Summary
酵母 2 ハイブリッド スクリーンのバッチ処理は、獲物の融合蛋白質の非常に複雑なセットを持つ複数の餌の蛋白質の相互作用のプロファイルの直接比較のためことができます。ここでは、我々 は洗練された方法、新しい試薬とこのような画面の使用を実装する方法について説明します。
Abstract
酵母 2 ハイブリッド法によるタンパク質-タンパク質相互作用のためのスクリーニングは、効果的なツールを長年が、その使用は主として相互作用する候補者のライブラリで濃縮され高い高親和性インターアクターの発見に制限されています。伝統的な形式の酵母 2 ハイブリッド試金は低親和性インターアクターを発見可能性があります低金詰りで実施を分析するあまりにも多くの植民地を得ることができます。また、別の餌プラスミドに対して同じライブラリの包括的かつ完全な尋問、なし比較分析を実現できません。これらの問題のいくつかは、アレイ獲物ライブラリを使用して対処できる、コストとインフラストラクチャは、このような画面を操作するために必要なことが禁止できます。代わりに、我々 は同時に過渡の多数を明らかにする酵母 2 ハイブリッド試金を適応しているし、戦略を利用した単一の画面内で静的な蛋白質の相互作用に deepn 深さ (評価のタンパク質ネットワークの動的な濃縮) と呼ばれています。ハイスループット DNA の配列と相互作用のパートナーをエンコード プラスミドの人口の進化に従ってくださいに計算が組み込まれています。ここでは、カスタマイズされた試薬と簡単にかつ低コストで実行する deepn 深さが画面を可能にするプロトコルについて述べる。
Introduction
細胞生物学的プロセスの完全な理解は、その分子機構の根底にある蛋白質相互作用ネットワークの検索に依存します。蛋白質の相互作用を識別する 1 つの方法は興味の蛋白質の 2 つの領域は互いにバインド1一度機能しているキメラ転写因子を組み立てることによって動作する酵母 2 ハイブリッド (Y2H) 試金。Y2H の典型的なスクリーンがプラスミド転写活性化因子に融合相互作用の蛋白質の両方図書館を収容する酵母の人口を作成することによって実行されます (例えば.、'捕食' 融合タンパク質) とタンパク質から成る特定の '餌' プラスミド興味の DNA 結合ドメイン (例えば、Gal4 上流活性化シーケンスにバインド Gal4 DNA 結合ドメイン) に溶けます。Y2H アプローチの主な利点の 1 つは、比較的簡単だし、ルーチンワーク分子生物2の典型的な研究室で実施する安価な装備です。しかし、伝統的に実行されると、ユーザーは正の Y2H 相互作用の選択により発生する個々 のコロニーをサンプリングします。これは、調査することができますライブラリ '捕食' クローンの数を厳しく制限されます。この問題は、特定の相互作用する獲物の豊富さが非常に高い他、低豊富な獲物プラスミドからの相互作用を検出する機会を減少と関連した合成されます。
プロテオームの包括的なカバレッジの Y2H 原理を使用して 1 つのソリューションは、知られている個々 の獲物プラスミドを含む配列を前記デジタルに尋問できるマトリックス形式のアプローチの使用です。ただし、このようなアプローチは蛋白質またはドメイン3の少数のインタラクトームを定義する際に興味を持っている個々 の捜査官に容易にアクセスや費用対効果のないインフラストラクチャが必要です。さらに、複数のフラグメントの相互作用の蛋白質を符号化するかもしれない非常に複雑な獲物ライブラリは、非現実的なサイズにこのような行列の配列のサイズを拡大します。代わりに、バッチで複雑なライブラリとアッセイを行い、大規模な並列高スループット シーケンス4を使用して相互作用するクローンの存在を評価します。これはアッセイの典型的なを使用して複数のコロニーで発生する獲物プラスミドの存在に適用できる Y2H 形式アプローチする酵母の細胞融合蛋白質の相互作用のペアを住宅プレート5,6に成長すること。この一般的な考えは、両方の複数の餌のクエリを増やすし、同じ時間7,8のコンポーネントを獲物に強調することができます。
それでも、多くの調査は簡単にまだ努力に注力ほんのタンパク質 '餌' を必要とし、単一の複雑な獲物ライブラリの包括的な半定量的なクエリによって恩恵を受けることができます。我々 は開発し、バッチ形式4で Y2H 原理を用いた大規模タンパク質相互作用研究を実行するアプローチを検証します。Y2H 相互作用9の相対的な強さのためのプロキシとして特定の獲物プラスミドの膨張率を使用します。集団内のすべてのプラスミドのディープ シーケンスが正常な成長を受けるまたは選択成長条件は、強くて弱い Y2H 相互作用を得られるクローンの完全なマップを生成します。インターアクターのレパートリーを入手し、直接複数の餌プラスミド間で比較することができます。Deepn 深さ (評価のタンパク質ネットワークの動的な濃縮) と呼ばれる作成されたワークフローは、対別のもの 1 つのタンパク質の比較を許可する蛋白質を識別する同じ獲物ライブラリから差分 interactomes を識別するためにこのように使用できます。
Deepn 深さを示すここでは、図 1に記載されている、その使用を容易にする実験室方法の改善を紹介。大幅な改善が含まれます。
獲物酵母集団の生成します。プラスミド獲物ライブラリの分布が同じ別の餌プラスミドと酵母の集団の生成 deepn 深さの重要な要件の 1 つです。獲物プラスミド ライブラリの同等基準集団が異なる餌の interactomes 間の正確な比較を行うために不可欠です。これは最高のライブラリ プラスミドは既に建物半数体酵母の人口で、その人口に与えられた餌のプラスミドの移動は、二倍体を生成する交配によって達成されるとき達成します。ここでは、我々 は半数体酵母の市販のライブラリを使用してこのような集団を作る方法で、明確な指針を提供します。我々 は二倍体数が多いを生成するメソッドを発見したが、これら商用ライブラリを含む酵母菌の全体的な交尾効率が低かった。したがって、交配反応あたりはるかに多くの切片が得られます獲物ライブラリを収容できる新しいひずみを構築しました。
新しい餌プラスミドの設定をします。エクスプレス '餌' 融合蛋白質で構成される興味の DNA 結合ドメインとタンパク質の多くの現在のプラスミドは、2 μ ベース、コピー数を増幅させることです。このコピーの数は、人口の非常に変数をでき、Y2H 転写応答の可変性に 。これは、ターンでは選択範囲の下のセルの成長の応答に基づいて特定の蛋白質の相互作用の強さを測定する能力が偏る可能性があります。これは、部分的アドレスのいくつかは以前市販 pDEST3210など記載されている低コピー プラスミドを用いた。上流の餌フラグメントの両方のクローンを作成ことができます Kanr 耐性遺伝子を運ぶTRP1セントロメア ベース低コピー プラスミド内 Gal4 DNA 結合ドメイン融合蛋白質を作り出す新しい餌プラスミド (pTEF GBD) を構築したとGal4 DNA 結合ドメインの下流。
新しい高密度 Y2H フラグメント ライブラリ。家 Y2H 獲物ライブラリに新しいプラスミドを構築し、ゲノム DNA の断片をランダムにせん断の酵母から作られた非常に複雑な Y2H ライブラリをビルドするために使用します。シーケンス解析は、このライブラリが前述の酵母ゲノム Y2H プラスミド ライブラリ11よりも遠く複雑以上 100 万の異なる要素を持っていたことを示した。この新しいライブラリ DEEPN ワークフローが堅牢な信頼性が高く、再現性のある方法で多くの異なるプラスミドを持つ複雑なライブラリに対応することを示すことができました。
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Protocol
1. メディアとプレートの準備
注: すべてのプレートは最小限、プロトコルを開始する前に 2 日間で行われる必要があります。メディアは、任意の時点で作成できます。ただし、バッファリングされた酵母エキス ペプトン ブドウ糖アデニン (bYPDA) は、使用する日を可能にする必要があります。いくつかのメディアは、通常使用されるものよりも大きいがアデニンのレベルを含むサプリメント ミックスを使用して行われます。ほとんどの最小媒体サプリメントは、10 mg/L アデニンを指定します。サプリメントのラベル '+ 40Ade' 40 mg/L のアデニンの合計を指定します。
- グルコース溶液を準備 (50 %w/v)。1 L のため、d-(+) の 500 g を溶解-1,000 mL のビーカーに蒸留水 800 mL にブドウ糖。1,000 mL の滅菌メディア ストレージ ボトルに 0.2 μ m の滅菌フィルターを通してメスシリンダーとフィルターを使用して 1,000 mL にボリュームを調整します。
- 酵母エキス ペプトン ブドウ糖 (YPD) プレートを準備します。の 1 L、20 g ペプトンと 1,000 mL のビーカーに蒸留水 800 mL に酵母エキス 10 g を溶かします。卒業シリンダーに注ぐ、960 mL を蒸留水で埋めます。2,000 mL 三角フラスコに注ぎ、寒天 15 g を追加します。37 ° C 水お風呂お風呂の水の温度が約 42 ~ 50 ° C に冷却するまでに冷却しオートクレーブピペットを使用すると、50% ブドウ糖 40 mL を追加します。旋回でよく混ぜます。
- ピペットで 20 ml のメディアの 100 mm の版のシリーズを注ぐ。
- 完全な合成最小媒体 (CSM) の準備-Trp プレート。1 Lのアミノ酸なし酵母窒素ベースの 6.7 g を 1,000 mL のビーカーに蒸留水 800 mL に溶解します。卒業シリンダーに入れて、蒸留水で最大 960 mL を埋めます。2,000 mL 三角フラスコに注ぐし、トリプトファン 0.7 g を追加-ドロップ アウト ミックス メチオニン、20 mg、寒天 15 g に会った。37 ° C 水お風呂お風呂の水の温度が約 42 ~ 50 ° C に冷却するまでに冷却しオートクレーブピペットを使用すると、50% ブドウ糖 40 mL を追加します。旋回でよく混ぜます。
