Summary
Lizozomal asit pH duyarlı hayati boya 5 (6) - carboxy - 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA) kullanarak C. elegans bağırsak kaybı soruşturma için bir adım adım kılavuz
Abstract
Yuvarlak solucanlar Caenorhabditis elegans (C. elegans) uzun ömür ve gelişim yolları çalışma için yaygın olarak kullanılan bir modeli sistemidir. Bu tür çalışmalar hayvan, ileriye ve geriye doğru genetik deneyleri, üreten fluorescently etiketli protein göreli kolaylığı ve ya erken microinjected floresan boyalar kullanımı yeteneği şeffaflık tarafından kolaylaştırdı embriyo veya hücre organelleri (örneğin phenoxazine-5-1 9-diethylamino-5 H-benzo (a) ve (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} - N - etiketlemek için onun gıda (E. coli zorlanma OP50) içine dahil [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Burada, bağırsak organellerin, lekeleri floresan bir pH duyarlı boya kullanımı canlı solucanlar lizozomal asitliği dinamik, fizyolojik değişikliklerin görsel bir okuma sağlayan mevcut. Bu iletişim kuralı lizozomal pH ölçmek değil, ama oldukça fizyolojik alakalı varyasyonları lizozomal asitliği değerlendirirken, güvenilir bir yöntem kurmayı amaçlıyor. cDCFDA floresan fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) hidroliz üzerine tarafından hücre içi esterazlar dönüştürülür hücre permeant bir bileşiktir. Organellerin içinde Protonation cDCF içinde nerede biriken bu organelleri yakalar. 4.8 düşük onun pKa nedeniyle, bu boya Maya bir pH sensör olarak kullanılmıştır. Burada bağırsak organellerin asitliği değerlendirmek için bir gıda takviyesi olarak cDCFDA kullanımı açıklamak C. elegans. Bu teknik canlı hayvanlar, alkalinizing organellerin tespiti için izin verir ve deneysel uygulamalar yaşlanma, autophagy ve lizozomal Biyogenez çalışmalar da dahil olmak üzere geniş bir yelpazesine sahiptir.
Introduction
Protein toplamları görünümünü yaygın bir hallmark ökaryotik hücreler1,2,3ve hangi hücresel yaşlanma4 ilke sürücüleri arasında düşünülmektedir oluşumu yaşlanma olmak kabul , 5 , 6 , 7. yaş hücreleri gibi protein katabolizma protein toplama artışa önde gelen Engelli olduğunu büyüyen kanıtıdır. Hücrelerin yaşlanma içinde proteolizis çöküşü autophagy8 yanı sıra proteasome-aracılı protein yıkımı9bir bozulma içerir. Son olarak, geri dönüşü olmayan protein oksidasyon daha fazla protein katabolizma10bozulması eski hücrelerde artar.
Autophagy başlangıçta için toplu bozulma bozuk proteinlerin non-selektif bir süreç olduğu düşünülüyordu ama son yıllarda yapılan çalışmalarda bu autophagy çok seçici protein toplamları ve işlevsel olmayan organelleri olmayan katabolizma belirttiler mükellef bozulması diğer protein izni mekanizmaları11ile için. Autophagy işlemi sırasında zarar görmüş ve toplanan proteinleri autophagosome denilen bir çift-membran vezikül münzevi. Bu autophagosome sonra da autophagosome kargo12düşmesine neden organellerin, denilen asidik organelleri ile Sigortalar. Organellerin autophagic yolun son nokta temsil ve membran tamir, transkripsiyon kontrolü ve besin algılama gibi farklı hücresel süreçler iştirak; hücresel homeostasis (ref. 13 gözden) içindeki merkezi rolü vurgulayarak. Çeşitli çalışmalarda lizozomal işlevi bir yaş bağımlı azalma ve çeşitli nörodejeneratif hastalıklar13arasındaki ilişkiyi göstermektedir. Sürekli olarak, büyük hücrelerdeki lizozomal işlevi geri yükleme fenotipleri yaşlanma ile ilgili14,15başlangıçlı gecikme. İntralumen ortamın kompozisyonu çalışmalarının lizozomal büyük hücre işlevinde çöküşü lizozomal proteaz16üretim azalma nedeniyle değil öneririz. Alternatif olarak, intralysosomal asit, enzimatik faaliyet, kritik bir gereklilik kaybı lysosome-aracılı proteolizis17düşüş altında yatan önerilmiştir. Bu hipotez keşfetmek için güçlü olmak, reaktifler ve dinamik değişiklikleri canlı hücrelerdeki lizozomal pH yinelenebilir ve tutarlı bir şekilde soruşturma için protokolleri geliştirmek esastır.
