Summary
Det overordnede målet med polysome profilering teknikk er analyse av translasjonsforskning aktivitet individuelle mRNAs eller transcriptome mRNAs under proteinsyntese. Metoden er viktig for studier av protein syntese regulering, oversettelse aktivisering og undertrykkelse i helse og flere menneskelige sykdommer.
Abstract
Riktig protein uttrykk til rett tid og i riktige mengder er grunnlaget for normal celle funksjon og overlevelse i et raskt skiftende miljø. I lang tid, ble gene expression studiene dominert av forskning på transcriptional nivå. Imidlertid stabil nivåene av mRNAs samsvarer ikke med protein produksjon, og translatability av mRNAs varierer sterkt avhengig av forholdene. I noen organismer, som parasitten Leishmania, er det protein uttrykket regulert hovedsakelig på translasjonsforskning nivå. Nyere studier har vist at protein oversettelsen feilregulering er knyttet til kreft, metabolsk, nevrodegenerative og andre menneskelige sykdommer. Polysome profilering er en kraftig metode å studere protein oversettelsen regulering. Det kan måle translasjonsforskning statusen for individuelle mRNAs eller undersøke oversettelse i genomet-bred skala. Grunnlaget for denne teknikken er separasjon av polysomes, ribosomer, tillates underorganisasjoner og gratis mRNAs under sentrifugering av en cytoplasmatiske lysate gjennom sukrose gradering. Her presenterer vi en universell polysome profilering protokollen brukes på tre forskjellige modeller - parasitten Leishmania store, kultivert menneskelige celler og dyr vev. Leishmania cellene vokse fritt i suspensjon og kultivert menneskelige celler vokse i tilhenger monolayer, mens mus testikkel representerer en dyr Vevsprøve. Dermed er teknikken tilpasset alle disse kildene. Protokollen for analyse av polysomal fraksjoner inneholder påvisning av individuelle mRNA nivåer av RT-qPCR, proteiner ved Western blot og analyse av ribosomal RNAs av geleelektroforese. Metoden kan fremme utbygget av undersøkelse av mRNAs tilknytning ribosom på transcriptome nivå av dyp RNA-seq og analyse av ribosom-assosiert proteiner av masse spektroskopi av fraksjoner. Metoden kan enkelt justeres til andre biologiske modeller.
Introduction
Regulering av genuttrykk i celler styres av transcriptional, posttranscriptional og posttranslational. Fremskritt i dyp RNA sekvensering tillate studiet av stabil mRNA nivåer i genomet-bred skala på et enestående nivå. Men avslørte nyere funn at stabil mRNA nivå ikke alltid samsvarer med protein produksjon1,2. Skjebnen til en individuell transkripsjon er svært kompleks og avhenger av mange faktorer som interne/eksterne stimuli, stress, osv. Regulering av genuttrykk under proteinsyntese gir et annet lag uttrykket kontroll nødvendig for en rask reaksjon på skiftende forhold. Polysome (eller "polyribosome") profilering, separasjon og visualisering aktivt oversette ribosomer, er en kraftig metode å studere regulering av proteinsyntese. Selv om sin første eksperimentelle søknadene dukket opp i 1960-tallet3, er polysome profilering en av de viktigste teknikkene i protein oversettelsen studier4. Enkelt mRNAs kan oversettes av flere ribosom fører til dannelsen av en polysome. Utskrifter kan bli stoppet på ribosomer med gapestokk5 og mRNAs som inneholder forskjellig antall polysomes kan skilles under polysome fraksjoneres av sukrose gradient ultracentrifugation6,7 , 8 , 9. RNA analyse av polysomal fraksjoner så lar måling av endringer i individuelle mRNAs translasjonsforskning statene på genomet-bred skala og under ulike fysiologiske forhold4,7, 10. metoden er også brukt til å avsløre rollene 5' UTR og 3 UTR sekvenser kontroll over mRNA translatability11, undersøke rollen av miRNAs i translasjonsforskning undertrykkelse12, avdekke feil i ribosom biogenesis13 , og forstå rollen ribosom-assosiert proteiner med menneskelige sykdommer14,15. I løpet av det siste tiåret, har en voksende rolle for regulering av genuttrykk under oversettelsen framstått som illustrerer sin betydning i menneskelige sykdommer. Bevisene for translasjonsforskning kontroll i Krepsen, metabolske og nevrodegenerative sykdommer er overveldende15,16,17,18. For eksempel feilregulering eIF4E-avhengige translasjonsforskning kontroll bidrar til autisme relaterte underskudd15 og FMRP er involvert i drøye ut av ribosomer på mRNAs knyttet til autisme14. Dermed er polysomal profilering et svært viktig verktøy for å studere defekter i translasjonsforskning regulering i flere menneskelige sykdommer.
Protein analyse av polysomal fraksjoner under ulike fysiologiske forhold dissekerer funksjonen av faktorer assosiert med ribosomer under oversetting. Polysome profilering teknikken har vært brukt i mange arter inkludert gjær, pattedyrceller, planter og protozoer10,19,20,21. Protozoan parasitter som Trypanosoma og Leishmania utstilling begrenset transcriptional kontroll av genuttrykk. Deres genomer organiseres i polycistronic gene klynger som mangler promoter regulert transkripsjon22. I stedet styres utviklingsmessige genuttrykk hovedsakelig på protein oversettelsen og mRNA stabilitet i trypanosomatid arter23,24. Forståelse av translasjonsforskning kontroll i fravær av transcriptional er derfor spesielt viktig for disse organismene. Polysomal profilering er et kraftig verktøy for å studere posttranscriptional regulering av byggkorn under Leishmania25,26,27,28.
