Summary
Een stapsgewijze handleiding sonde verlies van lysosomale zuurtegraad in de darm van C. elegans met behulp van de pH-gevoelige vitale kleurstof 5 (6) - carboxy - 2', 7'-dichlorofluorescein-DIACETAAT (cDCFDA)
Abstract
De nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een modelsysteem dat veel gebruikt wordt om te studeren, lange levensduur en ontwikkelings trajecten. Dergelijke studies worden gefaciliteerd door de transparantie van het dier, de mogelijkheid om te vooruit en achteruit genetische tests, het relatieve gemak van genereren fluorescently geëtiketteerde eiwitten, en het gebruik van fluorescente kleurstoffen die kan worden microinjected in de vroege embryo of opgenomen in zijn voedsel (E. coli stam OP50) op het etiket van cellulaire organellen (bijvoorbeeld 9-diethylamino-5 H-benzo (a) phenoxazine-5-één en (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} - N - [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Hier presenteren we het gebruik van een fluorescente kleurstof van pH-gevoelige die vlekken intestinale lysosomen, voorzien van een visuele uitlezing van dynamische, fysiologische veranderingen in lysosomale zuurgraad in levende wormen. Dit protocol niet lysosomale pH meet, maar wil liever een betrouwbare methode voor de beoordeling van de fysiologische relevante varianten in lysosomale zuurgraad. cDCFDA is een cel-permeant verbinding die wordt geconverteerd naar de fluorescerende fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) na hydrolyse door intracellulaire esterasen. Protonering binnen lysosomen overlapt cDCF in deze organellen, waar het zich ophoopt. Als gevolg van zijn lage pKa van 4.8, is deze kleurstof gebruikt als een pH sensor in gist. Hier beschrijven we het gebruik van cDCFDA als een voedingssupplement te beoordelen van de zuurgraad van intestinale lysosomen in C. elegans. Deze techniek zorgt voor de detectie van alkalinizing lysosomen in levende dieren in, en heeft een breed scala van experimentele toepassingen met inbegrip van studies over autophagy, veroudering en lysosomale biogenese.
Introduction
Het uiterlijk van eiwit-aggregaten is algemeen aanvaard als een kenmerk van veroudering in eukaryote cellen1,2,3, en de vorming van die wordt beschouwd als onder de bestuurders van het principe van cellulaire senescentie4 , 5 , 6 , 7. er zijn steeds meer aanwijzingen dat leeftijd cellen, eiwit katabolisme bijzondere waardevermindering heeft ondergaan is, wat leidt tot een toename van de aggregatie van eiwitten. De ineenstorting van proteolyse in de veroudering van de cellen impliceert een bijzondere waardevermindering van autophagy8 evenals proteasoom-gemedieerde eiwit afbraak9. Ten slotte, onomkeerbare eiwit oxidatie wordt verhoogd in oude cellen, verder afbreuk te doen aan eiwit katabolisme10.
Autophagy was in eerste instantie dacht dat een niet-selectieve proces voor bulk afbraak van beschadigde eiwitten, maar recente studies hebben aangegeven dat autophagy is zeer selectief aan het katabolisme van eiwit-aggregaten en disfunctionele organellen die niet vatbaar voor afbraak via andere eiwit klaring mechanismen11. Tijdens het proces van autophagy, zijn beschadigde en geaggregeerde eiwitten afgezonderd in een dubbel-membraan blaasje genaamd de autophagosome. Dit autophagosome vervolgens combineert met de zure organellen genaamd lysosomen, die leidt tot aantasting van de lading autophagosome12. Lysosomen vertegenwoordigen het eindpunt van het autophagic traject en deelnemen aan verschillende cellulaire processen zoals membraan reparatie, transcriptionele controle en nutriënten sensing; markeren hun centrale rol in de cellulaire homeostase (herzien in ref. 13). Verschillende studies hebben een associatie tussen een leeftijd afhankelijke daling in lysosomale functie en verschillende neurodegeneratieve aandoeningen13aangetoond. Consequent, kan herstel van de lysosomale functie in oudere cellen vertragen het ontstaan van veroudering-gerelateerde fenotypen14,15. Studies van de samenstelling van de intralumen kring suggereren dat de ineenstorting van de lysosomale functie in oudere cellen niet te wijten aan een vermindering van de productie van lysosomale proteasen16 is. Er wordt ook geopperd dat verlies van intralysosomal zuurgraad, een kritieke eis van de enzymatische activiteit, de daling lysosoom-gemedieerde proteolyse17ten grondslag kan liggen. Om te kunnen verkennen deze hypothese, is het essentieel om reagentia en protocollen om te sonderen dynamische veranderingen in lysosomale pH in levende cellen in een repliceerbare en consistente manier te ontwikkelen.