- ピペットで 20 ml のメディアの 100 mm の版のシリーズを注ぐ。
- CSM ルー会ったプレートを準備します。の 1 L, 10.05 g 酵母窒素ベースのアミノ酸なしを 1,000 mL のビーカーに蒸留水 800 mL に溶解します。卒業シリンダーに注ぐし、蒸留水の 940 mL までを記入します。2,000 mL 三角フラスコに注ぐし、ルーの 1.005 g を追加-ドロップ アウト ミックス寒天 15 g に会った。37 ° C 水お風呂お風呂の水の温度が約 42 ~ 50 ° C に冷却するまでに冷却しオートクレーブピペットを使用すると、50% ブドウ糖の 60 mL を追加します。旋回でよく混ぜます。
- ピペットで 20 ml のメディアの 100 mm の版のシリーズを注ぐ。
- CSM ルー Trp プレートを準備します。の 1 L, 10.05 g 酵母窒素ベースのアミノ酸なしを 1,000 mL のビーカーに蒸留水 800 mL に溶解します。メスシリンダーに入れて、蒸留水の 940 mL までを記入します。2,000 mL 三角フラスコに注ぐし、トリプトファンの 1.005 g を追加-ルー + 40Ade ドロップ アウト ミックス、アデニン、240 mg、寒天 15 g。37 ° C 水お風呂お風呂の水の温度が約 42 ~ 50 ° C に冷却するまでに冷却しオートクレーブピペットを使用すると、50% ブドウ糖の 60 mL を追加します。旋回でよく混ぜます。
- ピペットで 20 ml のメディアの 100 mm の版のシリーズを注ぐ。
- CSM ルー Trp 彼のプレートを準備します。の 1 L, 10.05 g 酵母窒素ベースのアミノ酸なしを 1,000 mL のビーカーに蒸留水 800 mL に溶解します。メスシリンダーに入れて、蒸留水の 940 mL までを記入します。2,000 mL 三角フラスコに注ぐし、トリプトファンの 0.975 g を追加-ルー-彼 + 40Ade ドロップ アウト ミックス、アデニン、240 mg、寒天 15 g。37 ° C 水お風呂お風呂の水の温度が約 42 ~ 50 ° C に冷却するまでに冷却しオートクレーブピペットを使用すると、50% ブドウ糖の 60 mL を追加します。旋回でよく混ぜます。
- ピペットで 20 ml のメディアの 100 mm の版のシリーズを注ぐ。
- CSM-ルー-Trp-彼-3AT プレートを準備します。の 1 L, 10.05 g 酵母窒素ベースのアミノ酸なしを 1,000 mL のビーカーに蒸留水 800 mL に溶解します。メスシリンダーに入れて、蒸留水の 940 mL までを記入します。2,000 mL 三角フラスコに注ぐし、トリプトファンの 0.975 g を追加-ルー-彼 + 40Ade ドロップ アウト ミックス、アデニン、240 mg、寒天 15 g。37 ° C 水お風呂お風呂の水の温度が約 42 ~ 50 ° C に冷却するまでに冷却しオートクレーブピペットを使用すると、50% ブドウ糖の 60 mL を追加します。3-アミノ 1,2,4 トリアゾール (3AT) 1 M 滅菌株式の 100 μ L 旋回でミックスします。
- ピペットで 20 ml のメディアの 100 mm の版のシリーズを注ぐ。
- LB Kanr プレートを準備します。1 L のため、溶解酵母 5 g、トリプトンの 10 g を抽出し、1,000 mL のビーカーに蒸留水を 800 mL の塩化ナトリウムの 10 g。卒業シリンダーに入れて、蒸留水 1,000 mL までを記入します。2,000 mL 三角フラスコに注ぎ、寒天 15 g を追加します。37 ° C 水お風呂お風呂の水の温度が約 42 ~ 50 ° C に冷却するまでに冷却しオートクレーブ50 mg カナマイシン、旋回で混ぜます。
- ピペットで 20 ml のメディアの 100 mm の版のシリーズを注ぐ。
- YPD、CSM 会ったルー、CSM Trp の CSM ルー Trp と CSM ルー Trp 彼のメディアを準備します。上記の手順を使用して、プレートを除いてメディア ストレージ ボトルに注ぐ三角フラスコを注ぐのではなく、寒天を省略します。
- BYPDA (バッファー産) を準備します。滅菌 YPD メディアを取り出して、滅菌蒸留水に 200 mg/L のアデニンを追加します。滅菌瓶に塩酸フィルターで 0.2 μ m の滅菌フィルターを 3.7 に pH を調整します。
- 変換バッファーを準備: 2 M ソルビトール、1 M リチウム酢酸二水和物、10 mM Tris pH 7.6, 0.5 ミリメートルの EDTA、蒸留水中で塩化カルシウム 0.2 mM。滅菌瓶の中に 0.2 μ m の滅菌フィルターをフィルターします。
- 止め釘の解決の準備: 70 %w/v ポリエチレング 3350 蒸留水で。オートクレーブで滅菌します。
- クルクルの準備: 8 M 尿素、4 w/v SDS、50 mM Tris pH 6.8, 10 %v/v グリセロール、0.02 %w/v ブロモフェノール ブルー滅菌蒸留水。
- STE (強い TE) の準備: 50 mM トリス、20 ミリメートルの EDTA、pH 8.0 蒸留水で。滅菌瓶の中に 0.2 μ m の滅菌フィルターをフィルターします。
- Zymolase 原液を準備: 10 mg/mL Zymolase 100T 50 mM カリウム リン酸二塩基性 pH 7.5、不稔性 50 %v/v グリセロール バッファー専用蒸留水 (-20 ° C で保存されます)。
2. クローニングと餌プラスミドの検証
注: Gal4 DNA 結合ドメインのプラスミッドの構造。現在、さまざまな市販と学問的な Y2H システムがあります。TRP1の DNA 結合ドメインに融合した興味の蛋白質を表現する餌プラスミドが deepn 深さはこれらの多くを収容できる-プラスミドを含みます。その他のダウン ストリームの要件シーケンスは、すぐに上流獲物ライブラリの挿入が知られており、正 Y2H の相互作用はヒスチジンに欠けているメディアの選択を可能にする His3 の生産によって得点することができます。ここで述べる新しい Y2H 餌プラスミド (pTEF GBD、図 2) の使用、ただし、同様 pGBKT7 を含む他の Y2H 餌プラスミドを使用できます。建設と餌プラスミドの評価、pTEF GBD の使用を述べる。一般的な注意としては、いい表情、クローン作成の容易さを確保するために酵母のコドン バイアスに準拠するオープンリーディング フレームを生成する遺伝子合成をお勧めします。クローン作成方式が Gal4 DNA 結合ドメインのフレームと 3' サイトへのクローニングしているとき、停止コドン餌コード領域を次の餌にできることを確認します。
- プラスミッドのベクトルを準備します。プラスミド pTEF GBD は興味の蛋白質を符号化断片をクローニング、5' または 3' エンコード Gal4 DNA 結合ドメインの迅速なアセンブリ メソッドを使用して領域の。0.5 μ G/ml エチジウム ブロマイド (EtBr) 対 100 で消費税カット 5,630 bp 2 4 1% DNA agarose の Electrophorese サンプルのため XhoI ゲル含む 0.2 - 5' のサイトで挿入ナリと EcoRI pTEF GBD の 3 μ g を消化または 3' サイトに挿入するため病原のダイジェストと TEF GBD DNA ゲル抽出キットを使用して、製造元の指示に従って浄化し、260 で吸光度によって DNA の定量化による分光光度計12nm。
注: 餌エンコード チップの世代。DNA 断片の蛋白質を符号化する、または興味の蛋白質断片が遺伝子合成を使用して作られた、非複製フラグメントとして利用可能にすることができます。酵母における発現コドンは最適化されており、コドン最適化のためのオンライン ツールは、材料のリストに含まれることをお勧めします。 - 5' の挿入の側面 5'-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC - 3、ATG 開始コドンを符号化する DNA のフラグメント 'と 5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3'、それぞれ。Gal4 DNA 結合ドメインを持つフレームに挿入 3' 5'-ctgcatatggccatggaggccgaa-3 によってエンコードのフラグメントをフランク 'と 5'-tagtaactagcataaccccttggggcc-3'。
- プラスミド構築のためカット pTEF GBD に製造元の指示で指定されたクローンの断片のための迅速なアセンブリ メソッドを使用しています。
- プレートすべては LB Kanr プレートにエシェリヒア属大腸菌を変形し、37 ° C で 16-20 時間インキュベート目的の挿入と pTEF GBD 住宅のコロニー pcr のオリゴヌクレオチドを使用してによって識別できます: 5'-CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3' と 5'-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3' 5' 挿入と 5'-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3 の ' と5'-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3' 3' 挿入。これらのオリゴヌクレオチドは挿入のシーケンスのためのプライマーとしても使えます。
- 準備計画 > 各 pTEF GBD 誘導体シーケンスと酵母の変換のための材料を提供するために単独で pTEF GBD の 10 μ g。
