Summary
酵母 2-混合筛的分批处理可以直接比较多饵蛋白与高度复杂的猎物融合蛋白的相互作用。在这里, 我们描述了精制方法, 新试剂, 以及如何实现这些屏幕的使用。
Abstract
用酵母 2-杂交法筛选蛋白质-蛋白质相互作用长期以来一直是一个有效的工具, 但它的使用在很大程度上仅限于发现高亲和性的 interactors 在互动的候选库中高度丰富。以传统的形式, 酵母 2-杂交试验可以产生太多的菌落分析时进行低严格的, 在那里可能发现低亲和 interactors。此外, 如果没有对同一图书馆进行全面和彻底的讯问, 对不同的诱饵质粒, 就无法进行比较分析。虽然这些问题中的一些可以使用阵列的牺牲品库来解决, 但操作此类屏幕所需的成本和基础设施却是令人望而却步的。作为替代, 我们已经适应了酵母 2-杂交检测, 同时发现在一个单一的屏幕上的许多瞬态和静态蛋白质相互作用的一个战略称为 DEEPN (动态富集评估蛋白质网络), 这采用高通量 DNA 测序和计算来跟踪编码相互作用伙伴的质粒种群的进化。在这里, 我们描述了定制的试剂和协议, 使 DEEPN 屏幕易于执行和经济高效。
Introduction
对细胞生物学过程的完全理解依赖于寻找其分子机制基础的蛋白质相互作用网络。一种识别蛋白质相互作用的方法是酵母 2-杂交 (Y2H) 法, 它通过组装一个功能的嵌合体转录因子, 一旦两个感兴趣的蛋白质领域绑定到另一个1。一个典型的 Y2H 屏幕是通过创建一个酵母种群, 它既可以将相互作用的蛋白质的质粒库编码成转录激活剂 (e. g, "猎物" 融合蛋白) 和由蛋白质组成的给定的 "诱饵" 质粒。的兴趣融合到 dna 绑定域 (例如, 绑定到 Gal4-upstream 激活序列的 Gal4 DNA 绑定域)。Y2H 方法的一个主要优点是, 在为常规分子生物学工作配备的典型实验室中, 进行2是相对容易和廉价的。但是, 当传统上执行时, 用户会对在选择时出现的单个菌落进行正面 Y2H 交互的采样。这严重限制了可以调查的图书馆 "猎物" 克隆的数量。当一个特定的相互作用的猎物的丰度相对于其他捕食者非常高时, 这一问题就会复杂化, 从而减少了从低丰度猎物质粒中检测相互作用的几率。
在蛋白质组的综合覆盖范围内使用 Y2H 原理的一个解决方案是使用矩阵格式化的方法, 其中包含已知单个猎物质粒的阵列可以进行数字审问。但是, 这种方法需要的基础结构对于那些有意定义少量蛋白质或域3的 interactome 的个体调查人员来说是不容易接近或成本效益高的。此外, 非常复杂的猎物库, 可能编码多个相互作用的蛋白质片段, 将扩大这种矩阵数组的大小不切实际的大小。另一种方法是在批次中执行复杂库的检测, 并使用大规模并行高通量排序4评估交互克隆的存在。这可以用来检测在多个殖民地出现的猎物质粒的存在, 使用典型的 Y2H 格式化的方法, 其中酵母细胞外壳的相互作用对融合蛋白被允许生长在一个板块5,6。这一总体思路可以增强, 以增加对多个诱饵和猎物组件的查询, 同时7,8。
尽管如此, 许多调查还是需要更简单、更专注于少量蛋白质 "诱饵" 的努力, 并且可以通过对单个复杂的猎物库进行详尽而半定量的查询来获得更多的好处。我们已经开发并验证了一种使用 Y2H 原则在批处理格式4中执行广泛的蛋白质交互研究的方法。这使用特定的猎物质粒的膨胀率作为 Y2H 交互作用的相对强度的代理9。在正常生长或选择性生长条件下, 在种群内的所有质粒的深度测序生成完整的克隆, 产生强弱的 Y2H 相互作用。interactors 可以在多个诱饵质粒中得到和直接比较。由此产生的工作流称为 DEEPN (对蛋白质网络进行动态富集评估), 因此可以用来识别同一个猎物库中的差异 interactomes, 以确定蛋白质, 从而使一种蛋白质与另一种蛋白进行比较。
在这里, 我们演示了 DEEPN, 并介绍了有助于其使用的实验室方法的改进, 其中概述了图 1。重大改进包括:
捕食酵母种群的生成.DEEPN 的关键要求之一是产生不同饵料质粒的酵母种群, 它们的粒细胞分布相同。捕食质粒库的等效基线种群对不同饵料的 interactomes 进行精确比较是必不可少的。这是最好的实现, 当一个图书馆的质粒已经安置在单倍体酵母种群和移动一个给定的诱饵质粒进入该人群是通过交配产生一个倍。在这里, 我们提供了一个明确的指南, 如何使这些人口使用的商业图书馆在单倍体酵母。虽然我们发现了产生大量 diploids 的方法, 但这些含有酵母菌的商业文库的整体交配效率却很低。因此, 我们构造了一种新的应变, 可以使猎物库产生更 diploids 的每一个交配反应。
新的诱饵质粒集。许多目前表达 "诱饵" 融合蛋白的质粒是由感兴趣的蛋白质和 DNA 结合的领域组成的, 2µ, 允许它们放大其拷贝数。这个拷贝数在人口中可能是相当可变的并且导致变异在 Y2H 转录反应。这反过来可能会扭曲的能力, 以衡量一个特定的蛋白质相互作用的强度, 根据细胞的生长反应的选择。这可以通过使用低拷贝质粒来部分解决, 其中一些以前曾被描述为商业上可用的 pDEST3210。我们构建了一种新的诱饵质粒 (pTEF GBD), 在TRP1着丝粒基低拷贝质粒中产生 Gal4-DNA-binding 域融合蛋白, 携带 Kanr 抵抗基因, 同时也允许克隆上游和Gal4 DNA 结合领域的下游。
新的高密度 Y2H 片段库.我们构建了一个新的质粒来 Y2H 猎物库, 并利用它建立一个高度复杂的 Y2H 图书馆由随机剪切片段的基因组 DNA 从酿酒酵母。序列分析表明, 该库有100万多个不同的元素, 远比以前描述的酵母基因组 Y2H 质粒库11复杂得多。通过这个新的库, 我们能够证明 DEEPN 工作流足够健壮, 能够以可靠和可重现的方式容纳许多不同质粒的复杂库。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 介质和板材的制备
注: 在开始该协议之前, 所有的盘子需要做最少2天。媒体可以在任何时候进行。然而, 缓冲酵母萃取蛋白胨葡萄糖腺嘌呤 (bYPDA) 需要做的日子, 将使用它。一些媒体是使用一个补充组合, 其中含有腺嘌呤水平大于通常使用。大多数最小的培养基补充剂指定10毫克/升腺嘌呤。标签为 ' + 40 艾德 ' 的补充剂指定总共40毫克/升腺嘌呤。
- 准备葡萄糖溶液 (50% 瓦特/v)。1 L, 在1000毫升烧杯中溶解800毫升蒸馏水中的 d-(+) 葡萄糖500克。调整体积到1000毫升使用一个毕业的圆筒和过滤通过一个0.2 µm 无菌过滤器成一个无菌1000毫升介质储存瓶。
- 制备酵母提取物蛋白胨葡萄糖 (YPD) 板。1 L, 在1000毫升烧杯中溶解20克的蛋白胨和10克的酵母萃取物在800毫升蒸馏水中。倒入一个毕业的圆筒, 用蒸馏水填满960毫升。倒入2000毫升锥形瓶, 加入15克琼脂。高压釜和冷却在37°c 水浴直到水浴温度冷却了到大约 42-50 °c。使用吸管添加40毫升50% 葡萄糖。用旋转的混合好。