C. elegans bağırsak solucanları önemli metabolik doku ve sistemik homeostazı ve ömrü kritik bir regülatör. Biz deneyleri değişikliklerini değerlendirip geliştirdik solucan nasıl lysosome-aracılı proteolizis belirlemek için bağırsak organellerin Lümen asitliği yaşlanmaya katkıda bulunur. PH-duyarlı fluorophores daha önce C. elegans içinde bağırsak organellerin işaretlemek için kullanılmıştır rağmen henüz küçük artışlar lizozomal pH vivo18'. algılayabilir başarılı bir iletişim kuralı kurmak çabası olmadı Burada, OP50 maması pH duyarlı fluorophore (cDCFDA) içeren basit ve uygun beslenme protokolü kullanarak lizozomal asit kaybı C. elegans bağırsak hücreleri algılamak için kullanılan bir protokol sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. leke ve bağırsak organellerin görüntü
- Tohum nematodunun büyüme medya (NGM) ile OP50 tabaklar
- NGM tabak başı olarak önerilen protokolü19 hazırlamak ve oda sıcaklığında 2 gün kuru kapalı plakalara sağlar.
- OP50 bakteri steril Luria suyu (LB) suyu aşılamak ve titreyen bir inkübatöre veya su banyoda 37 ° c 36 h ya OD 0,2 0,4 aramda kadar büyür. Bir bakteri kültürü ile OD kullanmaktan kaçının > 1 veya OD < 0,2.
- NGM tabak kuru olduğunda, OP50 inoculum Merkezi plaka üzerine bir damla (~ 30 µL) yerde ve daha sonra yaklaşık 2 cm x 2 cm boyutunda bir yama içine damla yayılırlar.
Not: Herhangi bir kalan OP50 inoculum 4 ° C'de için bir ay kadar saklanır. - İnoculum (yaklaşık 10-15 dk) kuruduktan sonra OP50 plakaları ters çevir ve plakaları için 36 h 37 ° C'de kuluçkaya.
- 36 h sonra plakaları kuluçka ve mağaza 4 ° C'de daha sonra kullanmak kadar kaldırın.
Not: Tabakları 4 ° C'de 1 ay için iyi olmalıdır
- CDCFDA OP50 için ilave
- CDCFDA OP50 plakalar üzerine ek 10 mM cDCFDA Dimetil sülfoksit (DMSO) içinde bir çalışma hazır hazır olun. Işık ve daha sonra kullanmak için-20 ° C'de mağaza korunuyorsunuz cDCFDA çözüm tutmak.
- Öyle ki tüm yama düzgün cDCFDA ile kaplıdır yavaşça 100 µL 10 mM cDCFDA çözüm 2 cm x 2 cm OP50 yama yüzeyine yerleştirin.
Not: OP50 tüm yama cDCFDA ile kaplıdır çok önemlidir. Gerekirse, cDCFDA 150 µL her plaka için kullanın. OP50 yama dışarı akar herhangi bir cDCFDA yemek dahil değil ve azaltılmış boyama şiddeti neden olur bu yana cDCFDA çözüm OP50 yama, sınırların ötesinde kapsamaz zorunludur. - Tüm cDCFDA çözüm absorbe kadar bakteriyel yama tezgah üstüne koyu bir kutu içinde OP50 tabak koyun (genellikle yaklaşık 25-30 dakika).
- Solucan cDCFDA kullanarak boyama
- Bir kez cDCFDA tamamen OP50 yama nüfuz, plaka başına 20'den fazla solucanlar yerleştirin ve en az 14 h 20 ° C'de ters plakaları kuluçkaya.
Not: Bu cDCFDA plakaları yakmak için pozlandırmayı en aza indirmek için opak bir kutuya koyun önerilir. - Deneyler arasındaki farklar alımı için kontrol etmek ve cDCFDA sinyalleri, normalize etmek (önerilen) 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) () ile ortak leke difluoro) Bor (bir taze yapılmış 1 mM çözüm 2.5 µL), kimin Floresans asidik pH spektrum üzerinde büyük ölçüde değişken olmayan olduğunu bir acidotropic zayıf Amin boya ( Malzemeler tablo bkz: reaktifler ortak adları için).