- 次の PCR 条件を使用: 98 ° C で 3 分は続く 30 の 25 サイクル 98 ° c、30 秒 55 ° c、s 72 ° C で 2 分続いて 2.5 mM MgCl2を格納するバッファーを使用して 72 ° C で 5 分、0.5 U/100 μ L の DNA ポリメラーゼおよび独自のバッファー。
3. Gal4 DNA 結合ドメイン融合タンパク質の発現
- 有能な酵母を作る。
- -80 ° C の 1 mm3を削り、滅菌木製アプリケータを生かして YPD プレート PJ69 4 a 酵母を連勝冷凍ストックと YPD プレート間こすり。各パスは、メディア表面の手つかずの部分を渡って行くようにプレートを木製のアプリケータを移動します。2 日間、または 1 つの植民地が表示されるまでは、30 ° C で YPD プレートを孵化させなさい。水や成長のメディアで酵母を中断、7 %dmso を補い、-80 ° C で保存する PJ69 4 a 酵母の冷凍ストックを作る
- 5 ml の滅菌木製アプリケータを使用して 20 × 150 mm 文化管内 YPD の文化の単一コロニーを接種して 200 rpm で揺れのインキュベーターで 30 ° C で一晩成長します。
- YPD PJ69 4 a 酵母の一晩の文化の 4 ml 滅菌エルレンマイヤー フラスコ 250 mL の 50 mL を接種します。吸光度標準の 1 cm 軽い経路で、約 1.2 30 ° C、光学濃度 (OD600) に 200 rpm で揺れのインキュベーターで成長します。成長は通常 5-7 h をかかります。
- ベンチトップ遠心分離機の部屋の温度で 5 分間 4,696 x g で円錐形の管の 50 mL の沈降によって酵母を分離します。液体廃棄物を投棄して上澄みを廃棄します。ピペットを使用して、変換バッファーと転送 15 mL の円錐管に 5 mL にペレットを再懸濁します。Resediment、上澄みを廃棄し、1000 μ L ピペットと変換バッファーの最終巻の 1 mL で酵母を再懸濁します。
- 200 rpm で揺れながら 30 ° C で 60 分酵母をインキュベートし、30-90 分間氷の上。
- 酵母プラスミド変換。
- 滅菌遠心チューブ 1.5 ml、pTEF ベース GBD プラスミド 1 μ g と 10 mg/mL キャリア サケ精子 DNA の解決の 5 μ L を追加します。負トランスフォーメーション コントロールとしてのみサケの精子のキャリアの DNA を含んでいる管があります。各管にピペットで冷たい酵母細胞懸濁液を 100 μ l 添加を追加します。70% の 100 μ L を追加 1000 μ L ピペットと静かフリック チューブ 5 - 10 倍 (ボルテックスにかけないでください) でミックスの止め釘の解決。
- 30 ° c、200 rpm で 45 分間の揺れインキュベーターで孵化させなさい。
- 15 分の 42 ° C で熱ショック。
- 室温で 3 分間 845 × g で遠心機で沈殿物をピペットし上澄みを廃棄、150 μ L の滅菌水で上下、ピペッティングでペレットを再懸濁します、CSM Trp プレートの表面に 。
- 上 30 ° C の定温器でプレートの右側に置き、植民地が表示されるまで 2 〜 3 日間インキュベートします。プレートは、6-12 h 30 ° C で培養後プレート表面の結露を避けるために逆さまになって可能性があります。
- 生殖不能のつまようじを使用して CSM Trp プレート上にパッチとして変換と連勝あたり 2-3 人のコロニーを取る。30 ° C で 24 時間成長できるように
- 蛋白質の表現の lysates を作る。
- パッチから酵母のマッチの頭サイズと CSM Trp 液体媒体の 3 mL を接種して、一晩で 20 × 150 mm 培養管 30 ° C 200 rpm で揺れながら成長します。餌と空 pTEF GBD ベクトルごと一晩二つの文化を作る。
- CSM Trp 一晩文化の各 3 mL に YPD の 1 mL を追加します。30 ° C で 1 h 200 rpm で揺れながら成長します。分光光度計による細胞の外径を確認してください。
- OD によると正規化のセル数が相当堆積物。室温で遠心機 2,348 x g で 5 分スピンと滅菌 1.5 mL 遠心管を使用します。ピペットを使用して、上澄みを廃棄します。最終的な在庫は、2.1 OD の最小値に対応します。
注: セルの相当数を計算するときそれは、最小限の 2.1 OD を達成するためにそれぞれの一晩の文化から別のボリュームが必要を発生できます。 - 上下にピペッティングで 0.2 M NaOH の 450 μ L でペレットを再懸濁します。室温で 5 分間インキュベートします。常温で 2,348 x g で 2 分間細胞を recentrifuge、ピペットで上澄みを廃棄します。
- 泡をしないように慎重にピペッティングを上下で回転バッファーの 50 μ L でペレットを再懸濁します。70 ° C で 5 分間熱サンプル
- SDS-PAGE によるタンパク質発現を確認します。
- 分子量の大きい範囲を確保するため 4-20% 勾配ゲルを解決ことができますを使用します。負荷相当額 (同じ OD) SDS ページにサンプルのゲルおよび未変更 pTEF GBD ベクトル13,14,15を含んでいる少なくとも 1 つのサンプルを含めるようにしてください。
- 電気泳動の分離後、ニトロセルロースとイムノブロット反 myc モノクローナル抗体やポリクローナル抗体と ECL 検出ソリューション (図 3) を使用するゲルを転送します。
4. 自己活性化テスト
- 滅菌木製アプリケータを取り、バイアルから少量の酵母をスクレーピング YPD プレート間ストリー キング住宅 YPD プレート上に関心の獲物ライブラリひずみに対応する-80 ° C の在庫から MATalpha 酵母を連勝。2 日間、または 1 つの植民地が表示されるまでは、30 ° C で YPD プレートを孵化させなさい。YPD プレート上にいくつかのシングル コロニーをパッチし、30 ° C で一晩インキュベート
注: Y2H いくつか互換性のある市販のライブラリに Y187 であるに対し、獲物図書館をここに開発される新しい株は PLY5725 です。 - 3.3.1 - の手順に従って 3.3.4 LEU2と PLY5725 を変換する-目的の獲物ライブラリの家に使用するプラスミドをベースします。対応するプラスミドは、ここで開発ライブラリ、pGal4AD (pPL6343)。酵母形質転換体、CSM ルー会ったプレートの上にプレートを取り戻そう。植民地後、CSM ルー会ったプレート パッチとして力を発生し、30 ° C で 24 時間インキュベート
- 3.4 pPL6343 空のベクターを使用して抗の式を確認するためのプロトコルに従う-HA モノクローナル抗体やポリクローナル抗体と ECL 検出ソリューション。
- プロトコル セクション 3.4 と 4.3 の蛋白質を表現し、30 ° C で一晩インキュベートを確認した YPD プレートに各 PLY5725 のクロス パターンに変換された PJ69 4 a 酵母を構築連勝。CSM ルー会った、別の 2 つの系統が一緒に成長しているパッチの上に細胞を 1 mm3 、CSM Trp と CSM Trp ルー プレートと 24 h の成長します。
注: 目的の切片は、CSM Trp ルー プレートに成長します。CSM ルー会った上の成長および CSM Trp プレート酵母の成長の肯定的な制御として役立ちます。 - 1 ml 30 ° C で一晩 CSM Trp ルー メディアの切片を成長します。2,348 × g、室温で遠心機 3 分チューブ 1.5 ml 遠心沈殿物 500 μ L 細胞。ピペットで上澄みを廃棄します。1 mL の滅菌水に細胞を再懸濁します、沈降と再移動を繰り返します。セルの OD600をチェックします。
- 1:10 のシリーズのほとんどが開始されたと滅菌水を使用して各細胞懸濁液のシリアル希薄を作る濃縮液各 0.5 の OD で。CSM ルー Trp プレート、CSM ルー Trp 彼のプレートと、CSM に各希釈の 5 μ L をスポット-ルー-Trp-彼 + 3AT プレート。30 ° C で孵化、成長の検査毎日 3 日間以上 (図 4)。
注: 1:10 のシリアル希薄を管内水の 90 μ L に外径 φ 0.5 の 10 μ L をピペットし、上下にピペッティングで混ぜます。場所に六つの異なる濃度の合計があるまで 1:10 のシリアル希薄を作り続けます。
5. 餌と獲物ライブラリ酵母集団を作成します。
注: 住宅商業獲物ライブラリ プラスミド Y187 ひずみはよく、相手をしません。したがって、次の最適化条件はライブラリの複雑さを維持するために必要です。PLY5725 ひずみ含む Y2H 獲物ライブラリ仲間良いとこの株 (図 5) で交尾と同じ手順を使用できます。
- 様々 なTRP1を運ぶ PJ69 4A transformants のそれぞれの文化の 3 mL を接種する-CSM Trp メディア文化チューブ pTEF GBD 餌プラスミッドを含んでいます。手続き型のコントロールとして機能するだけで pTEF GBD ベクトル プラスミッドを含んでいる 2 つの独立した文化があります。30 ° C、6 h の 200 rpm で文化をインキュベートし、一晩成長のため滅菌三角フラスコで文化の 25 mL に希釈しています。
- LEU2を含む MATalpha 細胞の凍結 (-80 ° C) バイアルを解凍-常温ライブラリ「獲物」を運ぶします。全く解凍バイアルと滅菌エルレンマイヤー フラスコで CSM ルー会ったメディアの 125 mL を接種します。200 rpm で振とうしながら一晩 30 ° C ですべての文化を育てます。
注: 一晩文化の外径600は、次の手順に進む前に 1.0 から 1.5 の間の範囲をする必要があります。 - 室温で 4,696 x g で 5 分のスピン PJ69 4A 形質文化のそれぞれの 21 の OD 同等を遠心します。交配反応ごとに 10 希望、別の 50 mL の円錐管の搬入ライブラリ プラスミド MATalpha ひずみのペレット 39 外径600同等物。
- ベンチトップ遠心分離機に室温で 10 mL の滅菌水に細胞と再円錐管 4,696 x g 5 分の新しい 50 mL にペレットを再懸濁します。小球形にされた細胞を中断させることがなく上澄みを除去ピペットを使用して、優しく。
- BYPDA (pH 3.7) 10 mL に PLY5725 セルと 4 mL PJ69 4 a 細胞のペレットを再懸濁します。
- セットアップ交配反応 PJ69 4 a の 1 mL 変形 bYPDA pH 3.7 円錐管の新しい 50 mL に 1 mL、1 mL MATalpha ライブラリを含むセルのセルを追加します。90 分の穏やかな軌道動揺 (100-130 rpm) 30 ° C で孵化させなさい。
- ベンチトップ遠心分離機に室温で、4,696 x g で 5 分間細胞を遠心します。ピペットで上澄みを削除し、1:1 bYPDA:YPD 2 mL にペレットを再懸濁します。100 mm YPD プレート上にすべて 2 mL をピペットでプレートし、30 ° C、約 20 時間で孵化させなさい。
- CSM ルー Trp メディアの 2-3 mL にセルを除去する細胞スクレーパーを使用して YPD プレートから細胞を採取します。50 mL の円錐管にピペットが外れているセルです。最大 1000 μ L を使用してメディアのピペットをピペッティングして優しく YPD プレート表面を横切って、メディアの取り出し CSM ルー Trp メディアの 2-3 mL で 4-5 回プレートをすすいでください。
- ベンチトップ遠心分離機に室温で 4,696 x g で 5 分間細胞を遠心します。ピペットで上澄みを廃棄し、(do いない渦) 上下ピペッティングによる CSM ルー Trp メディアの 40 mL の細胞を再懸濁します。
- 二倍体細胞の形成数を見積もるには、200 μ L、2000 μ L CSM Trp ルー メディアに二倍体の混合物の 4 μ L を希釈します。CSM ルー Trp プレート上に各希釈 200 μ L をプレートします。
注記: 2 つのプレートは、切片収穫し、ステップ 5.7 後チェック プレート 36 40 h. の 30 ° C で培養後 1: 10,000 希釈プレートに期待 〜 9,000 27,000 コロニーを降伏の在庫の 1: 10,000、1: 100,000 倍希釈を表します。5.8 の手順に続行する 1: 10,000 希釈プレートの 200 コロニーの最小数が必要 - すぐに再懸濁細胞の各 40 mL の残りの部分を取るし、CSM ルー Trp メディアの 500 mL を含む三角フラスコの 1,000 mL を接種します。初期の OD600を取る。30 ° C で飽和 (~2.0 OD/mL) に到達するまで 180 rpm で振とうしながらこれらのフラスコを孵化させなさい。通常かかります約 36-40, 24 h モニター成長再度 36 h で OD600。
- 各文化や接種エルレンマイヤー フラスコ、1 つ含む 750 mL CSM ルー Trp メディア、3AT の最下位レベルで CSM ルー Trp 彼の含む 2 番目の 750 mL 2,000 mL の飽和 500 mL から 20 mL の因数を削除、ピペットを使用しています。背景 (4.5 節で先に決定) を排除します。旋回によってよく新しい文化 (770 mL) を混合し、初期の OD600を取る。
- 通常未選択の CSM ルー Trp 文化 24 h 内で発生し、Y2H の相互作用のための選択の下で文化の 70 h 以上を取ることができる彩度に達するまで 180 rpm で揺れながら 30 ° C で文化を孵化させなさい。
- 文化が飽和 (OD 〜 2.0) に達したら、室温で 4,696 x g で 5 分スピンのセル ピペット、堆積物によって 11 mL を削除、ピペットで上澄みを廃棄、-20 ° C で凍結または DNA の抽出に続行します。ディープ シーケンスの選択と選択されていないサンプルを両方使用されます。
6. deepn 深さが深いシーケンス処理の前処理
- DNA の抽出。
- ピペットを使用して、ステレオ バッファーと転送のプロトコル セクション 5.7 で 500 μ L から 1.5 mL 遠心チューブに細胞ペレットを再懸濁します。Betamercaptoethanol の 3 μ L と Zymolase 株式の 10 μ L を追加します。よく混ぜ、24-36 時間 37 ° C のインキュベーターで孵化させなさい。
- ヒューム フード16を使用している間 2 回 500 μ L フェノール/クロロホルム/イソアミル アルコールでサンプルを抽出します。
- 4 M の NaCl の 7 μ L、氷冷 100% エタノール (エタノール)、インバージョンによるミックスといずれかの凍結-20 ° C の 900 μ L を追加または 21,130 x g 10 分間遠心機で室温で回転して堆積物 DNA に進みます。
- ピペットで上澄みを廃棄します。ペレットを 70% の 900 μ L で 3 回江藤。
- 堆積物は、2 分間 21,130 x g のペレットし、ピペットによって残留エタノール洗浄を削除します。42 ° C で 7 分乾燥ペレット
- 90 分の 37 ° C の水浴中 0.1 x ステ 120 μ L でペレットを再懸濁します、30 分毎をミックスするチューブをフリックします。
- 滅菌 1.5 mL の遠心管にピペットの 60 μ L の DNA を抽出し。STE は、RNase A 株式をミックスし、37 ° C 1 時間インキュベート フリックの 3.5 μ L の 120 μ L を追加します。
- エタノール沈殿物セクション 6.1.3 - 6.1.5 で以前に行ったが 4 M NaCl ではなく 5 M 酢酸アンモニウムの 7 μ L を使用します。
- 90 分の 37 ° C の水浴中 0.1 x ステ 55 μ L で RNase A 処理した DNA を再懸濁します、260 で吸光度によって 30 分ごとに定量化するための DNA を混合するチューブをフリック nm の分光光度計です。
- PCR の cDNA を挿入します。
- 2 つの DNA のサンプルあたり 50 μ L の PCR の反作用を実行します。各反応を含むライブラリ獲物プラスミドに一致する各前方および逆のプライマーの 25 pmol (マテリアルを参照してください)。反応も忠実度の高い 2 x PCR マスター ミックス、DNA サンプルの 5 μ g の 25 μ L を含むし、72 ° c、アニール温度 55 ° C、30 分の延長時間と 25 サイクルの最大 50 μ L 増幅反応を水 s と 10 s. 先行 98 ° C で変性サイクリング。72 ° C で 5 分インキュベーションと 98 ° C およびフォローで 30 s 変性によって
- 分析 4 μ L の DNA の agarose が付いて 1% DNA agarose ゲル電気泳動法によって各 PCR の反作用はゲル含む 0.2 - 0.5 μ g/mL EtBr17。UV 光透視による DNA のサンプルを視覚化します。サンプルは、DNA、帯状の模様があるサンプルの Y2H 相互作用があった 1-3 kb 程度の汚れを選択 (図 6) が表示されます。
- 重複したサンプルを PCR を組み合わせると PCR 精製キットを使用して、製造元の指示に従って浄化し、260 で吸光度によって DNA の定量化 nm の分光光度計です。
7. ディープ シーケンス
注: サンプル調製とディープ シーケンス プラットフォームの配列は商業および学術の DNA シーケンスの中核施設で一般に利用です。
- 〜 300 の平均の長さの断片を与えるため、高性能超-超音波発生装置を使用して PCR の製品のせん断 600 ng bp。
- リンカー バーコードをエンコード、サイトをプライミングを追加ディープ シーケンスの準備キットを使用してインデックス付き配列ライブラリを生成し、DNA 断片の両端に非対称的シーケンスのキャプチャします。
- ライブラリの製造元の指示に従って準備を実行します。プールには、ライブラリとディープ シーケンス プラットフォーム (例えば2 x 150 bp PE ヒット) で長いペアエンド リードとしてシーケンス インデックス付き。各サンプルのターゲットの読み取りの必要な数は 10 と 4000 万、通常複雑な選択されていない集団に必要な読み取りの間です。選択されていない人口のため、少なくとも 2000 万以上の読み取りをお勧めします。
8. バイオ情報処理と検証
- プロセス DNA シーケンス (1) シーケンスにマップに構築されたプログラムを読む 2) 普遍的なサム形式(のファイルを定量化するスタンドアロンのソフトウェアのセットを持つ fastq 形式のデータ データセット(間遺伝子濃縮 3) におけるデータの統計解析を実行します。遺伝子どちらの候補者をランク付けする順序も陽性 Y2H 相互作用(4) 何地域と per 遺伝子獲物 cDNA のそれぞれで何の並進フレーム断片を相互作用が構成され、正の Y2H 収量については、(5) を提供を提供5' だけでなく伝統的な Y2H 形式で検証、再構築を許可する相互作用の断片の 3' 末端を再構築するためのツールです。これらのプログラムの操作は、付属の研究で詳細です。
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Representative Results
Y2H 試金は蛋白質: 蛋白質の相互作用を見つけるため広く使用されているし、いくつかの適応やシステムが開発されています。ほとんどの部分については、これらの従来のアプローチを成功させるに役立つ同じ考慮事項が deepn 深さが重要です。重要なベンチマークのいくつかが含まれます: DNA 結合ドメインの発現融合蛋白質、スプリアスの低バック グラウンド彼 + 空獲物プラスミド、餌の配偶効率と利子の餌を含む切片で成長性の確保を確保します。マタ ライブラリ含有酵母を含む MATalpha は酵母、そして最後に、多くの肯定的な Y2H 反応選択条件下で成長する人口を許可する低逼迫条件もものその農産物の低レベルの His3 活動と弱いY2H 転写応答。
