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Developmental Biology

लाइव Caenorhabditis एलिगेंस की आंत में Lysosomal Alkalinization का आकलन

Published: April 13, 2018 doi: 10.3791/57414
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, University of Saskatchewan

Summary

एक कदम दर कदम गाइड सी. एलिगेंस की आंत में lysosomal अम्लता के नुकसान की जांच करने के लिए पीएच के प्रति संवेदनशील का उपयोग कर महत्वपूर्ण डाई 5 (6)-carboxy-2 ', 7 '-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

Abstract

निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस (सी. एलिगेंस) एक मॉडल प्रणाली है कि व्यापक रूप से दीर्घायु और विकासात्मक रास्ते का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस तरह के अध्ययनों से पशु की पारदर्शिता, आगे करने की क्षमता और आनुवंशिक परख रिवर्स, फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन पैदा करने के सापेक्ष आसानी, और फ्लोरोसेंट रंजक है कि या तो जल्दी में microinjected जा सकता है का उपयोग करने की सुविधा है भ्रूण या अपने भोजन में शामिल (ई. कोलाई तनाव OP50) को सेलुलर organelles लेबल (उदा 9-diethylamino-5H-benzo (क) phenoxazine-5-एक और (3-{2-[(1, 1 ' H-2, 2 '-bipyrrol-5-yl-kappaN (1)) methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N- [2-(dimethylamino) एथिल] propanamidato) (difluoro) बोरान) । यहां, हम एक फ्लोरोसेंट पीएच के प्रयोग के प्रति संवेदनशील डाई कि दाग आंत्र lysosomes, गतिशील के एक दृश्य readout, जीना कीड़े में lysosomal अंलता में शारीरिक परिवर्तन प्रदान प्रस्तुत करते हैं । इस प्रोटोकॉल lysosomal पीएच उपाय नहीं है, बल्कि lysosomal अंलता में शारीरिक प्रासंगिक विविधताओं का आकलन करने का एक विश्वसनीय विधि स्थापित करना है । cDCFDA एक सेल permeant यौगिक है कि फ्लोरोसेंट fluorophore 5-(और-6) में परिवर्तित कर दिया है-carboxy-2 ', 7 '-dichlorofluorescein (cDCF) पर hydrolysis intracellular द्वारा esterases । lysosomes जाल के अंदर प्रोटॉन इन organelles में cDCF, जहां यह संचित । ४.८ के अपने कम pKa के कारण, इस डाई खमीर में एक पीएच सेंसर के रूप में इस्तेमाल किया गया है । यहां हम एक खाद्य पूरक के रूप में cDCFDA के उपयोग का वर्णन करने के लिए आंत्र lysosomes की अम्लता का आकलन करने के लिए C. एलिगेंस. इस तकनीक को जीवित पशुओं में alkalinizing lysosomes का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, और उंर बढ़ने, autophagy, और lysosomal उत्पत्ति पर अध्ययन सहित प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के एक व्यापक रेंज है ।

Introduction

प्रोटीन समुच्चय की उपस्थिति व्यापक रूप से eukaryotic कोशिकाओं1,2,3में उंर बढ़ने की एक बानगी हो स्वीकार किया है, और गठन जो सेलुलर वार्धक्य4 के सिद्धांत ड्राइवरों के बीच होने लगा है , 5 , ६ , 7. वहां बढ़ सबूत है कि कोशिकाओं के रूप में उंर, प्रोटीन catabolism ख़राब है, प्रोटीन एकत्रीकरण में वृद्धि करने के लिए अग्रणी । उंर बढ़ने कोशिकाओं में प्रोटियोलिसिस के पतन के एक autophagy8 के रूप में अच्छी तरह के रूप में proteasome-मध्यस्थता प्रोटीन क्षरण9की हानि शामिल है । अंत में, अपरिवर्तनीय प्रोटीन ऑक्सीकरण पुरानी कोशिकाओं में वृद्धि हुई है, आगे प्रोटीन catabolism10बिगड़ती ।