Not: Bu yetersiz cDCFDA boyama yoğunluğunu sağlamak ve yanlış yorumun lizozomal pH vermek beri solucanlar az 14 h için leke değil.
- Bir kez cDCFDA tamamen OP50 yama nüfuz, plaka başına 20'den fazla solucanlar yerleştirin ve en az 14 h 20 ° C'de ters plakaları kuluçkaya.
- Slaytlar mikroskopi için hazırlanıyor
- Teyp yaklaşık 3 inç apart pürüzsüz düz bir yüzeye, bir ayna (şekil 1) gibi etiketleme iki paralel şeritler yerleştirin.
- Su geçirmez sprey ile ayna yüzeyine ceket ve fazla sıvı temizle.
- (Çözünmüş distile H2O) % 2 özel bir mikrodalga tamamen sıvılaşmış kadar erime sonra teyp iki şeritler arasında özel bir 50 µL damla koyun ve öyle ki slayt dikey şeritler için hızlı bir şekilde mikroskop kaydıraklı, açılan kapak kaset. Özel katılaşmış sonra oluşturan dairesel bir yastık altında slayt, slayt ters çevirin ve 5 mM sodyum azid (NaN3) özel yastık üzerine 10-15 µL ekleyebilirsiniz.
Not: NaN3 sitokrom C inhibitörü olduğunu o zaman düşük konsantrasyonlarda kullanılır, böylece onlar görüntüleme sırasında hareket etmez geri dönülebilir olarak solucan anesthetizes. - Solucan cDCFDA ile desteklenmiş OP50 plaka almak ve herhangi bir OP50 olmadan temiz bir NGM plakasına aktarmak. Solucanlar solucan yüzeyinden kaldırılacak OP50 çoğunu izin vermek bir kaç saniyeliğine taşımak izin ve sonra 5 mM sodyum azid içeren özel yastık solucanlar aktarın.
- Hemen özel yastık bir kapak notu ile kapak. Bu solucan patlama neden olabilir bu yana çok fazla baskı uygulamadan kapak notu yavaşça yerleştirdiğinizden emin olun.
Not: cDCFDA ile desteklenmiş OP50 bakteri mikroskobu tarafından görüntülenir zaman bulabilsem, bu nedenle solucanların en iyi temizlemek mümkün olduğunca sodyum azid içeren özel yastık bunları yerleştirmeden önce önemlidir. 6'dan fazla (N2, vahşi türü denetimi de dahil olmak üzere) C. elegans suşları prepping, böylece solucanlar özel yastık üzerinde kurumasına olduğunu sağlamak için 6, toplu halde örneklerinde hazırlamak için tavsiye edilir. Bazı suşları vulva kapak notu baskısı nedeniyle uzun bir süre sonra buna göre planlamak önemlidir bu yüzden rüptürü başlanır.
- Confocal mikroskobu
Not: Bazı mikroskoplar otomatik olarak artırır floresan yoğunluğu Floresans çeşitli düzeyleri için telafi etmek için yerleşik bir özelliği var. Böyle mikroskoplar de doğal olarak örnekleri floresan yoğunluğu artacak bu yana cDCFDA ile lekeli solucanlar görüntüleme için çalışmayabilir.- 488/530 için ayarla uyarma/emisyon dalga boylarında kullanarak standart confocal mikroskop düşsel gerçekleştirmek nm cDCFDA için. Uçak bağırsak organellerin (değil Z-yığınlar) görüntülerini alın ve odak (maksimal sinyal yoğunluğu) yoğunluk miktar için çoğu organellerin kullanın.
Not: Belki de boya kullanılabilirlik farklılıkları nedeniyle, bağırsak hücreleri için farinks doğrudan arka organellerin yoğunluğu ne olursa olsun genotip veya yaş boyama cDCFDA korumak, dolayısıyla bu hücrelerde organellerin Imaging önlemek için özen gösterilmelidir. - 2 gün eski vahşi N2 ilk solucanlar türünü içeren slayt görüntü. Bunu yaparken de, lazer gücü, iğne deliği ve diyafram yoğunluğu boyama cDCFDA değil doygun olduğunu emin olmak için gibi confocal görüntüleme parametreleri ayarlayın.
Not: Bu ayarlar ayarladığınızda, onları o gün için görüntüleme tüm süresince değiştirmeyin. - Bağırsak (solucanı başına 3-4 görüntü) tek bir uçağın 1024 x 1024 piksel çekim bir 60 X büyütme objektif kullanarak.
