Summary
Una guía paso a paso para la pérdida de acidez lysosomal en el intestino de C. elegans con el colorante vital sensible a pH 6 - carboxi - 2', 7'-Diclorofluoresceína diacetato (cDCFDA)
Abstract
El nematodo Caenorhabditis elegans (C. elegans) es un modelo que es ampliamente utilizado para el estudio de longevidad y las vías de desarrollo. Tales estudios son facilitados por la transparencia de los animales, la capacidad de marcha adelante y atrás ensayos genéticos, la relativa facilidad de generar proteínas fluorescencia de etiquetado y el uso de tintes fluorescentes que tampoco puede ser microinyectados en el temprano embrión o incorporado en su alimento (e. coli cepa OP50) etiquetar organelos celulares (e.g. 9-dietilamino-5 H-benzo (a) fenoxazina-5-one y (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} - N - [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Aquí, presentamos el uso de un fluorescente tinte pH-sensible que tiñe lisosomas intestinales, proporcionando una lectura visual de los cambios dinámicas, fisiológicas en acidez lysosomal en gusanos vivos. Este protocolo no mide pH lisosomal, sino más bien tiene por objeto establecer un método confiable de evaluación fisiológicas variaciones relevantes en acidez lysosomal. cDCFDA es un compuesto celular florescente que es convertido a fluorescente fluoróforo 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) al producirse la hidrólisis por esterasas intracelulares. Protonación dentro de lisosomas trampas cDCF en estos orgánulos, donde se acumula. Debido a su bajo pKa de 4.8, este colorante se ha utilizado como un sensor de pH en la levadura. Aquí describimos el uso de cDCFDA como suplemento del alimento para determinar la acidez de lisosomas intestinales en C. elegans. Esta técnica permite la detección de alcalinizantes lisosomas en animales vivos, y tiene una amplia gama de aplicaciones experimentales, incluyendo estudios sobre envejecimiento, autofagia y biogénesis lisosomal.
Introduction
La aparición de agregados proteicos es ampliamente aceptada que un sello de envejecimiento en las células eucariotas1,2,3y la formación de los cuales se cree que entre los conductores de principio de senescencia celular4 , 5 , 6 , 7. Existe creciente evidencia que como células edad, catabolismo proteico se deteriora, provocando un aumento en la agregación de la proteína. El colapso de la proteólisis en el envejecimiento de las células conlleva una debilitación de la autofagia8 , así como de la degradación de proteínas mediada por proteasoma9. Finalmente, oxidación irreversible de la proteína aumenta en las células viejas, deteriorando aún más proteína catabolismo10.
Autofagia fue pensada inicialmente para ser un proceso no selectivo para la degradación de la mayor parte de proteínas dañadas, pero estudios recientes han indicado que la autofagia es altamente selectiva para el catabolismo de los agregados de proteínas y organelos disfuncionales que no son susceptibles a la degradación a través de otras proteínas separación mecanismos11. Durante el proceso de autofagia, proteínas dañadas y agregadas son secuestradas en una vesícula de membrana doble llamada el autophagosome. Este autophagosome entonces se funde con los ácidos organelos llamados lisosomas, que conduce a la degradación de la carga de autophagosome12. Lisosomas representan el punto final de la vía de la autofagia y participan en diversos procesos celulares tales como reparación de membrana, control transcripcional y detección de nutrientes; destacando su papel centralizado en la homeostasis celular (revisada en Ref. 13). Varios estudios han demostrado una asociación entre una disminución dependiente de la edad en la función lisosomal y de trastornos neurodegenerativos diversos13. Constantemente, restaurar la función lysosomal en células mayores puede retrasar la aparición de fenotipos relacionados con el envejecimiento14,15. Estudios de la composición del medio intralumen sugieren que el colapso de la función lysosomal en células mayores no es debido a una reducción en la producción de proteasas lisosomales16. Por otra parte, se ha propuesto que la pérdida de acidez produce, un requisito fundamental de su actividad enzimática, puede ser la base la disminución de la proteólisis mediada por el lisosoma17. Para poder explorar esta hipótesis, es esencial desarrollar los reactivos y protocolos para cambios dinámicos en pH lisosomal en células vivas de una manera coherente y replicable.