- 用吸管倒入100毫米的20毫升培养基。
- 准备完整的合成最小介质 (CSM)-多金属板。1 L, 在1000毫升烧杯中溶解6.7 克的酵母氮基, 而不含氨基酸为800毫升蒸馏水。倒入一个已毕业的圆筒, 用蒸馏水填满960毫升的水。倒入2000毫升的锥形瓶, 并添加 0.7 g 的-多党人满足的辍学混合, 20 毫克的蛋氨酸, 15 克的琼脂。高压釜和冷却在37°c 水浴直到水浴温度冷却了到大约 42-50 °c。使用吸管添加40毫升50% 葡萄糖。用旋转的混合好。
- 用吸管倒入100毫米的20毫升培养基。
- 准备 CSM-列伊-满足板块。1 L, 在1000毫升烧杯中溶解10.05 克的酵母氮基, 而不含氨基酸为800毫升蒸馏水。倒入一个毕业的圆筒和填充940毫升的蒸馏水。倒入2000毫升的锥形烧瓶中, 加入1.005 克列伊-满足的辍学混合和15克琼脂。高压釜和冷却在37°c 水浴直到水浴温度冷却了到大约 42-50 °c。使用吸管添加60毫升50% 葡萄糖。用旋转的混合好。
- 用吸管倒入100毫米的20毫升培养基。
- 准备 CSM-列伊多党板块。1 L, 在1000毫升烧杯中溶解10.05 克的酵母氮基, 而不含氨基酸为800毫升蒸馏水。倒入一个已毕业的圆筒, 用蒸馏水填满940毫升的水。倒入2000毫升的锥形瓶, 并添加 1.005 g 的 Leu+40Ade 的辍学混合, 240 毫克腺嘌呤和15克的琼脂。高压釜和冷却在37°c 水浴直到水浴温度冷却了到大约 42-50 °c。使用吸管添加60毫升50% 葡萄糖。用旋转的混合好。
- 用吸管倒入100毫米的20毫升培养基。
- 准备好他的盘子1 L, 在1000毫升烧杯中溶解10.05 克的酵母氮基, 而不含氨基酸为800毫升蒸馏水。倒入一个已毕业的圆筒, 用蒸馏水填满940毫升的水。倒入2000毫升的锥形瓶, 并添加 0.975 g 的 Leu-His+40Ade 的辍学混合, 240 毫克腺嘌呤和15克的琼脂。高压釜和冷却在37°c 水浴直到水浴温度冷却了到大约 42-50 °c。使用吸管添加60毫升50% 葡萄糖。用旋转的混合好。
- 用吸管倒入100毫米的20毫升培养基。
- 准备 CSM-Leu-Trp-His-3AT 板。1 L, 在1000毫升烧杯中溶解10.05 克的酵母氮基, 而不含氨基酸为800毫升蒸馏水。倒入一个已毕业的圆筒, 用蒸馏水填满940毫升的水。倒入2000毫升的锥形瓶, 并添加 0.975 g 的 Leu-His+40Ade 的辍学混合, 240 毫克腺嘌呤和15克的琼脂。高压釜和冷却在37°c 水浴直到水浴温度冷却了到大约 42-50 °c。使用吸管添加60毫升50% 葡萄糖。混合100µL 1 米无菌库存的3氨基-12, 4 三唑 (3AT) 旋转。
- 用吸管倒入100毫米的20毫升培养基。
- 准备 LB Kanr 板。1 L, 在800毫升烧杯中溶解10克胰蛋白胨、5克酵母萃取物和10克氯化钠在1000毫升蒸馏水中。倒入一个已毕业的圆筒, 用蒸馏水填满1000毫升的水。倒入2000毫升的锥形瓶, 加入15克琼脂。高压釜和冷却在37°c 水浴直到水浴温度冷却了到大约 42-50 °c。加入50毫克卡那霉素, 混合旋转。
- 用吸管倒入100毫米的20毫升培养基。
- 准备 YPD, 列伊会谈, csm-激进党, csm-列伊激进党和 csm-列伊激进党-他的媒体。使用上面的程序板, 除了不倒入锥形瓶, 倒入一个媒体储存瓶和省略琼脂。
- 准备 bYPDA (缓冲 YPDA)。服用无菌 YPD 培养基, 在无菌蒸馏水中加入200毫克/升腺嘌呤。将 pH 值调整为 3.7, 用 HCl 将0.2 µm 无菌过滤器过滤成无菌瓶。
- 准备转换缓冲器: 2 米山梨醇, 1 米醋酸锂, 10 毫米三 pH 7.6, 0.5 毫米 EDTA, 蒸馏水中的0.2 毫米氯化钙。通过0.2 µm 无菌过滤器过滤成无菌瓶。
- 准备 PEG 溶液: 70% 瓦特/v 聚乙二醇3350在蒸馏水。用高压釜消毒。
- 准备旋转: 8 米尿素, 4% 瓦特/v SDS, 50 毫米三 pH 6.8, 10% 伏/v 甘油, 0.02% 瓦特/v 溴酚蓝色在无菌蒸馏水。
- 准备 (强 TE):50 毫米三, 20 毫米 EDTA, pH 8.0 在蒸馏水。通过0.2 µm 无菌过滤器过滤成无菌瓶。
- 准备 Zymolase 库存解决方案:10 毫克/毫升 Zymolase 100T 在50毫米磷酸钾二元 pH 7.5, 50% 伏/v 甘油缓冲在无菌蒸馏水 (储存在-20 °c)。
2. 诱饵质粒的克隆和鉴定
注: Gal4-DNA-binding 领域质粒的构建。目前, 有各种各样的商业可用和学术上可用的 Y2H 系统。DEEPN 可以容纳其中的许多, 条件是, 表达感兴趣的蛋白质的诱饵质粒被融合到 DNA 结合域中, 是在含有TRP1的质粒中。其他下游要求是已知的, 在猎物库插入的上游序列是众所周知的, 一个积极的 Y2H 互动可以通过生产 His3, 允许选择的媒体缺乏组氨酸。在这里, 我们将描述使用一个新的 Y2H 诱饵质粒 (pTEF-GBD,图 2), 但是, 其他 Y2H 诱饵粒, 包括 pGBKT7 也可以使用。对于诱饵质粒的构建和评价, 我们将描述 pTEF-GBD 的使用。作为一般的说明, 我们建议基因合成, 以产生一个开放阅读框架, 坚持酵母密码子的偏见, 以帮助确保良好的表达和易于克隆。确保克隆方案允许诱饵与 Gal4 DNA 结合的领域内帧, 当克隆到 3 ' 站点, 一个停止密码子跟踪诱饵编码区域。
- 制备质粒载体。质粒 pTEF-GBD 允许克隆一个片段编码的兴趣蛋白 5 ' 或 3 ' 的区域编码的 Gal4 DNA 结合领域使用快速组装方法。在 5 ' 站点上插入, 文摘3µg pTEF-GBD 与纳莉和 EcoRI 或为插入在 3 ' 站点, 消化与 BamHI 和 XhoI 2-4 h. Electrophorese 样品在1% 个脱氧核糖核酸琼脂糖凝胶包含 0.2-0.5 µg/毫升溴溴 (EtBr) 在 100 v. 消费削减 5630 bp 毒性当量因子-GBD 和纯化使用 dna 凝胶萃取试剂盒根据制造商的指示和量化 DNA 的吸收率在 260 nm 的分光光度计12。
注: 生成诱饵编码插入。DNA 片段编码的蛋白质或蛋白质片段的兴趣可以利用基因合成和可用作为 uncloned 片段。建议在酿酒酵母中对密码子进行最佳表达, 并将密码子优化的在线工具包括在材料列表中。 - 对于 5 ' 插入, 侧面的 DNA 片段编码一个 ATG 开始密码子由 5 '-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3 ' 和 5 '-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3 ', 分别。对于 3 ' 插入帧与 Gal4 DNA 结合域, 侧面编码片段由 5 '-ctgcatatggccatggaggccgaa-3 ' 和 5 '-tagtaactagcataaccccttggggcc-3 '。