Not: Solucan cDCFDA emisyon spektrumunda 520 nm rastlayan bağırsak autofluorescence (şekil 3) ayrı bir belirli sinyal okuma sağlayan onun bildirilen Floresans spektrum20ile tek bir önemli en yüksek verim. - RAW confocal resim (.lsm dosyaları) her kanal için .tiff dosyası olarak dışa aktarın.
- Daha sonra ImageJ açın ve dosyasını tıklatın | Açık sayısal için görüntü dosyası açmak için. Görüntü yükler sonra oval şekil seçim aracını ImageJ içinde faiz (ROI) bir bölge seçmek için kullanın.
- Bundan sonra tıklayın analiz | Ölçü floresan yoğunluğu için ki ROI ölçmek için. 4 – 5 farklı, odakta organellerin resim başına seçin ve faiz (ROI) her bölgede ortalama göreli floresan yoğunluğu hesaplayın.
- Her görüntü için arka plan floresan yoğunluğu arasında organellerin bağırsak bölgesinde ölçmek. Arka plan Floresans yoğunluk değerleri lizozomal Floresans yoğunluk değerleri üzerinden çıkarma.
- Toplamda, yaklaşık 30-50 normalleştirilmiş değerlerini cDCFDA yoğunluğu (6-10 hayvanlar) test edilen her zorlanma için ayrı ayrı toplamak. Bu değerler herhangi bir uygun istatistiksel yazılım kullanarak bir kutu ve bıyık arsa çizmek için kullanın.
Not: floresan yoğunluğu karşılaştırmalar yalnızca aynı boyama deneme sürecinde örnekleri içinde anlamlıdır öyle ki boyama önemli ölçüde sıcaklık, kuluçka süresi ve genel sağlık/yaş hayvan gibi faktörlere bağlı olarak değişebilir. Bu nedenle boyama her denemede denetimleri işlemek önemlidir. İstatistiksel farklar hesaplama (t-testleri) herhangi bir uygun istatistiksel yazılım kullanarak. - Görüntü tüm (aynı gün lekeli) aynı deneme görüntüleme parametrelerden birini değiştirmek için dikkat çekici sırayla suşları.
- 488/530 için ayarla uyarma/emisyon dalga boylarında kullanarak standart confocal mikroskop düşsel gerçekleştirmek nm cDCFDA için. Uçak bağırsak organellerin (değil Z-yığınlar) görüntülerini alın ve odak (maksimal sinyal yoğunluğu) yoğunluk miktar için çoğu organellerin kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
cDCFDA bir pH bağımlı şekilde organellerin lekeleri ve onun düşük pKa ve hazır Alım organellerin içine bir ideal pH sensör21yapar. cDCFDA yoğunluğu boyama lizozomal pH (Yani boyama yoğunluğu arttıkça pH azalır)18,22' ye ters orantılıdır. cDCFDA sinyalleri sürekli zayıf organellerin hayvanların klorokin, lizozomal asitleştirme bir inhibitörü 20 mM ile tedavi ve v-ATPaz, protein kompleksi için proton ithalat22 gereklidir organellerin membran üzerinde tükenmiş solucanlar . Bunlar diğer genetik arka planlar veya tedavi boyama cDCFDA göreli düzeylerini değerlendirirken kullanılacak önemli denetimlerdir.