El intestino de C. elegans es el tejido metabólico importante en gusanos y es un regulador crítico de la homeostasis sistémica y la vida útil. Desarrollamos análisis para evaluar los cambios en la acidez del lumen intestinales lisosomas de gusanos para determinar cómo lisosoma-mediada de la proteólisis contribuye al envejecimiento. Aunque fluoróforos sensibles al pH han sido utilizados previamente en C. elegans para marcar lisosomas intestinales, sin embargo no ha habido un esfuerzo por establecer un protocolo exitoso que puede detectar pequeños incrementos en el pH lisosomal en vivo18. Presentamos un protocolo que puede utilizarse para detectar pérdida de acidez lisosomal de las células intestinales de C. elegans mediante un protocolo de alimentación sencillo y cómodo que incorpora un fluoróforo sensible al pH (cDCFDA) OP50 alimentos.
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Protocol
1. Mancha y lisosomas intestinales de la imagen
- Medios de cultivo nematodos de semilla (NGM) placas con OP50
- Preparar platos para NGM según el protocolo recomendado19 y permita que las placas cerradas secar por 2 días a temperatura ambiente.
- Inocular las bacterias OP50 en caldo estéril caldo de Luria (LB) y crecen en un baño incubador o agitación a 37 ° C durante 36 h o hasta que el OD es entre 0.2 y 0.4. Evitar el uso de un cultivo bacteriano con OD > 1 o OD < 0,2.
- Una vez seco planchas NGM, coloque una gota (30 μL) del inóculo OP50 en el centro de la placa y luego la gota en un parche más o menos que es de 2 cm x 2 cm de tamaño.
Nota: Cualquier inóculo OP50 restantes puede almacenarse a 4 ° C por hasta un mes. - Invertir las placas OP50 una vez que el inóculo ha secado (aproximadamente 10 o 15 min) y luego incubar las placas a 37 ° C durante 36 horas.
- Después de 36 h, quitar las placas de la incubadora y almacenar a 4 ° C hasta su uso posterior.
Nota: Las placas deben ser buenas para un máximo de 1 mes a 4 ° C.
- CDCFDA que suple a OP50
- Para complementar cDCFDA sobre placas OP50, preparar una acción de trabajo de cDCFDA de 10 mM en dimetil sulfóxido (DMSO). Mantener la solución de cDCFDA protegida de la luz y almacenar a-20 ° C para su uso posterior.
- Suavemente coloque 100 μl de solución de cDCFDA de 10 mM sobre la superficie del parche OP50 2 cm x 2 cm, tal que la totalidad del parche está uniformemente cubierto con cDCFDA.
Nota: Es muy importante que la totalidad del parche de OP50 está cubierto con cDCFDA. Si es necesario, utilizar hasta 150 μL de cDCFDA para cada placa. También es imprescindible que la solución de cDCFDA no se extiende más allá de las fronteras del parche OP50, puesto que cualquier cDCFDA que sale el parche OP50 no será incorporado a los alimentos y se traducirá en menor intensidad de la tinción. - Coloque las placas OP50 en una caja oscura en la mesa hasta que todos los de la solución cDCFDA es absorbido en el parche bacteriano (generalmente alrededor de 25 a 30 minutos).
- Tinción de gusanos usando cDCFDA
- Una vez que el cDCFDA ha permeado totalmente el parche OP50, colocar no más de 20 gusanos por placa e incubar las placas invertidas a 20 ° C durante un mínimo de 14 h.
Nota: Se recomienda colocar las placas de cDCFDA en una caja opaca para minimizar la exposición a la luz. - Controlar por las diferencias de consumo entre experimentos y normalizar las señales cDCFDA, (recomiendan) Mancha Co con () 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) Difluoro) boro (2,5 μl de una solución recién hecho de 1 mM), un colorante de acidotropic amina débil cuya fluorescencia es en gran parte no variante sobre el espectro de pH ácido (véase Tabla de materiales para los nombres comunes de reactivos).