- 对于质粒结构, 请按照制造商指示的快速装配方法将片段克隆成切 pTEF-GBD。
- 板块全部转化为 16-20 小时, 在37摄氏度的 Kanr 板和孵化. 殖民地住房 pTEF-GBD 与所需的插入可以通过 PCR 扩增, 使用寡核苷酸: 5 '-CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3 ' 和 5 '-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC 3 ' 为 5 ' 插入和 5 '-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3 ' 和5 '-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3 ' 为 3 ' 插入。这些寡核苷酸也可以作为排序插入的引物。
- 规划每 pTEF GBD 衍生物和 pTEF GBD 的制备 > 10 µg, 为测序和酵母转变提供材料。
- 使用以下 PCR 条件: 3 分钟在98°c, 跟随25个周期三十年代在98°c, 三十年代在55°c 和 2 min 在72°c, 跟随5分钟在72°c 使用包含2.5 毫米氯化镁2的缓冲区, 0.5 U/100 µL DNA 聚合酶和专有缓冲器。
3. Gal4-DNA-binding 域融合蛋白的表达
- 制作合格的酵母。
- 通过服用无菌的木制涂抹器, 将 PJ69-4A 酵母 YPD 板上, 刮1毫米3的-80 °c 冷冻库存, 并轻轻地擦过 YPD 板。将木制的涂抹器移下盘子, 使每个通行证穿过介质表面的未触及部分。将 YPD 板孵育30°c 2 天, 或直到单个菌落可见。在水或生长培养基中悬浮酵母, 使 PJ69-4A 酵母冷冻储存, 补充亚砜为 7%, 贮存于-80 摄氏度。
- 接种一个单一的殖民地在5毫升的文化 YPD 在一个20毫米 x 150 毫米培养管使用无菌的木制涂抹器和在30°c 隔夜增长在一个震动孵化器在 200 rpm。
- 在250毫升的无菌锥形瓶中接种50毫升的 YPD, PJ69-4A 酵母菌株的隔夜培养4毫升。生长在震动孵化器在30°c, 200 rpm 到光学密度 (OD600) 大约 1.2, 由分光光度法确定以标准 1 cm 光路径。增长通常需要 5-7 小时。
- 在台式离心机室温下, 以 4696 x g 为5分钟, 在50毫升锥形管中沉淀分离酵母。倾倒到液体废料中, 弃上清液。使用吸管, 并用重悬5毫升的转化缓冲颗粒, 并转移到15毫升圆锥管。Resediment 放弃上清, 并并用重悬酵母在1毫升的最终容积的转化缓冲器与1000µL 吸管。
- 孵育酵母细胞60分钟在30°c, 而颤抖在 200 rpm, 然后放在冰上 30-90 分钟。
- 酵母质粒的转化。
- 在1.5 毫升的无菌离心管中, 添加1µg 的 pTEF-GBD 基质粒和5µL 10 毫克/毫升鲑鱼精子载体 DNA 溶液。还包括一只含有鲑鱼精子载体 DNA 作为负转化控制的管。用吸管将100µL 的冰冷酵母细胞悬浮在每管上。添加100µL 70% PEG 溶液与1000µL 吸管和混合轻轻地弹管 5-10 倍 (不涡)。
- 孵育在30°c, 在震动孵化器在200转每分钟45分钟。
- 热休克在42°c 15 分钟。
- 沉积物在离心在 845 x g 在室温下3分钟, 去除和丢弃上清, 并用重悬颗粒在150µL 的无菌水中吹打上下, 并扩散到一个 CSM-跨国激进板块的表面。
- 放置在30°c 孵化器和孵化2-3 天, 直到殖民地可见的板块右侧。在30°c 6-12 小时的孵化后, 板块可能会颠倒, 以避免板材表面凝结。
- 以 2-3 个殖民地每转换和条纹作为一个补丁上的 CSM-多党板块使用无菌牙签。允许生长24小时, 在30摄氏度。
- 使裂解物蛋白表达。
- 接种3毫升的 CSM-激进党的液体介质与匹配头大小的酵母从补丁和增长隔夜在30°c 在20毫米 x 150 毫米培养管, 而颤抖在 200 rpm。每一个诱饵和空 pTEF-GBD 向量两个通宵文化。
- 加入1毫升的 YPD 到每3毫升的 CSM-跨国激进党文化。生长1小时在30摄氏度, 而颤抖在 200 rpm。用分光光度计检查细胞的 OD。
- 沉积一个等价的细胞数, 根据 OD 正常化。使用无菌1.5 毫升的离心管, 5 分钟旋转 2348 x g 在室温下的离心。用吸管丢弃上清液。最后的股票相当于至少2.1 的 OD。
注意: 在计算相等数量的单元格时, 可能需要从每晚的区域性中获得不同的卷, 以达到最小的 2.1 OD。 - 并用重悬450µL 0.2 米氢氧化钠中的颗粒, 上下吹打。室温下孵育5分钟。Recentrifuge 细胞在室温下以 2348 x g 为2分钟, 用吸管去除上清液。
- 并用重悬50µL 旋转缓冲器的球团, 吹打上下小心, 不会产生气泡。热样本为5分钟, 在70摄氏度。
- 通过 SDS 页检查蛋白质表达。
- 使用梯度凝胶 4-20%, 以确保大范围的分子量可以解决。将样本的等效数量 (相同 OD) 加载到 SDS 页凝胶中, 并确保至少包含一个包含未修改的 pTEF GBD 向量13,14,15的示例。
- 电泳分离后, 使用抗 c-myc 单克隆或多克隆抗体和 ECL 检测解决方案 (图 3) 将凝胶转移到硝化棉和应用免疫印迹。
4. 自活化试验
- MATalpha 酵母从-80 °c 的股票对应的应变住房的猎物图书馆的 YPD 板上采取了一个无菌的木制涂抹器, 从瓶子里刮出少量的酵母, 并在 YPD 板上裸奔。将 YPD 板孵育30°c 2 天, 或直到单个菌落可见。将一对夫妇单一的殖民地贴在 YPD 板上, 在30摄氏度的一夜之间孵化。
注意: 在这里开发的新的应变房子猎物库是 PLY5725, 而一些兼容的商业可用的 Y2H 图书馆被安置在 Y187。 - 按照 3.3.1 3.3.4 中的过程, 使用用于存储所需的猎物库的基于LEU2的质粒来转换 PLY5725。在这里开发的图书馆, 相应的质粒是 pGal4AD (pPL6343)。要恢复酵母转化, 板到 CSM-列伊满足板。在殖民地出现之后, 条纹作为补丁到 CSM-列伊遇见的板材和孵育24小时在30°c。
- 遵循3.4 中的协议, 通过抗 HA 单克隆或多克隆抗体和 ECL 检测解决方案, 确认 pPL6343 空载体的表达。
- 将每种转化后的 PJ69-4A 酵母与 PLY5725 构造在一个 YPD 板上, 在3.4 和4.3 的协议节中证实表达蛋白, 并在30°c 过夜孵化。采取1毫米3的细胞, 其中两个菌株已共同成长, 并修补到单独的 csm-列伊, csm, 和 csm-多党-列伊板块和增长 24 h。