De darm van C. elegans is het belangrijke metabole weefsel in wormen en is een kritische regelgever van systemische homeostase en levensduur. Hebben we testen om te evalueren van de veranderingen in de zuurgraad van het lumen van de darm lysosomen van wormen om te bepalen hoe lysosoom-gemedieerde proteolyse bijdraagt aan veroudering. Hoewel pH-gevoelige fluorophores hebben eerder is gebruikt in C. elegans om te markeren van intestinale lysosomen, is er nog niet een poging om een succesvolle protocol dat kleine stijgingen in lysosomale pH in vivo18. detecteren kan Wij bieden hier, een protocol dat kan worden gebruikt voor het detecteren van verlies van lysosomale zuurgraad in de intestinale cellen van C. elegans met behulp van een eenvoudige en handige voeding protocol waarin een pH-gevoelige fluorophore (cDCFDA) in OP50 voedsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vlekken en intestinale lysosomen Image
- Zaad nematode groei media (NGM) platen met OP50
- Bereiden van NGM platen volgens de aanbevolen protocol19 en laat de gesloten platen voor 2 dagen bij kamertemperatuur drogen.
- Inoculeer OP50 bacteriën in steriele Luria Bouillon (LB) Bouillon en groeien in een schudden incubator of water bad bij 37 ° C gedurende 36 uur of totdat de OD tussen 0,2 en 0.4 is. Vermijd het gebruik van een bacteriële cultuur met OD > 1 of OD < 0.2.
- Zodra NGM platen droog zijn, breng een druppel (~ 30 µL) van OP50 entmateriaal in het midden van de plaat, en verspreidde zich vervolgens de daling in een patch ongeveer 2 cm x 2 cm groot.
Opmerking: Alle resterende OP50 entmateriaal kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal een maand. - Omkeren van de platen OP50 zodra het entmateriaal is opgedroogd (ongeveer 10 of 15 min), en vervolgens Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 36 h.
- Na 36 h, verwijder de platen uit de incubator en winkel bij 4 ° C tot later opnieuw kunt gebruiken.
Opmerking: De platen moet goed voor maximaal 1 maand bij 4 ° C.
- Ter aanvulling van cDCFDA naar OP50
- Ter aanvulling van cDCFDA op OP50 platen, bereiden een voorraad van de werken van 10 mM cDCFDA in dimethylsulfoxide (DMSO). Bewaar de oplossing van de cDCFDA beschermd tegen licht en opslag bij-20 ° C voor later gebruik.
- Voorzichtig plaats 100 µL van 10 mM cDCFDA oplossing op het oppervlak van de 2 cm x 2 cm OP50 patch, zodanig dat de gehele patch gelijkmatig met cDCFDA bedekt is.
