Polysome Profilerstellung in Leishmaniose, menschliche Zellen und Maus Hoden

Zemfira N. Karamysheva; Elena B. Tikhonova; Petar N. Grozdanov; James C. Huffman; Kristen R. Baca; Alexander Karamyshev; R. Brian Denison; Clinton C. MacDonald; Kai Zhang; Andrey L. Karamyshev

doi:10.3791/57600

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Methodenartikel

Polysome Profilerstellung in Leishmaniose, menschliche Zellen und Maus Hoden

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DOI:

10.3791/57600

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8. April 2018

Zemfira N. Karamysheva² , Elena B. Tikhonova¹ , Petar N. Grozdanov¹ , James C. Huffman²^,³ , Kristen R. Baca¹^,³ , Alexander Karamyshev¹ , R. Brian Denison¹ , Clinton C. MacDonald¹ , Kai Zhang² , Andrey L. Karamyshev¹

¹Department of Cell Biology and Biochemistry, Texas Tech University Health Sciences Center, ²Department of Biological Sciences, Texas Tech University, ³CISER (Center for the Integration of STEM Education & Research), Texas Tech University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das übergeordnete Ziel der Polysome Profilerstellung Technik ist Analyse der übersetzerischen Tätigkeit der einzelnen mRNAs oder Transkriptom mRNAs während der Proteinsynthese. Die Methode ist für Studien von Protein-Synthese-Verordnung, Übersetzung Aktivierung und Repression in Gesundheit und mehrere menschliche Krankheiten wichtig.

Zusammenfassung

Richtige Protein-Expression zum richtigen Zeitpunkt und in der richtigen Menge ist die Grundlage der normalen Zellfunktion und Überleben in einer sich schnell verändernden Umgebung. Für eine lange Zeit dominierten die genexpressionsstudien Forschung auf transkriptioneller Ebene. Jedoch die Steady-State Ebenen der mRNAs nicht korrelieren gut mit Protein-Produktion und die Übersetzbarkeit von mRNAs variiert stark je nach Bedingungen. In einigen Organismen, wie den Parasiten Leishmaniaist die Proteinexpression vor allem auf der translationalen Ebene geregelt. Jüngste Studien gezeigt, dass dieses Protein Übersetzung Dysregulation mit Krebs, Stoffwechselstörungen, neurodegenerativen und anderen Krankheiten des Menschen verknüpft ist. Polysome Profilerstellung ist eine leistungsfähige Methode, Protein Übersetzung Verordnung zu studieren. Es ermöglicht die translationalen Status der einzelnen mRNAs zu messen oder Übersetzung auf einer genomweiten Skala zu untersuchen. Die Grundlage dieser Technik ist die Trennung von Polysomes, Ribosomen, deren Untereinheiten und kostenlose mRNAs bei der Zentrifugation von einer zytoplasmatischen lysate durch einen Farbverlauf von Saccharose. Hier präsentieren wir Ihnen eine universelle Polysome Profilerstellung verwendete Protokoll auf drei verschiedenen Modellen - Parasiten Leishmania großen, kultivierten Zellen der menschlichen und tierischen Geweben. Leishmaniose Zellen wachsen frei schwebend und kultivierte menschlichen Zellen wachsen in adhärenten Monolage während Maus Hoden eine tierisches Gewebeprobe darstellt. Somit ist die Technik an all diese Quellen angepasst. Das Protokoll für die Analyse der polysomal Brüche beinhaltet Erkennung von einzelnen mRNA-Niveaus von RT-qPCR Proteine durch Western-Blot und Analyse der ribosomalen RNAs durch Elektrophorese. Die Methode kann durch Untersuchung der mRNAs Association mit dem Ribosom auf Transkriptom Ebene durch tiefe RNA-Seq und Analyse des Ribosom-assoziierte Proteine durch Massenspektroskopie der Fraktionen erweitert werden. Die Methode ist leicht zu anderen biologischen Modellen einstellbar.

Einleitung

Regulation der Genexpression in den Zellen wird durch transkriptionelle, posttranskritionelle und posttranslationale Mechanismen gesteuert. Fortschritte in der Tiefe RNA Sequenzierung ermöglichen die Untersuchung der stationären mRNA-Niveaus auf einer genomweiten Skala auf einem noch nie da gewesenen Niveau. Neuere Erkenntnisse ergaben jedoch, dass stationäre mRNA Ebene nicht immer mit Protein Produktion¹^,^{2 korreliert}. Das Schicksal eines einzelnen Niederschrift ist sehr komplex und hängt von vielen Faktoren wie interne/externe Reize, Stress, etc.. Regulation der Genexpression während der Proteinsynth....