注: 所需的 diploids 将生长在 CSM-跨国激进-列伊板块。csm-列伊和 csm-多金属板块的生长对酵母生长起着积极的控制作用。 - 在1毫升的 CSM-多党-列伊媒体上, 在30摄氏度一夜之间生长 diploids。沉积物500µL 细胞在1.5 毫升离心管在 2348 x g, 3 分钟在室温下离心。用吸管丢弃上清液。并用重悬1毫升的无菌水中的细胞, 重复沉淀和泥沙。检查单元格的 OD600 。
- 用无菌水对每个细胞悬浮液进行一系列1:10 系列稀释, 其起始最集中的溶液为0.5。点5µL 每稀释到一个 csm-列伊多党板块, 一个 csm-列伊多党-他的盘子, 和一个 CSM-Leu-Trp-His+3AT 板块。孵化30摄氏度, 每天检查增长3天 (图 4)。
注: 对于1:10 系列稀释, 吸管10µL 的管含有0.5 到90µL 的水和混合吹打上下。继续制作1:10 系列稀释直到有六种不同浓度的斑点。
5. 用诱饵和猎物库创造酵母种群
注意: 住宅商业猎物库质粒的 Y187 菌株不太好交配。因此, 需要以下优化条件来维护库的复杂性。包含 Y2H 猎物库的 PLY5725 菌株更好, 相同的交配过程可以与此应变 (图 5) 一起使用。
- 接种每 PJ69-4A 转化的3毫升的培养物, 携带各种TRP1的 pTEF GBD 诱饵质粒在 CSM-多党培养基中的培养管中。包括两种单独的文化, 仅包含 pTEF-GBD 载体质粒作为过程控制。孵化的文化在30摄氏度, 200 rpm 6 小时, 然后稀释成25毫升的文化, 在一个无菌的锥形烧瓶过夜生长。
- 在室温下解冻含有LEU2的 MATalpha 细胞的冰冻 (-80 °c) 瓶, 携带 "猎物" 库。接种125毫升的 CSM-列伊满足媒体在一个无菌锥形瓶与整个解冻瓶。在30摄氏度, 以200转每分钟的震动生长所有的文化。
注意: 隔夜区域性的 OD600需要介于1.0 到1.5 之间, 然后再继续执行下一步步骤。 - 离心机 21 PJ69-4A 转化文化的当量, 在室温下 4696 x g 旋转5分钟。每10个交配反应, 颗粒 39 OD600当量的 MATalpha 菌株携带图书馆质粒在单独的50毫升圆锥管。
- 在10毫升的无菌水中并用重悬细胞, 在台式离心机的室温下, 在50毫升的锥形管中重新颗粒 4696 x g 5 分钟。使用吸管, 轻轻地移除上清, 不破坏颗粒细胞。
- PJ69-4A 细胞在4毫升和 PLY5725 细胞中的并用重悬颗粒, 10 毫升 bYPDA (pH 3.7)。
- 为建立交配反应, 加入1毫升的 PJ69-4A 转化细胞, 1 毫升 MATalpha 文库细胞, 1 毫升 bYPDA pH 3.7 到新的50毫升圆锥管。孵育在30°c 与柔和的轨道鼓动 (100-130 rpm) 为90分钟。
- 离心细胞为5分钟, 在 4696 x g, 在室温下的台式离心机。用吸管去除上清液, 并用重悬2毫升 1:1 bYPDA: YPD。板所有2毫升到100毫米 YPD 板上的吸管和孵化30°c 约20小时。
- 利用细胞刮刀从 YPD 板上收获细胞, 将细胞转化为 2-3 毫升的 CSM-列伊多党媒体。吸管将细胞脱落成50毫升的锥形管。用1000µL 吸管吹打介质, 并在 YPD 板表面轻轻弹出介质, 用 2-3 毫升的 CSM-列伊多党介质冲洗盘子 4-5 倍。
- 离心细胞为5分钟, 在室温下在台式离心机 4696 x g。用吸管去除上清液, 并用重悬40毫升的 CSM-列伊多党介质中的细胞, 吹打上下 (不要涡旋)。
- 为了估计形成的双胞细胞的数量, 将双倍混合混合物的4µL 稀释成200µL 和2000µL CSM-多党-列伊的介质。板200µL 每稀释到一个 CSM-列伊多党板块。
注: 两个板块代表1:10,000 和1:100,000 倍稀释的 diploids 的库存, 并产生预期的 ~ 9000-2.7万殖民地在1:10,000 稀释板孵化后, 30 °c 36-40 h. 在步骤5.7 之后检查车牌。1:10,000 稀释板上至少有200个菌落需要进行步骤5。8 - 立即采取每40毫升细胞泥沙的其余部分和接种1000毫升锥形瓶含有500毫升的 CSM-列伊多党媒体。采取初始 OD600。孵化这些烧瓶在30°c 与震动在 180 rpm, 直到他们达到饱和 (~ 2.0 OD/毫升)。这通常需要大约 36-40 小时的时间, 在24小时内监测增长, 然后在36小时内通过 OD600。
- 使用吸管, 从每一个饱和的500毫升的文化和 innoculate 2000 毫升的锥形烧瓶中移除20毫升的整除数, 其中一个含有750毫升的 csm-列伊多党媒体, 第二个含有750毫升的 csm-列伊激进党-他的最低水平 3AT,消除背景 (以前在第4.5 节中确定)。混合新的文化 (770 毫升) 以及旋转和采取初始 OD600。
- 孵育的文化在30°c, 而晃动在 180 rpm, 直到达到饱和, 这通常发生在24小时内未选定的 CSM-列伊多党文化, 并可以采取超过 70 h 的文化选择为 Y2H 互动。
- 一旦培养达到饱和度 (OD ~ 2.0), 去除11毫升的吸管, 沉积的细胞以5分钟的旋转在 4696 x g 在室温下, 放弃上清, 并冻结在-20 摄氏度或继续进行 DNA 提取。选定的和未选定的示例都将用于深度排序。
6. DEEPN 深度测序样品的制备
- DNA 提取。
- 使用吸管在500µL 的并用重悬中, 从5.7 号协议部分中的细胞颗粒中, 转移到1.5 毫升的离心管。添加3µL 的 betamercaptoethanol 和10µL 的 Zymolase 库存。混合良好和孵化在37°c 孵化器为24-36 小时。
- 用500µL 苯酚/氯仿/异戊醇提取样品两次, 同时使用通风罩16。
- 添加7µL 4 米氯化钠, 900 µL 的冰冷100% 乙醇 (乙醇), 混合通过反转和冻结-20 °c 或继续沉积 DNA 通过旋转在 21130 x g 在室温下在离心的10分钟。
- 用吸管丢弃上清液。用900µL 70% 乙醇, 三次清洗颗粒。
- 泥沙颗粒 21130 x 克, 2 分钟, 并去除残留乙醇洗涤的吸管。干颗粒为7分钟, 在42摄氏度。
- 并用重悬颗粒在120µL 37 °c 水浴90分钟, 每隔30分钟就能把管子搅拌一遍。
- 吸管60µL 提取的 DNA 成无菌1.5 毫升离心管。添加120µL, 3.5 µL RNase 一股, 轻拍混合和孵化37°c 1 小时。
- 乙醇沉淀如前所做的部分 6.1.3-6.1.5, 但使用7µL 5 米醋酸铵而不是4米氯化钠。
- 并用重悬 RNase 在55µL 0.1x 的37摄氏度水浴中处理的 dna 为90分钟, 每隔30分钟就能把管子混合在一起. 通过光度法在分光光度计上吸收 260 nm 来量化 dna。
