag 8 post L4) maskar.

En av begränsningarna av cDCFDA färgning tekniken är dess lång inkubationstid. När maskar inkuberas vid en viss tidpunkt, kan resultatet visualiseras endast efter ~ 24 h. Det vore mer effektivt att utveckla en stam av C. elegans som ger en realtid avläsning av lysosomala pH, förmodligen med hjälp av en pH-känsliga fluorophore taggade till ett protein som lysosomala membranet.

Medan det finns några olika metoder för bedömning av pH i tarmen av C. elegans, de flesta av dessa tekniker antingen bedöma pH-värdet i tarmen som en hela30, eller kräver injektion i kroppen hålighet, vilket är tidskrävande och besvärliga31. cDCFDA kan lätt tillämpas för storskaliga genetiska skärmar använder utfodring RNAi bibliotek söka efter C. elegans mutanter att Visa förändrat lysosomal pH eller fysiologi. De endast kritiska aspekterna av denna metod är koncentrationen av cDCFDA används och att vara noga med att inkludera en ung (dag 2 post L4) N2 kontrollisolatet som riktmärke för att konfigurera confocal imaging under varje session.

För att bättre förstå bidrag lysosomal pH till åldrande, är det viktigt att dissekera regleringsmekanismer bakom de dynamiska förändringarna i lysosomala surhetsgrad som svar på olika cellulära och miljömässiga ingångar. cDCFDA färgning kan användas som en strategi för att utöka denna forskning i C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar någon intressekonflikt.

Acknowledgments

Vi vill tacka Caenorhabditis genetik centrum för stammar, naturvetenskap och teknik forskning rådet (NSERC), och Kanada Stiftelsen för Innovation (CFI) för finansiering. Vi vill tacka Dr Lizhen Chen (Institutionen för Cell Systems och anatomi, UT hälsa San Antonio) för att tillåta obegränsad användning av hennes lab faciliteter för alla C. elegans experiment samt Dr Exing Wang (Associate Director, optisk Imaging anläggning UT hälsa San Antonio) för hjälp med konfokalmikroskopi. Vi vill också tacka Dr Myron Ignatius för att ge stöd och uppmuntran att underlätta video shoot.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
OP50 (E. coli) Caenorhabditis Genetics Center Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50
5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate  ThermoFisher C369 Commonly known as cDCFDA
9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron ThermoFisher L7528 Commonly known as Lysotracker Red
Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510)
ImageJ Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LB Broth powder ThermoFisher 22700041
Bacto Agar Sigma A5306-1KG
NaCl Sigma S9888
Bacto Peptone Fisher Scientific S71604
Cholesterol powder Sigma C3045 
CaCl2 Sigma 449709
MgSO4 Sigma M7506
K3PO4 Sigma P5629
Sodium Azide Sigma S2002
DMSO Sigma D8418
Microscope Slides VWR 48311-703
Cover Slips ThermoFisher 3406
Agarose Sigma A6013
Incubator
Mirror or other smooth flat surface