Ayrıca açık hiçbir etkisi üzerinde fitness cDCFDA maruz kalma veya doğurganlık tedavi Worms (veri gösterilmez) bulun. Bu iletişim kuralını kullanan, post-reproductive vahşi türü Worms organellerin asitliği endojen bir kaybı tespit edilmiştir. 3 resimde görüldüğü gibi cDCFDA floresan sinyal genç (2 gün sonrası L4) organellerin içinde sağlam C. elegansacidified organellerin belirten, yeniden oluşturma. Boyama yoğunluğu oldukça eski (8 günlük yazı L4) solucanlar de olduğu gibi nerede proton akını içine bu organelleri azalır solucanlar (via nakavt vha genlerin v-ATPaz alt birimleri kodlama) içinde gözlemlediği gibi organellerin, alkalinization azaltır. Bu yöntemi kullanarak, lizozomal Asitlik fizyolojik bir kaybı post-reproductive hayvanlar ( Şekil 2, şekil 3Albümdeki Floresans diyagramında) bağırsak tespit ettik. İndirimli cDCFDA gün 8 (post-L4) bağırsaklarında alkalinized organellerin ve protein yetkisi içinde olası bir bozulma solucanlar işaret sinyali. Bu hayvanlar protein toplamları organellerin bu hayat sahne22içinde önemli ölçüde biriktikçe durum, bu aslında. Lumen de-asitleştirme bu süreçte rol doğrulamak için biz iki çekirdek bileşenleri v-ATPaz pompası makinaları (VHA-2 ve VHA-8), RNAi tarafından tüketilmiş ve bu nedenle düzgün proton içine almamalısınız hayvan üreten genç, ortak lekeli organellerin. Beklendiği gibi bu post-reproductive vahşi türü Worms karşılaştırılabilir ve alkalinized organellerin (şekil 3) ile tutarlı RNAi hayvanlar, vha-2 ve vha-8 üreme aşamasında bile, azaltılmış cDCFDA floresan sinyallerini gösterdi.
Şekil 1: slaytlar mikroskopi için hazırlanıyor. Mikroskopi için slayt hazırlamak için takip edilmesi gereken adımları gösteren bir basit adım adım şematik.
Resim 2: C. elegansbağırsak organellerin asitliği soruşturma için pH duyarlı boya kullanımı. Bağırsak cDCFDA floresan yoğunluğu şekillerinin (2 gün) üreten ve sonrası üreme (günde 8) solucan gösteren diyagram. Solucanları bütün. en iyi diyagramları gösterir Alt temsil kutularına Yakınlaştırılmış, midgut bölgesinin merkezinde intestinal Lümen diyagramları öngörülen. Organellerin veziküller büyüklüklerde bağırsak hücreleri sitoplazmada olarak tasvir edilir. Bu şematik diyagramları şekil 3 görüntüleri ile karşılaştırın.
Şekil 3: Resim Boyama cDCFDA. Temsili Resim 2 gün ve günde 8 (L4 sonrası) gösterilen cDCFDA ile lekeli C. elegans bağırsak organellerin (N2 vahşi türü) yanı sıra vha-2 ve vha-8 RNAi Worms bağırsak organellerin cDCFDA (pozitif kontrol) ile lekeli. vha-2 ve vha-8 katmaninin ATPaz (vATPase), lizozomal Lümen asitleştirme için sorumludur lizozomal membran astar proton pompa altbirimden kodlamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücresel ve moleküler olayları çeşitli katkıda bulunmak için yaşlanma, yaşam öyküsü özellikleri ve genetik faktörlerden etkilenir. Bizim son çalışma22 üreme döngüsü lizozomal pH dynamics düzenlenmesi aracılığıyla soma fitness denetlenmesinde önemli bir rol oynar öneriyor. Biz hayvanlar aktif olarak sırayla asidik organellerin sağlar v-ATPaz transkripsiyon upregulation tarafından yeniden iken o lizozomal aracılı proteolizis yükseltilir gösterdi. Üreme, v-ATPaz ifade damla, sonu üzerine organellerin alkalinize ve protein toplamları bu hücrelerinde birikir.
Lizozomal asitleştirme zarar bozuklukları değişmiş v-ATPaz aktivitesi tarafından neden olduğu gösterilmiştir ve v-ATPaz işlevi beyinde azalan Ayrıca çeşitli nörodejeneratif hastalıklar23altında yatan için önerilmiştir. Sonuçlarımız daha da hipotezini Engelli v-ATPaz işlevi hücresel yaşlanma ve yaşlanma24nedenleri arasında destekler.
Bir saytolojik yaşlanma hücreleri misfolded ve toplanan proteinler ilerici oluşumu eski hücreler1,25,26,27,28,29özelliğidir. Post-Reproductive C. elegansolduğu gibi benzer protein toplamları geçit memeli kültürlü lizozomal Lümen içinde geç bulunan27,29hücreleri. Organellerin autophagic yolu terminal bitiş noktası olduğundan, hasarlı proteinler ve organelleri alkalinized organellerin içine sürekli akını sonra diğerine yol açar bu organellerin fonksiyonel çöküşü sonuçlanan akla yatkın Sonuçta hücresel yaşlanma için katkıda aşağı akım olaylar.