Framskritt i deteksjon av personlige mRNAs nivåer av ekte kvantitative PCR (RT-qPCR) og hele transcriptome av neste generasjons sekvensering, samt Proteomikk teknologier, bringer oppløsning og fordeler av polysomal profilering til et nytt nivå. Bruk av disse metodene kan fremme utbygget av analyse av individuelle polysomal fraksjoner av dyp RNA sekvensering kombinert med proteomic analyse for å overvåke translasjonsforskning statusen til celler i en genome-bred skala. Dette gjør identifisering av nye molekylær spillere regulere oversettelse under ulike fysiologiske og patologiske forhold. Her presenterer vi en universell polysome profilering protokollen brukes på tre forskjellige modeller: den parasitten Leishmania store, kultivert menneskelige celler og dyr vev. Vi presenterer råd om utarbeidelse av celle lysates fra ulike organismer, optimalisering av gradient, valg av RNase hemmere og anvendelse av RT-qPCR, Western blot og RNA geleelektroforese for å analysere polysome brøker i denne studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr behandling og håndtering av vev innhentet i studien ble utført i henhold til protokoller godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen ved Texas Tech University Health Science Center i henhold til National Institutes of Helse dyrevelferd retningslinjer, Protokollnummer 96005. Vennligst ofre vertebrate dyr og forberede vev i henhold til retningslinjer fra institusjonelle Animal Care og bruk komiteen. Hvis mangler slik en komité, se National Institutes of Health dyrevelferd retningslinjene. Voksen (> 60 dagers gammel) C57BL/6 mus ble brukt. Alle dyr og vev ble innhentet etter protokoller godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen ved Texas Tech University Health Sciences Center i henhold til National Institutes of Health dyrevelferd veiledning. For eutanasi, et enkelt museklikk ble plassert i et lite kammer, og luften ble fordrevet gradvis med ca 30% karbondioksid å bedøve og minimere smerte av dyret. Etter opphør av pusting brukte vi cervical forvridning for å bekrefte at dyret før høsting vev.
Advarsel: Alle arbeider med live Leishmania og kultivert menneskelige celler ble gjort i biosikkerhet regjering i BSL-2 sertifisert laboratory.
1. utarbeidelse av cytoplasmatiske Lysates fra Leishmania store , kultivert menneskelige celler og mus vev
Merk: Det er flere forskjeller i lysate forberedelsene fra annen kilde materialer. Andre trinn inkludert sukrose gradient forberedelse og polysomal fraksjoneres er identiske og avhengig ikke av prøvekilden.
-
Leishmania store cytoplasmatiske lysate forberedelse
- Vaksinere Leishmania store (FV1 belastning) celler i 30 mL 1 x M199 middels29 som inneholder 10% fosterets Bovine Serum (FBS) og penicillin/streptomycin blanding (100 enheter og 100 μg/mL tilsvarende)på tettheten av 1 x 105 celler/mL .
Merk: Alle trinn som involverer Leishmania store cellene må være gjennomført i en biosafety kabinett. - Plasser celler i kuvøse og vokse dem ved 27 ° C til logaritmisk fase (midten av loggen tilsvarer 5 x 106 celler/mL). Det tar vanligvis ca to dager for å vokse.
- Legge til gapestokk Leishmania store kultur til en siste konsentrasjon 100 μg/ml å arrestere ribosomene på oversatte mRNAs. Plassere cellene tilbake i inkubator for 10 min på 27 ° C.
- Etter gapestokk behandling er fullført, overføre celler slik 50 mL koniske og spinne dem på 1800 x g og 4 ° C i 8 min. Forkast nedbryting.
- Vask celler med 30 mL av Dulbeccos fosfat bufret saltvann (DPBS). Sentrifuger 1800 x g og 4 ° C i 8 min.
- Kast nedbryting. Resuspend celler i 1 mL av DPBS.
- Ta en aliquot av celler og bland det med 3,5% formaldehyd løsning.
- Telle celler av hemocytometer og bestemme deres konsentrasjon. Overføre ønsket antall celler i microfuge rør. Lysate utarbeidet av 0.5x108-2 x 108 celler/mL er tilstrekkelig for en sukrose gradient lasting.
- Spinn cellene på 1800 x g og 4 ° C i 8 min. forkaste nedbryting.
- Resuspend celle pellet på is i 1 mL av lyseringsbuffer inneholder proteasehemmere og RNase inhibitor (20 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, 1% NP-40, 1 x protease hemmer cocktail (EDTA-ledig), 200 enheter/mL RNase hemmer).
- Passere i lysate gjennom en 23-gauge nålen tre ganger. Det lysate bør bli gjennomsiktig etter passasje gjennom nålen.
- Sentrifuger 11200 x g og 4 ° C i 10 min å klargjøre lysate. Overføre den avklart lysate til en frisk rør og holde det på is inntil sukrose gradient ultracentrifugation.
- Samle 400-500 μL lysate som inndata (for å analysere senere), fryse den umiddelbart i flytende nitrogen for fremtidige protein analyse eller legge RNA rensing reagens før frysing for RNA analyse.
- Vaksinere Leishmania store (FV1 belastning) celler i 30 mL 1 x M199 middels29 som inneholder 10% fosterets Bovine Serum (FBS) og penicillin/streptomycin blanding (100 enheter og 100 μg/mL tilsvarende)på tettheten av 1 x 105 celler/mL .
-
Cytoplasmatiske lysate forberedelse fra kultivert menneskelig HeLa celler
- Delt HeLa celler og frø dem i 20 mL DMEM mediet som inneholder 10% FBS og penicillin/streptomycin blanding (100 enheter og 100 μg/mL tilsvarende) med cellen teller 2 x 105 celler/mL i en 15 cm plate.
- Vokse HeLa celler ved 37 ° C, 5% CO2 for 20-24 h. utføre plasmider DNA transfection etter produsentens protokoller.
- Overføre celler for 24 timer etter transfection ved 37 ° C, 5% CO2.
- Legge til gapestokk vokst HeLa celler til den siste konsentrasjonen av 100 μg/mL arrestere ribosomene på oversatt mRNAs og ruge celler for 10 min ved 37 ° C, 5% CO2. Sug opp medium. Vask cellene to ganger med kald DPBS på is.
- Legg til 500 μL lyseringsbuffer (20 mM HEPES-KOH pH 7.4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 1 x protease hemmer cocktail (EDTA-ledig), 200 enheter/mL av RNase hemmer eller 1 mg/mL heparin) til platen og skrape cellene på is.
- Overføre lysed cellene til microfuge røret. Justere konsentrasjonen av NP-40 til 0,5% og MgCl2 til 5 mM i det økte volumet av prøven.