Autophagy शुरू में क्षतिग्रस्त प्रोटीन के थोक क्षरण के लिए एक गैर चयनात्मक प्रक्रिया होने लगा था, लेकिन हाल के अध्ययनों से संकेत दिया है कि Autophagy प्रोटीन समुच्चय और बेकार organelles के catabolism के लिए उच्च चयनात्मक है कि नहीं कर रहे है अंय प्रोटीन निकासी तंत्र11के माध्यम से गिरावट के लिए उत्तरदाई । autophagy की प्रक्रिया के दौरान, क्षतिग्रस्त और एकत्रित प्रोटीन एक डबल-झिल्ली पुटिका autophagosome बुलाया में तनहा हैं । यह autophagosome तो lysosomes बुलाया अंलीय organelles के साथ फ़्यूज़, जो autophagosome कार्गो12के क्षरण की ओर जाता है । Lysosomes autophagic मार्ग के अंत बिंदु का प्रतिनिधित्व करते हैं और इस तरह के झिल्ली की मरंमत, transcriptional नियंत्रण और पोषक तत्वों संवेदन के रूप में अलग सेलुलर प्रक्रियाओं में भाग लेते हैं; सेलुलर homeostasis में उनकी केंद्रीकृत भूमिका पर प्रकाश डाला (रेफरी .13 में समीक्षा की) । कई अध्ययनों से lysosomal समारोह और विभिंन neurodegenerative विकारों में एक उंर पर निर्भर कमी के बीच एक संघ दिखाया है13। लगातार, पुराने कोशिकाओं में lysosomal समारोह बहाल उंर बढ़ने से संबंधित phenotypes14,15की शुरुआत में देरी कर सकते हैं । intralumen वातावरण की संरचना का अध्ययन सुझाव है कि पुरानी कोशिकाओं में lysosomal समारोह के पतन lysosomal के उत्पादन में कमी के कारण नहीं है16। वैकल्पिक रूप से, यह प्रस्तावित किया गया है कि intralysosomal अंलता, अपनी एंजाइमी गतिविधि की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता की हानि, lysosome में छोड़ आबाद-मध्यस्थता प्रोटियोलिसिस17हो सकता है । इस परिकल्पना का पता लगाने में सक्षम होने के लिए, यह एक replicable और सुसंगत तरीके से जीवित कोशिकाओं में lysosomal पीएच में गतिशील परिवर्तन की जांच करने के लिए रिएजेंट और प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए आवश्यक है ।

सी. एलिगेंस की आंत कीड़े में प्रमुख चयापचय ऊतक है और यह प्रणालीगत homeostasis और जीवन की एक महत्वपूर्ण नियामक है । हम को विकसित किया है परख कीड़े की आंतों lysosomes के लुमेन की अंलता में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए निर्धारित कैसे lysosome-मध्यस्थता प्रोटियोलिसिस उंर बढ़ने के लिए योगदान देता है । हालांकि पीएच-संवेदनशील fluorophores पहले सी. एलिगेंस में आंतों lysosomes निशान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, वहां अभी तक एक सफल प्रोटोकॉल है कि vivo18 मेंlysosomal पीएच में छोटे वृद्धि का पता लगाने के लिए कर सकते है स्थापित करने का प्रयास नहीं किया गया है। यहां, हम एक प्रोटोकॉल है कि एक सरल और सुविधाजनक खिला प्रोटोकॉल है कि OP50 भोजन में एक पीएच-संवेदनशील fluorophore (cDCFDA) शामिल का उपयोग कर के आंतों की कोशिकाओं में lysosomal अंलता की हानि का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रदान करते हैं ।