Nota: No mancha gusanos de menos de 14 h, ya que esto puede proporcionar la intensidad de la tinción inadecuada cDCFDA y dar una falsa interpretación del pH lisosomal.
- Una vez que el cDCFDA ha permeado totalmente el parche OP50, colocar no más de 20 gusanos por placa e incubar las placas invertidas a 20 ° C durante un mínimo de 14 h.
- Preparación de portaobjetos para microscopía
- Coloque dos tiras paralelas de etiquetado cinta unas 3 pulgadas aparte en una superficie plana lisa, como un espejo (figura 1).
- Capa de la superficie del espejo con spray repelente al agua y limpie el exceso de líquido.
- Derretir la agarosa al 2% (disuelto en agua destilada H2O) en el microondas hasta que totalmente licuado, luego coloque una gota 50 de μl de agarosa entre las dos tiras de cinta adhesiva y cubrir rápidamente la gota con un portaobjetos de microscopio, que es perpendicular a las tiras de la diapositiva cinta. Después de la agarosa ha solidificado, formando una almohadilla circular debajo de la diapositiva, voltee la diapositiva y agregar 10-15 μl de azida de sodio 5mM (NaN3) en la almohadilla de agarosa.
Nota: NaN3 es un inhibidor del citocromo C que cuando se utiliza en bajas concentraciones, anestesia reversible gusanos para que no se mueva durante la proyección de imagen. - Recoger gusanos de la placa OP50 complementado con cDCFDA y transferirlas a una placa limpia de NGM sin cualquier OP50. Que los gusanos a mover durante unos segundos permitir que la mayoría de los OP50 a eliminarse de la superficie de los gusanos y luego se transfieren los gusanos a la almohadilla de agarosa que contiene azida de sodio 5 mM.
- Cubra inmediatamente la almohadilla de agarosa con un cubreobjetos. Asegúrese de colocar suavemente el cubreobjetos sin aplicar demasiada presión, ya que esto puede resultar en explosión de gusanos.
Nota: Bacterias OP50 complementadas con cDCFDA fluorescencia cuando es visualizado por microscopía, por lo tanto es importante limpiar los gusanos lo mejor posible antes de colocar sobre la almohadilla de agarosa que contiene azida de sodio. Si preparando más de 6 cepas de C. elegans (incluyendo N2, control de tipo salvaje), es recomendable preparar las muestras en lotes de 6, con el fin de asegurar que los gusanos no seque sobre la almohadilla de agarosa. En algunas cepas, la vulva comienza a romperse después de largos períodos de tiempo debido a la presión de la hoja de cubierta, por lo que es importante planificar en consecuencia.
- Microscopía confocal
Nota: Algunos microscopios tienen una función incorporada que automáticamente aumenta la intensidad de fluorescencia para compensar niveles variables de fluorescencia. Estos microscopios pueden no funcionar bien para gusanos teñidas con cDCFDA, puesto que intrínsecamente aumentan la intensidad de fluorescencia de las muestras de la proyección de imagen.- Realizar la proyección de imagen en un microscopio confocal estándar con longitudes de onda de excitación/emisión a 488/530 nm para cDCFDA. Solo plano imágenes (no Z-stacks) de lisosomas intestinales y utilizar sólo los lisosomas que se encuentran en foco (intensidad máxima) para la cuantificación de la intensidad.
Nota: Tal vez debido a diferencias en la disponibilidad de tinte, lisosomas de las células intestinales directamente posteriores a la faringe mantienen cDCFDA tinción intensidad independientemente del genotipo o edad, por lo tanto debe tenerse cuidado para evitar imágenes de lisosomas de estas células. - Imagen de la diapositiva que contiene 2 viejo tipo wild que N2 gusanos primero. Al hacerlo, ajustar los parámetros de proyección de imagen confocales como energía del laser, agujero de alfiler y apertura para garantizar que la cDCFDA intensidad de tinción no es sobresaturado.
Nota: Una vez que estos ajustes se establecen, no cambiar para toda la duración de la proyección de imagen para ese día. - Capturar imágenes de 1024 x 1024 píxeles de un solo plano del intestino (3 o 4 imágenes por gusano) usando un 60 X lente de aumento.