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants. Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).
  2. Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. Autophagy for the avoidance of neurodegeneration. Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).
  3. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  4. Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
  5. Cuervo, A. M., et al. Autophagy and aging: the importance of maintaining "clean" cells. Autophagy. 1 (3), 131-140 (2005).
  6. Harrington, A. J., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Caenorhabditis elegans as a model system for identifying effectors of alpha-synuclein misfolding and dopaminergic cell death associated with Parkinson's disease. Methods. 53 (3), 220-225 (2011).
  7. Muchowski, P. J. Protein misfolding, amyloid formation, and neurodegeneration: a critical role for molecular chaperones? Neuron. 35 (1), 9-12 (2002).
  8. Cuervo, A. M., Dice, J. F. Age-related decline in chaperone-mediated autophagy. J Biol Chem. 275 (40), 31505-31513 (2000).
  9. Tonoki, A., et al. Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process. Mol Cell Biol. 29 (4), 1095-1106 (2009).
  10. Squier, T. C. Oxidative stress and protein aggregation during biological aging. Exp Gerontol. 36 (9), 1539-1550 (2001).
  11. Sarkar, S., et al. Small molecules enhance autophagy and reduce toxicity in Huntington's disease models. Nat Chem Biol. 3 (6), 331-338 (2007).
  12. Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).
  13. Boya, P. Lysosomal function and dysfunction: mechanism and disease. Antioxid Redox Signal. 17 (5), 766-774 (2012).
  14. Kim, D. K., et al. Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function. Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).
  15. Vila, M., Bove, J., Dehay, B., Rodriguez-Muela, N., Boya, P. Lysosomal membrane permeabilization in Parkinson disease. Autophagy. 7 (1), 98-100 (2011).
  16. Cuervo, A. M., Dice, J. F. How do intracellular proteolytic systems change with age? Front Biosci. 3, d25-d43 (1998).
  17. Cuervo, A. M., Dice, J. F. When lysosomes get old. Exp Gerontol. 35 (2), 119-131 (2000).
  18. Gachet, Y., Codlin, S., Hyams, J. S., Mole, S. E. btn1, the Schizosaccharomyces pombe homologue of the human Batten disease gene CLN3, regulates vacuole homeostasis. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5525-5536 (2005).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  20. Preston, R. A., Murphy, R. F., Jones, E. W. Assay of vacuolar pH in yeast and identification of acidification-defective mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (18), 7027-7031 (1989).
  21. Pringle, J. R., et al. Fluorescence microscopy methods for yeast. Methods Cell Biol. 31, 357-435 (1989).
  22. Baxi, K., Ghavidel, A., Waddell, B., Harkness, T. A., de Carvalho, C. E. Regulation of Lysosomal Function by the DAF-16 Forkhead Transcription Factor Couples Reproduction to Aging in Caenorhabditis elegans. Genetics. 207 (1), 83-101 (2017).
  23. Colacurcio, D. J., Nixon, R. A. Disorders of lysosomal acidification-The emerging role of v-ATPase in aging and neurodegenerative disease. Ageing Res Rev. 32, 75-88 (2016).
  24. Kang, H. T., et al. Chemical screening identifies ATM as a target for alleviating senescence. Nat Chem Biol. 13 (6), 616-623 (2017).
  25. Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death. Nature. 431 (7010), 805-810 (2004).
  26. Brunk, U. T., Terman, A. The mitochondrial-lysosomal axis theory of aging: accumulation of damaged mitochondria as a result of imperfect autophagocytosis. Eur J Biochem. 269 (8), 1996-2002 (2002).
  27. Gerland, L. M., et al. Autolysosomes accumulate during in vitro CD8+ T-lymphocyte aging and may participate in induced death sensitization of senescent cells. Exp Gerontol. 39 (5), 789-800 (2004).
  28. Poon, H. F., Vaishnav, R. A., Getchell, T. V., Getchell, M. L., Butterfield, D. A. Quantitative proteomics analysis of differential protein expression and oxidative modification of specific proteins in the brains of old mice. Neurobiol Aging. 27 (7), 1010-1019 (2006).
  29. Yin, D. Biochemical basis of lipofuscin, ceroid, and age pigment-like fluorophores. Free Radic Biol Med. 21 (6), 871-888 (1996).
  30. Nehrke, K. A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span. J Biol Chem. 278 (45), 44657-44666 (2003).
  31. Chakraborty, K., Leung, K., Krishnan, Y. High lumenal chloride in the lysosome is critical for lysosome function. Elife. 6, (2017).

Tags

Utvecklingsbiologi fråga 134 C. elegans lysosomer pH v-ATPas proteinkatabolism cDCFDA
Bedömningen av lysosomala alkalisering i tarmen av Live <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baxi, K., de Carvalho, C. E.… More

Baxi, K., de Carvalho, C. E. Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (134), e57414, doi:10.3791/57414 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter