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Biochemistry

एक खमीर 2-बैच में संकर स्क्रीन प्रोटीन बातचीत की तुलना करने के लिए

Published: June 6, 2018 doi: 10.3791/57801
Automatic Translation
1, 1, 1
1Molecular Physiology and Biophysics, University of Iowa

Summary

2 खमीर के बैच प्रसंस्करण-संकर स्क्रीन शिकार फ्यूजन प्रोटीन का एक अत्यधिक जटिल सेट के साथ कई चारा प्रोटीन की बातचीत प्रोफाइल की प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देता है । यहां, हम परिष्कृत तरीकों, नए रिएजेंट का वर्णन है, और कैसे ऐसी स्क्रीन के लिए उनके उपयोग को लागू करने के लिए ।

Abstract

प्रोटीन के लिए स्क्रीनिंग-प्रोटीन बातचीत खमीर 2 का उपयोग-संकर परख लंबे समय से एक प्रभावी उपकरण किया गया है, लेकिन इसके उपयोग मुख्यतः उच्च संबंध है कि अत्यधिक बातचीत उंमीदवारों के पुस्तकालय में समृद्ध कर रहे है की खोज के लिए सीमित किया गया है । एक पारंपरिक स्वरूप में, खमीर 2-संकर परख भी कई कालोनियों उपज के लिए विश्लेषण कर सकते है जब कम stringency में आयोजित किया, जहां कम संबंध के संपर्क में पाया जा सकता है । इसके अलावा, अलग चारा plasmids के खिलाफ एक ही पुस्तकालय के एक व्यापक और पूर्ण पूछताछ के बिना, एक तुलनात्मक विश्लेषण प्राप्त नहीं किया जा सकता है । हालांकि इन समस्याओं के कुछ सरणी शिकार पुस्तकालयों का उपयोग कर संबोधित किया जा सकता है, लागत और ऐसी स्क्रीन संचालित करने के लिए आवश्यक बुनियादी सुविधाओं के निषेध किया जा सकता है । एक विकल्प के रूप में, हम खमीर अनुकूलित किया है 2-संकर परख के लिए एक ही एक स्क्रीन एक रणनीति का उपयोग DEEPN (प्रोटीन नेटवर्क के मूल्यांकन के लिए गतिशील संवर्धन) के भीतर परिवर्तनीय और स्थैतिक प्रोटीन बातचीत के दर्जनों उजागर करने के लिए, जो उच्च प्रवाह डीएनए अनुक्रमण और गणना शामिल plasmids की आबादी के विकास का पालन करने के लिए कि सांकेतिक शब्दों में बदलना भागीदारों । यहाँ, हम अनुकूलित रिएजेंट और प्रोटोकॉल है कि एक DEEPN स्क्रीन आसानी से और लागत प्रभावी ढंग से क्रियान्वित करने की अनुमति का वर्णन.

Introduction

सेल जैविक प्रक्रियाओं की एक पूरी समझ प्रोटीन संपर्क नेटवर्क है कि उनके आणविक तंत्र आबाद खोजने पर निर्भर करता है । एक दृष्टिकोण प्रोटीन बातचीत की पहचान करने के लिए खमीर 2-संकर (Y2H) परख, जो एक कार्य chimeric प्रतिलेखन कारक कोडांतरण द्वारा काम करता है एक बार दो एक दूसरे के लिए ब्याज बांध के प्रोटीन डोमेन है1। एक ठेठ Y2H स्क्रीन खमीर की आबादी बनाने के द्वारा किया जाता है कि घरों plasmids एक transcriptional उत्प्रेरक से जुड़े प्रोटीन बातचीत एन्कोडिंग के दोनों एक पुस्तकालय (उदा, ' शिकार ' फ्यूजन प्रोटीन) और एक दिया ' चारा ' प्रोटीन के शामिल प्लाज्मिड एक डीएनए बंधन डोमेन से जुड़े ब्याज की (उदा, Gal4 डीएनए-बंधन डोमेन है कि Gal4 के लिए बांध-ऊपर अनुक्रम को सक्रिय) । Y2H दृष्टिकोण का मुख्य लाभ में से एक यह है कि यह अपेक्षाकृत आसान और सस्ती एक ठेठ नियमित आणविक जैविक काम2के लिए सुसज्जित प्रयोगशाला में आचरण है । हालांकि, जब परंपरागत रूप से प्रदर्शन किया, एक उपयोगकर्ता एक सकारात्मक Y2H बातचीत के लिए चयन पर उठता है कि व्यक्तिगत कालोनियों के नमूने । यह गंभीर रूप से ' पुस्तकालय शिकार ' क्लोन है कि सर्वेक्षण किया जा सकता है की संख्या सीमा । यह समस्या जटिल है जब एक विशेष बातचीत शिकार की बहुतायत बहुत अधिक दूसरों के सापेक्ष है, कम बहुतायत शिकार plasmids से संपर्क का पता लगाने का मौका कम ।

proteome के व्यापक कवरेज में Y2H सिद्धांत का उपयोग करने के लिए एक समाधान एक मैट्रिक्स-स्वरूपित दृष्टिकोण का उपयोग है जिसमें एक सरणी ज्ञात व्यक्ति शिकार plasmids डिजिटल पूछताछ किया जा सकता है युक्त । हालांकि, इस तरह के एक दृष्टिकोण एक बुनियादी सुविधा है कि आसानी से सुलभ या व्यक्तिगत जांचकर्ताओं जो प्रोटीन या डोमेन3की एक छोटी संख्या के interactome को परिभाषित करने में रुचि रखते है के लिए लागत प्रभावी नहीं है की आवश्यकता है । इसके अलावा, बहुत जटिल शिकार पुस्तकालयों कि बातचीत प्रोटीन के कई टुकड़े सांकेतिक शब्दों में बदलना अव्यावहारिक आकार के लिए मैट्रिक्स arrays के आकार का विस्तार हो सकता है । एक विकल्प बैचों में जटिल पुस्तकालयों के साथ परख प्रदर्शन और व्यापक समानांतर उच्च प्रवाह अनुक्रमण4का उपयोग कर क्लोनों बातचीत की उपस्थिति का आकलन है. यह परख शिकार plasmids की उपस्थिति के लिए लागू किया जा सकता है कि कई कालोनियों में पैदा एक ठेठ Y2H स्वरूपित दृष्टिकोण है जिसमें खमीर कोशिकाओं फ्यूजन प्रोटीन के एक बातचीत जोड़ी आवास एक थाली5,6पर बढ़ने की अनुमति दी है का उपयोग कर । यह सामांय विचार दोनों एकाधिक चारा और शिकार घटकों की एक ही समय में7,8की क्वेरी को बढ़ाने के लिए बल दिया जा सकता है ।

फिर भी, कई जांच एक आसान अभी कुछ ' प्रोटीन ' चारा पर और अधिक ध्यान केंद्रित प्रयास की आवश्यकता है और एक संपूर्ण और अर्द्ध एक जटिल शिकार पुस्तकालय की मात्रात्मक क्वेरी से अधिक लाभ उठा सकते हैं । हम विकसित और एक दृष्टिकोण को मांय करने के लिए व्यापक पैमाने पर प्रोटीन बातचीत बैच प्रारूप में एक Y2H सिद्धांत का उपयोग कर अध्ययन4। यह Y2H बातचीत के सापेक्ष शक्ति के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में एक विशेष शिकार प्लाज्मिड के विस्तार की दर का उपयोग करता है9। एक सामान्य वृद्धि या चयनात्मक विकास की स्थिति के अधीन आबादी के भीतर सभी plasmids के गहरे अनुक्रमण क्लोन का एक पूरा नक्शा है कि मजबूत और कमजोर Y2H बातचीत उपज पैदा करता है । बातचीत की प्रदर्शनियां प्राप्त किया जा सकता है और सीधे कई चारा plasmids भर की तुलना में । परिणामी कार्यप्रवाह DEEPN (प्रोटीन नेटवर्क के मूल्यांकन के लिए गतिशील संवर्धन) इस प्रकार एक ही शिकार पुस्तकालयों से अंतर interactomes की पहचान करने के लिए प्रोटीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, एक प्रोटीन बनाम एक और के बीच तुलना की अनुमति ।

यहां, हम प्रदर्शन DEEPN और प्रयोगशाला तरीकों में सुधार का परिचय है कि इसके उपयोग की सुविधा है, जो चित्रा 1में उल्लिखित हैं । महत्वपूर्ण सुधार शामिल हैं:

शिकार खमीर आबादी की पीढ़ी । DEEPN की प्रमुख आवश्यकताओं में से एक अलग चारा plasmids कि प्लाज्मिड शिकार पुस्तकालयों का ही वितरण किया है के साथ खमीर की आबादी पैदा कर रहा है । शिकार प्लाज्मिड पुस्तकालय के समकक्ष आधारभूत आबादी अलग चारा के interactomes के बीच सटीक तुलना करने के लिए आवश्यक हैं । यह सबसे अच्छा है जब एक पुस्तकालय प्लाज्मिड पहले से ही एक अगुणित खमीर जनसंख्या में स्थित है और उस आबादी में एक दिया चारा प्लाज्मिड जा रहा है प्राप्त संभोग द्वारा प्राप्त की है एक द्विगुणित उपज है । यहां, हम कैसे ऐसी आबादी वाणिज्यिक अगुणित खमीर में स्थित पुस्तकालयों का उपयोग कर बनाने के लिए में एक स्पष्ट मार्गदर्शन प्रदान करते हैं । हालांकि हम तरीकों कि diploids की एक उच्च संख्या उत्पंन पाया, इन वाणिज्यिक पुस्तकालय के समग्र संभोग दक्षता युक्त खमीर उपभेदों कम था । इसलिए, हम एक नया तनाव है कि शिकार पुस्तकालयों घर कर सकते है कि पैदावार संभोग प्रतिक्रिया प्रति अधिक diploids का निर्माण किया ।

चारा plasmids का नया सेट। कई मौजूदा plasmids कि एक्सप्रेस ' चारा ' फ्यूजन प्रोटीन ब्याज और एक डीएनए-बाध्यकारी डोमेन के प्रोटीन के शामिल 2 µ आधारित हैं, उंहें अपने प्रति संख्या बढ़ाना करने की अनुमति । इस प्रति संख्या जनसंख्या में काफी चर सकता है और Y2H transcriptional प्रतिक्रिया में परिवर्तनशीलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । यह बदले में एक दिया प्रोटीन चयन के तहत कोशिकाओं के विकास की प्रतिक्रिया के आधार पर बातचीत की ताकत गेज करने की क्षमता विषम सकता है । यह एक कम प्रति प्लाज्मिड का उपयोग करके आंशिक रूप से पता किया जा सकता है, जिनमें से कुछ पहले ऐसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध pDEST3210के रूप में वर्णित किया गया है । हम एक नया चारा प्लाज्मिड (pTEF-GBD) है कि Gal4-डीएनए-एक TRP1 centromere के भीतर डोमेन फ्यूजन प्रोटीन का उत्पादन प्लाज्मिड प्रतिरोध जीन है कि यह भी चारा की क्लोनिंग की अनुमति देता है ले Kanr आधारित निर्माण दोनों ऊपर और Gal4 डीएनए के बहाव-बाध्यकारी डोमेन ।

नई उच्च घनत्व Y2H टुकड़ा पुस्तकालय । हम घर Y2H शिकार पुस्तकालयों के लिए एक नया प्लाज्मिड का निर्माण किया और यह एक उच्च जटिल Y2H Saccharomyces cerevisiaeसे जीनोमिक डीएनए के बेतरतीब ढंग से कतरनी टुकड़े से बना पुस्तकालय का निर्माण करने के लिए उपयोग । अनुक्रम विश्लेषण से पता चला कि इस पुस्तकालय १,०००,००० विभिन्न तत्वों पर था, कहीं अधिक जटिल पहले से वर्णित खमीर जीनोमिक Y2H प्लाज्मिड पुस्तकालयों11. इस नए पुस्तकालय के साथ, हम दिखाने के लिए कि DEEPN कार्यप्रवाह काफी मजबूत है एक तरह से है कि विश्वसनीय और reproducible है में कई अलग plasmids के साथ जटिल पुस्तकालयों को समायोजित करने में सक्षम थे ।

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Protocol

1. मीडिया और प्लेट की तैयारी

नोट: सभी प्लेटें प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले ंयूनतम 2 दिन किए जाने की जरूरत है । मीडिया किसी भी बिंदु पर बनाया जा सकता है । हालांकि, बफर खमीर निकालने peptone डेक्सट्रोज adenine (bYPDA) की जरूरत है जिस दिन यह प्रयोग किया जाएगा बनाया जाएगा । कुछ मीडिया adenine का एक स्तर है कि क्या आम तौर पर इस्तेमाल किया जाता है से बड़ा है जिसमें एक पूरक मिश्रण का उपयोग किया जाता है । सबसे कम मीडिया की खुराक निर्दिष्ट 10 मिलीग्राम/L adenine । ' + 40Ade ' लेबल की खुराक ४० मिलीग्राम/L adenine की कुल निर्दिष्ट करें ।

  1. ग्लूकोज समाधान तैयार करें (५०% w/ 1 एल के लिए, डी के ५०० जी भंग (+)-एक १,००० मिलीलीटर चोंच में आसुत पानी की ८०० मिलीलीटर में ग्लूकोज । एक बाँझ १,००० मिलीलीटर मीडिया भंडारण की बोतल में एक ०.२ µm बाँझ फिल्टर के माध्यम से एक स्नातक की उपाधि प्राप्त सिलेंडर और फिल्टर का उपयोग कर के १,००० मिलीलीटर की मात्रा को समायोजित करें ।
  2. तैयार खमीर निकालने peptone डेक्सट्रोज (YPD) प्लेटें । 1 एल के लिए, Peptone के 20 जी भंग और एक १,००० मिलीलीटर चोंच में आसुत पानी की ८०० मिलीलीटर में खमीर निकालने के 10 जी । एक एेसे सिलेंडर में डालो, आसुत जल के साथ ९६० मिलीलीटर तक भरें । एक २,००० मिलीलीटर Erlenmeyer कुप्पी में डालो और आगर के 15 ग्राम जोड़ें । आटोक्लेव और ३७ ° c पानी स्नान में ठंडा जब तक पानी स्नान तापमान लगभग ४२-५० ° c करने के लिए ठंडा है । ५०% ग्लूकोज की ४० मिलीलीटर जोड़ने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें । अच्छी तरह से घूमता हुआ मिलाएं ।
    1. पिपेट द्वारा मीडिया के 20 मिलीलीटर के साथ १०० mm प्लेट्स की एक श्रृंखला डालो ।
  3. पूरा सिंथेटिक मिनिमल मीडिया (CSM)-टीआरपी प्लेट्स तैयार करें । 1 एल के लिए, एक १,००० मिलीलीटर चोंच में आसुत पानी की ८०० मिलीलीटर में अमीनो एसिड के बिना खमीर नाइट्रोजन आधार के ६.७ जी भंग । एक स्नातक सिलेंडर में डालो, आसुत जल के साथ के ९६० मिलीलीटर तक भरें । Erlenmeyer कुप्पी के २,००० मिलीलीटर में डालो और ०.७ जी की टीआरपी जोड़ें dropout मिक्स, methionine के 20 मिलीग्राम, और आगर के 15 ग्राम । आटोक्लेव और ३७ ° c पानी स्नान में ठंडा जब तक पानी स्नान तापमान लगभग ४२-५० ° c करने के लिए ठंडा है । ५०% ग्लूकोज की ४० मिलीलीटर जोड़ने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें । अच्छी तरह से घूमता हुआ मिलाएं ।
    1. पिपेट द्वारा मीडिया के 20 मिलीलीटर के साथ १०० mm प्लेट्स की एक श्रृंखला डालो ।
  4. CSM-लियू से मुलाकात की प्लेट तैयार करते हैं । 1 एल के लिए, एक १,००० मिलीलीटर चोंच में आसुत पानी की ८०० मिलीलीटर में अमीनो एसिड के बिना खमीर नाइट्रोजन आधार के १०.०५ जी भंग । एक एेसे सिलेंडर में डालें और आसुत जल के साथ ९४० मिलीलीटर तक भरें । Erlenmeyer कुप्पी के एक २,००० मिलीलीटर में डालो और १.००५ के जी लियू जोड़ें-dropout मिक्स और आगर के 15 ग्राम से मुलाकात की । आटोक्लेव और ३७ ° c पानी स्नान में ठंडा जब तक पानी स्नान तापमान लगभग ४२-५० ° c करने के लिए ठंडा है । ५०% ग्लूकोज की ६० मिलीलीटर जोड़ने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें । अच्छी तरह से घूमता हुआ मिलाएं ।
    1. पिपेट द्वारा मीडिया के 20 मिलीलीटर के साथ १०० mm प्लेट्स की एक श्रृंखला डालो ।
  5. CSM-लियू-टीआरपी प्लेट्स तैयार करें । 1 एल के लिए, एक १,००० मिलीलीटर चोंच में आसुत पानी की ८०० मिलीलीटर में अमीनो एसिड के बिना खमीर नाइट्रोजन आधार के १०.०५ जी भंग । एक स्नातक सिलेंडर में डालो, आसुत जल के साथ के ९४० मिलीलीटर तक भरें । Erlenmeyer कुप्पी के एक २,००० मिलीलीटर में डालो और १.००५ जी की टीआरपी-लियू + 40Ade dropout मिश्रण, २४० adenine के मिलीग्राम, और आगर के 15 ग्राम जोड़ें । आटोक्लेव और ३७ ° c पानी स्नान में ठंडा जब तक पानी स्नान तापमान लगभग ४२-५० ° c करने के लिए ठंडा है । ५०% ग्लूकोज की ६० मिलीलीटर जोड़ने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें । अच्छी तरह से घूमता हुआ मिलाएं ।
    1. पिपेट द्वारा मीडिया के 20 मिलीलीटर के साथ १०० mm प्लेट्स की एक श्रृंखला डालो ।
  6. तैयार CSM-लियू-टीआरपी-उसकी प्लेटें । 1 एल के लिए, एक १,००० मिलीलीटर चोंच में आसुत पानी की ८०० मिलीलीटर में अमीनो एसिड के बिना खमीर नाइट्रोजन आधार के १०.०५ जी भंग । एक स्नातक सिलेंडर में डालो, आसुत जल के साथ के ९४० मिलीलीटर तक भरें । Erlenmeyer कुप्पी के एक २,००० मिलीलीटर में डालो और ०.९७५ जी की टीआरपी-लियू-अपने + 40Ade dropout मिक्स, २४० adenine के मिलीग्राम, और आगर के 15 ग्राम जोड़ें । आटोक्लेव और ३७ ° c पानी स्नान में ठंडा जब तक पानी स्नान तापमान लगभग ४२-५० ° c करने के लिए ठंडा है । ५०% ग्लूकोज की ६० मिलीलीटर जोड़ने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें । अच्छी तरह से घूमता हुआ मिलाएं ।
    1. पिपेट द्वारा मीडिया के 20 मिलीलीटर के साथ १०० mm प्लेट्स की एक श्रृंखला डालो ।
  7. CSM-लियू-टीआरपी-अपने-3AT प्लेट्स तैयार करें । 1 एल के लिए, एक १,००० मिलीलीटर चोंच में आसुत पानी की ८०० मिलीलीटर में अमीनो एसिड के बिना खमीर नाइट्रोजन आधार के १०.०५ जी भंग । एक स्नातक सिलेंडर में डालो, आसुत जल के साथ के ९४० मिलीलीटर तक भरें । Erlenmeyer कुप्पी के एक २,००० मिलीलीटर में डालो और ०.९७५ जी की टीआरपी-लियू-अपने + 40Ade dropout मिक्स, २४० adenine के मिलीग्राम, और आगर के 15 ग्राम जोड़ें । आटोक्लेव और ३७ ° c पानी स्नान में ठंडा जब तक पानी स्नान तापमान लगभग ४२-५० ° c करने के लिए ठंडा है । ५०% ग्लूकोज की ६० मिलीलीटर जोड़ने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें । 3-एमिनो-1, 2, 4 triazole (3AT) के एक 1 मीटर बाँझ स्टॉक के १०० µ l में मिलाकर घूमता है.
    1. पिपेट द्वारा मीडिया के 20 मिलीलीटर के साथ १०० mm प्लेट्स की एक श्रृंखला डालो ।
  8. LB-Kanr प्लेट्स तैयार करें । 1 एल के लिए, Tryptone के 10 जी भंग, खमीर निकालने के 5 जी और एक १,००० मिलीलीटर चोंच में आसुत पानी की ८०० मिलीलीटर में NaCl के 10 ग्राम । एक स्नातक सिलेंडर में डालो, आसुत जल के साथ के १,००० मिलीलीटर तक भरें । Erlenmeyer कुप्पी की २,००० मिलीलीटर में डालो और आगर के 15 ग्राम जोड़ें । आटोक्लेव और ३७ ° c पानी स्नान में ठंडा जब तक पानी स्नान तापमान लगभग ४२-५० ° c करने के लिए ठंडा है । जोड़ें ५० मिलीग्राम कनमीसिन और घूमता द्वारा मिश्रण ।
    1. पिपेट द्वारा मीडिया के 20 मिलीलीटर के साथ १०० mm प्लेट्स की एक श्रृंखला डालो ।
  9. तैयार YPD, CSM-लियू से मुलाकात की, CSM-टीआरपी, CSM-लियू-टीआरपी और CSM-लियू-टीआरपी-अपने मीडिया । के बजाय एक Erlenmeyer कुप्पी में डालने के अलावा प्लेटों के लिए ऊपर की प्रक्रिया का प्रयोग करें, एक मीडिया भंडारण की बोतल में डालना और छोड़ आगर ।
  10. तैयार bYPDA (buffered YPDA) । बाँझ YPD मीडिया ले लो और २०० मिलीग्राम/L adenine बाँझ आसुत जल में जोड़ें । ३.७ को एचसीएल के साथ पीएच समायोजित करें । एक बाँझ बोतल में एक ०.२ µm बाँझ फिल्टर के माध्यम से फिल्टर.
  11. रूपांतरण बफर तैयार: आसुत जल में 2 एम सोर्बिटोल, 1 एम लिथियम एसीटेट डाईहाइड्रेट, 10 मिमी Tris पीएच ७.६, ०.५ मिमी EDTA, ०.२ मिमी कैल्शियम क्लोराइड । एक बाँझ बोतल में एक ०.२ µm बाँझ फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर.
  12. तैयार खूंटी समाधान: ७०% w/v पॉलीथीन ग्लाइकोल ३३५० आसुत जल में । आटोक्लेव द्वारा निष्फल ।
  13. तैयार घुमाव: 8 एम यूरिया, 4% डब्ल्यू/वी एसडीएस, ५० मिमी Tris पीएच ६.८, 10% वी/वी ग्लिसरॉल, ०.०२% डब्ल्यू/वी bromophenol नीले बाँझ आसुत पानी में ।
  14. तैयार करें एसटी (मजबूत ते): ५० एमएम Tris, 20 एमएम EDTA, पीएच ८.० आसुत जल में । एक बाँझ बोतल में एक ०.२ µm बाँझ फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर.
  15. तैयार Zymolase स्टॉक समाधान: 10 मिलीग्राम/एमएल Zymolase 100T ५० मिमी पोटेशियम फॉस्फेट dibasic पीएच ७.५, ५०% v/वी ग्लिसरॉल बफर बाँझ आसुत जल में (-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) ।

2. चारा Plasmids का क्लोनिंग और सत्यापन

नोट: Gal4-डीएनए-बाइंडिंग डोमेन Plasmids का निर्माण । वर्तमान में, वहां व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और अकादमिक उपलब्ध Y2H प्रणालियों की एक किस्म है । DEEPN इनमें से कई को समायोजित कर सकते है बशर्ते कि चारा एक डीएनए बंधन डोमेन से जुड़े ब्याज के प्रोटीन व्यक्त प्लाज्मिड एक TRP1युक्त प्लाज्मिड में है । अंय बहाव आवश्यकताओं कि अनुक्रम तुरंत शिकार पुस्तकालय डालने के ऊपर जाना जाता है और कहा कि एक सकारात्मक Y2H बातचीत His3 के उत्पादन में मीडिया की कमी histidine में चयन के लिए अनुमति के द्वारा बनाए जा सकते हैं । यहां हम एक नया Y2H चारा प्लाज्मिड (pTEF-GBD, चित्रा 2), तथापि, Y2H सहित अंय plasmids चारा pGBKT7 के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है के उपयोग का वर्णन करेंगे । चारा plasmids के निर्माण और मूल्यांकन के लिए, हम pTEF-GBD के उपयोग का वर्णन करेंगे । एक सामांय ध्यान दें के रूप में, हम जीन संश्लेषण की सिफारिश एक खुले पढ़ने के फ्रेम है कि खमीर codon पूर्वाग्रह का पालन करने में मदद अच्छी अभिव्यक्ति और क्लोनिंग के साथ आसानी सुनिश्चित करने के उत्पादन । सुनिश्चित करें कि क्लोनिंग योजना चारा के लिए अनुमति देता है में Gal4 डीएनए के साथ फ्रेम-बाध्यकारी डोमेन और है कि जब ' 3 साइट, एक बंद codon में क्लोनिंग चारा-कोडिंग क्षेत्र के बाद ।

  1. प्लाज्मिड वेक्टर तैयार करें । प्लाज्मिड pTEF-GBD एक तेजी से विधानसभा विधि का उपयोग कर Gal4 डीएनए-बंधन डोमेन एंकोडिंग क्षेत्र के 5 ' या 3 ' ब्याज के प्रोटीन एंकोडिंग टुकड़ा क्लोनिंग के लिए अनुमति देता है । 5 ' साइट पर सम्मिलन के लिए, नारी और EcoRI के साथ pTEF-GBD के 3 µ g को पचाने के लिए या 3 ' साइट पर सम्मिलन के लिए, BamHI और XhoI के साथ डाइजेस्ट 1% डीएनए agarose जेल में 2-4 ज. Electrophorese नमूना युक्त ०.२-०.५ µ जी/एमएल ethidium ब्रोमाइड (EtBr) पर १०० वी. एक्साइज कट ५,६३० बीपी TEF-GBD और निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक डीएनए जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर शुद्ध और २६० एनएम में अवशोषण द्वारा डीएनए मात्रा spectrophotometer द्वारा12।
    नोट: चारा की पीढ़ी-एंकोडिंग आवेषण । डीएनए टुकड़े एंकोडिंग प्रोटीन या ब्याज की प्रोटीन टुकड़े जीन संश्लेषण का उपयोग कर बनाया जा सकता है और unक्लोन टुकड़े के रूप में उपलब्ध है । यह अनुशंसित है कि codons Saccharomyces cerevisiae में अभिव्यक्ति के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है और codon ऑप्टिमाइज़ेशन के लिए ऑनलाइन उपकरण सामग्रियों की सूची में शामिल हैं ।
  2. 5 ' प्रविष्टि के लिए, डीएनए टुकड़ा एंकोडिंग एक ATG शुरू codon द्वारा 5 '-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3 ' और 5 '-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3 ', क्रमशः । Gal4 डीएनए बंधन डोमेन के साथ फ्रेम में 3 ' प्रविष्टि के लिए, 5 '-ctgcatatggccatggaggccgaa-3 ' और 5 '-tagtaactagcataaccccttggggcc-3 ' द्वारा एंकोडिंग टुकड़ा पार्श्व ।
  3. प्लाज्मिड निर्माण के लिए, कट pTEF-GBD में टुकड़े क्लोनिंग के लिए निर्माता के निर्देशों में निर्दिष्ट के रूप में तीव्र असेंबली विधि का उपयोग करें ।
    1. प्लेट सभी के पौंड पर ई. कोलाई -Kanr प्लेटें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 16-20 घंटे के लिए मशीन बदल । कालोनियों आवास pTEF-GBD वांछित डालने के साथ पीसीआर द्वारा पहचाना जा सकता है प्रवर्धन का उपयोग कर oligonucleotides: 5 '-CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3 ' और 5 '-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3 ' के लिए 5 ' डालने और 5 '-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3 ' और 5 '-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3 ' के लिए 3 ' संमिलित करें । इन oligonucleotides भी अनुक्रमण डालने के लिए प्राइमर के रूप में सेवा कर सकते हैं ।
    2. की तैयारी पर योजना > 10 प्रत्येक pTEF के µ जी-GBD व्युत्पंन और pTEF-अकेले GBD अनुक्रमण और खमीर परिवर्तनों के लिए सामग्री प्रदान करने के लिए ।
    3. निंनलिखित पीसीआर शर्तों का प्रयोग करें: ९८ डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट, ९८ डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के 25 चक्र के बाद, ५५ डिग्री सेल्सियस पर 30 एस, और ७२ ° c पर 2 मिनट, ७२ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के बाद एक बफर युक्त का उपयोग कर २.५ mM MgCl2 , ०.५ U/100 µ l डीएनए पोलीमरेज़, और मालिकाना बफर.

3. Gal4 की अभिव्यक्ति-डीएनए-बंधन डोमेन फ्यूजन प्रोटीन

  1. सक्षम खमीर बनाओ ।
    1. एक बाँझ लकड़ी applicator लेने के द्वारा एक YPD प्लेट पर PJ69-4a खमीर बाहर लकीर, एक-८० डिग्री सेल्सियस जमे हुए शेयर के 1 mm3 स्क्रैप और यह धीरे YPD थाली भर में रगड़ । हर पास मीडिया की सतह का एक अछूता हिस्सा भर जाता है ताकि प्लेट नीचे लकड़ी के applicator ले जाएँ. 2 दिनों के लिए या जब तक एकल कालोनियों दिखाई दे रहे हैं के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर YPD प्लेट की मशीन । पानी या विकास मीडिया में खमीर सस्पैंड द्वारा PJ69-4a खमीर के जमे हुए शेयर बनाओ, 7% DMSO के साथ पूरक है, और पर भंडारण-८० ° c ।
    2. Inoculate एक 20 मिमी x १५० मिमी संस्कृति एक बाँझ लकड़ी applicator का उपयोग कर ट्यूब में YPD की संस्कृति के 5 मिलीलीटर में एक एकल कॉलोनी और २०० rpm में एक मिलाते हुए मशीन में 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर हो जाना ।
    3. Inoculate ५० PJ69-4a खमीर तनाव के रातोंरात संस्कृति के 4 मिलीलीटर के साथ बाँझ Erlenmeyer कुप्पी के एक २५० मिलीलीटर में YPD की मिलीलीटर । 30 डिग्री सेल्सियस, २०० rpm एक ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो६००) के लिए लगभग १.२, के रूप में एक मानक 1 cm प्रकाश पथ के साथ spectrophotometry द्वारा निर्धारित पर एक मिलाते हुए मशीन में हो जाना । वृद्धि आमतौर पर 5-7 एच लेता है ।
    4. एक benchtop केंद्रापसारक में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ४,६९६ x जी में शंकु ट्यूब की एक ५० मिलीलीटर में अवसादन द्वारा खमीर को अलग । तरल अपशिष्ट में डंपिंग द्वारा supernatant त्यागें । एक पिपेट का प्रयोग, परिवर्तन बफर के 5 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड और शंकु ट्यूब के 15 मिलीलीटर के लिए स्थानांतरण । supernatant को छोड़ने के लिए reतलछट, और एक १००० µ l पिपेट के साथ परिवर्तन बफर के अंतिम खंड के 1 मिलीलीटर में खमीर reसस्पेंड ।
    5. 30 डिग्री सेल्सियस में ६० मिनट के लिए गर्मी खमीर कोशिकाओं जबकि २०० rpm पर मिलाते हुए और फिर 30-90 मिनट के लिए बर्फ पर जगह है ।
  2. खमीर प्लाज्मिड परिवर्तन ।
    1. में १.५ मिलीलीटर बाँझ microcentrifuge ट्यूब, जोड़ें 1 µ g of pTEF-GBD-आधारित प्लाज्मिड और 5 µ l के 10 mg/एमएल सामन शुक्राणु वाहक डीएनए समाधान. इसके अलावा एक नकारात्मक परिवर्तन नियंत्रण के रूप में केवल सामन शुक्राणु वाहक डीएनए युक्त ट्यूब शामिल हैं । पिपेट द्वारा प्रत्येक ट्यूब के लिए बर्फ ठंडा खमीर सेल निलंबन के १०० µ एल जोड़ें । एक १००० µ l पिपेट के साथ ७०% खूंटी समाधान के १०० µ एल जोड़ें और धीरे से ट्यूब झटका द्वारा मिश्रण (भंवर नहीं है).
    2. 30 ° c में, एक मिलाना मशीन में ४५ मिनट के लिए २०० rpm पर मशीन ।
    3. 15 मिनट के लिए ४२ ° c पर गर्मी सदमे ।
    4. ८४५ एक्स जी में एक microcentrifuge में तलछट कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए, बंद पिपेट और supernatant को त्यागें, १५० µ l में pipetting ऊपर और नीचे द्वारा बाँझ पानी की गोली reसस्पेंड, और एक CSM-टीआरपी प्लेट की सतह पर फैल गया ।
    5. प्लेस प्लेट्स दाईं ओर 30 ° c मशीन में ऊपर और 2-3 दिनों के लिए मशीन जब तक कालोनियों दिखाई दे रहे हैं । प्लेटें उल्टा हो सकता है 6-12 एच के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर मशीन के बाद प्लेट की सतह पर संघनित्र से बचने के लिए ।
    6. एक CSM-Trp प्लेट एक बाँझ दंर्तखोदनी का उपयोग पर एक पैच के रूप में परिवर्तन और लकीर प्रति 2-3 कालोनियों ले लो । 30 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए बढ़ने की अनुमति दें ।
  3. प्रोटीन एक्सप्रेशन के लिए lysates बनाएं ।
    1. Inoculate एक मैच के साथ CSM-टीआरपी तरल मीडिया के 3 मिलीलीटर-सिर-पैच से खमीर के आकार और एक 20 मिमी x १५० mm संस्कृति ट्यूब में 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर हो जाना, जबकि २०० rpm पर मिलाते हुए । चारा और खाली pTEF-GBD वेक्टर प्रति रात दो संस्कृतियों बनाओ ।
    2. CSM-टीआरपी रातोंरात संस्कृति के प्रत्येक 3 मिलीलीटर के लिए YPD के 1 मिलीलीटर जोड़ें । २०० rpm पर मिलाते हुए, 30 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए हो जाना । spectrophotometer द्वारा कोशिकाओं के आयुध डिपो की जांच करें ।
    3. तलछट कोशिकाओं के एक समकक्ष संख्या, आयुध डिपो के अनुसार सामांय । एक microcentrifuge में कमरे के तापमान पर २,३४८ x g पर एक 5 मिनट स्पिन के साथ microcentrifuge ट्यूबों के बाँझ १.५ मिलीलीटर का प्रयोग करें । supernatant को छोड़ने के लिए पिपेट का उपयोग करें । अंतिम शेयर २.१ आयुध डिपो की एक ंयूनतम करने के लिए मेल खाती है ।
      नोट: जब कोशिकाओं के समकक्ष संख्या की गणना, यह हो सकता है कि विभिंन संस्करणों प्रत्येक रात संस्कृति से आवश्यक हो सकता है ंयूनतम २.१ आयुध डिपो प्राप्त करने के लिए ।
    4. ४५० ०.२ मीटर NaOH के µ एल में गोली को फिर से स्थगित ऊपर और नीचे pipetting द्वारा । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन । कक्ष के तापमान पर २,३४८ x g पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं reकेंद्रापसारक, और पिपेट द्वारा supernatant त्यागें ।
    5. घुमाव बफर के ५० µ एल के साथ गोली reसस्पेंड ऊपर और नीचे ध्यान से के रूप में बुलबुले बनाने के लिए नहीं करने के लिए pipetting । ७० डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए गर्मी नमूना ।
  4. एसडीएस-पृष्ठ द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए जांच करें ।
    1. आणविक भार की एक बड़ी रेंज को सुनिश्चित करने के लिए 4-20% की एक ढाल जेल का प्रयोग करें हल किया जा सकता है । एक एसडीएस-पृष्ठ जेल में नमूनों की बराबर राशि (एक ही आयुध डिपो) लोड और संशोधित pTEF-GBD वेक्टर13,14,15युक्त कम से कम एक नमूना शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    2. electrophoretic जुदाई के बाद, nitrocellulose और immunoblot विरोधी myc मोनोक्लोनल या polyclonal एंटीबॉडी और ECL डिटेक्शन समाधान (चित्रा 3) का उपयोग कर के लिए जेल हस्तांतरण ।

4. स्व-सक्रियण परीक्षण

  1. -८० डिग्री सेल्सियस शेयर से MATalpha खमीर बाहर लकीर एक YPD प्लेट पर एक बाँझ लकड़ी applicator लेने के द्वारा ब्याज की शिकार पुस्तकालय के लिए इसी तनाव, शीशी से बाहर खमीर की एक छोटी राशि scraping और यह YPD प्लेट भर में लकीर । 2 दिनों के लिए या जब तक एकल कालोनियों दिखाई दे रहे हैं के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर YPD प्लेट की मशीन । एक YPD प्लेट पर कुछ एकल कालोनियों पैच और 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
    नोट: नई तनाव घर शिकार पुस्तकालय के लिए यहां विकसित PLY5725 है, जबकि कुछ संगत व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Y2H पुस्तकालयों Y187 में स्थित हैं ।
  2. 3.3.1-3.3.4 में प्रक्रियाओं का पालन करने के लिए वांछित शिकार पुस्तकालय घर के लिए इस्तेमाल किया प्लाज्मिड के साथ PLY5725 को बदलने के लिए LEU2आधारित है । यहां विकसित पुस्तकालयों के लिए, इसी प्लाज्मिड pGal4AD (pPL6343) है । CSM-लियू पर खमीर transformants, प्लेट ठीक करने के लिए प्लेटों से मुलाकात की । बाद कालोनियों उठता है, एक CSM पर पैच के रूप में लकीर-लियू से मुलाकात की थाली और 30 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए गर्मी ।
  3. ३.४ में प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए pPL6343 खाली वेक्टर विरोधी हा मोनोक्लोनल या polyclonal एंटीबॉडी और ECL डिटेक्शन समाधान का उपयोग कर की अभिव्यक्ति की पुष्टि करें ।
  4. PLY5725 के साथ एक क्रॉस पैटर्न में बदल PJ69-4a खमीर के प्रत्येक लकीर एक YPD प्लेट कि प्रोटोकॉल खंड ३.४ और ४.३ और 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में गर्मी एक्सप्रेस में प्रोटीन व्यक्त करने की पुष्टि की थी पर constructs । 1 मिमी ले लो कोशिकाओं के3 जहां दो उपभेदों एक साथ हो गया है और अलग CSM पर पैच-लियू से मुलाकात की, CSM-टीआरपी, और CSM-टीआरपी-लियू प्लेटें और विकास 24 एच ।
    नोट: इि diploids की CSM-Trp-लियू प्लेट्स पर बढ़ेगी । CSM-लियू पर विकास से मुलाकात की और CSM-Trp प्लेटें खमीर विकास के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं ।
  5. CSM के 1 मिलीलीटर में diploids बढ़ने-टीआरपी-लियू 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर मीडिया । तलछट ५०० µ l कोशिकाओं में microcentrifuge ट्यूब की एक १.५ मिलीलीटर में २,३४८ x g, एक microcentrifuge में कमरे के तापमान पर 3 मिनट । पिपेट द्वारा supernatant त्यागें । बाँझ पानी और दोहराने अवसादन और resuspension की 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं reसस्पेंड । कोशिकाओं के आयुध डिपो६०० की जांच करें ।
  6. प्रत्येक कोशिका के 1:10 धारावाहिक कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला बनाओ निलंबन ०.५ के एक आयुध डिपो में प्रत्येक के शुरू सबसे केंद्रित समाधान के साथ बाँझ पानी का उपयोग । एक CSM-लियू-टीआरपी प्लेट, एक CSM-लियू-टीआरपी-उसकी थाली, और एक CSM-लियू-टीआरपी-अपने + 3AT प्लेट पर एक कमजोर पड़ने के 5 µ l स्पॉट । 30 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी और 3 दिनों में दैनिक विकास (चित्रा 4) के लिए निरीक्षण किया ।
    नोट: 1:10 धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए, पिपेट 10 µ एल ट्यूब की एक आयुध डिपो ०.५ में ९० µ पानी की एल और मिश्रण के ऊपर और नीचे pipetting द्वारा । 1:10 धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाने के लिए जारी रखें जब तक वहां छह अलग सांद्रता के एक कुल के लिए जगह नहीं है ।

5. चारा और शिकार पुस्तकालय के साथ खमीर आबादी बनाएं

नोट: Y187 तनाव है कि मकान वाणिज्यिक शिकार पुस्तकालय plasmids अच्छी तरह से दोस्त नहीं है । इस प्रकार, निंनलिखित अनुकूलित शर्तों पुस्तकालय की जटिलता बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं । PLY5725 Y2H शिकार पुस्तकालयों युक्त तनाव साथियों बेहतर और एक ही संभोग प्रक्रिया इस तनाव के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है (चित्रा 5) ।

  1. Inoculate PJ69 में से प्रत्येक की संस्कृतियों के 3 मिलीलीटर-4a transformants विभिंन TRP1युक्त pTEF-GBD में चारा प्लाज्मिड-एक संस्कृति ट्यूब में टीआरपी मीडिया ले जा रहा है । pTEF-GBD वेक्टर प्लाज्मिड अकेले प्रक्रियात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा युक्त दो अलग संस्कृतियों में शामिल हैं । 6 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस, २०० rpm पर संस्कृतियों की मशीन और फिर रात के विकास के लिए एक बाँझ Erlenmeyer कुप्पी में संस्कृति के एक 25 मिलीलीटर में पतला ।
  2. MATalpha कोशिकाओं के एक जमे हुए (-८० डिग्री सेल्सियस) शीशी-कमरे के तापमान पर "शिकार" पुस्तकालय ले जाने वाले LEU2युक्त । Inoculate CSM-लियू की १२५ मिलीलीटर-पूरे गल शीशी के साथ एक बाँझ Erlenmeyer कुप्पी में मीडिया से मुलाकात की । २०० rpm पर मिलाते के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सभी संस्कृतियों हो जाना ।
    नोट: रात संस्कृतियों के आयुध डिपो६०० अगले चरणों के लिए आगे बढ़ने से पहले १.५ के लिए १.० के बीच सीमा की जरूरत है ।
  3. केंद्रापसारक 21 PJ69 में से प्रत्येक के आयुध डिपो के समकक्ष-4 ए 5 मिनट के साथ एक कमरे के तापमान पर ४,६९६ x g पर स्पिन । हर 10 संभोग प्रतिक्रियाओं के लिए वांछित, गोली ३९ आयुध डिपो MATalpha के समकक्ष६०० शंकु ट्यूबों के अलग ५० मिलीलीटर में पुस्तकालय plasmids ले जाने तनाव ।
    1. एक benchtop केंद्रापसारक में कमरे के तापमान पर शंकु ट्यूब ४,६९६ x g 5 मिनट के नए ५० मिलीलीटर में बाँझ पानी और फिर से गोली की 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं reसस्पेंड । एक पिपेट का प्रयोग, धीरे से छर्रों कोशिकाओं को बाधित किए बिना supernatant निकालें ।
    2. bYPDA के 10 मिलीलीटर में 4 मिलीलीटर और PLY5725 कोशिकाओं में PJ69-4a कोशिकाओं के छर्रों reसस्पेंड (पीएच ३.७) ।
  4. सेट अप संभोग प्रतिक्रियाओं के लिए, PJ69 के 1 मिलीलीटर-4a रूपांतरित कोशिकाओं, MATalpha पुस्तकालय युक्त कोशिकाओं की 1 मिलीलीटर जोड़ने, और bYPDA पीएच ३.७ के 1 मिलीलीटर के लिए नई ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब । ९० मिनट के लिए कोमल कक्षीय आंदोलन (१००-१३० rpm) के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    1. ४,६९६ x g पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को एक benchtop केंद्रापसारक में कमरे के तापमान पर, केंद्रापसारक । पिपेट द्वारा supernatant निकालें और 1:1 bYPDA के 2 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड: YPD । प्लेट पिपेट और 30 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 20 एच के लिए गर्मी से एक १०० mm YPD प्लेट पर के सभी 2 मिलीलीटर ।
  5. YPD प्लेटों से फसल कोशिकाओं एक सेल खुरचनी का उपयोग करने के लिए CSM-लियू-टीआरपी मीडिया के 2-3 मिलीलीटर में कोशिकाओं को उखाड़ फेंकना । पिपेट शंकु ट्यूब की एक ५० मिलीलीटर में कोशिकाओं को उखाड़ फेंक । CSM-लियू के 2-3 मिलीलीटर के साथ 4-5 बार प्लेटों कुल्ला-मीडिया एक १००० µ एल पिपेट का उपयोग कर और धीरे YPD प्लेट की सतह के पार मीडिया बेदखल द्वारा टीआरपी मीडिया ।
    1. एक benchtop केंद्रापसारक में कमरे के तापमान पर ४,६९६ x g पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं के केंद्रापसारक । पिपेट द्वारा supernatant त्यागें और CSM-लियू-टीआरपी मीडिया के ४० मिलीलीटर में कोशिकाओं को reसस्पेंड ऊपर और नीचे (भंवर नहीं है) pipetting द्वारा ।
  6. का गठन द्विगुणित कोशिकाओं की संख्या का अनुमान लगाने के लिए, पतला २०० µ एल में द्विगुणित मिश्रण के 4 µ एल और २००० µ एल CSM-टीआरपी-लियू मीडिया । प्लेट २०० एक कमजोर पड़ने के µ एल एक CSM-लियू-टीआरपी प्लेट पर ।
    नोट: दो प्लेटों का प्रतिनिधित्व एक 1:10000 और 1:100000 गुना कमजोर पड़ने के शेयर की diploids काटा और एक उंमीद की उपज ~ ९,०००-२७,००० कालोनियों पर 1:10000 कमजोर पड़ने की प्लेट 30 डिग्री सेल्सियस पर में मशीन के बाद ३६-४० एच के लिए जांच प्लेटें चरण ५.७ के बाद । 1 पर २०० कालोनियों की एक ंयूनतम संख्या: 10000 कमजोर पड़ने प्लेट ५.८ कदम के लिए आगे बढ़ने के लिए आवश्यक है
  7. तुरंत सेल resuspension के प्रत्येक ४० मिलीलीटर के शेष ले और CSM-लियू-टीआरपी मीडिया के ५०० मिलीलीटर युक्त Erlenmeyer कुप्पी के एक १,००० मिलीलीटर inoculate । एक प्रारंभिक आयुध डिपो६००लें । १८० rpm पर मिलाते के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर इन कुप्पी गर्मी जब तक वे संतृप्ति तक पहुंचने (~ २.० आयुध डिपो/ यह आमतौर पर के बारे में लेता है ३६-४० h. मॉनिटर विकास पर 24 ज तो फिर से ३६ में एच६००।
  8. एक पिपेट का उपयोग करना, aliquots के 20 मिलीलीटर संस्कृतियों और innoculate २,००० मिलीलीटर की Erlenmeyer कुप्पी, CSM-लियू के ७५० मिलीलीटर-टीआरपी मीडिया और दूसरे से युक्त ७५० मिलीलीटर के प्रत्येक से निकाल CSM-लियू की टीआरपी-अपने 3AT के निंनतम स्तर के साथ कि पृष्ठभूमि (पहले खंड ४.५ में निर्धारित) को समाप्त करता है । मिश्रण नई संस्कृतियों (७७० एमएल) अच्छी तरह से घूमता है और एक प्रारंभिक आयुध डिपो ले लो६००।
  9. 30 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों की गर्मी, जबकि १८० rpm पर मिलाते हुए संतृप्ति, जो आम तौर पर unselected CSM-लियू के लिए 24 घंटे के भीतर होता है टीआरपी संस्कृति तक पहुंचने और Y2H बातचीत के लिए चयन के तहत संस्कृतियों के लिए ७० से अधिक h ले सकते हैं ।
  10. एक बार संस्कृतियों संतृप्ति (आयुध डिपो ~ २.०) तक पहुंच चुके हैं, पिपेट द्वारा के 11 मिलीलीटर, तलछट एक 5 मिनट के साथ कोशिकाओं को हटाने के कमरे के तापमान पर ४,६९६ x g पर स्पिन, पिपेट द्वारा supernatant त्यागना, और पर रोक-20 ° c या डीएनए निष्कर्षण पर जारी है । चयनित और अचयनित नमूनों दोनों गहरी अनुक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।

6. DEEPN गहरी अनुक्रमण के लिए नमूना तैयारी

  1. डीएनए निष्कर्षण ।
    1. एक पिपेट का प्रयोग करें प्रोटोकॉल धारा ५.७ से ५०० µ एल में एसटी बफर और स्थानांतरण के लिए एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के सेल छर्रों reसस्पेंड करने के लिए । Zymolase शेयर के betamercaptoethanol और 10 µ l के 3 µ l को जोड़ें । अच्छी तरह से मिश्रण और 24-36 एच के लिए ३७ ° c मशीन में गर्मी ।
    2. ५०० µ l phenol/क्लोरोफॉर्म/isoamyl शराब के साथ नमूना दो बार निकालें जबकि एक धुएं डाकू16का उपयोग कर ।
    3. 4 एम NaCl, बर्फ ठंडा १००% इथेनॉल के ९०० µ एल के 7 µ एल जोड़ें (ेतोः), उलटा द्वारा मिश्रण और या तो फ्रीज-20 डिग्री सेल्सियस या एक microcentrifuge में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए २१,१३० x जी में कताई द्वारा तलछट डीएनए के लिए जारी है ।
    4. पिपेट द्वारा supernatant त्यागें । ९०० µ एल के साथ तीन बार गोली धो ७०% ेतोः की ।
    5. तलछट गोली २१,१३० एक्स जी 2 मिनट के लिए और पिपेट द्वारा अवशिष्ट ेतोः धोने हटा दें । ४२ डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए सूखी गोली ।
    6. १२० µ एल में एक ३७ ९० मिनट के लिए पानी के स्नान में 0.1 x एसटी की गोली reसस्पेंड, हर 30 मिनट के मिश्रण के लिए ट्यूबों झटका ।
    7. पिपेट ६० microcentrifuge ट्यूब की एक बाँझ १.५ मिलीलीटर में निकाले डीएनए के µ एल. जोड़ें १२० µ के एसटी, ३.५ µ एल के RNase एक शेयर, झटका मिश्रण करने के लिए और 1 एच के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
    8. इथेनॉल के रूप में पहले खंड 6.1.3-6.1.5 में किया हाला, लेकिन 4 मीटर NaCl के बजाय 5 एम अमोनियम एसीटेट के 7 µ l का उपयोग करें ।
    9. reसस्पेंड RNase ५५ µ एल में 0.1 x एक ३७ डिग्री सेल्सियस जल स्नान के लिए ९० मिनट के लिए में इलाज डीएनए, ट्यूब झटका हर 30 मिनट मिश्रण करने के लिए एक spectrophotometer पर २६० एनएम पर अवशोषण द्वारा डीएनए बढ़ाता है ।
  2. पीसीआर सीडीएनए न्या.
    1. डीएनए नमूने के अनुसार दो, ५० µ एल पीसीआर प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन । प्रत्येक प्रतिक्रिया शिकार-पुस्तकालय प्लाज्मिड (सामग्री देखें) मिलान प्रत्येक आगे और रिवर्स प्राइमर के 25 pmol शामिल हैं । प्रतिक्रियाओं भी उच्च निष्ठा 2x पीसीआर मास्टर मिश्रण के 25 µ एल होते हैं, 5 डीएनए नमूना के µ जी, और पानी अप करने के लिए ५० µ l. ७२ डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के विस्तार के समय के साथ 25 चक्र के लिए प्रतिक्रियाओं बढ़ाना, 30 एस के लिए ५५ ° c के एक ऐनी तापमान, और denaturing पर ९८ ° c के लिए 10 एस. पहले सायक्लिंग ९८ ° c पर एक 30 एस विकार द्वारा और ७२ डिग्री सेल्सियस पर एक 5 मिनट की मशीन के साथ पालन करें ।
    2. 1% द्वारा प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया के 4 µ l का विश्लेषण डीएनए agarose जेल ट्रो युक्त डीएनए agarose जेल के साथ ०.२-०.५ µ जी/एमएल EtBr17। यूवी transillumination द्वारा डीएनए नमूना कल्पना । नमूने 1-3 kb के आसपास डीएनए का एक धब्बा दिखाएगा, जहां बैंडिंग पैटर्न नमूनों के लिए पाया जा सकता है जहां एक Y2H बातचीत का चयन किया गया था(चित्रा 6).
    3. डुप्लिकेट पीसीआर नमूनों का मिश्रण है और निर्माता के निर्देशों के अनुसार पीसीआर शोधन किट का उपयोग कर शुद्ध और एक spectrophotometer पर २६० एनएम में अवशोषण द्वारा डीएनए यों तो ।

7. गहरी अनुक्रमण

नोट: नमूना तैयारी और एक गहरी अनुक्रमण मंच पर अनुक्रमण आम तौर पर वाणिज्यिक और अकादमिक डीएनए अनुक्रमण कोर सुविधाओं में उपलब्ध है ।

  1. कतरनी ६०० पीसीआर उत्पाद के एनजी एक उच्च प्रदर्शन अल्ट्रा sonicator का उपयोग ~ ३०० बीपी की एक औसत लंबाई के टुकड़े दे ।
  2. अनुक्रमित अनुक्रमण पुस्तकालयों कि बारकोड कूटबंधन, भड़काना साइटों, और डीएनए टुकड़े के सिरों पर विषम अनुक्रम पर कब्जा जोड़ता है के लिए एक तैयारी किट का उपयोग कर उत्पंन ।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार पुस्तकालय की तैयारी करें । पूल अनुक्रमित पुस्तकालयों और अनुक्रम के रूप में लंबे समय युग्मित-अंत एक गहरी अनुक्रमण मंच पर पढ़ता है (उदा., 2 x १५० bp PE पढ़ता) । प्रत्येक नमूने के लिए लक्षित पढ़ता है की इच्छित संख्या 10 और ४०,०००,००० के बीच है, के साथ अधिक के लिए इच्छित पढ़ता है अचयनित आबादी आम तौर पर अधिक जटिल हैं । हम अनुशंसा करते है कम से २०,०००,००० या अधिक अचयनित आबादी के लिए पढ़ता है ।

8. Bioinformatic प्रसंस्करण और सत्यापन

  1. fastq के रूप में प्रक्रिया डीएनए अनुक्रमण डेटा खड़े अकेले सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के लिए बनाया का एक सेट के साथ (1) नक्शा अनुक्रम एक सार्वभौमिक सैम प्रारूप में फ़ाइलें पढ़ें (2) डेटासेट के बीच जीन संवर्धन बढ़ाता है (3) में डेटा का सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन आदेश जो उंमीदवार जीन Y2H बातचीत के लिए सकारात्मक है रैंक करने के लिए (4) क्या क्षेत्र (ओं) के रूप में जानकारी प्रदान करते है और क्या अनुवाद प्रति शिकार सीडीएनए जीन टुकड़े उपज है कि सकारात्मक Y2H बातचीत शामिल हैं, और (5) प्रदान करने के लिए प्रत्येक फ्रेम उपकरण न केवल 5 ' लेकिन यह भी बातचीत टुकड़े एक पारंपरिक Y2H प्रारूप में उनके पुनर्निर्माण और सत्यापन की अनुमति के 3 ' अंत को खंगाला । इन कार्यक्रमों के संचालन के साथ अध्ययन में विस्तृत है ।

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Representative Results

प्रोटीन बातचीत और कई रूपांतरों और प्रणालियों विकसित किया गया है: Y2H परख व्यापक रूप से प्रोटीन खोजने के लिए इस्तेमाल किया गया है । अधिकांश भाग के लिए, एक ही विचार है कि इन पिछले दृष्टिकोण के साथ सफलता सुनिश्चित करने में मदद DEEPN के लिए महत्वपूर्ण हैं । महत्वपूर्ण बेंचमार्क में से कुछ में शामिल हैं: डीएनए की अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने-बंधन डोमेन फ्यूजन प्रोटीन, एक खाली शिकार प्लाज्मिड, चारा की एक उच्च संभोग दक्षता के साथ ब्याज की चारा युक्त diploids में अपने + विकास नकली की एक कम पृष्ठभूमि सुनिश्चित पुस्तकालय के साथ माता खमीर युक्त MATalpha खमीर युक्त, और अंत में, कम stringency शर्तों है कि जनसंख्या शर्तों के तहत विकसित करने की अनुमति है कि कई सकारात्मक Y2H प्रतिक्रियाओं के लिए चयन करें, यहां तक कि लोगों कि His3 गतिविधि के निंन स्तर का उत्पादन और एक कमजोर Y2H transcriptional प्रतिसाद.

DEEPN के महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक को उपभेदों है कि विभिंन चारा plasmids होते है और मज़बूती से उन पुस्तकालय plasmids कि सकारात्मक Y2H बातचीत बनाने के लिए उन आबादियों का चयन करने में Y2H पुस्तकालय परिचय reproducibly है । यह और अधिक मुश्किल हो जाता है जब Y2H पुस्तकालय की जटिलता बढ़ जाती है क्योंकि यह कठिन है कि विभिंन प्रारंभिक आबादी भर में पूरे पुस्तकालय के पर्याप्त हस्तांतरण सुनिश्चित करने के लिए । इसके अलावा, चयन की स्थिति और अनुक्रमण की गहराई के तहत विकसित करने के लिए चुना आबादी के आकार के लिए पर्याप्त Y2H प्लाज्मिड संरचना में reproducible परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए मज़बूती से सच सकारात्मक Y2H बातचीत की पहचान करने के लिए काफी हो गया है । पिछले अध्ययनों में, हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Y2H सीडीएनए पुस्तकालयों का इस्तेमाल किया । हम अलग एक ही चारा plasmids ले जाने की आबादी के बीच Y2H पुस्तकालय वितरण में परिवर्तनशीलता पाया कम है, < 0.01 के चयन से पहले दो प्रारंभिक आबादी के बीच एक फैलाव के साथ सामांयतया, और ०.३५-०.५५ के लिए अलग चयन के बाद आबादी4. हालांकि, इन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Y2H पुस्तकालयों में से कुछ की जटिलता काफी कम है (चित्र 7) । इसके अलावा, यह (~ ६०%) के भीतर क्लोन के कई सीडीएनए टुकड़े की पूरी तरह से बना रहे है कि कोडिंग क्षेत्र है, जो आगे अपनी उपयोगिता की सीमा के 3 ' कर रहे हैं । यह प्रदर्शित करने के लिए कि उपरोक्त विधियां अधिक जटिल Y2H पुस्तकालयों को समायोजित करने में सक्षम थीं, हमने सुव्यवस्थित ' शिकार ' में एक नया Y2H पुस्तकालय बनाया प्लाज्मिड वेक्टर (pGal4AD) से जीनोमिक डीएनए के अंशों से युक्त Saccaromyces cerevisiae (तनाव PLY5725) । जीनोमिक डीएनए बाल काटना द्वारा खंडित किया गया था, आकार ६००-१५०० बीपी की पर्वतमाला के लिए चयनित, एडेप्टर के साथ संशोधित, और SacCer_TAB Y2H पुस्तकालय (चित्रा 8) बनाने के लिए pGal4AD में डाला. पुस्तकालय PLY5725 में तब्दील हो गया था, जो एक खमीर जनसंख्या है कि तब PJ69-4a माता pTEF-GBD अकेले प्लाज्मिड ले जाने के अलग नमूने के लिए दोस्त था का उत्पादन किया । डुप्लिकेट द्विगुणित आबादी गैर चयनात्मक और चयनात्मक शर्तों के तहत बड़े हो रहे थे । Y2H प्लाज्मिड पुस्तकालय आवेषण गहरी अनुक्रमण द्वारा विश्लेषण किया गया । जब जीनोमिक डीएनए के लिए मैप १०० बीपी नदी के ऊपर और प्रत्येक प्रोटीन के बहाव को शामिल क्षेत्र कोडिंग (पूरे जीनोम के ८४%), हमने पाया > 1.1 लाख विभिंन plasmids पुस्तकालय में एक खमीर में पुस्तकालय का अनुमानित कुल आकार के लिए ~ १,३५०,००० अलग Plasmids. एक तुलना के रूप में, हम भी MATalpha खमीर में एक पहले वर्णित खमीर जीनोमिक Y2H पुस्तकालय11 (PJ_C1, C2, C3 Y2H पुस्तकालय) बदल गया है, और यह ऊपर के रूप में एक ही विश्लेषण के अधीन । हमने पाया है कि हमारे यादृच्छिक टुकड़ा खमीर Y2H पुस्तकालय की जटिलता दूर उच्च था और कहीं अधिक plasmids एंकोडिंग पहले से प्रकाशित पुस्तकालय की तुलना में प्रत्येक जीन के फ्रेम टुकड़े (चित्रा 9) । महत्वपूर्ण रूप से, द्विगुणित आबादी वाले आरंभिक पुस्तकालय की पीढ़ी < 0.01 (चित्र 10) के फैलाव के साथ बहुत reproducible थी । इसके अलावा, दो अलग खमीर आबादी होने के reproducibility सकारात्मक Y2H बातचीत के लिए चयन के बाद plasmids के समान पुनर्वितरण उत्पादन बहुत अच्छा था, ०.३ के एक फैलाव उपज । इस प्रकार, यहां तरीकों पहले इस्तेमाल किया उन से अधिक जटिलता के बड़े Y2H पुस्तकालयों को समायोजित ।

DEEPN की आसानी में वृद्धि के संदर्भ में, हम जीन संश्लेषण का उपयोग करने के लिए ब्याज की चारा प्रोटीन के लिए कोडिंग संमिलित करना पसंद करते हैं । यह प्रोटीन डोमेन, chimeras के लिए कोडिंग क्षेत्रों की अनुमति देता है, और म्यूटेंट को आसानी से Y2H चारा plasmids में शामिल किया जाएगा, लेकिन यह भी उनके codons एस. cerevisiaeमें अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित करने की अनुमति देता है । दो अलग Gal4 की अभिव्यक्ति-डीएनए-बंधन डोमेन फ्यूजन प्रोटीन चित्रा 3में प्रदर्शित किया जाता है । दो अलग खमीर दो चारा फ्यूजन प्रोटीन के या तो व्यक्त transformants तैयार किया गया और विरोधी myc एंटीबॉडी के साथ एसडीएस पृष्ठ और immunoblotting के अधीन । नोट चारा प्रोटीन की अभिव्यक्ति का स्तर Gal4 डीएनए-बंधन के सापेक्ष खाली सदिश से अकेले डोमेन । हमने पाया है यह न केवल चारा संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी सटीक माता खमीर रूपांतरित कॉलोनी में अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए विस्तार करने के लिए और शिकार पुस्तकालय के लिए दोस्त खमीर युक्त इस्तेमाल किया जाएगा । एक बार एक रूपांतरण की पहचान की गई है, यह संभव है इसे फ्रीज नीचे और बाद में उपयोग के लिए दुकान ।

चित्रा 4 आत्म सक्रियण के लिए एक परीक्षण से पता चलता है, जहां द्विगुणित कोशिकाओं के एक सीरियल कमजोर पड़ने CSM-लियू-टीआरपी (+ अपने) पर चढ़ाया जाता है, CSM-trp-लियू-अपने (-अपने), और CSM-टीआरपी-लियू-उसकी + 3AT (-उसकी + 3AT) प्लेटों और 3 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ने की अनुमति दी । वांछित परिणाम उपस्थिति में विकास का निरीक्षण करने के लिए है लेकिन histidine की परवाह किए बिना नहीं है कि वहां 3AT है । यह CSM-Trp-लियू के उपयोग की अनुमति देगा-अपने एक सकारात्मक खमीर 2 के साथ खमीर के लिए चयन-संकर बातचीत । अगर वहां CSM-लियू-टीआरपी-उसकी प्लेटों पर विकास है, तो एक Y2H चयन अभी भी 3AT है कि विकास को रोकता है की सबसे कम एकाग्रता का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है । हम पाते है कि अगर विकास CSM-Trp-लियू में अवरुद्ध किया जा सकता है-अपने + ०.१ mM 3AT, तो DEEPN परख इस हालत का उपयोग कर आगे Y2H बातचीत के लिए चयन कर सकते हैं । अगर, तथापि, pGal4AD या अंय खाली शिकार प्लाज्मिड और pTEF-GBD-चारा संलयन प्लाज्मिड युक्त diploids के विकास के निषेध 3AT की उच्च सांद्रता की आवश्यकता है, यह DEEPN प्रक्रिया और एक अलग चारा के प्रदर्शन से समझौता होगा प्लाज्मिड मांगी जानी चाहिए । ध्यान दें कि उसकी + वृद्धि एक सकारात्मक Y2H बातचीत के लिए ही चयन है । हमने पाया है यह बैच में Y2H बातचीत के लिए समृद्ध करने के लिए पर्याप्त है ।

DEEPN कार्यप्रवाह में सबसे महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं में से एक माता-Y2H शिकार पुस्तकालय ले जाने MATalpha खमीर के साथ चारा प्लाज्मिड ले जाने के खमीर के उच्च दक्षता संभोग प्राप्त करने के लिए है । हमने पाया है कि कुछ उपभेदों (जैसे, Y187)18, आवास व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सीडीएनए पुस्तकालयों, अपेक्षाकृत गरीब संभोग दक्षता है । कि कारण के लिए, हम एक Y2H पुस्तकालयों ले तनाव इंजीनियर । इस तनाव BY4742, S288c के व्युत्पंन पर आधारित है । इस तनाव में GAL4, GAL80, TRP1, LEU2, और HIS3का अभाव है । यह कोई रिपोर्टर है कि एक संकर Gal4 प्रोटीन के लिए उत्तरदाई है और न ही एक अलग संकर (जैसे, LexA-VP16) शामिल हैं । इसके बजाय, Y2H के स्रोत-प्रेरित His3 उत्पादन माता तनाव है कि विशेष रूप से चारा प्लाज्मिड ले जाएगा भीतर स्थित है । इस प्रणाली को सरल और अधिक लचीलापन है कि एक ही पुस्तकालय का उपयोग एक LexA-चारा फ्यूजन प्रोटीन और एक LexA (यूएएस) व्यक्त एक तनाव के साथ दोस्त को MATalpha कोशिकाओं युक्त कर सकते है अनुमति देता है-HIS3 रिपोर्टर या एक Gal4-DBD-चारा फ्यूजन प्रोटीन और एक Gal4 (यूएएस)-HIS3 संवाददाता.

एक बार दोनों एक चारा प्लाज्मिड और पुस्तकालय ले जाने की आबादी पैदा कर रहे हैं, वे पतला और शर्तों के तहत विकसित करने की अनुमति दी है कि बस दोनों plasmids (जैसे, CSM-टीआरपी-लियू) के लिए या दोनों plasmids और एक सकारात्मक Y2H बातचीत के लिए चुनें कि His3 का उत्पादन ड्राइव (जैसे, CSM-लियू-टीआरपी-His) । यह शुरू आबादी की एक बड़ी राशि के साथ शुरू करने के लिए एक विकासवादी ' अड़चन ' है कि जनसंख्या विषम कर सकते है कि एक सकारात्मक Y2H बातचीत के लिए चयन के बाद परिणाम से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । इस प्रकार, हमारी प्रक्रिया से बाहर की 20 मिलीलीटर का उपयोग निर्दिष्ट करता है ५०० द्विगुणित जनसंख्या संस्कृति की एमएल ताजा CSM-लियू-टीआरपी-अपने मीडिया के ७५० मिलीलीटर में हो इस समस्या से बचने के लिए । pTEF के साथ चारा प्लाज्मिड के रूप में GBD, हमने पाया कि कमजोर पड़ने और विकास के एक दौर एक जानकारीपूर्ण जनसंख्या विकसित करने के लिए पर्याप्त था । विभिंन चारा plasmids पहले का प्रयोग, हम कमजोर पड़ने और विकास, ७५० मिलीलीटर में से एक प्रारंभिक 20 मिलीलीटर के दो दौर का इस्तेमाल किया, और फिर उस संतृप्त संस्कृति से 2 मिलीलीटर ७५ मिलीलीटर में पतला । चित्रा 6 द्विगुणित जनसंख्या के लिए पुस्तकालय आवेषण भर में पीसीआर प्रवर्धन से परिणाम से पता चलता है गैर चयनात्मक शर्तों के तहत हो, साथ ही साथ कमजोर पड़ने और दो अलग के लिए चयनात्मक हालत में विकास की पहली और दूसरी लगातार दौर चारा plasmids. ध्यान दें कि कोई चयन के साथ, वहां पीसीआर के एक सामान्यीकृत धब्बा है एक जटिल और अपेक्षाकृत अच्छी तरह से टुकड़े का सामान्यीकृत मिश्रण का संकेत उत्पादों । चयन पर, कि पैटर्न परिवर्तन, कुछ प्रजातियों के साथ बहुत समृद्ध है कि व्यक्तिगत बैंड समझदार किया जा सकता है । बैंडिंग के कुछ डिग्री अभी तक आयोजित सफल प्रयोगों की खासियत है, इसके अलावा में एक धब्बा पैटर्न, या एक बैंडिंग पैटर्न के बजाय, शिकार आवेषण का एक जटिल मिश्रण का संकेत है और अगर एक उंमीदवारों की संख्या को अधिकतम करना चाहता है वांछनीय है कि DEEPN का पता लगाता है । बहुत मजबूत बैंडिंग पैटर्न, जहां पीसीआर उत्पाद के सबसे 1-3 बैंड में पाया जाता है, इंगित करता है कि sequencing डेटा के अधिकांश केवल 1-3 शिकार आवेषण द्वारा हावी हो जाएगा । एक इस आंशिक रूप से और अधिक इस नमूने से पढ़ता समर्पित द्वारा क्षतिपूर्ति कर सकते हैं । एक देख सकते हैं कि अगर आबादी पतला और आगे बढ़ा है (देखें ' चयनित d2 ' चित्रा 5में), बैंडिंग पैटर्न और अधिक प्रमुख है, यह दर्शाता है कि शिकार plasmids कमजोर लेकिन प्रामाणिक Y2H बातचीत को कम किया जा रहा है, जबकि एक का चयन कुछ शिकार plasmids अपनी बहुतायत बढ़ा रहे हैं । लगातार कमजोर पड़ने और इस अत्यधिक स्तर के विकास के संभावित उंमीदवारों की सबसे बड़ी संख्या को पकड़ने के लक्ष्य को उल्टा समझा जाता है और इस प्रकार यहां प्रोटोकॉल के साथ, हम कमजोर पड़ने और विकास के एक दौर की सिफारिश करते थे ।

Figure 1
चित्र 1: DEEPN कार्यप्रवाह का योजनाबद्ध. प्रयोगशाला प्रक्रियाओं की सामांय रूपरेखा को इसी कार्य को पूरा करने के लिए अनुमानित समय के साथ बाईं ओर दिखाया गया है । दाईं ओर bioinformatics कार्यप्रवाह DEEPN और Stat_Maker सॉफ़्टवेयर पैकेज का उपयोग कर रहा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: pTEF के योजनाबद्ध-GBD । TRP1-युक्त कम कॉपी Gal4 डीएनए बाइंडिंग डोमेन फ्यूजन प्रोटीन अभिव्यक्ति प्लाज्मिड दिखाया गया है । यह एक गठन TEF1 प्रमोटर, myc epitope टैग, Gal4 डीएनए बंधन डोमेन एक T7 आरएनए पोलीमरेज़ बंधन साइट, polylinker, और एक PRM9 (केंद्र) के भीतर centromere टर्मिनेटर-आधारित प्लाज्मिड के बाद सुविधाएं । इस प्लाज्मिड भी कनमीसिन प्रतिरोध किया जाता है और ColE1 बैक्टीरियल प्रतिकृति के मूल । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: Gal4-चारा फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति । खमीर से Lysates अलग चारा प्रोटीन Gal4 डीएनए-बंधन pTEF में व्यक्त डोमेन से जुड़े-GBD एसडीएस-पृष्ठ और विरोधी immunoblotting एंटीबॉडी के साथ myc के अधीन थे व्यक्त । pTEF-GBD सिर्फ Gal4-डीएनए-bindng डोमेन अकेला व्यक्त करता है; pTEF-GBD-bait1 Gal4-डीएनए-bindng एक अपने सी टर्मिनल RhoA साइट और आवास एक उत्परिवर्तन यह एक prenylation-अनुरूपता में ताला लगाने की कमी GTP से जुड़े डोमेन व्यक्त; pTEF-GBD-bait2 Gal4-डीएनए-bindng एक अपने सी टर्मिनल RhoA साइट और आवास एक उत्परिवर्तन यह एक सकल घरेलू उत्पाद में यह ताला लगाने के अनुरूप एक कमी prenylation से जुड़े डोमेन व्यक्त करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: स्व-सक्रियण परीक्षण. Diploids PJ69-4a कोशिकाओं संकेत दिया चारा plasmids और PLY5725 संकेत शिकार प्लाज्मिड ले जाने की कोशिकाओं से बना प्रश्नपत्र पतला और CSM-लियू-Trp प्लेटों पर देखा गया, CSM-लियू-टीआरपी-उसकी प्लेटें, और CSM-लियू-टीआरपी-अपने + 3AT प्लेटें और 3 दिनों के लिए उगाया पर 30 ° c. PJ69-4a transformants संभोग के लिए इस्तेमाल किया प्रत्येक जोड़ी के पहले थे चित्रा 3में दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: Y187 बनाम PLY5725 की संभोग दक्षता । PJ69-4a के बीच संभोग प्रतिक्रिया एक TRP1युक्त चारा वेक्टर और Y187 या PLY5725 ले जाने के शिकार प्लाज्मिड युक्त) किया गया था । 1:10000 कमजोर पड़ने CSM-टीआरपी-लियू पर चढ़ाया गया diploids के लिए चयन करें । PLY5725 तनाव के साथ Y187 तनाव से एक उच्च संभोग दक्षता से पता चलता है ~ 10 गुना अधिक कालोनियों का उत्पादन किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: शिकार पुस्तकालय आवेषण की पीसीआर । डीएनए एक शिकार पुस्तकालय है कि गैर चयनात्मक शर्तों (CSM-लियू-टीआरपी मीडिया) या एक सकारात्मक Y2H बातचीत के लिए चयन शर्तों (CSM-लियू-टीआरपी-अपने मीडिया) के तहत हो गया था युक्त द्विगुणित खमीर से अलग था । पुस्तकालय के पार पीसीआर आवेषण चयनित आवेषण की प्रदर्शनों की प्रदर्शितताओं में मतभेद बयां करता है । चयनात्मक विकास के दो दौर का इस्तेमाल किया गया । कमजोर द्वारा किए गए विकास के एक प्रारंभिक दौर के ५०० में द्विगुणित संस्कृति के ७५० मिलीलीटर गैर की एमएल CSM-लियू-टीआरपी मीडिया, और एक और 20 मिलीलीटर की ७५० मिलीलीटर में CSM-लियू-टीआरपी के एक प्रारंभिक दौर के लिए अपने मीडिया चयनात्मक वृद्धि (d1) । यह विकास का एक अतिरिक्त दौर (d2) द्वारा d1 संस्कृति और चयनात्मक मीडिया CSM-लियू-टीआरपी के ७५ मिलीलीटर में कमजोर के 2 मिलीलीटर लेने के द्वारा किए गए उनके बाद किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: Y2H सीडीएनए पुस्तकालय की जटिलता । एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माउस सीडीएनए Y2H शिकार पुस्तकालयों की सामग्री का विश्लेषण: माउस मस्तिष्क के सीडीएनए से एक पुस्तकालय और एक से अधिक माउस के ऊतकों से एक । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्रा 8: Y2H खमीर जीनोमिक टुकड़ा पुस्तकालय की पीढ़ी । A. योजनाबद्ध pGal4AD में खमीर जीनोमिक टुकड़ा पुस्तकालय के विधानसभा का वर्णन । जीनोमिक डीएनए से तनाव PLY5725 बेतरतीब ढंग से कतरनी, संकेत के साथ ligated Y-एडेप्टर, और ligated में SfiI-कट pGal4AD था । Ligations बैक्टीरिया में तब्दील करने के लिए २.२ x 106 स्वतंत्र कालोनियों कि संयुक्त और उनके प्लाज्मिड डीएनए के अलगाव से पहले हो गए थे SacCer_TAB Y2H पुस्तकालय शामिल उपज थे । ख. LEU2-युक्त प्लाज्मिड (pGal4AD) आवास Gal4 transcriptional सक्रियण डोमेन दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्रा 9: Y2H खमीर जीनोमिक पुस्तकालय की जटिलता । SacCer_TAB जीनोमिक पुस्तकालय PLY5725 MATalpha तनाव में तब्दील हो गया था और PJ_C1, C2, C3 खमीर जीनोमिक पुस्तकालय υ १८७ ΜΑΤalpha तनाव में तब्दील हो गया था । इन आबादियों के Diploids को PJY69-4a तनाव से सहवास करके बनाया गया था. आबादी 10 पीढ़ियों और शिकार टुकड़ों के लिए उगाया गया पीसीआर प्रवर्धित उच्च प्रवाह अनुक्रमण और विश्लेषण के अधीन थे । A. Y2H प्रति जीन पढ़ता द्वारा विभाजित पुस्तकालयों में प्रत्येक जीन प्रति पढ़ता के रैंक आदेश दिखाता है जो खमीर जीनोम sequencing द्वारा पाया । प्रत्येक जीन के बराबर बहुतायत दिया, प्रत्येक जीन 1 के एक मूल्य होगा । ख. plasmids जीन प्रति अद्वितीय है कि एक टुकड़ा है कि दोनों में प्रोटीन क्षेत्र कोडन (ओआरएफ) और उचित अनुवाद पढ़ने के फ्रेम में सांकेतिक शब्दों में बदलना की संख्या दिखा हिस्टोग्राम । C. प्रत्येक पुस्तकालय है कि सांकेतिक शब्दों में बदलना खमीर जीन और इन है कि कर रहे है और सही अनुवाद पढ़ने के फ्रेम में नहीं है या पीछे की तरफ डाला जाता है के अनुपात में अलग plasmids की संख्या की तुलना । D. भूखंडों और जंक्शनों की बहुतायत दिखा रहा है कि उदाहरण के जीन (VPS8 और VPS16) को नक्शा प्रत्येक पुस्तकालय में plasmids के लिए मिला । जीन फ्यूजन कि सही शोधों पढ़ने के फ्रेम में कर रहे हैं के साथ Plasmids ब्लू नामित कर रहे हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 10
चित्रा 10: जटिल Y2H खमीर जीनोमिक पुस्तकालय के साथ DEEPN के Reproducibility । A. चार अलग खमीर द्विगुणित आबादी SacCer_TAB Y2H पुस्तकालय PLY5725 में स्थित के साथ संभोग द्वारा बनाए गए थे, गैर के तहत हो चयनात्मक शर्तों, और अनुक्रम । प्रत्येक जनसंख्या के लिए जीन प्रति पढ़ता व्यक्तिगत रूप से सभी आबादी भर में औसत रैंक आदेश मूल्य के एक समारोह के रूप में रची है । B. सकारात्मक Y2H बातचीत के लिए चयन के बाद दो नमूनों के बीच जीन प्रति पढ़ता दिखाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यहां हम कैसे बैच में Y2H परख प्रदर्शन करने के लिए अनुकूलित तरीकों का उपयोग करने के लिए एक गाइड प्रदान करते हैं । वहां कुछ महत्वपूर्ण कदम प्रक्रिया में मदद करने के लिए सुनिश्चित करें कि खमीर कि चयन के तहत रखा जाएगा की जनसंख्या शुरू पुस्तकालय के प्रतिनिधि है और यह है कि शुरू खमीर जनसंख्या के लिए पर्याप्त चयन से गुजरना करने के लिए प्रयोग किया जाता है परिवर्तनशीलता सीमा . महत्वपूर्ण बात, इन मानकों को अपेक्षाकृत के लिए तरीके और एक पारंपरिक Y2H परख के लिए सामग्री के अनुकूल है, इस प्रकार यह सबसे मानक आणविक जीवविज्ञान के लिए सुसज्जित प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ बनाने के साथ प्राप्त करने के लिए आसान कर रहे हैं । DEEPN अलग चारा plasmids का उपयोग करते हुए एक ही शिकार पुस्तकालय आबादी से चयन की अनुमति देता है । इसलिए, उंमीदवारों कि एक अंय बनाम एक चारा के साथ एक Y2H बातचीत का उत्पादन बातचीत के सेट की तुलना में सीधे किया जा सकता है । गहरी अनुक्रमण प्रयोग किया जाता है, क्योंकि एक एक चारा विशिष्ट खमीर जनसंख्या के लिए शुरू पुस्तकालय संरचना सत्यापित कर सकते है और स्वतंत्र रूप से पुस्तकालय में प्रत्येक उंमीदवार शिकार जीन के संवर्धन का पालन करें । बैच प्रसंस्करण एक अर्द्ध मात्रात्मक तरीके से है कि फिर एक एक सांख्यिकीय रैंकिंग4की गणना करने की अनुमति देता में अलग चारा के खिलाफ एक ही पुस्तकालय क्वेरी की अनुमति देता है ।

इस प्रोटोकॉल है कि सफलता के लिए महत्वपूर्ण है में कई कदम उठाए हैं । एक यह है कि diploids की एक बड़ी संख्या में Y2H शिकार पुस्तकालय के पर्याप्त प्रतिनिधित्व सुनिश्चित करने के लिए प्राप्त किया जाना चाहिए ब्याज की प्रत्येक चारा प्लाज्मिड के साथ मिलाया जाता है । संभोग प्रक्रिया यहां वर्णित कई मापदंडों अलग से अनुकूलित किया गया है । हमने पाया है कि कुछ उपभेदों कि घर वाणिज्यिक Y2H पुस्तकालयों सामांय में खराब दोस्त है, तथापि, संभोग प्रक्रिया यहां वर्णित 2 x 106-2 x 107 diploids उत्पंन कर सकते है जब पीछा किया, Y2H के पर्याप्त और reproducible हस्तांतरण की अनुमति जनसंख्या में पुस्तकालय । प्रक्रिया का एक और महत्वपूर्ण पहलू यह सुनिश्चित करना है कि ब्याज की चारा प्लाज्मिड अपने दम पर या खाली Gal4 सक्रियण डोमेन शिकार प्लाज्मिड के साथ एक सकारात्मक Y2H बातचीत पैदा नहीं करता है । एक Y2H बातचीत के चयन के लिए विधि Histidine के अभाव में वृद्धि की मांग की है जिसमें एक सकारात्मक Y2H संपर्क HIS3 की प्रतिलेखन लाती को कोशिकाओं को अपने + होने की अनुमति है । जबकि नियमित रूप से पारंपरिक Y2H परख प्रतिस्पर्धी अवरोधक 3AT जोड़ने के लिए पृष्ठभूमि विकास या अंय पत्रकारों का उपयोग करें3 , इस प्रक्रिया का सबसे अच्छा काम करता है जब कमजोर Y2H बातचीत के साथ कोशिकाओं को विकसित कर सकते है और इस तरह वृद्धि के लिए stringency बढ़ सकता है और केवल मजबूत Y2H बातचीत के साथ कोशिकाओं के लिए चयन शिकार plasmids की प्रदर्शनियों कि पहचान की जा सकती है सीमाओं । एक अंय महत्वपूर्ण पहलू को यकीन है कि शुरू द्विगुणित आबादी की एक बड़ी राशि के लिए चयनात्मक और गैर चयनात्मक शर्तों के तहत विकसित करने के लिए नमूना त्रुटि से विकासवादी अड़चनों से बचने के लिए प्रयोग किया जाता है4 । संस्कृति की मात्रा और यहां निर्दिष्ट कक्ष संख्या के बाद reproducibility सुनिश्चित करने में मदद मिलेगी और शोर कम ।

कारणों में से एक DEEPN दृष्टिकोण शक्तिशाली है कि यह व्यापक अपने हित के चारा के साथ बातचीत करने की क्षमता के लिए एक दिया शिकार पुस्तकालय में सभी plasmids का पालन कर सकते हैं । इस प्रकार, DEEPN की सीमाओं में से एक पुस्तकालय की जटिलता का इस्तेमाल किया है । लोगों को हम यहां इस्तेमाल की तरह वाणिज्यिक पुस्तकालयों में से कुछ के लिए, हमने पाया है कि plasmids की संख्या बोना सीडीएनए ओआरएफ कि Gal4 सक्रियकरण डोमेन के एक ही पढ़ने के फ्रेम में है कि सांकेतिक शब्दों में बदलना का प्रतिनिधित्व के साथ 3-6 x10 4 के बीच है ~ ६,०००-8, 00 0 अलग जीन । हमने पाया है कि इन पुस्तकालयों के लगभग ७५% निहित सीडीएनए क्षेत्रों है कि कोडिंग डीएनए अनुक्रम के 3 ' थे (सीडी/ इसके अलावा, लगभग एक तिहाई जीन जो पुस्तकालय में टुकड़े था कोई भी नहीं है कि ओआरएफ या ओआरएफ के नदी के ऊपर में क्षेत्रों से मेल खाती थी ।

हमने DEEPN पद्धति में तीन अन्य परिवर्तन किए. एक एक नया MATalpha तनाव है कि ले ' शिकार ' पुस्तकालयों एक TRP1 प्लाज्मिड के भीतर लुफ्त उठा सकते है और वह अब तक कुछ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पुस्तकालय से बेहतर-ऐसे Y187 के रूप में उपभेदों युक्त साथी । इस में मदद करता है ब्याज की प्रत्येक चारा के लिए पुस्तकालय की आबादी का पूरा हस्तांतरण सुनिश्चित करते हैं । हम भी एक नया ' चारा ' अभिव्यक्ति प्लाज्मिड, जो पहले से वर्णित plasmids है कि एक चर प्रति 2 µ आधारित रीढ़ की10का उपयोग करें से अलग किया । यहां हम एक कम कॉपी केंद्र प्लाज्मिड (pTEF-GBD) का वर्णन और पाते है कि चयनात्मक विकास का एक दौर शिकार plasmids बातचीत के लिए समृद्ध करने के लिए पर्याप्त है । अन्त में, हम एक सुव्यवस्थित ' शिकार ' पुस्तकालय वेक्टर का निर्माण और एक उच्च घनत्व यादृच्छिक-टुकड़ा जीनोमिक Y2H पुस्तकालय का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया Saccharomces cerevisiae, जो खोज और निस्र्पक बातचीत के लिए भविष्य में उपयोगी होना चाहिए amonst खमीर प्रोटीन । कुल मिलाकर, सामग्री और bioinformatics उपकरण में सुधार (साथ काम में वर्णित) DEEPN व्यापक और तुलनात्मक Y2H स्क्रीन प्रदर्शन का एक सुलभ, साध्य, और कारगर तरीका दृष्टिकोण बनाते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

हम NGS पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण के लिए मानव आनुवंशिकी के संस्थान के भीतर कर्मचारियों को धन्यवाद । हम Y2H प्लाज्मिड पुस्तकालय के लिए जीनोमिक पुस्तकालय टुकड़े तैयार करने में उसकी विशेषज्ञता के लिए Einat Snir धंयवाद यहां बनाया । इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था: NIH R21 EB021870-01A1 और द्वारा NSF अनुसंधान परियोजना अनुदान: १५१७११० ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Illumina HiSeq 4000 Illumina deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies Biolegend 901514 Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies QED Biosciences Inc 18826 Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI New England BioLabs R0191S
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
BamHI-HF New England BioLabs R3236S
XhoI New England BioLabs R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder J.T. Baker U2211-08
Salmon Sperm DNA Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific 50-948-286 carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate Research Products International K22000
LE Agarose GeneMate E-3120-500 used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride Research Products International S23025
Tryptone Research Products International T60060
D-Sorbitol Research Products International S23080
Lithium Acetate Dihydrate MP Biomedicals 155256
Calcium Chloride ThermoFisher C79
EDTA Sodium Salt Research Products International E57020
Yeast Extract Powder Research Products International Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids Research Products International Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE Formedium DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE Formedium DCS1169
CSM-Leu-Met Formedium DCS0549
CSM-Trp-Met Bio 101, Inc 4520-922
L-Methionine Formedium DOC0168
Adenine Research Products International A11500
D-(+)-Glucose Research Products International G32045
Bacto Agar BD 214010 used for making media plates in section 1
Peptone Research Products International P20240
3-amino-1,2,4 Triazole Sigma A8056
2-Mercaptoehanol (BME) Sigma-Aldrich M6250
Zymolyase 100T USBiological Z1004
Potassium phosphate dibasic Sigma P8281
Phenol:Chloroform:IAA Ambion AM9732
Ammonium Acetate Sigma-Aldrich 238074
Ethanol Decon Laboratories, INC 2716
RNAse A ThermoFisher EN0531
Urea Research Products International U20200
SDS Research Products International L22010
glycerol Sigma Aldrich G5516
Tris-HCl Gibco 15506-017
bromophenol blue Amresco 449
Gibson Assembly Cloning Kit New England Biolabs E5510S Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix New England Biolabs M0541S Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide Amresco 0492-5G
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104 Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit KAPA Biosystems KK8500 preparation kit for deep sequencing
Codon optimization http://www.jcat.de
Codon optimization https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks Integrated DNA Technologies DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings Thermofisher DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit EPOCH Life Sciences Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220 Covaris high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT
CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG
ACATTCCCAGTTGTTC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT
TTCTGCCACCTCTTCC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC
ACTATTTGGAGCGCTG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG
CCTCTGCGAGTG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT
AGCGTCAAATACC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA
GTGGTATCAACG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA
AGTGTCAACAACGTA -3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436 MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD Dr. Robert Piper Lab Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
pGal4AD (pPL6343) Dr. Robert Piper Lab Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes Kord-Vallmark sold by VWR 2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube Thermofisher 14-961-33
pipet-aid Drummond 4-000-100
5 mL Serological Pipette Denville P7127
10 mL Serological Pipette Denville P7128
25 mL Serological Pipette Denville P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker Fisher Scientific 02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle Fisher Scientific 06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder Fisher Scientific 08-572-6G
SpectraMax 190 Molecular Devices used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000 Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator Ultra Lum MEB 20 used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123602G
P200 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123601G
P20 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123600G
P10 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips GeneMate P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips VWR 10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips VWR 10017-042
50 mL conical tube VWR 490001-627
15 mL conical tube VWR 490001-621
cell scraper Denville Scientific TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
HCl Fluka Analytical 318949-1L
NaOH J.T. Baker 5674-02
Wooden applicators Solon Care 55900
Eppendorf microcentrifuge 5424 Fisher Scientific 05-400-005 microcentrifuge
Sorvall ST16R Thermo Fisher Scientific 75004381 benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE Healthcare NA934-1ML Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE Healthcare NA931-1ML Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific 34080 ECL detection solution
Isotemp Incubator Thermo Fisher Scientific Incubator
Mutitron 2 INFORS HT Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205 Fisher Scientific water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue) Clontech 630482 commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain) Clontech 630488 commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector Clontech 630442 commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector Clontech 630443 commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase Bioline BIO-21042 DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler BioExpress P-6050-60 pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes USA Scientific 1405-8100

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References

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एक खमीर 2-बैच में संकर स्क्रीन प्रोटीन बातचीत की तुलना करने के लिए
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Peterson, T. A., Stamnes, M. A., Piper, R. C. A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions. J. Vis. Exp. (136), e57801, doi:10.3791/57801 (2018).

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