- Passere i lysate gjennom en 23-gauge nål 3 - 6 ganger.
- Spinn 11200 x g og 4 ° C i 8 min å klargjøre lysate. Etter sentrifugering, overføre nedbryting til en ny tube. Bruk et spektrofotometer å vurdere celle lysis effektivitet og å finne eksempel beløpet for lasting på graderingen. Tilsett 10 μL av prøve 0,5 mL 0,1% natrium Dodecyl Sulfate (SDS). Tomt mot 0,1% SDS. Måle absorbans ved 260 nm. Forventet absorbansen verdien er rundt 15-20 enheter/mL.
- Fortynne alle prøver med lyseringsbuffer samme absorbansen verdi før sukrose gradient sentrifugering. Holde prøvene på is inntil sukrose gradient sentrifugering.
-
Cytoplasmatiske lysate forberedelse fra mus testikkel
- Dissekere mus testikkel. Lag et lite innsnitt i tunica albuginea og samle de seminiferous tubules av testiklene og overføre dem i et 15 mL konisk rør som inneholder 5 mL av DPBS med 0,1 mM phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF).
- Bland vevet kraftig ved å snu flere ganger. Kan vev å bosette seg på enheten tyngdekraften på is til 5 minutter.
- Fjerne og slette skyet bufferen som inneholder connective celler og vev fragmenter. Gjenta 2-3 ganger. Det gjenværende hvite pellet er beriket seminiferous tubules og bakterie celler.
- Overføre seminiferous tubule pellets til en 2 mL microcentrifuge rør og spinn på 500 x g i 1 kast nedbryting.
- Legg til 500 µL av lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 1 x protease hemmer cocktail (EDTA-ledig), 1 mg/mL heparin eller 200 enheter/mL av RNase hemmer) på tubuli. Bruke en pipette for å triturate vev.
- Overføre suspensjon til en liten (0,5-1.0 mL) Dounce homogenizer. Forstyrre vevet med syv-åtte strøk av glass pistil.
- Overføring av lysate til en 1,5 mL microcentrifuge tube.
- Sentrifuge prøven på 12.000 x g og 4 ° C i 8 min å fjerne den lysate. Overføre nedbryting til en ny tube og butikk på is til lasting i sukrose graderingen.
- Samle 50 μL av lysate som inndata prøve, fryse den umiddelbart ved-80 ° C i fremtidige protein analyse; eller Legg til RNA rensing reagens før frysing for RNA analyse.
2. sukrose Gradient forberedelse og Ultracentrifugation
- Forberede to sukrose gradient løsninger (20 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 x protease hemmer cocktail), som inneholder 10% sukrose eller 50% sukrose. (Tris-HCl, pH 7.4, kan brukes i stedet for HEPES). Legge til 200 enheter/mL RNase hemmer eller 1 mg/mL heparin ifølge eksperimentell design. Plasser en ultracentrifuge tube for SW 41 rotoren i markør blokk og trekke linjen langs den øvre nivået av blokken. Overføre røret til en stabil rack.
- Ta en 10-mL sprøyte med lagdeling enheten koblet og fyll sprøyten med 10% sucrose løsning (forberedt som ovenfor). Forsiktig ut det nederst på ultracentrifuge røret til den når merket på røret.
- Fyll en sprøyte med 50% sucrose løsning og nøye setter lagdeling enheten gjennom 10% sukrose laget til bunnen av røret. Forsiktig ut sucrose løsning fra bunnen til den når merket på røret. Forsegle røret med angitte cap.
- For å forberede sukrose graderingen, slå gradient maker enheten ON. Nivå plate med opp eller ned knapper og trykker du DONE. Leveling er viktig for linearitet av graderingen.
- Etter plate trykker GRAD å åpne gradient-menyen. Gå til listen på gradient-menyen og velg SW 41 Ti rotoren. Velg ønsket sukrose gradient fra listen over menyen bruke opp - og ned -knappene. Trykk Bruk.
- Plassholder gradient rør på gradient maker tallerkenen. Overføre røret til abonnenten. Opptil 6 graderinger kan tilberedes samtidig. Trykk kjøre. Gradient maker roterer rørene på programmert hastighet og vinkler dannet en lineær forløpning. Det tar bare noen minutter å tilberede graderingen.
- Når prosessen er fullført, rør i et rack. Ta dekslene av. Fjerne samme volum som eksempel volumet fra toppen av ultracentrifuge tuber.
- Nøye laste 400-500 μL lysate som inneholder 15-20 a260 enheter av polysomes på toppen. Plassere rør i rotoren bøtter og balanserer dem.
- Sentrifuge 260.000 x g og 4 ° C for 2t bruker SW 41 rotoren.
3. polysome fraksjoneres og prøvetaking
Merk: Mens lysate forberedelser har noen forskjeller avhengig av kilden, gradient forberedelse og polysome fraksjoneres protokoller er de samme for alle typer lysates.
- Etter ferdigstillelse av ultracentrifugation, plassere rotoren bøtter med rør på isen. Slå brøkdel samler og graderte fractionator ON. Klikk Søk på fractionator-menyen. Et stativ med 24 samling rør inn brøkdel kollektoren.
- Fyll opp en skylling reservoaret på siden av fractionator med deionisert vann. Tasten SKYLL for 10 s skylle pumpen på fractionator. Knytte en skylling adapter med sprøyten fylt med vann å stempelet for kalibrering.
- Åpne programmet fractionator på datamaskinen. Trykk KALIBRERE. Bruk standard innstillinger og trykk OK. Være klar til å injisere vann fra sprøyten.
- Trykk OK for å gjøre kalibrering. Umiddelbart begynne å injisere vann for de neste 5 s. Samtidig vannet vil strømme gjennom UV-detektor flyt cellen og instrumentet vil være kalibrert. Tegn Null kalibrering fullført vises. Apparatet er klar for fraksjoneres.
- Fjerne skyll adapteren med sprøyten. Knytte et tips til stempelet til fractionator.
- Åpne messing air ventil og trykk luft nøkkel for 10 s tørr slange og flyt cellen. Lukk luftventilen.