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Protocol

1. दाग और छवि आंत्र lysosomes

  1. सीड निमेटोड ग्रोथ मीडिया (NGM) प्लेट्स विथ OP50
    1. अनुशंसित प्रोटोकॉल19 के अनुसार NGM प्लेट तैयार करें और बंद प्लेटों को कमरे के तापमान पर 2 दिनों के लिए सूखने दें ।
    2. Inoculate OP50 जीवाणु बाँझ Luria शोरबा में (पौंड) शोरबा और ३७ ° c में एक मिलाते हुए मशीन या पानी स्नान में बढ़ने ३६ ज के लिए या जब तक आयुध डिपो ०.२ और ०.४ के बीच है । आयुध डिपो > 1 या आयुध डिपो के साथ एक जीवाणु संस्कृति का उपयोग करने से बचें < 0.2 ।
    3. एक बार NGM प्लेटें सूखी हैं, एक बूंद (~ 30 µ एल) OP50 इनोक्युलम की थाली के केंद्र पर जगह है, और फिर एक पैच में गिरावट फैला है कि मोटे तौर पर 2 सेमी एक्स आकार में 2 सेमी है ।
      नोट: किसी भी बचे हुए OP50 इनोक्युलम को एक महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
    4. OP50 प्लेटों को पलटना एक बार इनोक्युलम सूख गया है (लगभग 10 या 15 मिनट), और फिर ३६ एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें मशीन ।
    5. ३६ एच के बाद, मशीन से प्लेटों को हटाने और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर बाद में उपयोग जब तक ।
      नोट: प्लेटें 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने के लिए अच्छा होना चाहिए ।
  2. पूरण cDCFDA को OP50
    1. OP50 प्लेट्स पर cDCFDA को सप्लीमेंट करने के लिए, dimethyl sulfoxide (DMSO) में 10 mM cDCFDA का वर्किंग स्टॉक तैयार करें । बाद में उपयोग के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश और स्टोर से सुरक्षित cDCFDA समाधान रखें ।
    2. धीरे 2 सेमी x 2-cm OP50 पैच की सतह पर 10 मिमी cDCFDA समाधान के १०० µ एल जगह है, इस तरह कि पूरे पैच समान रूप से cDCFDA के साथ कवर किया जाता है.
      नोट: यह बहुत महत्वपूर्ण है कि OP50 के पूरे पैच cDCFDA के साथ कवर किया जाता है । यदि आवश्यक हो, तो प्रत्येक प्लेट के लिए cDCFDA के १५० µ l तक का उपयोग करें । यह भी जरूरी है कि cDCFDA समाधान OP50 पैच की सीमाओं से परे का विस्तार नहीं करता है, के बाद से किसी भी cDCFDA कि OP50 पैच से बाहर बहती भोजन में शामिल नहीं किया जाएगा, और कम धुंधला तीव्रता में परिणाम होगा ।
    3. cDCFDA समाधान के सभी बैक्टीरियल पैच (आमतौर पर के बारे में 25 से 30 मिनट) में अवशोषित हो जाती है जब तक बेंच शीर्ष पर एक अंधेरे बॉक्स में OP50 प्लेट रखें ।
  3. दाग cDCFDA का उपयोग कीड़े
    1. एक बार cDCFDA पूरी तरह से OP50 पैच रिस चुका है, एक प्लेट प्रति 20 से अधिक कीड़े जगह और 20 डिग्री सेल्सियस पर औंधा प्लेटें 14 घंटे की एक ंयूनतम के लिए ।
      नोट: यह प्रकाश के लिए जोखिम को कम करने के लिए एक अपारदर्शी बॉक्स में cDCFDA प्लेटें जगह की सिफारिश की है.
    2. प्रयोगों और cDCFDA संकेतों को सामान्य करने के बीच सेवन अंतर के लिए नियंत्रित करने के लिए, (अनुशंसित) 3-{2-[(1) के साथ सह-दाग 1 ' H-2, 2 '-bipyrrol-5-yl-kappaN (1)) methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino) एथिल] propanamidato) ( difluoro) बोरान (२.५ µ एल के एक हौसले से बनाया 1 मिमी समाधान), एक acidotropic कमजोर अमीन डाई जिसका प्रतिदीप्ति मोटे तौर पर गैर अम्लीय पीएच स्पेक्ट्रम से अधिक संस्करण है (देखें सामग्री की तालिका के आम नाम के लिए रिएजेंट).