Deepn 深さの重要な側面の一つは、再現性をもって Y2H ライブラリを別の餌のプラスミドを持つ系統に投入し、プラス Y2H の相互作用を作成するこれらのライブラリのプラスミッドのためのそれらの人口を確実に選択です。Y2H ライブラリの複雑さ増加するさまざまな初期集団全体のライブラリの適切な転送を確実に困難ですので、これはより困難になります。さらに、選択条件とシーケンスの深さの下で成長する分野の人口のサイズは、真正 Y2H 相互作用を確実に同定する Y2H プラスミド組成の再現性の変化を観察するのに十分な大きさでなければなりません。以前の研究では、市販 Y2H cDNA ライブラリを使用しました。運ぶ同じ餌プラスミッドの別々 の人口間の Y2H ライブラリ分布の変動は低くの選択の前に 2 つの初期個体過大分散 < 0.01 通常、および 0.35 - 個別 0.55選択4後集団。しかし、これら市販の Y2H ライブラリのいくつかの複雑さはかなり低い (図 7)。さらに、(~ 60%) の内でクローンの多くは、さらにその有用性を制限するコーディング領域の 3' cDNA 断片の完全作られています。上記の方法より複雑な Y2H ライブラリに対応できる、合理化された '捕食' プラスミッドのベクトルで新しい Y2H ライブラリを作成したことを示すためのした(ひずみからゲノム DNA の断片 (pGal4AD) を含むPLY5725)。ゲノム DNA は剪断サイズ SacCer_TAB Y2H ライブラリ (図 8) を作成するアダプターを変更し、pGal4AD に挿入、600-1500 bp の範囲の選択によって断片化されました。ライブラリは、PLY5725、pTEF GBD プラスミドだけを運ぶ PJ69 4A マタの試料分離に嵌された酵母人口を生産に変換されました。重複する 2 倍体集団は非選択的で選択的な条件下で栽培されました。Y2H プラスミド ライブラリの挿入は、ディープ シーケンスによって分析されました。100 を含むゲノム DNA にマップされるとき bp 上流と下流にそれぞれ蛋白質コード領域 (ゲノム全体の 84%)、我々 が見つかりました > 110 万の異なるプラスミド ~1.35 100万別の酵母でライブラリの推定合計サイズのライブラリにプラスミド。比較としてまた、上記酵母ゲノム Y2H ライブラリ11 (PJ_C1、C2、C3 Y2H ライブラリ) MATalpha 酵母を変換し、上記と同様の分析を受けます。分かったこと私たちのランダムなフラグメント酵母 Y2H ライブラリの複雑さは、はるかに高かったはるかプラスミドで以前に公開されたライブラリ (図 9) より各遺伝子のフレームの断片を持っていた。重要なは、2 倍体集団を含んでいる最初のライブラリの世代だったの過大分散で再現可能な < 0.01 (図 10)。さらに、2 つの独立した酵母集団の再現性は、正 Y2H 相互作用のための選択は非常に良かった、0.3 の過大分散を降伏後プラスミドのような再配布を作成します。したがって、メソッドは以前使用していたものよりもより高い複雑さの大きな Y2H 図書館を収容します。
Deepn 深さの容易さを増加の面では、興味の餌の蛋白質のためのコーディングをする遺伝子合成を使用して挿入を好みます。これは、タンパク質ドメイン、キメラ、Y2H 餌プラスミドに組み込まれる容易に突然変異体に地域のコーディングにより、そのコドン出芽酵母における発現の最適化することができます。2 つの異なる Gal4 DNA 結合ドメイン融合タンパク質の発現は、図 3に示されています。餌融合蛋白質の 2 つのいずれかを表現する 2 つの異なる酵母形質転換準備し、SDS-PAGE および反 myc 抗体と免疫ブロットを受けます。餌だけで空のベクターから Gal4 DNA 結合ドメインに関連タンパク質の発現レベルに注意してください。餌融合タンパク質の発現を確認するのみならず、表現を展開し、獲物のライブラリを含む酵母に交尾に使用する正確なマタ酵母の形質のコロニーを確認することが重要だとわかりました。な形質を特定したら、ダウンそれを凍結し、後で使用するため保存することが可能です。
図 4は、CSM ルー Trp (+ 彼) に二倍体細胞のシリアル希薄をメッキする、自己活性化のテストを示します CSM Trp ルー彼 (-彼) と CSM-Trp-ルー-彼 + 3AT (-彼 + 3AT) プレートし、3 日間の 30 ° C で育つことができます。目的の結果は成長を観察する存在がないかどうかに関係なくヒスチジンの 3AT があります。これは CSM-Trp-ルー-彼の肯定的な酵母 2 ハイブリッド相互作用を持つ酵母を選択するの使用が許可されます。CSM ルー Trp 彼プレート上の成長がある場合、Y2H 選択は入手可能成長を防止 3AT の最低濃度を用いるします。我々 は、CSM Trp ルー彼 ± 0.1 mM 3AT の成長を阻止でき、DEEPN アッセイできます進みます Y2H 相互作用を選択するこの条件を使用を見つけます。DEEPN 手順と異なる餌プラスミドのパフォーマンスが妥協されますただし、pGal4AD や他の空獲物プラスミドと pTEF GBD 餌融合プラスミドを含む切片の伸長の抑制は、3AT の高濃度を必要とする場合は、求めなければなりません。彼 + 成長が正の Y2H 相互作用の唯一の選択であることに注意してください。我々 は、これがバッチ Y2H 相互作用に対するを豊かにするための十分な発見しました。
Y2H 獲物ライブラリを運ぶ MATalpha 酵母の餌プラスミドを運ぶマタ酵母の交尾高効率を達成するために DEEPN ワークフローで最も重要な手順の 1 つです。我々 は、ことがわかったいくつかの系統 (例えばY187) の18、市販の cDNA ライブラリを住宅、繁殖効率が比較的悪い。そのため、我々 は緊張 Y2H ライブラリを遂行する設計。この歪みは、BY4742、S288c の派生物に基づいています。この歪みは、 HIS3 LEU2、 TRP1 GAL80 GAL4を欠いています。ハイブリッド Gal4 タンパク質も異なるハイブリッド (例えば、 LexA VP16) に敏感である記者は含まれていません。代わりに、特定の餌のプラスミドを運ぶだろうマタひずみ内 Y2H 誘起 His3 生産の源にあります。これは、システムを簡素化でき、あの柔軟性は LexA 餌融合タンパク質と LexA(UAS)-HIS3記者や、Gal4 Gal4 DBD 餌融合蛋白質を表現するひずみと交尾する同じライブラリを含む MATalpha セルを使用できます。(UAS)-HIS3記者。
餌プラスミドとライブラリの両方を運ぶ二倍体の個体が生成されると、彼らは希釈し、条件下で成長だけを選択 (例えば、 CSM Trp ルー) 両方のプラスミッドのためまたはプラスミッドの正 Y2H の相互作用を許可します。ドライブ His3 の生産 (例えば、 CSM ルー Trp 彼)。大量の進化 '' ことでボトルネックを避けるために開始人口が人口正 Y2H の相互作用のための選択後、その結果をスキューできますを始めることが重要です。したがって、我々 の手順は、二倍体の集団文化の 500 mL から 20 mL を使用してこの問題を回避する新鮮な CSM ルー Trp 彼メディアの 750 mL で栽培することを指定します。餌プラスミドとして pTEF GBD、希釈と成長の単一の円形は有益な人口を進化するための十分ながわかった。以前別の餌プラスミドを使用して、我々 は成長に 750 mL の初期 20 mL と希釈の 2 つのラウンドを使用し、それから 2 mL の飽和 75 mL で希釈した文化。図 6倍人口成長成長と希釈の最初と 2 番目の連続ラウンドと同様に、非選択性の条件の下で 2 つの選択条件で別のライブラリの挿入に PCR の拡大の結果を示していますプラスミドを餌します。選択していないことに注意してください、フラグメントの複雑で比較的正しく正規化された混合物の PCR の製品の一般的な汚れがあります。選択すると、個々 のバンドを識別できるように、豊かに大きくいくつかの種とそのパターンが変化します。ある程度のバンドがこれまでのところ、実験成功の典型的なまだ塗抹標本パターンに、または帯状の模様ではなく獲物挿入の複雑な混合物を示すが、候補者の数を最大化したい場合に望ましくその deepn 深さを検出します。PCR の製品のほとんどが 1-3 バンドである場所、非常に強力なのバンディング パターンは、ほとんどのシーケンス データを 1-3 獲物挿入だけによって支配されることを示します。1 つは部分的にこのサンプルからより多くの読み取りを捧げることによってこれを補償します。1 つは人口は希釈され、('選択した d2'図5 を参照) さらに成長して場合、帯状の模様がより顕著でその獲物を捕食する少数精鋭ながら減少されているプラスミドが本格的な弱い Y2H 相互作用を付与を示すことを見ることができます。プラスミドは、その豊富な増加しています。連続希釈、この過剰なレベルへの成長は、潜在的な候補者のそしてこうしてここのプロトコルの最大の数を引くの目的に逆効果と認められる、お勧め希釈と成長の 1 つのラウンドを使用します。
図 1: DEEPN ワークフローのスケマティック。実験室プロシージャの一般的なアウトラインは、対応するタスクを完了するために必要なおおよその時間と一緒に左に表示されます。右側は deepn 深さおよび Stat_Maker のソフトウェア パッケージを使用してバイオインフォマティクス ワークフローです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: pTEF GBD のスケマティック。TRP1-低コピー Gal4 DNA 結合ドメイン融合タンパク質発現プラスミドを含むが表示されます。構成のTEF1プロモーター、myc エピトープ タグを併設、Gal4 DNA 結合ドメインに続く T7 RNA ポリメラーゼ結合部位、polylinker、動原体 (CEN) 内 PRM9 ターミネーター-プラスミドを用いた。このプラスミドには、カナマイシン耐性とレプリケーションの ColE1 細菌起源また運ぶ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: Gal4 餌の融合蛋白質の表現。PTEF GBD で表される Gal4 DNA 結合ドメインに融合した別の餌の蛋白質を表現する酵母からの Lysates は SDS-PAGE および反 myc 抗体と免疫ブロットを受けた。pTEF GBD 表現だけ Gal4 DNA bindng ドメインだけで。pTEF GBD bait1 Gal4 DNA bindng ドメインの C 末端のプレニル化サイトに欠けていると GTP 結合構造; にそれをロックする突然変異を住宅 ρ に融合を表現します。pTEF GBD bait2 は、その C 末端プレニル化サイトに欠けている、GDP 結合構造にそれをロックする突然変異を住宅 ρ に融合 Gal4 DNA bindng ドメインを表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 自己活性化試験切片の示された餌プラスミドを運ぶ PJ69 4 a 細胞と示された獲物プラスミドを運ぶ PLY5725 細胞から作られていた連続希釈し、CSM CSM ルー Trp 彼のプレート、プレート CSM ルー Trp に斑点を付ける-ルー-Trp-彼 + 3AT プレートで 3 日間の成長と30 ° C交配用 PJ69 4A 形質転換体は図 3に示すように各ペアの最初の.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: Y187 対 PLY5725 の効率を交尾します。TRP1を含む PJ69 4 a 間交配反応-餌ベクトルと Y187 または PLY5725 の運ぶ獲物プラスミドを含む行った。1: 10,000 の希釈は、CSM-Trp-ルーの切片を選択するにメッキされました。PLY5725 ひずみは、〜 10 倍より多くの植民地の生産で Y187 菌株よりも高い嵌合効率を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 獲物ライブラリ挿入の PCR 。DNA から分離された非選択的条件 (CSM ルー Trp メディア) で栽培した獲物のライブラリを含む二倍体酵母または条件正 Y2H 相互作用 (CSM ルー Trp 彼メディア) を選択します。ライブラリ全体で PCR を選択挿入のレパートリーの中で明らかに違いを挿入します。選択成長の 2 つのラウンドに使用されました。非選択培地 CSM ルー Trp の 750 mL と 750 mL の CSM ルー Trp 彼のメディア選択成長 (d1) の最初のラウンドのために別の 20 mL に二倍体文化の 500 mL の 20 mL を希釈して作られた成長の最初のラウンド。これは d1 文化の 2 mL を取り、選択培地の 75 mL に希釈によって成長 (d2) の追加ラウンドが続いた CSM ルー Trp 彼。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: Y2H cDNA ライブラリの複雑さ。市販のマウス cDNA Y2H 獲物ライブラリのコンテンツの分析: マウスの脳および複数のマウス組織から 1 つの cDNA からライブラリ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: Y2H 酵母ゲノム フラグメント ライブラリの生成。A. pGal4AD 酵母ゲノム フラグメント ライブラリの概略記述するアセンブリ。ひずみ PLY5725 由来の DNA はランダムにせん断、示された Y アダプターで結紮、SfiI カット pGal4AD に。利回り 2.2 × 106独立した植民地を組み合わせ、そのプラスミド SacCer_TAB Y2H ライブラリを構成する DNA の分離の前に成長する細菌に変換された.B. LEU2-含むプラスミド (pGal4AD) 住宅 Gal4 転写活性化ドメインが表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 9: Y2H 酵母ゲノム ライブラリーの複雑さ。SacCer_TAB ゲノム ライブラリーは、PLY5725 MATalpha 歪み、PJ_C1、C2、C3 酵母ゲノム ライブラリーは Υ187 ΜΑΤalpha ひずみと化したに変身しました。これらの個体群の切片は、PJY69 4 a ひずみに交配によって作られました。10 代の人口が育ったし、獲物の断片の PCR 増幅が高スループット シーケンスと分析に服従しました。A.遺伝子は酵母のゲノムを配列することによって見つけたあたりの読み取り数で割った Y2H ライブラリで各遺伝子ごとの読み取り順位を示しています。各遺伝子の同等の豊かさを与え、各遺伝子は、1 の値があります。B.ヒストグラム蛋白質コード領域 (ORF) と適切な医療リーディング ・ フレームの両方は、フラグメントをエンコードする遺伝子あたりユニークなプラスミッドの数を示します。C.酵母の遺伝子をエンコード ライブラリごとに別のプラスミッドの数、および正しい並進リーディング ・ フレームではないまたは後方に挿入されるこれらの割合を比較します。+プロットの位置と各ライブラリでプラスミッドのため発見例遺伝子 (VPS8およびVPS16) にマップされる接合の豊かさを示します。正しい並進リーディング ・ フレームにある融合遺伝子をプラスミドには、青を指定されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 10: 複雑な Y2H 酵母ゲノム ライブラリーに deepn 深さの再現性。A. 4 つの異なる酵母の 2 倍体集団が PLY5725 内にあり、非選択性の条件の下で成長して、シーケンス SacCer_TAB Y2H ライブラリと交配によって作成されました。個別に各人口のための遺伝子あたりの読み取り数と、すべての人口にわたって平均順位値の関数としてプロットされます。B.正 Y2H 相互作用のための選択の後の 2 つのサンプル間の遺伝子あたりの読み取り数を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで最適化されたメソッドを使用してバッチで Y2H アッセイを実行する方法のためのガイドを提供します。開始ライブラリの代表を選択下に置かれると酵母の人口には変動を制限するための選択を受けること開始の酵母集団の十分なされているかを確認する手順をいくつかの重要なステップがあります。.重要なは、これらのベンチマークは、比較的適応方法やこのアプローチになり、ほとんどの実験室標準的な分子生物学のための装備にアクセスできる伝統的な Y2H アッセイの材料と一緒に実現しやすい。Deepn 深さが異なる餌プラスミドを使用しながら同じ獲物ライブラリ人口から選択が可能します。したがって、対別のもの 1 つの餌と Y2H の相互作用を生成する相互作用の候補の集合を直接比較できます。ディープ シーケンスを使用するため、各餌固有酵母集団の開始のライブラリ構成を確認してください、ライブラリにある各候補の獲物遺伝子の濃縮を個別に従ってくださいできます。バッチ処理では、統計的ランキング4を計算することができます、半定量的な方法で異なる餌に対して同じライブラリを照会することができます。
成功のために欠かせないこのプロトコルのいくつかのステップがあります。1 つは Y2H 獲物ライブラリの適切な表現は興味の各餌プラスミドと混合されるように多数の切片を得る必要があります。交配手順ここでは、いくつかのパラメーターを変化させることにより最適化されています。Y2H の適切かつ再現可能な転送を許可する、家商業 Y2H ライブラリ メイト一般的、しかし悪いいくつかの系統、ここで記載されている交配手順 2 x 106- 2 × 107切片に従えばを生成できることがわかった人口にライブラリ。プロシージャのもう一つの重要な側面は、関心の餌プラスミドは独自に正 Y2H の相互作用を作成または空の Gal4 活性化ドメインと獲物プラスミドできなくすることです。Y2H 相互作用を選択する方法は前記交流 Y2H HIS3ようにする細胞の転写を誘導するヒスチジンの不在の成長を要求して彼 +。伝統的な Y2H 法が背景の成長を減少させるまたは他の記者3 、最高の時に弱い Y2H 相互作用と細胞が成長することができますこの手順が機能および成長のため逼迫が増えて使用に競合阻害 3AT を追加が、日常的に識別できる獲物プラスミドのレパートリーを制限 Y2H の強い相互作用を持つセルだけを選択します。もう一つの重要な側面は、開始の二倍体の人口の大量使用してサンプリング エラー4から進化のボトルネックを避けるための選択と非選択性の条件下で成長することを確認することです。文化ボリュームと細胞、ここで指定した番号は再現性を確保し、騒音を減少させるに役立ちます。
DEEPN アプローチは強力な理由の 1 つは、それは包括的に関心の餌と対話する能力を与えられた獲物ライブラリ内のすべてのプラスミドを従うことができますです。したがって、deepn 深さの制限の 1 つは使用されるライブラリの複雑さです。我々 はここで使用される物のような市販のライブラリのいくつかは、我々 は発見した cDNA Gal4 活性化ドメインの同じ読み枠は、ORF は 3-6 x 10 間の善意の断片をエンコードのプラスミッドの数4 〜 6,000 - の表現 8,000 の異なる遺伝子。ほぼ 75% これらのライブラリの含まれていること (CD/ORF) コーディング dna の 3 ' cDNA 領域にのみ対応するフラグメントがわかった。さらに、ライブラリの断片を持っていた遺伝子のほぼ 3 分の 1 は、ORF または ORF の上流の地域に相当するどれもなかった。