- Forsiktig fjerne gradient røret fra rotoren bøtte og plasser den i racket. Bruke tube holder lokket på toppen av røret og nøye flytte røret inn i røret holderen og låse det i posisjon.
- Plass holderen under stempelet til fractionator. Polysomal band kan ofte sees av øyet. Innføre de ønskede innstillingene for brøk tall og volum (24 brøker til 500 μL/brøkdel er vanligvis tilstrekkelig). Gi filen riktig. Trykk OK, og deretter Gå til diagram -knappen. I neste vindu, trykker du Starte avsøke. Innstillinger vises, trykk på OK. Kollektoren flyttes fra rennesteinen til første brøk og stempelet flytter inn i røret. Når stempelet når toppen av graderingen som det vil avta til den valgte hastigheten og fraksjoner samles. Når fullført, flyttes stempelet ut av gradient slangen.
- Åpne messing air ventil og trykk luft nøkkelen på fractionator hente siste brøken.
- Flytte rørene fra stativet på is.
- Legg 2 mengder RNA rensing reagens til hver fraksjon og flash fryse i flytende nitrogen til RNA rensing. Alternativt, hvis protein må analyseres, legge Trekloredikksyre til siste konsentrasjonen av 10% til konsentrer dem for vestlige blotting (se avsnitt 8).
4. forberedelse av syntetiske RNA I Vitro for normalisering av mRNAs nivåer under RT-qPCR dataanalyse
Merk: E. coli OmpA mRNA brukes i denne protokollen for normalisering. Andre RNA som ikke har omfattende identitet med mRNAs av studerte organismen (pattedyr eller Leishmania) kan brukes.
- Forberede OmpA DNA fragment som inneholder SP6 promoter sekvens av en standard PCR reaksjon fra en plasmider inneholder OmpA genet30.
- Forberede 100 µL av blandingen: 80 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 16 mM MgCl2, 2 mM Spermidine, 10 mM DTT, 3 mM ATP, 3 mM CTP, 3 mM UTP, 3 mM GTP, 0,5 U/μL RNase inhibitor, 1 μg OmpA PCR DNA, 3 μL SP6 RNA polymerase , 0.005 U/μL pyrophosphatase.
- Inkuber ved 40 ° C i 2 timer.
- Rense RNA ved en RNA rensing kit.
- Måle konsentrasjon av spektrofotometer og undersøke av agarose gel geleelektroforese.
5. RNA isolasjon fra Gradient brøker og cDNA forberedelse
Merk: Fortsett direkte med denne protokollen for RNA rensing hvis en RNase hemmer ble brukt som en ribonuclease hemmer. Men når den brukes som en ribonuclease hemmer, vil heparin hemme revers transkriptase brukes i cDNA forberedelse. Ekstra rensing av RNA vil derfor være nødvendig hvis heparin ble brukt i lyseringsbuffer og gradering. Se delen 6 å forberede RNA cDNA syntese hvis heparin ble brukt.
- Tine prøvene som inneholder RNA rensing reagens, legge til 20 ng av syntetiske som intern kontroll for normalisering av RT-qPCR resultater. Fortsett med RNA forberedelse i henhold til produsentens protokollen unntatt én endring. Legg 1 µL av RNA klasse glykogen (20 µg) tidligere isopropanol nedbør. Oppløse RNA pellets i 20-25 µL RNase uten vann.
Merk: Glykogen fungerer som en transportør og bidrar til å unngå tap og visualisere RNA pellets under renselsen. OmpA mRNA brukes for ytterligere normalisering i RT-qPCR reaksjoner. - Måle RNA konsentrasjon bruke spektrofotometer for å sikre tilstrekkelig avkastning. Kombinere like volum av RNA brøker som inneholder 40-årene, 60S og monosomes som prepolysomes. Brøker som inneholder 2-4 ribosomer kombinere som lys polysomes og brøker med 5-8 ribosomer kombinerer som tung polysomes.
- Bruk 5-10 µL av fra kombinerte fraksjoner for å forberede cDNAs hjelp en kit og følge produsentens anbefalinger.
- Legge til 80 µL nuclease gratis vann 20 µL av cDNA. Fryse cDNA prøvene på 20 ° C.
6. RNA rensing mot Heparin
Merk: Heparin hemmer nukleinsyre behandling enzymer som revers transkriptase. Derfor bruke denne ekstra rensing-protokollen når heparin brukes i lyseringsbuffer og/eller i forløpningen.
- Legge til LiCl i en 1 M siste konsentrasjon å renset RNA prøvene.
- Bland prøvene og ruge på is 1t.
- Spinne prøvene 16.000 x g og 4 ° C i 15 min.
- Fjerne nedbryting så komplett som mulig å bruke en pipette.
- Air-Dry pellets for om 5 min.
- Nytt avbryte pellets første volumet av RNase-fritt vann.
- Utføre Spektrofotometri måling på 260 nm å bestemme konsentrasjonen av den. Tap av prøven er vanligvis minimal.
7. RT-qPCR og dataanalyse av mRNA distribusjon
- Kombiner 10.2 μL vann, 20 μL SYBR Green, 4,8 μL genet bestemt primere (2,5 μM hvert sett), 5 μL cDNA, bland godt og laste inn 10 μL per brønn i triplicates i 384-vel plate.
- Dekkramme med lim tett og sentrifuge plate 1800 x g i 5 min.
- Bruke en Real-Time PCR instrument sette opp qPCR reaksjon under forhold som er vist i tabell 1.
- Bruker syklus terskelen (CT) beregner verdier og komparativ CT (ΔΔCT) metoden31 prosenten (%) av mRNA distribusjon i prepolysomes, lys og tunge polysomes som beskrevet32 med en endring. Bruke syntetisk RNA (OmpA her) for data normalisering i RT-qPCR dataanalyse. Den syntetiske RNA gir en normalisering kontroll som gjør det mulig å beregne relative mRNAs nivåer og sammenligne dem i ulike deler av en gradient.