Nota: El espectro de emisión de cDCFDA en gusanos producirá un solo pico prominente en 520 nm coincidiendo con su divulgado fluorescencia espectro20, proporcionando una lectura de la señal específica que es distinta de Autofluorescencia intestinal (figura 3). - Exportar imagen confocal (ficheros .lsm) como archivos .tiff para cada canal.
- A continuación, abra ImageJ y haga clic en archivo | Abrir abrir el archivo de imagen para ser cuantificada. Una vez que se carga la imagen, utilice la herramienta de selección de forma ovalada en ImageJ para seleccionar una región de interés (ROI).
- Después de eso, haga clic en analizar | Medida para cuantificar la intensidad de la fluorescencia para ese retorno de la inversión. Seleccione 4 – 5 diferentes foco lisosomas por imagen y calcular la intensidad de fluorescencia relativa promedio de cada región de interés (ROI).
- Para cada imagen, medir la intensidad de la fluorescencia de fondo en una región del intestino entre lisosomas. Restar los valores de intensidad de fluorescencia de fondo de los valores de intensidad de fluorescencia lysosomal.
- En total, recogen alrededor de 30 a 50 valores normalizados individuales de intensidad cDCFDA (animales de 6 a 10) para cada cepa ensayada. Use estos valores para trazar un diagrama de caja y bigotes utilizando cualquier software estadístico apropiado.
Nota: La coloración puede variar considerablemente dependiendo de factores como temperatura, tiempo de incubación y la salud general, edad de los animales que sólo son relevantes en proceso de muestras en el mismo experimento tinción comparaciones de intensidad de fluorescencia. Por lo tanto, es importante procesar controles en cada experimento de tinción. Calcular diferencias estadísticas (t-pruebas) utilizando cualquier software estadístico apropiado. - Imagen todos las cepas del mismo experimento (teñido en el mismo día) en secuencia, teniendo cuidado de no para cambiar a cualquiera de los parámetros de la proyección de imagen.
- Realizar la proyección de imagen en un microscopio confocal estándar con longitudes de onda de excitación/emisión a 488/530 nm para cDCFDA. Solo plano imágenes (no Z-stacks) de lisosomas intestinales y utilizar sólo los lisosomas que se encuentran en foco (intensidad máxima) para la cuantificación de la intensidad.
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Representative Results
cDCFDA lisosomas tiñe de manera dependiente del pH y su pKa bajo y lista absorción en lisosomas es un sensor de pH ideal21. cDCFDA coloración de intensidad es inversamente proporcional al pH lisosomal (es decir, tinción intensidad los aumentos como disminuciones de pH)18,22. las señales cDCFDA son siempre débiles en los lisosomas de los animales tratados con 20 mM de la cloroquina, un inhibidor de la acidificación lysosomal y en gusanos agotados de la v-ATPasa, la proteína compleja en la membrana de los lisosomas que se requiere para la importación de protones22 . Estos son controles importantes a utilizar al evaluar los niveles relativos de cDCFDA tinción en otros contextos genéticos portadores o tratamientos.
También encontramos no manifiestos efectos de la exposición de cDCFDA en el gimnasio o fertilidad de gusanos tratados (datos no mostrados). Usando este protocolo, identificamos una pérdida endógena de acidez en los lisosomas de gusanos tipo salvaje post-reproductivos. Como se muestra en la figura 3, la señal de fluorescencia cDCFDA es robusta en los lisosomas de los jóvenes (post 2 día L4) reproducción de C. elegans, que significa lisosomas acidificados. La intensidad de la tinción se reduce considerablemente a alcalinización de los lisosomas, como se observa en edad (8 días post L4) gusanos así como gusanos donde se reduce el flujo de protones en estos orgánulos (vía caída de vha los genes que codifican subunidades de la v-ATPasa). Usando este método, se detectó una pérdida fisiológica de lysosomal acidez en el intestino de animales post-reproductivos (diagrama en la figura 2, imágenes de fluorescencia en la figura 3). La cDCFDA reducida la señal en los intestinos del día 8 (post-L4) gusanos señalaron alkalinized lisosomas y un posible deterioro en la remoción de proteína. De hecho es el caso, como estos animales acumulan significativamente agregados de proteína dentro de lisosomas en esta etapa de vida22. Para validar un papel de desacidificación de lumen en este proceso, nos Co teñido jovenes, reproducción de animales que habían sido agotados por RNAi de dos componentes de la maquinaria de la bomba de la v-ATPasa (VHA-2 y VHA-8) y por lo tanto deben importar correctamente protones en lisosomas. Como se esperaba, vha-2 y vha-8 animales de ARNi, incluso en la etapa reproductiva, mostraron señales de fluorescencia reducida cDCFDA comparables a las de tipo salvaje post-reproductivos gusanos y consistente con lisosomas alkalinized (figura 3).