DEEPN メソッドに他の 3 つの変更を加えました。1 つは、'捕食' TRP1プラスミドと合致する Y187 など、ライブラリを含む市販菌株よりもはるかの内で収容される図書館を運ぶことができる新しい MATalpha 株です。関心の各餌用ライブラリの人口の完全な転送に役立ちます。また、新しい '餌'10変数のコピー 2 μ ベースのバックボーンを使用して、前述のプラスミドから異なる発現プラスミド。ここで述べる低コピー CEN プラスミド (pTEF GBD)、選択成長の単一のラウンドを見つけるは相互作用する獲物プラスミドを豊かにするための十分です。最後に、私たちは合理化された '餌' ライブラリ ベクトルを構築し、発見と amonst でも相互作用を特徴付けるのための将来に役立つ必要がありますSaccharomces 酵母の高密度ランダム フラグメント ゲノム Y2H ライブラリを作成するために使用イースト蛋白質。全体的にみて、材料と (それに伴う作業で説明) のバイオインフォマティクス ツールの改善は、deepn 深さが包括的な比較の Y2H 画面を実行するアクセス可能な現実的で、効率的な方法のアプローチを作る。
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Disclosures
著者がある何も開示するには
Acknowledgments
NGS ライブラリの準備およびシーケンスのための人間遺伝学研究所内スタッフに感謝いたします。ここで作られた Y2H プラスミド ライブラリのゲノム ライブラリー フラグメントの準備で彼女の専門知識を Einat snir/を感謝いたします。この仕事は健康の国民の協会によって支えられた: NIH R21 EB021870 01A1、NSF 研究プロジェクト助成: 1517110。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Illumina HiSeq 4000 | Illumina | deep sequencing platform | |
| Monoclonal anti-HA antibodies | Biolegend | 901514 | Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs |
| Polyclonal anti-myc antibodies | QED Biosciences Inc | 18826 | Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs |
| NarI | New England BioLabs | R0191S | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3236S | |
| XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
| Polyethylene Glycol 3350, powder | J.T. Baker | U2211-08 | |
| Salmon Sperm DNA | Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific | 50-948-286 | carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1. |
| Kanamycin Monosulfate | Research Products International | K22000 | |
| LE Agarose | GeneMate | E-3120-500 | used for making DNA agarose gels |
| Sodium Chloride | Research Products International | S23025 | |
| Tryptone | Research Products International | T60060 | |
| D-Sorbitol | Research Products International | S23080 | |
| Lithium Acetate Dihydrate | MP Biomedicals | 155256 | |
| Calcium Chloride | ThermoFisher | C79 | |
| EDTA Sodium Salt | Research Products International | E57020 | |
| Yeast Extract Powder | Research Products International | Y20020 | |
| Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids | Research Products International | Y20040 | |
| CSM-Trp-Leu+40ADE | Formedium | DCS0789 | |
| CSM-Trp-Leu-His+40ADE | Formedium | DCS1169 | |
| CSM-Leu-Met | Formedium | DCS0549 | |
| CSM-Trp-Met | Bio 101, Inc | 4520-922 | |
| L-Methionine | Formedium | DOC0168 | |
| Adenine | Research Products International | A11500 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International | G32045 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | used for making media plates in section 1 |
| Peptone | Research Products International | P20240 | |
| 3-amino-1,2,4 Triazole | Sigma | A8056 | |
| 2-Mercaptoehanol (BME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Zymolyase 100T | USBiological | Z1004 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P8281 | |
| Phenol:Chloroform:IAA | Ambion | AM9732 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 238074 | |
| Ethanol | Decon Laboratories, INC | 2716 | |
| RNAse A | ThermoFisher | EN0531 | |
| Urea | Research Products International | U20200 | |
| SDS | Research Products International | L22010 | |
| glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Tris-HCl | Gibco | 15506-017 | |
| bromophenol blue | Amresco | 449 | |
| Gibson Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5510S | Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2 |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541S | Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1 |
| Ethidium Bromide | Amresco | 0492-5G | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Used for purification of pcr products in section 6.2.3 |
| Qiaquick DNA Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1 |
| KAPA Hyper Prep kit | KAPA Biosystems | KK8500 | preparation kit for deep sequencing |
| Codon optimization | http://www.jcat.de | ||
| Codon optimization | https://www.idtdna.com/CodonOpt | ||
| gBlocks | Integrated DNA Technologies | DNA fragments used for cloning in Section 2.2 | |
| Strings | Thermofisher | DNA fragments used for cloning in Section 2.2 | |
| GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit | EPOCH Life Sciences | Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3 | |
| Covaris E220 | Covaris | high performance ultra-sonicator in section 7 | |