8. analyse av proteiner i Polysomal fraksjoner av vestlige Blotting
- Fra et 100% (w/v) lager, legge Trekloredikksyre (TCA) til valgte fraksjoner (500 μL) til en siste konsentrasjon på 10%, holde på is minst 15 min sentrifuge i en microfuge for 5 min, forkaste nedbryting, vaske to ganger med iskald aceton og løses i 25 μL S DS-side eksempel lasting buffer for geleelektroforese.
- Last på SDS-siden og gjennomføre standard geleelektroforese med følgende overføring til PVDF membranen. Videre til Western blotting33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne studien vi beskriver bruken av polysomal profilering teknikken til tre forskjellige kilder: parasittiske Leishmania store, kultivert menneskelige celler og mus testikkel. Leishmania cellene vokse fritt i flytende media i suspensjon kultivert menneskelig cellene vokse i tilhenger monolayer på plater og mus testikkel representerer en Vevsprøve. Metoden kan enkelt justeres til andre typer fritt voksen celler i suspensjon, ulike typer vev, eller fra en annen organisme, og ulike typer kulturperler celler. Tilnærmingen består av fire hovedtrinn: lysate forberedelse, sukrose gradient forberedelse og ultracentrifugation trinn, polysome fraksjoneres og prøvetaking etterfulgt av analyse av fraksjoner. Celler fra ulike kilder er samlet, vasket og lysed i lyseringsbuffer av passasje gjennom en nål eller Dounce homogenizer. Sentrifugering brukes til å fjerne celle rusk, avklare den lysate. Ordningen med gradient fraksjoneres er vist i figur 1A. Kontinuerlig sukrose gradering dannes ved blanding av 10% og 50% sukrose løsninger i en gradient maker. Den lysate er lastet på graderingen. Ultracentrifugation skiller mRNAs tilknyttet et annet antall ribosomer som overvåkes av en UV-detektor under fraksjoneres, danner en distinkt absorbansen spektrum. Samlet fraksjoner brukes for RNA og protein analyse (figur 1B). RNA kan analyseres av geleelektroforese etterfulgt av nordlige blot eller brukt for cDNA produksjon etterfulgt av en RT-qPCR reaksjon til å analysere sammenslutning av personlige mRNAs med polysomes. Neste generasjons sekvensering kan brukes til å analysere translasjonsforskning status for mRNAs på en genomet-bred skala7. For protein analyse av polysomal fraksjoner, er proteiner utløst med Trekloredikksyre å konsentrere seg. Proteiner analyseres deretter ved Western blotting eller masse spektroskopi på proteom nivå.
En typisk polysomal profil generert fra Leishmania store aktivt voksende kultur er vist i figur 2A. Absorbansen grafen til fraksjoneres har en tydelig form med typiske topper ribosom underenheter (40-årene og 60-tallet), enkelt ribosomer (80 eller monosomes) og polysomes.
Kvantitativ RT PCR (RT-qPCR) var ansatt å oppdage sammenslutning av personlige Leishmania mRNAs med ribosomer og polysomes. Metoden for sammenlignende CT (ΔΔCT)-31 er en enkel og riktig tilnærming å studere relativ mRNAs nivåer i cellene. Denne metoden krever en intern kontroll (en stabil mRNA, som ikke endrer uttrykk under behandlinger eller betingelser for eksperimentet) for beregninger. Men er det ingen intern kontroll i polysomal fraksjoner fordi noen mRNA eller ribosomal RNA vil variere i fraksjoner, avhengig av tilknytningen ribosomer, polysomes, etc. For å løse problemet med en intern kontroll, har vi brukt syntetiske bakteriell OmpA mRNA normalisering av relativ personlige Leishmania mRNA nivåer i fraksjoner. OmpA mRNA ble syntetisert i vitro og lagt i like mengder til hver fraksjon før RNA utdrag. Tillegg av syntetiske RNA er viktig fordi det gjør beregninger av RT-qPCR data mer presis, tjener som intern kontroll for beregninger av komparative CT (ΔΔCT) metoden.
Dele gradient fraksjoner ble blandet inn i tre grupper: prepolysomes (underenheter og monosomes), lett polysomes (bestående av 2-4 ribosomer), og tunge polysomes (bestående av 5-8 ribosomer). RT-qPCR ble utført på RNA fra kombinerte fraksjoner analysere mRNA fordeling mellom disse kombinert fraksjoner (figur 2B). 18s ribosomal RNA ble brukt som en kontroll. De relative nivåene bestemmes av RT-qPCR korrelert med anslagsvis fordelingen av de små ribosomal underenheter (gratis underenheten, og som en del av monosomes og polysomes) på spectrum. RT-qPCR analyse viste at personlige mRNAs testet har forskjellige grader av engasjement i oversettelse i logaritmisk fasen av Leishmania vekst. Tubulin mRNA er tilknyttet fortrinnsvis tunge polysomes, foreslå effektiv oversettelse. Derimot Sherp mRNA finnes hovedsakelig med prepolysomes og lette polysomes støtter mindre aktive oversettelse med tubulin mRNA.
Uttrykk for rekombinante proteinene i kulturperler celler er en viktig eksperimentelle tilnærming i ulike kategorier av studier. Her presenterer vi et eksempel på polysomal profilering av rekombinant protein mRNAs i en annen prøvekilden, kultivert menneskelige celler. HeLa celler ble transiently transfekterte med Plasmidene uttrykke rekombinant cystisk fibrose transmembrane konduktans regulator (CFTR)34 eller Norrie sykdom protein (NDP). Absorbansen spektra av polysome fraksjoneres fra disse to uavhengige kulturer var svært lignende og inneholdt forskjellige topper tilsvarende ribosomal underenheter (40-årene og 60-tallet), monosomes (80), og polysomes (figur 3A). Likheten i spektra fra disse eksperimentene illustrerer reproduserbarhet av den graderte fraksjoneres. Som i Leishmania studiene, ble distribusjon av mRNAs bestemt av RT-qPCR i fraksjoner som representerer prepolysomes, lett polysomes og tunge polysomes (figur 3B). Oppdagelsen av små ribosomal delenhet 18S korrelert med anslagsvis distribusjonen i til spectra. NDP mRNAs var mest assosiert med lette og tunge polysomal fraksjoner, mens CFTR mRNAs fant det meste i prepolysome fraksjoner, noe som tyder på at NDP oversettes mer effektivt. Mens NDP er et relativt lite protein, er CFTR et veldig stort protein (1480 aminosyre rester) bestående fra flere domener, folder seg uavhengig under oversettelse35. Lavere engasjementer av CFTR mRNA med polysomes kan gjenspeile tregere oversettelse som kreves for cotranslational folding av dens forskjellige domener.