Opmerking: Het is zeer belangrijk dat de gehele patch van OP50 met cDCFDA bedekt is. Indien nodig, gebruik maximaal 150 µL van cDCFDA voor elke plaat. Het is ook noodzakelijk dat de cDCFDA oplossing niet buiten de grenzen van de OP50 patch, geldt aangezien elke cDCFDA die uit de OP50-patch stroomt niet zal worden opgenomen in de voedselketen, en in een verminderde kleuring intensiteit resulteren zal. - Plaats de platen OP50 in een donkere kast op de top van de bank totdat alle van de cDCFDA oplossing wordt geabsorbeerd in de bacteriële patch (meestal ongeveer 25 tot 30 minuten).
- Kleuring van wormen met behulp van cDCFDA
- Zodra de cDCFDA de OP50 patch volledig doordrongen heeft, plaats van niet meer dan 20 wormen per plaat en Incubeer de platen bij 20 ° C gedurende ten minste 14 h omgekeerd.
Opmerking: Het is aanbevolen om de plaats van de cDCFDA platen in een ondoorzichtige vak om te minimaliseren van de blootstelling aan licht. - Voor de bediening voor inname verschillen tussen experimenten en te normaliseren cDCFDA signalen, aanbevolen () mede vlek met 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)) difluoro) boor (2,5 µL van een vers bereide 1 mM-oplossing), een acidotropic zwak amine kleurstof waarvan fluorescentie grotendeels niet-variant het zure pH-spectrum is (Zie Tabel van materialen voor gemeenschappelijke namen van reagentia).
Opmerking: Geen vlekken wormen voor minder dan 14 h aangezien dit kan onvoldoende cDCFDA kleuring intensiteit bieden en een valse interpretatie van lysosomale pH.
- Zodra de cDCFDA de OP50 patch volledig doordrongen heeft, plaats van niet meer dan 20 wormen per plaat en Incubeer de platen bij 20 ° C gedurende ten minste 14 h omgekeerd.
- Dia's voorbereiden microscopie
- Plaats twee evenwijdige stroken van labeling tape ongeveer 3 inch uit elkaar op een gladde vlakke ondergrond, zoals een spiegel (Figuur 1).
- Coat het oppervlak van de spiegel met waterafstotende spray en veeg overtollige vloeistof af.
- Smelt 2% agarose (opgelost in gedestilleerd H2O) in de magnetron totdat volledig vloeibaar gemaakt, dan plaatst u een 50 µL druppel agarose tussen de twee stroken tape en snel dekken de daling met een microscoopglaasje, zodanig dat de dia loodrecht op de stroken staat tape. Nadat de agarose is gestold, vormen een cirkelvormig pad onder de dia, de dia flipover en voeg 10 à 15 µL van 5mM natriumazide (NaN3) op de agarose pad.
Opmerking: NaN3 is een inhibitor van cytochroom C dat wanneer gebruikt in lage concentraties, omkeerbaar anesthetizes wormen zodat ze zal niet worden verplaatst tijdens imaging. - Kies wormen uit de plaat van de OP50 aangevuld met cDCFDA, en deze overbrengen naar een schone NGM plaat zonder enige OP50. Toestaan dat de wormen te bewegen voor een paar seconden om het merendeel van de OP50 van het oppervlak van de wormen worden verwijderd, en vervolgens de wormen overbrengen in de agarose pad met 5 mM natriumazide.
- Onmiddellijk dekken de agarose pad met een cover slip. Zorg ervoor dat zachtjes plaats de cover slip zonder teveel druk, toe te passen, aangezien dit kan resulteren in wormen barsten.
Opmerking: OP50 bacteriën aangevuld met cDCFDA lichten wanneer gevisualiseerd door microscopie, daarom is het belangrijk om de wormen zo goed mogelijk schoon alvorens ze te plaatsen op de agarose pad met natriumazide. Als prepping meer dan 6 stammen van C. elegans (met inbegrip van N2, wild type controle), is het raadzaam om voor te bereiden van de monsters in batches van 6, om ervoor te zorgen dat de wormen niet voort naar de agarose stempelkussen doen uitdrogen. In sommige stammen begint de vulva te scheuren na langere tijd als gevolg van druk van de cover slip, dus het is belangrijk om het plan dienovereenkomstig.