- PCR cDNA 插入物。
- 每个 DNA 样本执行两个50µL PCR 反应。每个反应包含 25 pmol 的每向前和反向底漆匹配的猎物库质粒 (见材料)。反应也包含25µL 高保真 2x PCR 大师组合, 5 µg 的 DNA 样本, 水可达50µL. 放大反应为25个周期以3分钟的延长的时间在72°c, 退火温度55°c 三十年代, 并且变性在98°c 十年代. 骑自行车之前由三十年代变性在98°c 并且跟随以5分钟孵化在72°c。
- 用 1% dna 琼脂糖凝胶电泳法分析4µL 的 PCR 反应, 其中含有 0.2-0.5 µg/毫升 EtBr17的 dna 琼脂糖凝胶。通过紫外线透视可视化 DNA 样品。样本将显示大约 1-3 kb 的 DNA 涂片, 其中可以找到用于选择 Y2H 交互的样本 (图 6) 的带状模式。
- 将重复 pcr 样品和纯化使用 pcr 纯化试剂盒按照制造商的指示和量化 DNA 的吸收率在 260 nm 的分光光度计。
7. 深度测序
注: 一个深测序平台上的样品准备和测序通常在商业和学术 DNA 测序核心设施中得到。
- 用高性能超 sonicator 剪切600的 PCR 产品, 给出平均长度为300的 bp 的碎片。
- 使用用于深度排序的准备工具包生成索引排序库, 该套件在 DNA 片段的两端不对称地添加连接器编码条形码、启动站点和捕获序列。
- 根据制造商的指示执行库准备工作。池索引库和序列作为长配对结束读取在一个深测序平台上 (例如, 2 x 150 bp PE 读取)。每个示例所需的读取数量介于10和4000万之间, 对未选定的群体所需的读取次数通常更为复杂。我们建议至少2000万个或更多的读取为未选定的人口。
8. 生物信息学加工和验证
- 以 fastq 的形式处理 DNA 排序数据与一组独立的软件程序构建到 (1) 映射序列读取文件中的通用 SAM 格式(2) 量化数据集之间的基因富集(3) 对数据进行统计分析。为了排列哪些候选基因对 Y2H 交互作用是正的, (4) 提供有关哪些区域和哪些平移框架的信息, 每个基因片段产生正 Y2H 相互作用的每一个猎物 cDNA, (5) 提供工具, 不仅重建 5 ', 而且 3 ' 结束互动片段允许他们的重建和验证的传统 Y2H 格式。在随附的研究中详细介绍了这些程序的操作。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Y2H 检测被广泛用于寻找蛋白质: 蛋白质相互作用和几个适应和系统已经开发。在大多数情况下, 同样的考虑, 帮助确保成功的这些以前的方法是重要的 DEEPN。一些重要的基准包括: 确保 DNA 结合领域融合蛋白的表达, 确保在 diploids 的低背景下, 他 + 生长在含有与空捕食质粒感兴趣的诱饵, 诱饵的交配效率高含有马来酵母与库含 MATalpha 酵母, 最后, 低严格的条件, 使人口增长的条件下, 选择许多积极的 Y2H 反应, 甚至那些产生低 His3 活动和弱Y2H 转录应答。
DEEPN 的一个关键方面是重现性将 Y2H 库引入含有不同诱饵质粒的菌株, 并可靠地为那些产生积极 Y2H 相互作用的库质粒选择这些种群。当 Y2H 库的复杂性增加时, 这就变得更加困难, 因为要确保整个图书馆在不同的初始人口之间进行充分的迁移是困难的。此外, 选择条件下选择生长的种群大小和测序深度必须足够大, 以观察 Y2H 质粒组成的可重复变化, 以可靠地识别真正的正 Y2H 相互作用。在以前的研究中, 我们使用了商业上可用的 Y2H cDNA 文库。我们发现, 在 Y2H 库中, 携带同一诱饵质粒的不同种群之间的分布是低的, 两个初始种群之间的 overdispersion 通常选择 < 0.01, 而 0.35-0.55 用于分离选择4后的填充。但是, 某些商业上可用的 Y2H 库的复杂性相当低 (图 7)。此外, 它里面的许多克隆 (60%) 完全是由编码区域的 3 ' 的 cDNA 片段组成的, 这进一步限制了它们的效用。为了证明上述方法能够容纳更复杂的 Y2H 库, 我们在简化的 "猎物" 质粒向量 (pGal4AD) 中创建了一个新的 Y2H 库, 其中包含来自Saccaromyces 酵母的基因组 DNA 片段 (应变PLY5725)。基因组 DNA 被剪切碎片, 大小为 600-1500 bp 的范围选择, 用适配器修改, 并插入 pGal4AD 以创建 SacCer_TAB Y2H 库 (图 8)。该图书馆被转化为 PLY5725, 它产生了一个酵母种群, 然后交配到单独的样本 PJ69-4A, 携带 pTEF-GBD 质粒单独。在非选择性和选择性条件下, 重复双倍种群生长。采用深度测序法对 Y2H 质粒库的插入进行了分析。当映射到包含 100 bp 在每个蛋白质编码区域的上游和下游的基因组 DNA (84% 的整个基因组), 我们发现 > 110万不同的质粒在图书馆的估计总大小的图书馆在135万不同的酵母质 粒。作为比较, 我们还改变了以前描述的酵母基因组 Y2H 库11 (PJ_C1,C2,C3 Y2H 库) 在 MATalpha 酵母, 并进行了相同的分析, 如上所述。我们发现, 我们的随机片段酵母 Y2H 库的复杂性远远高于以前发布的库 (图 9), 它对每个基因的帧片段进行了更高的编码。重要的是, 生成包含双倍种群的初始库是非常重复的, 其 overdispersion < 0.01 (图 10)。此外, 在选择阳性 Y2H 相互作用后, 具有两种不同酵母种群的重复性产生了类似的再分发质粒, 产量为 overdispersion 0.3。因此, 这里的方法可以容纳比以前使用的更大的复杂 Y2H 库。
在提高 DEEPN 的易用性方面, 我们更倾向于使用基因合成技术对诱饵蛋白进行插入编码。这允许编码区域为蛋白质领域, 合体和突变体容易地被加入 Y2H 诱饵质粒, 但也允许他们的密码子被优化为表达在S. 酵母。在图 3中演示了两种不同 Gal4-DNA-binding 域融合蛋白的表达式。两种不同的酵母转化表达两种诱饵融合蛋白之一, 并接受 SDS 页和免疫印迹法的抗 c-myc 抗体。注意诱饵蛋白的表达水平相对于 Gal4 DNA 结合域单独从空向量。我们发现重要的是, 不仅要验证诱饵融合蛋白的表达, 而且要验证确切的蛋白酵母转化菌落中的表达, 将用于扩大和交配的猎物库含有酵母。一旦确定了转化, 就有可能将其冻结并存储以供以后使用。