      नोट: यह अपर्याप्त cDCFDA धुंधला तीव्रता प्रदान कर सकते है और lysosomal पीएच के एक झूठी व्याख्या देने के बाद से कम 14 घंटे के लिए कीड़े दाग नहीं है ।
  4. माइक्रोस्कोपी के लिए स्लाइड तैयार करना
    1. लेबलिंग टेप के दो समानांतर स्ट्रिप्स प्लेस के बारे में 3 इंच के अलावा एक चिकनी सपाट सतह पर, जैसे एक दर्पण (चित्र 1) ।
    2. कोट पानी से बचाने वाली क्रीम स्प्रे के साथ दर्पण की सतह, और अधिशेष तरल पोंछ बंद ।
    3. पिघल 2% agarose (आसुत एच2में भंग) एक माइक्रोवेव में जब तक पूरी तरह से तरलीकृत, फिर टेप के दो स्ट्रिप्स के बीच agarose की एक ५० µ एल ड्रॉप प्लेस और जल्दी से एक खुर्दबीन स्लाइड के साथ छोड़ कवर, ऐसी है कि स्लाइड के स्ट्रिप्स के लिए सीधा है टेप. agarose जम गया है के बाद, स्लाइड के तहत एक परिपत्र पैड बनाने, स्लाइड पर फ्लिप और 5 मिमी सोडियम azide के 10 से 15 µ एल जोड़ने (3) agarose पैड पर ।
      नोट:3 एक cytochrome सी अवरोधक है कि जब कम सांद्रता में इस्तेमाल किया, reversibly anesthetizes कीड़े इतना है कि वे इमेजिंग के दौरान कदम नहीं होगा ।
    4. cDCFDA के साथ पूरक OP50 प्लेट से कीड़े उठाओ, और किसी भी OP50 के बिना एक साफ NGM प्लेट के लिए उन्हें हस्तांतरण । कीड़े के बारे में कुछ सेकंड के लिए जाने के लिए अनुमति देने के लिए OP50 के सबसे कीड़े की सतह से हटा दिया जाना है, और फिर agarose 5 मिमी सोडियम azide युक्त पैड को कीड़े हस्तांतरण ।
    5. तुरंत कवर स्लिप के साथ agarose पैड को कवर किया । हो धीरे से बहुत अधिक दबाव लागू करने के बिना कवर स्लिप जगह यकीन है, के बाद से इस कीड़े फट में परिणाम कर सकते हैं ।
      नोट: OP50 बैक्टीरिया cDCFDA fluoresce के साथ पूरक जब माइक्रोस्कोपी द्वारा visualized, इसलिए यह सोडियम azide युक्त agarose पैड पर रखने से पहले के रूप में संभव के रूप में सबसे अच्छा के रूप में कीड़े साफ करने के लिए महत्वपूर्ण है. यदि prepping से अधिक 6 उपभेदों के एलिगेंस (N2 सहित, जंगली प्रकार के नियंत्रण), यह सलाह दी जाती है 6 के बैचों में नमूनों को तैयार करने के लिए, ताकि यह सुनिश्चित करने के लिए कि कीड़े बाहर agarose पैड पर सूखी नहीं है । कुछ उपभेदों में योनी को कवर स्लिप से दबाव के कारण समय की विस्तारित अवधि के बाद टूटना शुरू होता है, तो यह महत्वपूर्ण है तदनुसार योजना है ।
  5. फोकल माइक्रोस्कोपी
    नोट: कुछ सूक्ष्मदर्शी प्रतिदीप्ति के चर स्तर के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए स्वचालित रूप से प्रतिदीप्ति तीव्रता बढ़ जाती है कि एक अंतर्निहित सुविधा है । इस तरह के सूक्ष्मदर्शी इमेजिंग कीड़े cDCFDA के साथ दाग के लिए अच्छी तरह से काम नहीं हो सकता है, क्योंकि वे स्वाभाविक नमूनों की प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि होगी ।
    1. cDCFDA के लिए 488/530 एनएम के लिए सेट उत्तेजना/उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का उपयोग कर एक मानक फोकल माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग प्रदर्शन । एक विमान छवियों आंतों lysosomes के (नहीं Z-पोट) ले लो और केवल lysosomes है कि ध्यान में है (अधिकतम संकेत तीव्रता ठहराव के लिए) का उपयोग करें ।