Burada açıklanan protokol göreli Asitlik basit ve tekrarlanabilir değerlendirilmesi canlı bağırsak organellerin üretmek için tasarlanmış C. elegans. Dar pH aralığı (4,5-5) bu organelleri uygun proteolizis için gereklidir çünkü pH ince artışlar cep ve doku homeostazı17için dramatik sonuçları var. Floresans özellikleri ve cDCFDA düşük pka sağlar bu fizyolojik ilgili pH pencere18asitliği değişiklikleri yakalamak bu boya. Organellerin boyama için önerilen cDCFDA konsantrasyonu lizozomal pH bizim görüntü parametreleri ve görüntüleme sistemi bağlı olarak değişiklikler en iyi olası okuma sağlamak için optimize edilmiştir. Öyle olsa bile, cDCFDA boyama sonuçlarını cDCFDA boyama desen lizozomal pH değişiklikleri doğru yansıtılmamış öyle ki onların görüntüleme kurulumu temel alınarak farklı son kullanıcılar için farklı olabilir. Bu olursa, elbette eylem en iyi en cDCFDA (10-100 mM) konsantrasyonları farklı varyasyonları görüntüleme için optimum konsantrasyonu belirlemek için kullanmak üzere olurdu vahşi türü N2 solucanlar 2 gün ve günde 8 mesaj L4. İdeal cDCFDA konsantrasyon organellerin genç (2. gün sonrası L4) Worms verimli bir şekilde doygun olmadan lekeleri ama aynı zamanda eski (günde 8 mesaj L4) solucanlar için azalan bir boyama yoğunluk gösterir biridir.
Bir cDCFDA boyama tekniği sınırlamaları onun uzun bir kuluçka zamanı geldi. Solucanlar bir belirli zamanda noktada inkübe zaman, bu sonuçlar yalnızca ~ 24 h sonra görüntülenmeyecektir. Muhtemelen bir pH duyarlı fluorophore lizozomal membran protein öğesini kullanarak lizozomal pH, gerçek zamanlı bir okuma sağlayan C. elegans bir tür geliştirmek için daha verimli olacaktır.
Orada iken birkaç farklı teknikler C. elegans, bağırsak pH değerlendirmek için bu tekniklerin çoğu bağırsak pH bir bütün30, değerlendirmek ya da zaman alan vücut boşluğu içine enjeksiyon gerektirir ve hantal31. cDCFDA büyük ölçüde genetik ekranlar bu değiştirilmiş Haritayı lizozomal pH veya Fizyoloji C. elegans mutantlar için aramak için beslenme RNAi kitaplıklarını kullanma için kolayca uygulanabilir. CDCFDA kullanılan ve bir genç (2. gün sonrası L4) eklediğinizden emin konsantrasyon bu yöntemin yalnızca önemli yönleridir N2 denetim zorlanma confocal görüntüleme her oturumu sırasında yapılandırma için bir kriter olarak.
Yaşlanma için lizozomal pH katkısını daha iyi anlamak için farklı hücresel ve çevresel girişlerine yanıt lizozomal Asitlik düzenleyici mekanizmaları arkasında dinamik değişiklikleri incelemek önemli olacaktır. cDCFDA boyama C. elegansaraştırmada genişletmek için bir strateji olarak kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.
Acknowledgments
Caenorhabditis genetik Merkezi suşları, Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) ve Kanada Vakfı için yenilik (finansmanı için CFI) teşekkür etmek istiyorum. Dr. Lizhen tüm C. elegans deneyler için onun laboratuar İmkanları sınırsız kullanımına izin veren için Chen (hücre sistemleri bölümü ve anatomi, UT sağlık San Antonio) yanı sıra Dr Exing Wang (müdür, optik görüntüleme tesis teşekkür etmek istiyorum UT sağlık San Antonio) confocal mikroskobu konusunda yardım almak için. Biz de doktor Myron Ignatius destek ve video çekimi kolaylaştırmak için cesaret verdiğiniz için teşekkür ederiz istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OP50 (E. coli) | Caenorhabditis Genetics Center | Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| 5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate | ThermoFisher | C369 | Commonly known as cDCFDA |
| 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron | ThermoFisher | L7528 | Commonly known as Lysotracker Red |
| Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510) | |||
| ImageJ | Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| LB Broth powder | ThermoFisher | 22700041 | |
| Bacto Agar | Sigma | A5306-1KG | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | S71604 | |
| Cholesterol powder | Sigma | C3045 | |
| CaCl2 | Sigma | 449709 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| K3PO4 | Sigma | P5629 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover Slips | ThermoFisher | 3406 | |
| Agarose | Sigma | A6013 | |
| Incubator | |||
| Mirror or other smooth flat surface |
References
- Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants. Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).
- Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. Autophagy for the avoidance of neurodegeneration. Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).
- Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
- Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
- Cuervo, A. M., et al. Autophagy and aging: the importance of maintaining "clean" cells. Autophagy. 1 (3), 131-140 (2005).
- Harrington, A. J., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Caenorhabditis elegans as a model system for identifying effectors of alpha-synuclein misfolding and dopaminergic cell death associated with Parkinson's disease. Methods. 53 (3), 220-225 (2011).
- Muchowski, P. J. Protein misfolding, amyloid formation, and neurodegeneration: a critical role for molecular chaperones? Neuron. 35 (1), 9-12 (2002).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. Age-related decline in chaperone-mediated autophagy. J Biol Chem. 275 (40), 31505-31513 (2000).
- Tonoki, A., et al. Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process. Mol Cell Biol. 29 (4), 1095-1106 (2009).
- Squier, T. C. Oxidative stress and protein aggregation during biological aging. Exp Gerontol. 36 (9), 1539-1550 (2001).
- Sarkar, S., et al. Small molecules enhance autophagy and reduce toxicity in Huntington's disease models. Nat Chem Biol. 3 (6), 331-338 (2007).
- Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).
- Boya, P. Lysosomal function and dysfunction: mechanism and disease. Antioxid Redox Signal. 17 (5), 766-774 (2012).
- Kim, D. K., et al. Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function. Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).
- Vila, M., Bove, J., Dehay, B., Rodriguez-Muela, N., Boya, P. Lysosomal membrane permeabilization in Parkinson disease. Autophagy. 7 (1), 98-100 (2011).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. How do intracellular proteolytic systems change with age? Front Biosci. 3, d25-d43 (1998).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. When lysosomes get old. Exp Gerontol. 35 (2), 119-131 (2000).
- Gachet, Y., Codlin, S., Hyams, J. S., Mole, S. E. btn1, the Schizosaccharomyces pombe homologue of the human Batten disease gene CLN3, regulates vacuole homeostasis. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5525-5536 (2005).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Preston, R. A., Murphy, R. F., Jones, E. W. Assay of vacuolar pH in yeast and identification of acidification-defective mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (18), 7027-7031 (1989).
- Pringle, J. R., et al. Fluorescence microscopy methods for yeast. Methods Cell Biol. 31, 357-435 (1989).
- Baxi, K., Ghavidel, A., Waddell, B., Harkness, T. A., de Carvalho, C. E. Regulation of Lysosomal Function by the DAF-16 Forkhead Transcription Factor Couples Reproduction to Aging in Caenorhabditis elegans. Genetics. 207 (1), 83-101 (2017).
- Colacurcio, D. J., Nixon, R. A. Disorders of lysosomal acidification-The emerging role of v-ATPase in aging and neurodegenerative disease. Ageing Res Rev. 32, 75-88 (2016).
- Kang, H. T., et al. Chemical screening identifies ATM as a target for alleviating senescence. Nat Chem Biol. 13 (6), 616-623 (2017).
- Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death. Nature. 431 (7010), 805-810 (2004).
- Brunk, U. T., Terman, A. The mitochondrial-lysosomal axis theory of aging: accumulation of damaged mitochondria as a result of imperfect autophagocytosis. Eur J Biochem. 269 (8), 1996-2002 (2002).
- Gerland, L. M., et al. Autolysosomes accumulate during in vitro CD8+ T-lymphocyte aging and may participate in induced death sensitization of senescent cells. Exp Gerontol. 39 (5), 789-800 (2004).
- Poon, H. F., Vaishnav, R. A., Getchell, T. V., Getchell, M. L., Butterfield, D. A. Quantitative proteomics analysis of differential protein expression and oxidative modification of specific proteins in the brains of old mice. Neurobiol Aging. 27 (7), 1010-1019 (2006).
- Yin, D. Biochemical basis of lipofuscin, ceroid, and age pigment-like fluorophores. Free Radic Biol Med. 21 (6), 871-888 (1996).
- Nehrke, K. A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span. J Biol Chem. 278 (45), 44657-44666 (2003).
- Chakraborty, K., Leung, K., Krishnan, Y. High lumenal chloride in the lysosome is critical for lysosome function. Elife. 6, (2017).