图 4显示了一个自激活测试, 其中将双细胞的串联稀释被镀到 CSM-列伊激进党 (+ 他), CSM-多党-列伊-他 (他), 和 CSM-Trp-Leu-His+3AT (-His+3AT) 板块, 并允许增长30摄氏度3天。理想的结果是观察在存在中的生长, 而不是不存在组氨酸, 无论是否有3AT。这将允许使用 CSM-多党-列伊-他选择酵母与积极的酵母 2-杂交互动。如果 CSM-列伊多党-他的板块的增长, 那么 Y2H 的选择仍然可以获得使用最低浓度 3AT, 以防止增长。我们发现, 如果增长可以阻止在 CSM-多党-列伊-他的 + 0.1 毫米 3AT, 然后 DEEPN 化验可以继续使用这个条件来选择 Y2H 相互作用。但是, 如果抑制含有 pGal4AD 或其他空捕食质粒的 diploids 的生长, pTEF GBD 诱饵融合质粒需要较高浓度 3AT, 则会损害 DEEPN 过程的性能和不同的诱饵质粒。应寻求。请注意, 他的 + 增长是一个积极的 Y2H 互动的唯一选择。我们发现这足以丰富 Y2H 的相互作用。
DEEPN 工作流程中最关键的程序之一是通过携带 Y2H 猎物库的 MATalpha 酵母, 实现对携带诱饵质粒的马来酵母进行高效交配。我们发现一些菌株 (例如, Y187)18, 住房商业上可用的 cDNA 文库, 具有相对较差的交配效率。出于这个原因, 我们设计了一个带 Y2H 库的应变。这种应变是基于 BY4742, S288c 的衍生物。此应变缺少GAL4、 GAL80、 TRP1、 LEU2和HIS3。它不包含对混合 Gal4 蛋白和不同杂交 (例如, LexA-VP16) 反应的记者。相反, Y2H-induced His3 生产的来源是位于马特菌株, 将携带特定的诱饵质粒。这简化了系统并允许更大的灵活性, 因为可以使用相同的库包含 MATalpha 单元格来与表示莱克萨诱饵融合蛋白和莱克萨 (无人参与) 的菌株交配,HIS3记者或 Gal4-DBD-bait 融合蛋白和 Gal4(无人接入)-HIS3记者。
一旦两个携带诱饵质粒和图书馆的双人种群被生成, 它们就会被稀释并允许生长, 条件是只选择两种粒 (例如, CSM-多党-列伊) 或两种粒的正 Y2H 相互作用,驱动生产 His3 (例如, CSM-列伊跨国激进党-他)。重要的是开始大量的开始人口, 以避免进化的 "瓶颈", 可以扭曲的人口, 结果后, 选择为积极的 Y2H 互动。因此, 我们的程序指定使用20毫升的500毫升的双倍人口培养, 以750毫升的新的 CSM-列伊多党-他的媒体, 以避免这个问题。以 pTEF GBD 为诱饵质粒, 我们发现一轮稀释和生长足以形成一个信息丰富的种群。使用不同的诱饵质粒以前, 我们使用了两个回合的稀释和生长, 最初的20毫升到750毫升, 然后2毫升从那饱和的文化稀释了75毫升。图 6显示了在非选择性条件下生长的双种群, 以及在选择性条件下第一和第二次连续的稀释和生长, 两种不同诱饵质粒。请注意, 没有选择, 有一个广义的涂片 PCR 产品指示一个复杂的和相对良好的标准化混合的片段。在选择时, 这种模式会发生变化, 有些物种会非常丰富, 这样就可以辨别出各个波段。某种程度上的条纹是迄今为止进行的成功实验的典型, 然而除了一种涂抹模式外, 还有一条条纹图案, 表明了一种复杂的猎物插入物混合物, 如果想要最大化候选者的数量, 这是可取的。DEEPN 检测到。非常强的带状模式, 其中大多数 PCR 产品在 1-3 波段发现, 表明大多数测序数据将只占 1-3 的猎物插入。你可能通过投入更多读从这个样品能补偿这部分。人们可以看到, 如果人口被稀释并进一步增长 (参见图 5中的 "选定的 d2"), 则带状模式更为突出, 表明在选择少量猎物时, 赋予弱但真实的 Y2H 相互作用的捕食质粒正在减少。质粒增加了它们的丰度。连续稀释和增长到这种过度的水平被认为是适得其反的目标, 以抓住最大数量的潜在候选人, 从而在这里的协议, 我们建议使用一轮稀释和增长。
图 1: DEEPN 工作流的示意图.实验室程序的总大纲显示在左侧, 同时还有完成相应任务所需的大约时间。右侧是使用 DEEPN 和 Stat_Maker 软件包的生物信息学工作流。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: pTEF GBD 的示意图.显示了含有低拷贝 Gal4 DNA 结合域融合蛋白表达质粒的TRP1。它具有一个构成的TEF1启动子、c-myc 表位标记、Gal4 DNA 结合域, 之后是一个 T7 RNA 聚合酶结合点、polylinker 和 PRM9 (以) 为基础的质粒。该质粒还具有卡那霉素耐药性和 ColE1 细菌起源的复制。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: Gal4-bait 融合蛋白的表达式.裂解物从酵母表达不同的诱饵蛋白融合到 Gal4 DNA 结合领域表达的 pTEF GBD 被置于 SDS 页和免疫印迹法的抗 c-myc 抗体。pTEF-GBD 仅表示 Gal4-DNA-bindng 域;pTEF-GBD-bait1 表示 Gal4-DNA-bindng 域融合到 RhoA 缺乏其 C 终端 prenylation 站点和外壳一个突变锁定它成一个 GTP 约束构象;pTEF-GBD-bait2 表示 Gal4-DNA-bindng 域融合到一个 RhoA 缺乏其 C 终端 prenylation 站点和住房一个突变锁定它成 GDP 约束的构象。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 自激活测试.Diploids 由 PJ69-4A 细胞携带的指示饵质粒和 PLY5725 细胞携带的指示的猎物粒被连续稀释, 并发现在 csm-列伊多金属板块, csm-列伊-激进党-他的盘子, 和 CSM-Leu-Trp-His+3AT 板, 并种植3天在30°c。用于交配的 PJ69-4A 转化是图 3中显示的每一对中的第一个。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: Y187 与 PLY5725 的交配效率.对含有TRP1的诱饵载体的 PJ69-4A 与 Y187 或 PLY5725 携带的捕食质粒进行了交配反应。1:10,000 稀释被镀到 CSM-多党-列伊, 以选择 diploids。PLY5725 菌株的交配效率比 Y187 菌株高出10倍, 产生的菌落多。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 猎物库插入的 PCR.DNA 是从双酵母中分离出来的, 其中含有一个在非选择性条件下生长的猎物库 (csm-列伊-多党媒体) 或选择积极的 Y2H 相互作用的条件 (csm-列伊-激进党-他的媒体)。PCR 贯穿库插入显示选择的插入曲目的差异。使用了两轮选择性生长。最初的一轮生长是通过稀释20毫升的500毫升的双体培养成750毫升的非选择性的 csm-列伊多党媒体, 另有20毫升到750毫升的 csm-列伊多党-他的媒体, 为最初一轮选择性增长 (d1)。随后又增加了一轮生长 (d2), 采取了2毫升的 d1 文化, 并稀释成75毫升选择性介质 CSM-列伊多党-他的。请单击此处查看此图的较大版本.