Polysome fraksjoner kan også brukes for påvisning av proteiner. Påvisning av proteiner i gradient fraksjoner ble gjennomført på eksempel på ribosomal proteiner i HeLa celler (Figur 4). Proteiner var konsentrert av nedbør med 10% TCA fra fraksjoner og Western blot ble brukt til å oppdage små delenhet ribosomal protein RPS6 og store delenhet ribosomal protein RPL11 (Figur 4, topp panel). Distribusjonen korrelert med de forskjellige toppene på absorbansen spekteret. Disse eksperimentene viser tydelig at polysome fraksjoner kan brukes til å analysere proteiner i dem.
Mange forskjellige sukrose konsentrasjoner graderinger (for eksempel 7-47%36, 5-50%7, 7-50%6 , 10-50%37, 15 til 50%8og andre) polysomes fraksjoneres ble brukt. Her sammenlignet vi to graderinger 10-50% og 17-51% (figur 5). Selv om 17-51% produsert akseptable resultater, ble separasjon i 10-50% forløpningen samlet bedre.
Det er godt dokumentert at chelaterande agenter, som EDTA, forstyrre ribosomer og polysomes8,9. Som det er vist i figur 6, EDTA behandling av HeLa lysate før lasting på graderingen fører til forsvinningen av toppene, tilsvarer monosomes og polysomes, og betydelig økning i ribosom underenheter topper. Dette eksperimentet fungerte som en kontroll og viste at de observerte toppene uten EDTA behandling er faktisk ribosomal monosomes og polysomes.
Figur 7 viser resultatene av polysome fraksjoneres fra musen testiklene. Absorbansen spekteret har likheter med de fra Leishmania og HeLa celler: forskjellige topper ribosomal underenheter, monosomes og polysomes. Sin form og distribusjon produsere et signaturutseende, som gjør det enkelt å identifisere dem på forskjellige polysomal spectra. Totalt RNAs var renset fra fraksjoner og RNAs fra valgte fraksjoner ble analysert av geleelektroforese i agarose gel (figur 7, topp panel). Geleelektroforese viser typiske distribusjon av 18S og 28S ribosomal RNAs. Deres skarp band indikerer intactness av prøvene. Gel kan brukes for individuelle mRNAs oppdagelsen av en følgende Nord blott eller den kan brukes til å vurdere kvaliteten på prøvene før videre eksperimenter på RNA eller protein analyse - diffust ribosomal RNAs band angi RNA degradering av prøvene.
Under våre studier brukte vi RNase hemmer og Heparin som RNase hemmere i den lysates og sukrose forløpninger. Mens begge gitt tilfredsstillende resultater, var bruken av RNase hemmer å foretrekke for RNA analyse fordi det ikke hemmer cDNA og RT-qPCR reaksjoner. Således, den ikke krever flere RNA rensing trinn. Men hvis forskere vil bruke heparin under polysome forberedelse, være klar over at heparin hemmer ned-stream programmer som RT-qPCR og ekstra RNA rensing trinn kreves (se protokollen del 6).
Figur 1 . Polysome profilering. (A) ordningen med gradient forberedelser, polysome fraksjoneres og absorbansen profil. (B) ordningen brøkdel analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Polysome profil analyse av Leishmania store kultur i logaritmisk stadium av vekst. (A) Cytoplasmic lysate var fraksjonert i 10-50% sukrose gradering. (B) Relative distribusjon av 18S RNA, tubulin og Sherp mRNAs (%) i prepolysomes, lette og tunge polysomes Logg celler analysert av RT-qPCR. Brøker som inneholder 40, ble 60 og monosomes kombinert som prepolysomes. Brøker med 2-4 ribosomer ble kombinert som lys polysomes, mens brøker med 5-8 ribosomer dannet tunge polysomes. Syntetisk E. coli OmpA mRNA lagt til brøker tidligere RNA utvinning som en normalisering kontroll RT-qPCR. Bruk sammenlignende CT (ΔΔCT)31 metoden for beregning av mRNA nivåer. Feilfelt representerer standardfeil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Polysome fraksjoneres og analyse av rekombinant CFTR og NDP mRNAs tilknytning til ribosomer i HeLa celler transfekterte med plasmider DNAs. (A) Polysomal profil i HeLa celler transfekterte med CFTR og NDP plasmider. 10% - 50% sukrose forløpningen ble brukt for å oppnå separasjon av polysomes. Toppene for små (40) og store (60) underenheter, samt monosome (80) angis. Brøker var kombinert som vist på panelet A og brukes for ytterligere analyse. (B) distribusjon av mRNAs av CFTR og NDP i forskjellige fraksjoner. Påvisning av 18S av RT-qPCR ble brukt som en polysome fraksjoneres. RNA nivåer ble vurdert av RT-qPCR analyse. Data var normalisert bruker syntetiske mRNA. Bruk sammenlignende CT (ΔΔCT)31 metoden for beregning av mRNA nivåer. Feilfelt representerer standardfeil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Påvisning av ribosomal proteiner i HeLa polysomal brøker. Hela celle lysate utsatt med 10% - 50% sukrose gradient sentrifugering. Proteiner i valgte fraksjoner ble påskyndet med TCA og analyseres av geleelektroforese i 12% SDS-side med følgende vestlige blotting bruker mus monoklonalt RPS6 og kanin polyklonale RPL11 antistoff som primære