- Confocale microscopie
Opmerking: Sommige microscopen hebben een ingebouwde functie die automatisch verhoogt de intensiteit van de fluorescentie te compenseren voor verschillende niveaus van fluorescentie. Deze Microscopen werken mogelijk niet goed voor imaging wormen gekleurd met cDCFDA, aangezien ze inherent de intensiteit van de fluorescentie van monsters toenemen zal.- Uitvoeren van imaging op een norm confocal microscoop met behulp van excitatie/emissie golflengten ingesteld op 488/530 nm voor de cDCFDA. Neem enkel vliegtuig beelden (niet Z-stacks) van intestinale lysosomen en gebruik van alleen lysosomen zijn in focus (maximale signaal intensiteit) voor de kwantificering van de intensiteit.
Opmerking: Misschien vanwege verschillen in de beschikbaarheid van de kleurstof, lysosomen van de intestinale cellen rechtstreeks posterieure naar de farynx handhaven cDCFDA kleuring intensiteit ongeacht genotype of leeftijd, dus zorg moet worden genomen om te voorkomen imaging lysosomen in deze cellen. - Het imago van de dia met 2 dag oud wild type die N2 eerst wormen. Terwijl doen, pas de confocal imaging parameters zoals laser macht pinhole en diafragma om ervoor te zorgen dat de cDCFDA kleuring intensiteit niet is oververzadigd.
Opmerking: Zodra deze instellingen zijn ingesteld, niet wijzigt voor de gehele duur van de beeldvorming voor die dag. - 1024 x 1024 pixel foto's vastleggen van een enkel vliegtuig van darm (3 tot en met 4 beelden per worm) met behulp van een 60 X vergroting lens.
Opmerking: Het emissiespectrum van de cDCFDA in wormen levert een enkele prominente piek op 520 nm samenvalt met de gerapporteerde fluorescentie spectrum20, leveren een uitlezing voor specifieke signaal dat verschilt van intestinale autofluorescence (Figuur 3). - Confocale raw-afbeeldingen (.lsm bestanden) exporteren als TIFF-bestanden voor elk kanaal.
- Volgende, open ImageJ en klik op bestand | Open te openen het afbeeldingsbestand worden gekwantificeerd. Zodra de afbeelding is geladen, gebruikt u het ovale vorm-gereedschap in ImageJ om een gebied van belang (ROI) te selecteren.
- Daarna, klik op de Analyze | Maatregel te kwantificeren van de intensiteit van de fluorescentie voor dat ROI. 4 – 5 verschillende in-focus lysosomen per afbeelding selecteren en de intensiteit van de gemiddelde relatieve fluorescentie van elke regio van belang (ROI) berekenen.
- Voor elke afbeelding, meet de intensiteit van de fluorescentie achtergrond in een regio van de darm tussen lysosomen. Aftrekken van de achtergrond fluorescentie intensiteitswaarden van de intensiteitswaarden lysosomale fluorescentie.
- Verzamelen in totaal ongeveer 30 tot 50 afzonderlijke genormaliseerde waarden voor cDCFDA intensiteit (6 tot 10 dieren) voor elke stam wordt getest. Deze waarden kunnen worden uitgezet op een perceel van het vak en friemeltje met behulp van passende statistische software gebruiken.
Opmerking: Kleuring kan aanzienlijk variëren afhankelijk van factoren zoals temperatuur, incubatietijd en de algehele gezondheid/leeftijd van dieren zodanig dat fluorescentie intensiteit vergelijkingen alleen relevant is binnen monsters proces in hetzelfde kleuring experiment zijn. Het is daarom belangrijk voor het verwerken van besturingselementen in elke kleuring experiment. Berekenen van de statistische verschillen (t-tests) met behulp van passende statistische software. - Afbeelding alle stammen uit hetzelfde experiment (gekleurd op dezelfde dag) in volgorde, als u niet wilt wijzigen van de imaging parameters verzorgen.