Figura 1: preparación de portaobjetos para microscopía. Un simple esquema paso a paso mostrando los pasos a seguir para la preparación de portaobjetos para microscopía.
Figura 2: Utilización de colorantes sensibles a pH para sonda acidez intestinales lisosomas de C. elegans. Diagrama que muestra los patrones de intensidad de fluorescencia de cDCFDA intestinal en reproducción (día 2) y post-reproductiva (día 8) gusanos. Los diagramas superiores muestran todo gusanos. Las cajas en la parte inferior representan el zoom, proyecta diagramas de la región del midgut, la luz intestinal en el centro. Lisosomas son descritos como vesículas de diferente tamaño en el citoplasma de las células intestinales. Comparar estos diagramas esquemáticos con imágenes de la figura 3 .
Figura 3: imágenes de tinción cDCFDA. Imágenes representativas que muestran día 2 y día 8 (post L4) C. elegans lisosomas intestinales (tipo N2) teñidos con cDCFDA como lisosomas intestinales de vha-2 y 8 de vha ARNi teñidas con cDCFDA (control positivo). VHA-2 y vha-8 codifican subunidades de la ATPasa vacuolar (vATPase), la bomba del protón la membrana lisosomal encargada de acidificación del lumen lysosomal de la guarnición.
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Discussion
Una variedad de eventos celulares y moleculares que contribuyen al envejecimiento, influenciado por características de historia de vida y factores genéticos. Nuestro reciente estudio22 sugiere que el ciclo reproductivo juega un papel importante en el control de la aptitud del soma a través de la regulación de la dinámica de pH lisosomal. Hemos mostrado que proteolisis lisosomal mediada es promovido mientras que animales se reproducen activamente upregulation de la transcripción de la v-ATPasa, que garantiza a su vez ácidos lisosomas. Sobre el final de la reproducción, gotas de expresión v-ATPasa, lisosomas alcalinizar y agregados de proteína se acumulan en estas células.
Trastornos que afectan la acidificación lisosomal han demostrado para ser causado por la actividad de la v-ATPasa alterada, y disminución de la función v-ATPasa en el cerebro también se ha propuesto que subyacen en varias de las enfermedades neurodegenerativas23. Nuestros resultados fomentan la ayuda la hipótesis de que la función deteriorada de la v-ATPasa es una de las causas de la senescencia celular y envejecimiento24.
Un citológico distintivo de envejecimiento de las células es la formación progresiva de las proteínas mal plegadas y agregadas en el viejo células1,25,26,27,28,29. Como en post-reproductivos C. elegans, proteína similar agregados se encuentran en el lumen lysosomal del último paso de mamíferos cultivadas las células27,29. Lisosomas son el extremo terminal de la vía de la autofagia, es plausible que la afluencia continua de proteínas dañadas y organelos en lisosomas alkalinized resulta en el colapso funcional de los lisosomas, que entonces conduce a otro eventos posteriores que en última instancia, contribuyan a la senescencia celular.