antistoffer og Peroxidase-Conjugated geit anti-mus eller anti-kanin sekundære antistoffer. Visualisering av signaler ble gjort av SuperSignal West Pico pluss chemiluminescent substrat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Sammenligning av HeLa polysomal profilering i 10% - 50% (svart) eller 17% - 51% (grått) sukrose forløpninger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 . Effekten av EDTA behandling på polysomal profil i HeLa celler. Hela celle lysate ble behandlet med 10 mM EDTA på is 10 min rett før sukrose gradient sentrifugering. MgCl2 ble erstattet av 5 mM EDTA i sukrose gradient løsninger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 . Polysomal profilen fra mus testikkel vev lysate. Brøker ble utsatt for RNA ekstraksjon med en RNA rensing reagens og analyseres av geleelektroforese i 1% agarose gel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Scenen | Trinn | Tilstand |
| Hold | Trinn 1 | Øke temperaturen fra 25 til 50° C med 1,6 ° C/s |
| Inkuber ved 50° C for 2:00 min | ||
| Trinn 2 | Øke temperaturen 50 95° c med 1,6 ° C/s | |
| Ruge på 95° C i 10:00 minutter | ||
| PCR | Trinn 1 | Ruge på 95° C 00:15 min |
| Trinn 2 | Redusere temperaturen fra 95 60° c med 1,6 ° C / | |
| Ruge på 60° C i 1:00 min | ||
| Antall sykluser 40 | ||
| Smelte kurve | Trinn 1 | Øke temperaturen fra 60 til 95° C med 1,6 ° C/s |
| Trinn 2 | Redusere temperaturen fra 95 til 60° C med 1,6 ° C/s | |
| Ruge på 60° C i 1:00 min | ||
| Trinn 3 (dissosiasjon) | Øke temperaturen fra 60 til 95° C med 0,05 ° C/s | |
| Ruge på 95° C 00:15 min | ||
Tabell 1. Betingelser for RT-qPCR
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Polysome fraksjoneres av sukrose gradering kombinert med RNA og protein av fraksjoner er en kraftig metode å analysere translasjonsforskning statusen til individuelle mRNAs eller hele translatome og roller protein faktorer regulere translasjonsforskning maskiner under normale fysiologiske eller sykdom tilstand. Polysomal profilering er en særlig egnet teknikk å studere translasjonsforskning regulering i organismer som trypanosomatids inkludert Leishmania der transcriptional er hovedsakelig fraværende og gene expression regulering hovedsakelig oppstår under oversettelse.
Her beskriver vi en polysome fraksjoneres protokollen brukes på tre modeller: Leishmania parasitter, kultivert menneskelige celler og mus vev. Polysome fraksjoneres trinnet er egentlig det samme for ulike organismer som brukes i denne studien; lysate utarbeidelse har imidlertid noen forskjeller. Leishmania cellene vokse i flytende kultur og samles inn av sentrifugering og celler telles før lysis å sikre lik lasting på graderingen. Menneskelige celler kan være vasket og lysed direkte på platen. Lik lasting styres av optisk densitet. Musen vev krever en Dounce homogenizer for effektiv lysis mens ved Leishmania og menneskelige celler, er det tilstrekkelig å passere dem 23-gauge nålen.
Reagenser brukes skal være RNase og protease gratis. Vi sammenlignet heparin og RNase inhibitor som hemmere av RNase aktivitet i de cytoplasmatiske lysates. Vi fant at begge reagenser kan effektivt blokkerer RNase. Heparin påvirker imidlertid nedstrøms programmer som cDNA forberedelse og RT-qPCR. Som et resultat, krever utarbeidelse av RNA en ekstra rensing trinn når heparin brukes. Etter vår mening den RNase inhibitor er mer praktisk valg og kan brukes effektivt i polysome profilering protokollen.
Polysomal profilering er arbeidsintensiv, som er en stor begrensning av metoden. Opptil seks graderinger kan tilberedes samtidig. Den graderte fractionator genererer 144 brøker som må behandles i en kort periode. Analyse av individuelle fraksjoner kan være tidkrevende og kostbar også. Derfor kombinere individuelle brøker i pre polysomes, lette og tunge polysomes gir en rask og mindre arbeidskrevende måte å anslå translasjonsforskning aktivitet av personlige mRNAs. RT-qPCR resultatene på kombinert fraksjoner tillot oss å identifisere forskjeller i translatability av forskjellige mRNAs både i Leishmania og HeLa celler (tall 2, 3). Men hvis finere oppløsning er nødvendig, kan deretter analyse av individuelle fraksjoner utføres.
Ribosom profilering er en annen metode å studere mRNA translasjonsforskning status og er basert på måling av protein produksjon via sekvensering av mRNA beskyttet av ribosom38. Denne teknologien gir kvantitativ informasjon knytte mRNA sekvenser med bestemte polysomal fraksjoner oversettes i en prøve, og kan gi nøyaktig informasjon om translasjonsforskning statusen for mRNAs med codon oppløsning i sammenligning med polysome profilering teknologi. Men polysome profilering kan brukes for både RNA og protein analyse, dermed gir tilleggsinformasjon om proteom av polysomes og identifisere faktorer som bidrar til regulering av oversettelse.