- Uitvoeren van imaging op een norm confocal microscoop met behulp van excitatie/emissie golflengten ingesteld op 488/530 nm voor de cDCFDA. Neem enkel vliegtuig beelden (niet Z-stacks) van intestinale lysosomen en gebruik van alleen lysosomen zijn in focus (maximale signaal intensiteit) voor de kwantificering van de intensiteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
cDCFDA vlekken lysosomen in een pH-afhankelijke manier, en de lage pKa en klaar opname in de lysosomen maakt het een ideale pH sensor21. cDCFDA kleuring intensiteit is omgekeerd evenredig met de lysosomale pH (d.w.z. kleuring intensiteit toeneemt als pH daalt)18,22. cDCFDA signalen zijn consequent zwak in de lysosomen van dieren die zijn behandeld met 20 mM van chloroquine, een inhibitor van de omwenteling van de lysosomale verzuring en wormen uitgeput van v-ATPase, het eiwit complex op het membraan van lysosomen die nodig is voor het importeren van de proton22 . Dit zijn belangrijke besturingselementen gebruiken bij de beoordeling van de relatieve hoeveelheid cDCFDA vlekken in andere genetische achtergronden of behandelingen.
Ook vinden we geen openlijke effecten van blootstelling aan cDCFDA op de geschiktheid of de vruchtbaarheid van behandelde wormen (gegevens niet worden weergegeven). Met behulp van dit protocol, we geïdentificeerd een endogene verlies van zuren in de lysosomen van post-reproductive wild type wormen. Zoals blijkt uit figuur 3, het signaal van de fluorescentie cDCFDA is robuust in de lysosomen van jongeren (2 dagen post L4) reproduceren C. elegans, betekenende aangezuurde lysosomen. De intensiteit van kleuring vermindert aanzienlijk Na alkaliseren van lysosomen, zoals waargenomen in oude (8-daagse post L4) wormen zo goed zoals wormen waar de proton-instroom in deze organellen is verminderd (via knockdown van vha genen coderend voor v-ATPase subeenheden). Met behulp van deze methode, wij een fysiologische verlies van lysosomale zuurgraad gedetecteerd in de darm van post-reproductive dieren (diagram in Figuur 2, fluorescentie afbeeldingen in Figuur 3). De verminderde cDCFDA signaal in de darmen van dag 8 (post-L4) wormen waarnaar gealkaliniseerd lysosomen en een mogelijke bijzondere waardevermindering bij eiwit goedkeuring. Dit is in feite het geval, aangezien deze dieren aanzienlijk eiwit-aggregaten binnen lysosomen in dit leven stadium22 accumuleren. Voor het valideren van een rol van ontzuring van het lumen in dit proces, wij mede gekleurd jonge, dieren die had uitgeput door RNAi van twee basisonderdelen van de v-ATPase-pomp-machine (VHA-2 en VHA-8) en derhalve goed Importeer geen protonen in reproduceren Lysosomen. Zoals verwacht, vha-2 en vha-8 RNAi dieren, zelfs op de reproductieve fase, toonde verminderde cDCFDA fluorescentie signalen vergelijkbaar zijn met die van post-reproductive wild type wormen en in overeenstemming met gealkaliniseerd lysosomen (Figuur 3).
Figuur 1: dia's voorbereiden microscopie. Een eenvoudige stapsgewijze schema toont de stappen moet worden gevolgd ter voorbereiding van de dia's van de microscopie.
Figuur 2: Gebruik van pH-gevoelige kleurstoffen sonde zuurgraad in de intestinale lysosomen van C. elegans. Diagram met de patronen van intestinale cDCFDA fluorescentie intensiteit in reproduceren (dag 2) en na reproductieve (dag 8) wormen. De bovenste telpatronen geven hele wormen. De vakken in de bodem vertegenwoordigen ingezoomd, geprojecteerd diagrammen van de middendarm regio, de intestinale lumen in het midden. Lysosomen worden afgeschilderd als blaasjes van wisselende grootte in het cytoplasma van intestinale cellen. Vergelijk deze schematische diagrammen met Figuur 3 beelden.