      ध्यान दें: शायद क्योंकि डाई उपलब्धता में मतभेद की, lysosomes आंत्र कोशिकाओं के सीधे ग्रसनी के पीछे जीनोटाइप या उम्र के बावजूद cDCFDA धुंधला तीव्रता बनाए रखने, इसलिए ध्यान इन कोशिकाओं में इमेजिंग lysosomes से बचने के लिए लिया जाना चाहिए.
    2. छवि 2 दिन पुराने जंगली प्रकार N2 कीड़े पहले युक्त स्लाइड । ऐसा करते समय, इस तरह के लेजर शक्ति, pinhole, और एपर्चर के रूप में फोकल इमेजिंग मानकों को समायोजित करने के लिए सुनिश्चित करें कि cDCFDA धुंधला तीव्रता संतृप्त नहीं है ।
      नोट: एक बार इन सेटिंग्स सेट कर रहे हैं, उंहें उस दिन के लिए इमेजिंग की पूरी अवधि के लिए नहीं बदल ।
    3. (इल्ली प्रति 3 से 4 छवियों) एक 60X आवर्धन लेंस का उपयोग कर आंत के एक विमान के १०२४ x १०२४ पिक्सेल छवियों पर कब्जा ।
      नोट: कीड़े में cDCFDA उत्सर्जन स्पेक्ट्रम ५२० अपनी रिपोर्ट प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम के साथ मेल पर एक एकल प्रमुख चोटी उपज होगा20, एक विशिष्ट संकेत readout कि आंतों autofluorescence (चित्रा 3) से अलग है प्रदान करते हैं ।
    4. raw फोकल छवि (. lsm फ़ाइलें) प्रत्येक चैनल के लिए. tiff फ़ाइलों के रूप में निर्यात करें ।
    5. अगला, खुला ImageJ और फ़ाइल पर क्लिक करें । quantified होने के लिए छवि फ़ाइल खोलने के लिए खोलें । एक बार छवि लोड, ImageJ में अंडाकार आकार चयन उपकरण का उपयोग करने के लिए ब्याज की एक क्षेत्र (रॉय) का चयन करें ।
    6. इसके बाद, विश्लेषण पर क्लिक करें | उपाय है कि रॉय के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता यों तो । चुनें 4-5 छवि प्रति अलग में ध्यान lysosomes और ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र (रॉय) के औसत सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना ।
    7. प्रत्येक छवि के लिए, lysosomes के बीच आंत के एक क्षेत्र में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने । lysosomal प्रतिदीप्ति तीव्रता मानों से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता मान घटाना ।
    8. कुल में, 30 के आसपास इकट्ठा करने के लिए ५० व्यक्तिगत सामान्यीकृत मूल्यों cDCFDA तीव्रता के लिए (6 से 10 पशु) प्रत्येक तनाव के लिए परीक्षण किया जा रहा है । इन मूल्यों का उपयोग किसी भी उचित सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक बॉक्स और मूंछ साजिश साजिश करने के लिए ।
      नोट: दाग काफी तापमान, मशीन समय और समग्र स्वास्थ्य जैसे कारकों के आधार पर भिन्न हो सकते हैं कि प्रतिदीप्ति तीव्रता तुलना केवल एक ही दाग प्रयोग में नमूनों की प्रक्रिया के भीतर प्रासंगिक हैं । इसलिए यह हर धुंधला प्रयोग में नियंत्रण की प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है । किसी भी उपयुक्त सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके सांख्यिकीय अंतर (t-परीक्षण) परिकलित करें ।
    9. छवि एक ही प्रयोग से सभी उपभेदों (एक ही दिन पर दाग) अनुक्रम में, ध्यान लेने के लिए नहीं इमेजिंग मापदंडों के किसी भी बदल जाते हैं ।