Derfor er polysomal profilering en allsidig teknikk som kan brukes til å analysere translasjonsforskning delstaten personlige mRNAs, undersøke ribosom-assosiert proteiner og studere translasjonsforskning regulering i annen modell organismer under annerledes eksperimentell forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Ching Lee hjelpen lydopptak. Forskningen ble støttet av oppstart midler fra Texas Tech University Health Sciences Center og ved Center of Excellence for translasjonsforskning nevrovitenskap og Therapeutics (CTNT) gi PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW A.L.K.; delvis av NIH grant R01AI099380 K.Z. James C. Huffman og Kristen R. Baca var CISER (senter for integrering av STEM utdanning og forskning) forskere og ble støttet av programmet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments: | |||
| Gradient master | Biocomp Instruments Inc. | 108 | |
| Piston Gradient Fractionator | Biocomp Instruments Inc. | 152 | |
| Fraction collector | Gilson, Inc. | FC203B | |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | NanoDrop One | |
| Nikon inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2-FL/Ts2 | |
| 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems by Life Technologies | 4359659 | |
| CO2 incubator | Panasonic Healthcare Co. | MCO-170A1CUV | |
| HERATHERM incubator | Thermo Scientific | 51028063 | |
| Biological Safety Cabinet, class II, type A2 | NuAire Inc. | NU-543-400 | |
| Revco freezer | Revco Technologies | ULT1386-5-D35 | |
| Beckman L8-M Ultracentifuge | Beckman Coulter | L8M-70 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 | |
| Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-45-30-11 | |
| Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228 | Applied Biosystems by life technologies | 4470661 | |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-51B | |
| Software | |||
| Triax software | Biocomp Instruments Inc. | ||
| Materials: | |||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 145-0011 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm) | Seton Scientific | 7030 | |
| Syringe, 5 mL | BD | 309646 | |
| BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle | BD | 10020439 | |
| Nunclon Delta Surface plate, 14 cm | Thermo Scientific | 168381 | |
| Nunclon Delta Surface plate, 9 cm | Thermo Scientific | 172931 | |
| Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES | Thermo Scientific | 569-0020 | |
| BioLite 75 cm3 flasks | Thermo Scientific | 130193 | |
| Nunc 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339653 | |
| Chemicals: | |||
| Trizol LS | Ambion by Life Technologies | 10296028 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1378-5KG | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM) | Sigma | D6429-500ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-50ML | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma | P0781-100ML | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O) | Acros Organics | AC413415000 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma | P9541-500G | |
| Nonidet P 40 (NP-40) | Fluka (Sigma-Aldrich) | 74385 | |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3993-1MU | |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors | Roche Diagnostics | 11836170001 | |
| Glycogen | Thermo Scientific | R0551 | |
| Water | Sigma | W4502-1L | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-1G | |
| Chloroform | Fisher Scientific | 194002 | |
| Dithiotreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Ethidium Bromide | Fisher Scientific | BP-1302-10 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA) | Fisher Scientific | S316-212 | |
| Optimem | Life Technologies | 22600050 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma | P8833-100MG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3KG | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049-100ML | |
| Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Applied Biosystems by life technologies | 4368814 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | 4367659 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144SI-212 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26324 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma | 221473-500G | |
| Anti-RPL11 antibody | Abcam | ab79352 | |
| Ribosomal protein S6 (C-8) antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-74459 | |
| 1xM199 | Sigma | M0393-10X1L | |
| Lithium cloride | Sigma | L-9650 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Gel Loading Buffer II | Thermo Scientific | AM8546G | |
| UltraPure Agarose | Thermo Scientific | 16500-100 | |
| Trichloracetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-100 | |
| SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34580 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L5750-1KG | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626-5G | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A1852-1VL | |
| Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP) | Sigma | C1506-250MG | |
| Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP) | Sigma | U6625-100MG | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma | G8877-250MG | |
| SP6 RNA Polymerase | NEB | M0207S | |
| Pyrophoshatase | Sigma | I1643-500UN | |
| Spermidine | Sigma | S0266-1G |
References
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Capewell, P., et al. Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host. PLoS One. 8 (6), e67069 (2013).
- Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 49, 122-129 (1963).
- Piccirillo, C. A., Bjur, E., Topisirovic, I., Sonenberg, N., Larsson, O. Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes. Nature Immunology. 15 (6), 503-511 (2014).
- Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
- Masek, T., Valasek, L., Pospisek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
- Zuccotti, P., Modelska, A. Studying the Translatome with Polysome Profiling. Methods in Molecular Biology. 1358, 59-69 (2016).
- Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), e15 (2017).
- Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 100 (7), 3889-3894 (2003).
- Gandin, V., et al. nanoCAGE reveals 5' UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs. Genome Research. 26 (5), 636-648 (2016).
- Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
- Zanchin, N. I., Goldfarb, D. S. Nip7p interacts with Nop8p, an essential nucleolar protein required for 60S ribosome biogenesis, and the exosome subunit Rrp43p. Molecular Cell Biology. 19 (2), 1518-1525 (1999).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Gkogkas, C. G., et al. Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control. Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).
- Robichaud, N., Sonenberg, N. Translational control and the cancer cell response to stress. Curr Opin Cell Biol. 45, 102-109 (2017).
- Gordon, B. S., Kelleher, A. R., Kimball, S. R. Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (10), 2147-2157 (2013).
- Ishimura, R., et al. RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodegeneration. Science. 345 (6195), 455-459 (2014).
- Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., Sharp, P. A. Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells. Molecular Cell. 21 (4), 533-542 (2006).
- Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 111 (1), E203-E212 (2014).
- Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 14 (11), R128 (2013).
- De Gaudenzi, J. G., Noe, G., Campo, V. A., Frasch, A. C., Cassola, A.
- Alves, L. R., Goldenberg, S. RNA-binding proteins related to stress response and differentiation in protozoa. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 78-87 (2016).
- De Pablos, L. M., Ferreira, T. R., Walrad, P. B. Developmental differentiation in Leishmania lifecycle progression: post-transcriptional control conducts the orchestra. Current Opinions in Microbiology. 34, 82-89 (2016).
- Soto, M., et al. Cell-cycle-dependent translation of histone mRNAs is the key control point for regulation of histone biosynthesis in Leishmania infantum. Biochemical Journal. 379, 617-625 (2004).
- McNicoll, F., et al. Distinct 3 '-untranslated region elements regulate stage-specific mRNA accumulation and translation in Leishmania. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35238-35246 (2005).
- Folgueira, C., et al. The translational efficiencies of the two Leishmania infantum HSP70 mRNAs, differing in their 3 '-untranslated regions, are affected by shifts in the temperature of growth through different mechanisms. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35172-35183 (2005).
- Dumas, C., Chow, C., Muller, M., Papadopoulou, B. A novel class of developmentally regulated noncoding RNAs in Leishmania. Eukaryotic Cell. 5 (12), 2033-2046 (2006).
- Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
- Karamyshev, A. L., Johnson, A. E. Selective SecA association with signal sequences in ribosome-bound nascent chains: a potential role for SecA in ribosome targeting to the bacterial membrane. Journal of Biological Chemistry. 280 (45), 37930-37940 (2005).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles. Bio Protocols. 7 (3), (2017).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Patrick, A. E., Karamyshev, A. L., Millen, L., Thomas, P. J. Alteration of CFTR transmembrane span integration by disease-causing mutations. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4461-4471 (2011).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO Journal. 33 (3), 265-276 (2014).
- Morita, M., et al. mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1. Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