Figuur 3: cDCFDA kleuring beelden. Representatieve afbeeldingen tonen van dag 2 en dag 8 (post L4) C. elegans intestinale lysosomen (N2 wild type) gekleurd met cDCFDA evenals intestinale lysosomen van vha-2 en vha-8 RNAi wormen gekleurd met cDCFDA (positieve controle). VHA-2 en vha-8 coderen subeenheden van de vacuolar ATPase (vATPase), de protonpomp voering van de lysosomale membraan die verantwoordelijk is voor de verzuring van de lysosomale lumen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een verscheidenheid van cellulaire en moleculaire gebeurtenissen bijdragen aan veroudering, beïnvloed door levensgeschiedenis karaktertrekken en genetische factoren. Onze recente studie22 suggereert dat de reproductieve cyclus een belangrijke rol speelt bij de controle van de geschiktheid van het soma door middel van de verordening van lysosomale pH dynamiek. We toonden dat lysosomal-gemedieerde proteolyse wordt bevorderd terwijl dieren actief reproduceren door opregulatie van v-ATPase transcriptie, die op zijn beurt zorgt voor een zuur lysosomen. Aan het einde van de reproductie, v-ATPase expressie druppels, lysosomen alkalinize en eiwit-aggregaten accumuleren in deze cellen.
Aandoeningen die afbreuk doen aan lysosomale verzuring is aangetoond dat ze worden veroorzaakt door gewijzigde v-ATPase activiteit en dalende v-ATPase functie in de hersenen is ook voorgesteld aan ten grondslag liggen aan diverse neurodegeneratieve ziekten23. Verder onze resultaten ondersteunen de hypothese dat verminderde v-ATPase-functie is een van de oorzaken van cellulaire senescentie en veroudering24.
Een cytologische kenmerk van verouderende cellen is de geleidelijke vorming van misfolded en geaggregeerde eiwitten in oude cellen1,25,26,27,28,29. Zoals in post-reproductive C. eleganscellen vergelijkbaar eiwit aggregaten zijn te vinden in de lysosomale lumen laat passage zoogdier gekweekte27,29. Aangezien lysosomen het terminal eindpunt van het autophagic traject, is het aannemelijk dat de voortdurende toestroom van beschadigde eiwitten en organellen in gealkaliniseerd lysosomen in de functionele ineenstorting van deze lysosomen, wat vervolgens tot andere leidt resultaten stroomafwaarts gebeurtenissen die uiteindelijk aan cellulaire senescentie bijdragen.
Het protocol hier beschreven is ontworpen voor het genereren van een eenvoudige en reproduceerbare beoordeling van de relatieve zuurgraad in de intestinale lysosomen van live C. elegans. Omdat een smal pH bereik (4,5-5) is vereist in deze organellen voor juiste proteolyse, subtiele verhoging pH dramatische gevolgen hebben voor cellulaire en weefsel homeostase17. De fluorescentie kenmerken en lage pka van cDCFDA kunt deze kleurstof om wijzigingen vast te leggen in de zuurgraad in deze fysiologisch relevante pH venster18. De concentratie van cDCFDA aanbevolen voor kleuring lysosomen is geoptimaliseerd om de best mogelijke uitlezing van veranderingen in lysosomale pH op basis van onze imaging parameters en imaging systeem. Zelfs zo, kunnen de resultatenvan cDCFDA kleuring variëren voor verschillende eindgebruikers op basis van hun beeldvorming instellen zodanig dat lysosomal pH wijzigingen niet nauwkeurig te in het cDCFDA kleuring patroon zien mogelijk. Als dit gebeurt, de beste cursus van actie zou moeten gebruiken van variërend van de concentraties van cDCFDA (10-100 mM) om te bepalen van de optimale concentratie voor imaging-variaties in wild type N2 wormen op dag 2 en dag 8 post L4. De ideale cDCFDA concentratie is één die vlekken lysosomen van jonge (dag 2 post L4) wormen efficiënt zonder wordt oververzadigd maar toont ook een verminderde kleuring intensiteit voor de oude (dag 8 post L4) wormen.