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Representative Results

cDCFDA एक पीएच-निर्भर तरीके से lysosomes दाग, और lysosomes में अपने कम pKa और तैयार ऊपर ले यह एक आदर्श पीएच सेंसर21बनाता है । cDCFDA धुंधला तीव्रता lysosomal पीएच (यानी पीएच कम कर देता है के रूप में धुंधला तीव्रता बढ़ जाती है) के लिए व्युत्क्रम आनुपातिक है18,22। cDCFDA संकेतों क्लोरोक्वीन के 20 मिमी, lysosomal अंलीकरण के एक अवरोध करनेवाला के साथ इलाज जानवरों के lysosomes में लगातार कमजोर हैं, और वी-ATPase के समाप्त कीड़े में, lysosomes की झिल्ली पर प्रोटीन परिसर कि प्रोटॉन आयात के लिए आवश्यक है22 . ये महत्वपूर्ण नियंत्रण कर रहे है जब अंय आनुवंशिक पृष्ठभूमि या उपचार में धुंधला cDCFDA के सापेक्ष स्तर का आकलन का उपयोग करें ।

हम भी फिटनेस या इलाज कीड़े की उर्वरता पर cDCFDA जोखिम का कोई खुला प्रभाव मिल (डेटा नहीं दिखाया गया है) । इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर, हम बाद प्रजनन जंगली प्रकार के कीड़े के lysosomes में अंलता के एक अंतर्जात नुकसान की पहचान की । के रूप में चित्रा 3 में दिखाया गया है, cDCFDA प्रतिदीप्ति संकेत युवा (2 दिन पोस्ट L4) reproducing C. एलिगेंस, वाचक acidified lysosomes के lysosomes में मजबूत है । धुंधला तीव्रता lysosomes के alkalinization पर काफी कम कर देता है, के रूप में पुराने में मनाया (8 दिन के बाद L4) कीड़े के रूप में अच्छी तरह से कीड़े के रूप में जहां इन organelles में प्रोटॉन आमद (पछाड़ना के माध्यम से कम हो जाता है vha जीन एंकोडिंग वी ATPase उप यूनिटों) । इस विधि का उपयोग कर, हम बाद प्रजनन जानवरों की आंत में lysosomal अंलता की एक शारीरिक हानि का पता लगाया ( चित्रा 2में आरेख, चित्रा 3में प्रतिदीप्ति छवियों) । 8 दिन की आंतों में कम cDCFDA संकेत (पोस्ट-L4) कीड़े alkaline lysosomes को बताया और प्रोटीन निकासी में एक संभव हानि । यह वास्तव में मामला है, के रूप में इन पशुओं के काफी इस जीवन स्तर22पर lysosomes अंदर प्रोटीन समुच्चय जमा । इस प्रक्रिया में लुमेन de-अंलीकरण की एक भूमिका को मांय करने के लिए, हम सह जवान, reproducing जानवरों है कि वी के दो कोर घटकों के RNAi द्वारा समाप्त किया गया था-ATPase पंप मशीनरी (VHA-2 और VHA-8) और इसलिए ठीक से प्रोटान में आयात नहीं करना चाहिए lysosomes । के रूप में की उंमीद है, vha-2 और vha-8 RNAi पशुओं, यहां तक कि प्रजनन स्तर पर, कम cDCFDA प्रतिदीप्ति के बाद प्रजनन जंगली प्रकार के कीड़े और alkaline lysosomes (चित्रा 3) के साथ संगत के लिए तुलनीय संकेतों को दिखाया ।

Figure 1
चित्र 1: माइक्रोस्कोप के लिए स्लाइड तैयार कर रहा है. एक सरल कदम दर कदम माइक्रोस्कोपी के लिए स्लाइड तैयार करने के लिए पीछा किया जा करने के लिए कदम दिखा योजनाबद्ध ।

Figure 2
चित्रा 2: पीएच-संवेदनशील रंजक का उपयोग आंत्र lysosomes में अम्लता की जांच करने के लिए C. एलिगेंस। reproducing (दिन 2) और बाद प्रजनन (दिन 8) कीड़े में आंत्र cDCFDA प्रतिदीप्ति तीव्रता के पैटर्न दिखा आरेख । शीर्ष आरेख पूरे कीड़े दिखातेहैं । नीचे बक्से में ज़ूम में, midgut क्षेत्र के अनुमानित आरेख, केंद्र में आंतों लुमेन का प्रतिनिधित्व करते हैं । Lysosomes आंत्र कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य में अलग आकार के बुलबुले के रूप में चित्रित कर रहे हैं । चित्रा 3 छवियों के साथ इन योजनाबद्ध आरेख की तुलना करें ।

Figure 3
चित्रा 3: cDCFDA धुंधला छवियों. प्रतिनिधि छवियां दिन 2 और 8 दिन (पोस्ट L4) सी एलिगेंस आंत्र lysosomes (N2 जंगली प्रकार) के रूप में अच्छी तरह से cDCFDA के आंत्र lysosomes के साथ दाग -2 और vha-8 vha कीड़े RNAi के साथ दाग (सकारात्मक नियंत्रण) दिखा । vha-2 और vha-8 vacuolar ATPase (vATPase) की उपइकाई सांकेतिक शब्दों में बदलना, प्रोटॉन पंप lysosomal झिल्ली कि अंलीकरण लुमेन के lysosomal के लिए जिंमेदार है अस्तर ।