| oligo nucelotide 5’- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction | |
| oligo nucelotide 5’-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction | |
| oligo nucelotide 5’-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction | |
| oligo nucelotide 5’-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction | |
| oligonucleotide 5’-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | 5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD | |
| oligonucelotide 5’-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | 3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD | |
| oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | 5' Pimer used for insert amplification of pGADT7 | |
| oligonucelotide 5’- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | 3' Pimer used for insert amplification of pGADT7 | |
| PJ69-4A MatA yeast strain | http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436 | MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7 | |
| pTEF-GBD | Dr. Robert Piper Lab | Gal4-DNA binding doimain expression plasmid | |
| pGal4AD (pPL6343) | Dr. Robert Piper Lab | Gal4-activation domain expression plasmid | |
| 100 mm petri dishes | Kord-Vallmark sold by VWR | 2900 | |
| 125 mL PYREX Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63270 | |
| 250 mL PYREX Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63271 | |
| 1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63274 | |
| 2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63275 | |
| 20 X 150 mm Disposable Culture Tube | Thermofisher | 14-961-33 | |
| pipet-aid | Drummond | 4-000-100 | |
| 5 mL Serological Pipette | Denville | P7127 | |
| 10 mL Serological Pipette | Denville | P7128 | |
| 25 mL Serological Pipette | Denville | P7129 | |
| 1,000 mL PYREX Griffin Beaker | Fisher Scientific | 02-540P | |
| 1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | |
| 1,000 mL graduated cylinder | Fisher Scientific | 08-572-6G | |
| SpectraMax 190 | Molecular Devices | used to measure the Optical Density of cells | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | Spectrophotometer used to quantify amount of DNA |
| Electronic UV transilluminator | Ultra Lum | MEB 20 | used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel |
| P1000 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F123602G | |
| P200 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F123601G | |
| P20 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F123600G | |
| P10 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F144802G | |
| 1250 µL Low Retention Pipette Tips | GeneMate | P-1236-1250 | |
| 200 µLLow Retention Pipette Tips | VWR | 10017-044 | |
| 10 µL XL Low Retention Pipette Tips | VWR | 10017-042 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 490001-627 | |
| 15 mL conical tube | VWR | 490001-621 | |
| cell scraper | Denville Scientific | TC9310 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| HCl | Fluka Analytical | 318949-1L | |
| NaOH | J.T. Baker | 5674-02 | |
| Wooden applicators | Solon Care | 55900 | |
| Eppendorf microcentrifuge 5424 | Fisher Scientific | 05-400-005 | microcentrifuge |
| Sorvall ST16R | Thermo Fisher Scientific | 75004381 | benchtop centrifuge |
| Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE Healthcare | NA934-1ML | Secondary Antibody |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE Healthcare | NA931-1ML | Secondary Antibody |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34080 | ECL detection solution |
| Isotemp Incubator | Thermo Fisher Scientific | Incubator | |
| Mutitron 2 | INFORS HT | Shaking incubator | |
| Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205 | Fisher Scientific | water bath | |
| Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue) | Clontech | 630482 | commercially available cDNA Library |
| Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain) | Clontech | 630488 | commercially available cDNA Library |
| pGADT7 AD Vector | Clontech | 630442 | commercially available AD Vector housing many cDNA libraries |
| pGBKT7 DNA-BD Vector | Clontech | 630443 | commercially available DNA-BD Vector |
| Biolase DNA Polymerase | Bioline | BIO-21042 | DNA polymerase used for section 2.4 |
| GeneMate GCL-60 Thermal Cycler | BioExpress | P-6050-60 | pcr machine |
| TempAssure 0.5 mL PCR tubes | USA Scientific | 1405-8100 |
References
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