Een van de beperkingen van de cDCFDA kleuring techniek is de lange incubatietijd. Wanneer wormen worden geïncubeerd op een bepaald tijdstip, kunnen de resultaten pas na ~ 24 h worden gevisualiseerd. Het zou efficiënter te ontwikkelen van een stam van C. elegans waarmee een real-time uitlezing van lysosomale pH, vermoedelijk met behulp van een pH-gevoelige fluorophore gelabeld aan een lysosomale membraan eiwit.
Terwijl er een paar verschillende technieken voor de beoordeling van de pH in de darm van C. elegans, meeste van deze technieken beoordelen de pH van de darm als een hele30, of injectie in de lichaamsholte, vereisen dat is tijdrovend en omslachtige31. cDCFDA kan gemakkelijk worden toegepast voor grootschalige genetische schermen voeding RNAi bibliotheken gebruiken om te zoeken naar C. elegans mutanten die Toon veranderd lysosomale pH of fysiologie. De alleen bij kritieke aspecten van deze methode zijn de concentratie van cDCFDA gebruikt en controleren of het opnemen van een jonge (dag 2 post L4) N2 controlestam als benchmark voor het configureren van de confocal imaging tijdens elke sessie.
Om de bijdrage van lysosomale pH aan veroudering beter te begrijpen, is het belangrijk om te ontleden de regulerende mechanismen achter de dynamische veranderingen in lysosomale zuurgraad in reactie op de verschillende ingangen van de cellulaire en milieu. cDCFDA kleuring kan worden gebruikt als een strategie om dit onderzoek in C. elegans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Acknowledgments
We zouden graag bedanken het Caenorhabditis genetica Center for stammen, the Natural Sciences and Engineering Research Raad (NSERC), en de Stichting van Canada voor innovatie (CFI) voor financiering. Wij zouden graag willen bedanken Dr. Lizhen Chen (departement van Cell Systems en anatomie, UT gezondheid San Antonio) voor het toestaan van onbeperkt gebruik van haar lab voorzieningen voor alle C. elegans experimenten evenals Dr. Exing Wang (Associate Director, optische Imaging faciliteit UT gezondheid San Antonio) voor hulp bij confocale microscopie. Ook bedank we Dr Myron Ignatius voor het verstrekken van steun en aanmoediging om de video-shoot.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OP50 (E. coli) | Caenorhabditis Genetics Center | Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| 5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate | ThermoFisher | C369 | Commonly known as cDCFDA |
| 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron | ThermoFisher | L7528 | Commonly known as Lysotracker Red |
| Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510) | |||
| ImageJ | Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| LB Broth powder | ThermoFisher | 22700041 | |
| Bacto Agar | Sigma | A5306-1KG | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | S71604 | |
| Cholesterol powder | Sigma | C3045 | |
| CaCl2 | Sigma | 449709 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| K3PO4 | Sigma | P5629 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover Slips | ThermoFisher | 3406 | |
| Agarose | Sigma | A6013 | |
| Incubator | |||
| Mirror or other smooth flat surface |
References
- Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants. Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).
- Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. Autophagy for the avoidance of neurodegeneration. Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).
- Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
- Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
- Cuervo, A. M., et al. Autophagy and aging: the importance of maintaining "clean" cells. Autophagy. 1 (3), 131-140 (2005).