图 7: Y2H cDNA 文库的复杂性.一种商用小鼠 cdna Y2H 的含量分析猎物库: 一个从小鼠大脑 cdna 和一个从多个小鼠组织的文库。请单击此处查看此图的较大版本.
图 8: Y2H 酵母基因组片段库的生成。A.描述酵母基因片段库的组装到 pGal4AD 的示意图。菌株 PLY5725 的基因组 DNA 被随机剪切, 与指示的 Y 型适配器结扎, 并结扎成 SfiI 切 pGal4AD。结扎被转化为细菌, 产生 2.2 x 106独立的菌落, 它们在质粒 DNA 分离之前被组合和生长, 构成了 SacCer_TAB Y2H 库。B.显示了 Gal4 转录激活域的LEU2包含的质粒 (pGal4AD) 外壳。请单击此处查看此图的较大版本.
图 9: Y2H 酵母基因组库的复杂性.将 SacCer_TAB 基因组库转化为 PLY5725 MATalpha 菌株, PJ_C1,C2,C3 酵母基因组库转化为Υ187ΜΑΤalpha 菌株。这些种群的 Diploids 是通过交配 PJY69-4A 菌株进行的。种群生长了10代, 而猎物片段 PCR 扩增则受到高通量测序和分析。A.显示 Y2H 库中每个基因的读秩顺序, 除以通过序列化酵母基因组所发现的每个基因的读数。每个基因的等效丰度, 每个基因的值为1。B.直方图显示每种基因的唯一质粒数, 编码了蛋白质编码区域 (ORF) 和正确平移阅读框架中的片段。C.比较每个库中对酵母基因进行编码的不同质粒的数量, 以及它们在正确的平移阅读框架或向后插入的比例。D.图显示了映射到每个库中的质粒的示例基因 (VPS8和VPS16) 的交叉点的位置和丰度。质粒与基因融合在正确的翻译阅读框架被选定蓝色。请单击此处查看此图的较大版本.
图 10: DEEPN 与复杂 Y2H 酵母基因组库的重现性。A.四种不同的酵母双倍种群是通过与位于 PLY5725 的 SacCer_TAB Y2H 库进行交配而产生的, 在非选择性条件下生长, 并进行了排序。每个种群的每种基因的读数分别被绘制为平均秩序值在所有人口中的函数。B.显示在选择了正 Y2H 交互后两个样本之间的每个基因的读数。请单击此处查看此图的较大版本.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这里, 我们提供了如何使用优化方法在批处理中执行 Y2H 化验的指南。在这个过程中有几个关键步骤, 以帮助确保将被放置在选择下的酵母的人口是起始库的代表, 并且足够的开始酵母人口用于接受选择限制变异.重要的是, 这些基准相对容易实现, 同时适应传统的 Y2H 检测方法和材料, 从而使大多数实验室都能使用标准分子生物学的方法。在使用不同的诱饵质粒时, DEEPN 允许从相同的猎物库种群中进行选择。因此, 一组互动的候选人, 产生一个 Y2H 的互动与一个诱饵对另一个可以直接比较。由于使用深度测序, 可以验证每个诱饵特定酵母种群的起始库组成, 并在库中独立地跟踪每个候选猎物基因的富集。批处理允许以半定量方式查询同一个库, 从而允许一个计算统计排名4。
此协议中有几个步骤对成功至关重要。一是必须获得大量的 diploids, 以确保 Y2H 猎物库的充分代表性与每种诱饵质粒的利益混合在一起。这里描述的交配过程是通过改变几个参数来优化的。我们发现, 房子商业 Y2H 库的一些菌株一般都很差, 但是, 这里描述的交配过程可以生成 2 x 106-2 x 107 diploids 之后, 允许适当和可重复地转移 Y2H图书馆入人口。该程序的另一个关键方面是确保所感兴趣的诱饵质粒不会产生一个积极的 Y2H 相互作用本身或与空 Gal4 激活领域的猎物质粒。选择 Y2H 交互的方法是要求在没有组氨酸的情况下生长, 其中积极的 Y2H 相互作用诱导了HIS3的转录, 使细胞成为他的 +。虽然常规的传统 Y2H 化验可以添加竞争抑制剂 3AT, 以减少背景的增长或使用其他记者3 , 这一过程是最好的, 当细胞与弱 Y2H 相互作用可以增长, 从而增加严格的增长并且只对具有强 Y2H 相互作用的细胞进行选择, 限制了可以识别的猎物质粒的汇辑。另一个关键的方面是确保大量的起始双种群用于在选择性和非选择性条件下生长, 以避免从采样错误4中产生进化瓶颈。下面指定的区域性卷和单元格编号将有助于确保重现性和减少噪音。
DEEPN 方法强大的原因之一是它可以全面地跟踪给定的猎物库中的所有质粒, 因为它们能够与感兴趣的诱饵相互作用。因此, DEEPN 的一个局限性就是所使用的图书馆的复杂性。对于一些商业图书馆, 比如我们在这里使用的, 我们发现, 在 Gal4 激活域的同一读取帧中, 编码 cDNA 的真实片段的质粒数量介于 3-6 x 104之间, 表示为 ~ 6000-8000种不同的基因。我们发现, 近75% 的这些库包含的片段仅对应于编码 DNA 序列 (CDS/ORF) 的 3 ' 的 cDNA 区域。此外, 在库中有片段的几乎第三个基因中, 没有一个对应于 orf 或在其上游的区域。
我们对 DEEPN 方法做了三其他更改。一个是新的 MATalpha 菌株, 它可以携带 "猎物" 库, 存放在TRP1质粒中, 并且比一些商业上可用的包含诸如 Y187 的库类菌株要好得多。这有助于确保每个感兴趣的诱饵完全转移图书馆的人口。我们还制作了一种新的 "诱饵" 表达质粒, 不同于以前所描述的使用基于可变拷贝2µ的主干10的粒。在这里, 我们描述一个低拷贝的 pTEF 质粒 (GBD), 并发现单轮选择性生长足以丰富的相互作用的猎物粒。最后, 我们构建了一个简化的 "猎物" 库向量, 用于为Saccharomces 酵母生成高密度随机片段基因组 Y2H 库, 在将来发现和描述相互作用时将会有帮助 amonst酵母蛋白。总的来说, 材料和生物信息学工具的改进 (在附带的工作中描述) 使 DEEPN 方法成为实现全面和比较 Y2H 屏幕的一种可访问、可行和有效的方法。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的
Acknowledgments
我们感谢人类遗传学研究所内的工作人员对图书馆的准备和测序。我们感谢 Einat Snir 在为这里制作的 Y2H 质粒库编写基因组文库片段方面的专长。这项工作得到国家卫生研究院的支持: NIH R21 EB021870-01A1 和 NSF 研究项目赠款: 1517110。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Illumina HiSeq 4000 | Illumina | deep sequencing platform | |
| Monoclonal anti-HA antibodies | Biolegend | 901514 | Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs |
| Polyclonal anti-myc antibodies | QED Biosciences Inc | 18826 | Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs |
| NarI | New England BioLabs | R0191S | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3236S | |
| XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
| Polyethylene Glycol 3350, powder | J.T. Baker | U2211-08 | |
| Salmon Sperm DNA | Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific | 50-948-286 | carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1. |
| Kanamycin Monosulfate | Research Products International | K22000 | |
| LE Agarose | GeneMate | E-3120-500 | used for making DNA agarose gels |
| Sodium Chloride | Research Products International | S23025 | |
| Tryptone | Research Products International | T60060 | |
| D-Sorbitol | Research Products International | S23080 | |
| Lithium Acetate Dihydrate | MP Biomedicals | 155256 | |
| Calcium Chloride | ThermoFisher | C79 | |
| EDTA Sodium Salt | Research Products International | E57020 | |
| Yeast Extract Powder | Research Products International | Y20020 | |
| Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids | Research Products International | Y20040 | |
| CSM-Trp-Leu+40ADE | Formedium | DCS0789 | |
| CSM-Trp-Leu-His+40ADE | Formedium | DCS1169 | |
| CSM-Leu-Met | Formedium | DCS0549 | |
| CSM-Trp-Met | Bio 101, Inc | 4520-922 | |
| L-Methionine | Formedium | DOC0168 | |
| Adenine | Research Products International | A11500 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International | G32045 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | used for making media plates in section 1 |
| Peptone | Research Products International | P20240 | |
| 3-amino-1,2,4 Triazole | Sigma | A8056 | |
| 2-Mercaptoehanol (BME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Zymolyase 100T | USBiological | Z1004 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P8281 | |
| Phenol:Chloroform:IAA | Ambion | AM9732 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 238074 | |
| Ethanol | Decon Laboratories, INC | 2716 | |
| RNAse A | ThermoFisher | EN0531 | |
| Urea | Research Products International | U20200 | |
| SDS | Research Products International | L22010 | |
| glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Tris-HCl | Gibco | 15506-017 | |
| bromophenol blue | Amresco | 449 | |
| Gibson Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5510S | Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2 |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541S | Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1 |
| Ethidium Bromide | Amresco | 0492-5G | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Used for purification of pcr products in section 6.2.3 |
| Qiaquick DNA Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1 |
| KAPA Hyper Prep kit | KAPA Biosystems | KK8500 | preparation kit for deep sequencing |
| Codon optimization | http://www.jcat.de | ||
| Codon optimization | https://www.idtdna.com/CodonOpt | ||
| gBlocks | Integrated DNA Technologies | DNA fragments used for cloning in Section 2.2 | |
| Strings | Thermofisher | DNA fragments used for cloning in Section 2.2 | |
| GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit | EPOCH Life Sciences | Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3 | |