El protocolo descrito aquí ha sido diseñado para generar una evaluación simple y reproducible de la relativa acidez intestinales lisosomas de vivo C. elegans. Porque se requiere una gama estrecha de pH (4.5-5) en estos organelos para la proteólisis adecuada, sutiles aumentos en el pH tienen consecuencias dramáticas para celular y tejido homeostasis17. Las características de la fluorescencia y bajo pka de cDCFDA permite este tinte capturar cambios en la acidez en este pH fisiológico relevantes ventana18. La concentración de cDCFDA recomendado para la tinción de lisosomas se ha optimizado para proporcionar la mejor lectura posible de cambios en el pH lisosomal basado en nuestro sistema de proyección de imagen y parámetros de proyección de imagen. Aún así, los resultados de la tinción de cDCFDA pueden variar para diferentes usuarios finales basados en su configuración de imagen tal que cambios en el pH lisosomal no podrían reflejarse exactamente en el patrón de coloración cDCFDA. Si esto sucede, el mejor curso de acción sería utilizar variando las concentraciones de cDCFDA (10 a 100 mM) para determinar la concentración óptima para las variaciones de la proyección de imagen en gusanos del tipo salvaje N2 en día 2 y día 8 post L4. La concentración de cDCFDA ideal es que manchas de lisosomas de gusanos jóvenes (post del día 2 L4) eficientemente sin ser sobresaturado, pero también muestra una disminución intensidad de la tinción para viejo (post día 8 L4) gusanos.
Una de las limitaciones de la técnica de tinción de cDCFDA es su tiempo de incubación. Cuando los gusanos se incuban en un determinado momento, los resultados se pueden visualizar sólo después de ~ 24 h. Sería más eficiente para el desarrollo de una cepa de C. elegans que proporciona una lectura en tiempo real de pH lisosomal, presumiblemente con un fluoróforo sensible al pH con la etiqueta a una proteína lysosomal de la membrana.
Mientras que existen algunas técnicas para evaluar el pH en el intestino de C. elegans, la mayoría de estas técnicas evaluar el pH del intestino como un entero de30, o requiere inyección en la cavidad del cuerpo, que es mucho tiempo y engorroso31. cDCFDA se puede aplicar fácilmente para pantallas genéticas a gran escala utilizando bibliotecas de ARNi alimentación buscar mutantes de C. elegans Mostrar alterado pH lisosomal o fisiología. Los aspectos sólo críticos de este método son la concentración de cDCFDA utilizado y estar seguro de incluir un joven (post del día 2 L4) N2 cepa de control como punto de referencia para la configuración de la proyección de imagen confocal durante cada sesión.
Para entender mejor la contribución del pH lisosomal al envejecimiento, será importante diseccionar los mecanismos detrás de los cambios dinámicos en acidez lysosomal en respuesta a diferentes entradas de celulares y ambientales. tinción de cDCFDA puede utilizarse como una estrategia para ampliar esta investigación en C. elegans.
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Disclosures
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a centro Caenorhabditis genética de las cepas, las ciencias naturales y Consejo de investigación Ingeniería (NSERC) y la Fundación de Canadá para la innovación (CFI) para la financiación. Nos gustaría agradecer a Dr. Lizhen Chen (Departamento de sistemas celular y anatomía, UT salud San Antonio) para permitir el uso irrestricto de sus instalaciones de laboratorio para todos los experimentos de C. elegans , así como el Dr. Exing Wang (Director asociado, centro de la proyección de imagen óptica UT salud San Antonio) para obtener ayuda con microscopía confocal. También nos gustaría agradecer a Dr. Myron Ignatius para proporcionar apoyo y aliento para facilitar la sesión de video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OP50 (E. coli) | Caenorhabditis Genetics Center | Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| 5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate | ThermoFisher | C369 | Commonly known as cDCFDA |
| 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron | ThermoFisher | L7528 | Commonly known as Lysotracker Red |
| Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510) | |||
| ImageJ | Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| LB Broth powder | ThermoFisher | 22700041 | |
| Bacto Agar | Sigma | A5306-1KG | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | S71604 | |
| Cholesterol powder | Sigma | C3045 | |
| CaCl2 | Sigma | 449709 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| K3PO4 | Sigma | P5629 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover Slips | ThermoFisher | 3406 | |
| Agarose | Sigma | A6013 | |
| Incubator | |||
| Mirror or other smooth flat surface |
References
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