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Discussion

सेलुलर और आणविक घटनाओं की एक किस्म उंर बढ़ने में योगदान, जीवन इतिहास लक्षण और आनुवंशिक कारकों से प्रभावित । हमारे हाल के अध्ययन के22 पता चलता है कि प्रजनन चक्र lysosomal पीएच गतिशीलता के विनियमन के माध्यम से सोमा की फिटनेस को नियंत्रित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । हमें पता चला है कि lysosomal-मध्यस्थता प्रोटियोलिसिस को बढ़ावा दिया है, जबकि पशुओं को सक्रिय रूप से वी के विनियमन-ATPase प्रतिलेखन, जो बारी में अंलीय lysosomes सुनिश्चित करता है के ऊपर से प्रतिलिपि । प्रजनन के अंत में, वी ATPase अभिव्यक्ति बूँदें, lysosomes alkalinize, और प्रोटीन समुच्चय इन कोशिकाओं में जमा ।

विकारों कि ख़राब lysosomal अंलीकरण बदल वी-ATPase गतिविधि के कारण होने के लिए दिखाया गया है, और मस्तिष्क में वी ATPase समारोह में गिरावट भी23विभिन्न आबाद रोगों neurodegenerative करने के लिए प्रस्तावित किया गया है. हमारे परिणाम आगे परिकल्पना है कि बिगड़ा वी ATPase समारोह सेलुलर वार्धक्य के कारणों और24उंर बढ़ने के बीच है समर्थन करते हैं ।

बुढ़ापे की कोशिकाओं की एक कोशिकाविज्ञान बानगी पुरानी कोशिकाओं1,25,26,27,28,29में एक और समग्र प्रोटीन के प्रगतिशील गठन है । के रूप में पोस्ट में प्रजनन सी एलिगेंस, इसी तरह के प्रोटीन समुच्चय देर से पारित स्तनधारी के lysosomal लुमेन में पाए जाते है प्रसंस्कृत कोशिकाओं27,29। चूंकि lysosomes autophagic मार्ग के टर्मिनल समापन बिंदु हैं, यह प्रशंसनीय है कि क्षतिग्रस्त प्रोटीन और organelles के कार्यात्मक पतन में alkaline lysosomes परिणामों में इन lysosomes है, जो फिर अंय की ओर जाता है की लगातार आमद । बहाव की घटनाओं है कि अंततः सेलुलर वार्धक्य के लिए योगदान ।

प्रोटोकॉल यहां वर्णित जीने सी एलिगेंस के आंतों lysosomes में रिश्तेदार अंलता का एक सरल और reproducible मूल्यांकन उत्पंन डिजाइन किया गया है । क्योंकि एक संकीर्ण पीएच रेंज (4.5-5) उचित प्रोटियोलिसिस के लिए इन organelles में आवश्यक है, पीएच में सूक्ष्म वृद्धि सेलुलर और ऊतक homeostasis17के लिए नाटकीय परिणाम है । प्रतिदीप्ति विशेषताओं और कम pka के cDCFDA इस डाई इस शारीरिक प्रासंगिक पीएच विंडो18में अंलता में परिवर्तन पर कब्जा करने के लिए अनुमति देता है । cDCFDA की एकाग्रता धुंधला lysosomes के लिए सिफारिश की गई है हमारे इमेजिंग मापदंडों और इमेजिंग प्रणाली के आधार पर lysosomal पीएच में परिवर्तन का सबसे अच्छा संभव readout प्रदान करने के लिए अनुकूलित किया गया है । फिर भी, cDCFDA धुंधला के परिणाम अलग अंत उपयोगकर्ताओं को अपनी इमेजिंग सेटअप के आधार पर भिंन हो सकते है जैसे कि lysosomal पीएच परिवर्तन सही cDCFDA धुंधला पैटर्न में प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है । यदि ऐसा होता है, कार्रवाई का सबसे अच्छा कोर्स के लिए cDCFDA की सांद्रता अलग का उपयोग करें (10 १०० mM) के लिए जंगली प्रकार N2 कीड़े में इमेजिंग भिंनता के लिए इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए 2 दिन और 8 दिन के बाद L4 । आदर्श cDCFDA एकाग्रता एक कि दाग lysosomes के जवान (दिन 2 पोस्ट L4) कुशलता के बिना संतृप्त किया जा रहा है, लेकिन यह भी पुराने (दिन 8 पोस्ट L4) कीड़े के लिए एक कम धुंधला तीव्रता से पता चलता है ।

cDCFDA धुंधला तकनीक की सीमाओं में से एक अपनी लंबी मशीन समय है । जब कीड़े एक विशेष समय बिंदु पर मशीन हैं, परिणाम केवल ~ 24 घंटे के बाद visualized किया जा सकता है । यह अधिक कुशल के लिए C. एलिगेंस का एक तनाव है कि lysosomal पीएच के एक वास्तविक समय readout, संभवतः एक पीएच-संवेदनशील fluorophore एक lysosomal झिल्ली प्रोटीन के लिए टैग का उपयोग कर प्रदान करता है विकसित होगा ।