- Harrington, A. J., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Caenorhabditis elegans as a model system for identifying effectors of alpha-synuclein misfolding and dopaminergic cell death associated with Parkinson's disease. Methods. 53 (3), 220-225 (2011).
- Muchowski, P. J. Protein misfolding, amyloid formation, and neurodegeneration: a critical role for molecular chaperones? Neuron. 35 (1), 9-12 (2002).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. Age-related decline in chaperone-mediated autophagy. J Biol Chem. 275 (40), 31505-31513 (2000).
- Tonoki, A., et al. Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process. Mol Cell Biol. 29 (4), 1095-1106 (2009).
- Squier, T. C. Oxidative stress and protein aggregation during biological aging. Exp Gerontol. 36 (9), 1539-1550 (2001).
- Sarkar, S., et al. Small molecules enhance autophagy and reduce toxicity in Huntington's disease models. Nat Chem Biol. 3 (6), 331-338 (2007).
- Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).
- Boya, P. Lysosomal function and dysfunction: mechanism and disease. Antioxid Redox Signal. 17 (5), 766-774 (2012).
- Kim, D. K., et al. Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function. Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).
- Vila, M., Bove, J., Dehay, B., Rodriguez-Muela, N., Boya, P. Lysosomal membrane permeabilization in Parkinson disease. Autophagy. 7 (1), 98-100 (2011).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. How do intracellular proteolytic systems change with age? Front Biosci. 3, d25-d43 (1998).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. When lysosomes get old. Exp Gerontol. 35 (2), 119-131 (2000).
- Gachet, Y., Codlin, S., Hyams, J. S., Mole, S. E. btn1, the Schizosaccharomyces pombe homologue of the human Batten disease gene CLN3, regulates vacuole homeostasis. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5525-5536 (2005).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Preston, R. A., Murphy, R. F., Jones, E. W. Assay of vacuolar pH in yeast and identification of acidification-defective mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (18), 7027-7031 (1989).
- Pringle, J. R., et al. Fluorescence microscopy methods for yeast. Methods Cell Biol. 31, 357-435 (1989).
- Baxi, K., Ghavidel, A., Waddell, B., Harkness, T. A., de Carvalho, C. E. Regulation of Lysosomal Function by the DAF-16 Forkhead Transcription Factor Couples Reproduction to Aging in Caenorhabditis elegans. Genetics. 207 (1), 83-101 (2017).
- Colacurcio, D. J., Nixon, R. A. Disorders of lysosomal acidification-The emerging role of v-ATPase in aging and neurodegenerative disease. Ageing Res Rev. 32, 75-88 (2016).
- Kang, H. T., et al. Chemical screening identifies ATM as a target for alleviating senescence. Nat Chem Biol. 13 (6), 616-623 (2017).
- Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death. Nature. 431 (7010), 805-810 (2004).
- Brunk, U. T., Terman, A. The mitochondrial-lysosomal axis theory of aging: accumulation of damaged mitochondria as a result of imperfect autophagocytosis. Eur J Biochem. 269 (8), 1996-2002 (2002).
- Gerland, L. M., et al. Autolysosomes accumulate during in vitro CD8+ T-lymphocyte aging and may participate in induced death sensitization of senescent cells. Exp Gerontol. 39 (5), 789-800 (2004).
- Poon, H. F., Vaishnav, R. A., Getchell, T. V., Getchell, M. L., Butterfield, D. A. Quantitative proteomics analysis of differential protein expression and oxidative modification of specific proteins in the brains of old mice. Neurobiol Aging. 27 (7), 1010-1019 (2006).
- Yin, D. Biochemical basis of lipofuscin, ceroid, and age pigment-like fluorophores. Free Radic Biol Med. 21 (6), 871-888 (1996).
- Nehrke, K. A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span. J Biol Chem. 278 (45), 44657-44666 (2003).
- Chakraborty, K., Leung, K., Krishnan, Y. High lumenal chloride in the lysosome is critical for lysosome function. Elife. 6, (2017).