| Covaris E220 | Covaris | high performance ultra-sonicator in section 7 | |
| oligo nucelotide 5’- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction | |
| oligo nucelotide 5’-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction | |
| oligo nucelotide 5’-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction | |
| oligo nucelotide 5’-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction | |
| oligonucleotide 5’-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | 5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD | |
| oligonucelotide 5’-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | 3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD | |
| oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | 5' Pimer used for insert amplification of pGADT7 | |
| oligonucelotide 5’- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | 3' Pimer used for insert amplification of pGADT7 | |
| PJ69-4A MatA yeast strain | http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436 | MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7 | |
| pTEF-GBD | Dr. Robert Piper Lab | Gal4-DNA binding doimain expression plasmid | |
| pGal4AD (pPL6343) | Dr. Robert Piper Lab | Gal4-activation domain expression plasmid | |
| 100 mm petri dishes | Kord-Vallmark sold by VWR | 2900 | |
| 125 mL PYREX Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63270 | |
| 250 mL PYREX Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63271 | |
| 1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63274 | |
| 2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63275 | |
| 20 X 150 mm Disposable Culture Tube | Thermofisher | 14-961-33 | |
| pipet-aid | Drummond | 4-000-100 | |
| 5 mL Serological Pipette | Denville | P7127 | |
| 10 mL Serological Pipette | Denville | P7128 | |
| 25 mL Serological Pipette | Denville | P7129 | |
| 1,000 mL PYREX Griffin Beaker | Fisher Scientific | 02-540P | |
| 1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | |
| 1,000 mL graduated cylinder | Fisher Scientific | 08-572-6G | |
| SpectraMax 190 | Molecular Devices | used to measure the Optical Density of cells | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | Spectrophotometer used to quantify amount of DNA |
| Electronic UV transilluminator | Ultra Lum | MEB 20 | used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel |
| P1000 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F123602G | |
| P200 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F123601G | |
| P20 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F123600G | |
| P10 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F144802G | |
| 1250 µL Low Retention Pipette Tips | GeneMate | P-1236-1250 | |
| 200 µLLow Retention Pipette Tips | VWR | 10017-044 | |
| 10 µL XL Low Retention Pipette Tips | VWR | 10017-042 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 490001-627 | |
| 15 mL conical tube | VWR | 490001-621 | |
| cell scraper | Denville Scientific | TC9310 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| HCl | Fluka Analytical | 318949-1L | |
| NaOH | J.T. Baker | 5674-02 | |
| Wooden applicators | Solon Care | 55900 | |
| Eppendorf microcentrifuge 5424 | Fisher Scientific | 05-400-005 | microcentrifuge |
| Sorvall ST16R | Thermo Fisher Scientific | 75004381 | benchtop centrifuge |
| Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE Healthcare | NA934-1ML | Secondary Antibody |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE Healthcare | NA931-1ML | Secondary Antibody |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34080 | ECL detection solution |
| Isotemp Incubator | Thermo Fisher Scientific | Incubator | |
| Mutitron 2 | INFORS HT | Shaking incubator | |
| Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205 | Fisher Scientific | water bath | |
| Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue) | Clontech | 630482 | commercially available cDNA Library |
| Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain) | Clontech | 630488 | commercially available cDNA Library |
| pGADT7 AD Vector | Clontech | 630442 | commercially available AD Vector housing many cDNA libraries |
| pGBKT7 DNA-BD Vector | Clontech | 630443 | commercially available DNA-BD Vector |
| Biolase DNA Polymerase | Bioline | BIO-21042 | DNA polymerase used for section 2.4 |
| GeneMate GCL-60 Thermal Cycler | BioExpress | P-6050-60 | pcr machine |
| TempAssure 0.5 mL PCR tubes | USA Scientific | 1405-8100 |
References
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
- Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
- Vidal, M., Fields, S. The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years. Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).
- Pashkova, N., et al. DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions. Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).
- Rajagopala, S. V. Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens. Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).
- Weimann, M., et al. A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome. Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).
- Yachie, N., et al. Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics. Molecular Systems Biology. 12 (4), 863 (2016).
- Trigg, S. A., et al. CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping. Nature Methods. , (2017).
- Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements. Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).
- Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins. Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).
- James, P., Halladay, J., Craig, E. A. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).
- Barbas, C. F. 3rd, Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J.
- Sambrook, J., Russell, D. W. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Alegria-Schaffer, A. Western blotting using chemiluminescent substrates. Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).
- Plank, J. Practical application of Phenol/Chloroform extraction. , Available from: http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction/ (2018).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).
- Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell. 75 (4), 805-816 (1993).