जबकि वहां सी. एलिगेंस की आंत में पीएच आकलन के लिए कुछ अलग तकनीक मौजूद हैं, इन तकनीकों के अधिकांश या तो एक पूरे30के रूप में आंत के पीएच का आकलन, या शरीर गुहा, जो समय लेने वाली है में इंजेक्शन की आवश्यकता और बोझिल31. cDCFDA आसानी से बड़े पैमाने पर आनुवंशिक के लिए खिला RNAi पुस्तकालयों का उपयोग करने के लिए सी. एलिगेंस म्यूटेंट कि बदल lysosomal पीएच या शरीर विज्ञान दिखाने के लिए खोज के लिए लागू किया जा सकता है । इस विधि के केवल महत्वपूर्ण पहलुओं cDCFDA की एकाग्रता का इस्तेमाल किया जा रहा है और एक युवा (दिन 2 पोस्ट L4) हर सत्र के दौरान फोकल इमेजिंग विंयस्त के लिए एक बेंचमार्क के रूप में N2 नियंत्रण तनाव शामिल करने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा है ।

बेहतर उंर बढ़ने के लिए lysosomal पीएच के योगदान को समझने के लिए, यह अलग सेलुलर और पर्यावरणीय आदानों के जवाब में lysosomal अंलता में गतिशील परिवर्तन के पीछे विनियामक तंत्र काटना महत्वपूर्ण होगा । cDCFDA धुंधला एक रणनीति के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए C. एलिगेंसमें इस शोध का विस्तार ।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं की ।

Acknowledgments

हम उपभेदों के लिए Caenorhabditis आनुवंशिकी केंद्र का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC), और कनाडा के लिए नवाचार के लिए फाउंडेशन (CFI) धन के लिए । हम dr. Lizhen चेन का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा (सेल सिस्टम और एनाटॉमी विभाग, यूटी स्वास्थ्य सैन एंटोनियो) सभी ग. एलिगेंस प्रयोगों के लिए उसे प्रयोगशाला सुविधाओं के अप्रतिबंधित उपयोग की अनुमति देने के लिए के रूप में अच्छी तरह के रूप में डॉ Exing वांग (एसोसिएट निदेशक, ऑप्टिकल इमेजिंग सुविधा , यूटी स्वास्थ्य सैन एंटोनियो) फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ सहायता के लिए । हम भी वीडियो शूट की सुविधा के लिए समर्थन और प्रोत्साहन प्रदान करने के लिए Dr. Myron Ignatius शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
OP50 (E. coli) Caenorhabditis Genetics Center Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50
5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate  ThermoFisher C369 Commonly known as cDCFDA
9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron ThermoFisher L7528 Commonly known as Lysotracker Red
Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510)
ImageJ Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LB Broth powder ThermoFisher 22700041
Bacto Agar Sigma A5306-1KG
NaCl Sigma S9888
Bacto Peptone Fisher Scientific S71604
Cholesterol powder Sigma C3045 
CaCl2 Sigma 449709
MgSO4 Sigma M7506
K3PO4 Sigma P5629
Sodium Azide Sigma S2002
DMSO Sigma D8418
Microscope Slides VWR 48311-703
Cover Slips ThermoFisher 3406
Agarose Sigma A6013
Incubator
Mirror or other smooth flat surface

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References

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विकास जीव विज्ञान अंक १३४ सी. एलिगेंस lysosomes पीएच वी-ATPase प्रोटीन catabolism cDCFDA
लाइव <em>Caenorhabditis एलिगेंस</em> की आंत में Lysosomal Alkalinization का आकलन
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Baxi, K., de Carvalho, C. E.… More

Baxi, K., de Carvalho, C. E. Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (134), e57414, doi:10.3791/57414 (2018).

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