Summary
טכניקה חדשה של rheometry כוח-קלאמפ משמש כדי לחקור את התכונות המכאניות של דגימות בנפח נמוך חלבון מבוססת הידרוג קשורה בין מנוע סליל קול חיישן כוח. מערכת אנלוגית (PID) פרופורציונלי-אינטגרל-נגזרת מאפשר לבצע את 'חסימת העורקים' של הכוח מנוסים בפרוטוקול הרצוי.
Abstract
כאן, אנו מתארים שיטה rheometry כוח-קלאמפ לאפיין את המאפיינים ביו-מכני של חלבון מבוססת hydrogels. שיטה זו משתמשת מערכת אנלוגית (PID) פרופורציונלי-אינטגרל-נגזרת להחלת פרוטוקולים כוח מבוקר על דגימות הידרוג חלבון מבוססת גלילי, אשר הם קשורה בין מנוע ליניארי קול סליל מתמר כוח. במהלך המבצע, מערכת PID מתאימה ההרחבה של המדגם הידרוג לעקוב פרוטוקול כוח שהוגדרו מראש על-ידי הקטנת ההבדל בין הכוחות נמדד קבע-נקודה. גישה ייחודית זו כדי hydrogels חלבון מבוססת מאפשר קשירה של דגימות הידרוג מאוד מצומצמות (< 5 µL) עם חלבונים שונים ריכוזים. תחת פרוטוקולים כוח-כבש, שבו הלחץ יישומית עליות וירידות באופן ליניארי עם הזמן, המערכת מאפשרת המחקר של ההתנהגויות גמישות ורכות היסטרזיס הקשורים עם קיפול (האו ם) של חלבונים והמידה של אלסטי סטנדרטי, viscoelastic פרמטרים. תחת קבוע-כוח, שם דופק כוח יש צורה כמו שלב, התגובה אלסטי, בשל לשינוי בכוח, הוא decoupled של התגובה viscoelastic, אשר מגיע מהתחום חלבון התגלגלות, refolding. בשל בנפח נמוך מדגם שלה צדדיות בהחלת לפליטת מכניים שונים, rheometry כוח-קלאמפ ממוטבת כדי לחקור את התגובה מכני של חלבונים תחת כוח תוך שימוש בגישה גורפת.
Introduction
פרט מאפיינים הפיזיים ייחודיים, חלבון מבוססת hydrogels להחזיק את ההבטחה של לעשות מהפכה ספקטרוסקופיה בכוח על-ידי הפיכת המדידה של מספר מולקולות מיליארד ב אחד 'למשוך', ובכך מאפשר חקר חלבונים בסביבות צפופות, דומה אלה המצויים העור ורקמות אחרות. חלבון תחומים נשארים מקופל בתוך hydrogels, המאפשר חקר את תגובתם biomechanical לכפות, איגוד שותפים והתנאים כימי. בנוסף, התגובה ביו-מכני של חלבון תחומים בתוך hydrogels דומה את התגובה עם טכניקות ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת. לדוגמה, denaturants כימי וסוכנים חמצון להקטין את יציבות המדינה מקופל,2,3 ברמה1,תחום חלבון יחיד והן מאקרוסקופית ברמה4,5 , 6 , 7. באופן דומה, osmolytes להגדיל את היציבות של חלבונים יחידה8,9, המוביל לירידה התגובה viscoelastic של hydrogels, עבור אותו לכפות תנאים7,10.
מספר גישות יושמו לסנתז חלבון מבוססת hydrogels, על ידי או באמצעות אינטראקציות גופניות11,12 או קוולנטיות cross-linking4,13. תגובות קוולנטיות לאפשר מיקומים קבועים cross-linking, hydrogels אלה ניתן לשחזר את המצב ההתחלתי על הסרה של לפליטת כימי או מכני. בגישה מוצלח עבור cross-linking קוולנטיות מסתמך על יצירת קישור קוולנטי, קשרי פחמן-פחמן הקשרים בין חומצות האמינו טירוזין חשוף באמצעות קירור (APS) כמו של חמצון ומלח רותניום (II) יוזם (איור 1)14. עם חשיפה לאור לבן, פתרון של חלבונים מרוכזים יכולים להיהפך של הידרוג. על ידי שליטה כאשר הוא מתחיל התגובה, לערבב חלבונים-APS יכול להיות מוזרק בכל צורה הליהוק, כגון טפלון (PFTE) צינורות (איור 1B ו- 1 C), המאפשר שימוש אמצעי אחסון קטן מאוד פתרון15. יתר על כן, השימוש של אור לבן כדי לעורר את התגובה cross-linking תוצאות הלבנת מוגבלת של חלבונים פלורסנט ומאפשר ניסוח של hydrogels ללא הפרדות צבע עם סמנים פלורסנט (איור 1). שיטות אחרות של היווצרות חלבון מבוססת הידרוג להשתמש cross-linking המבוססת על אינטראקציה קוולנטיות SpyTag-SpyCatcher16, אמין cross-linking ויה גלוטראלדהיד13, או אינטראקציות ביוטין-streptavidin17.
ניתוח מכני דינמי (DMA) היא טכניקה המשמשת בהרחבה ללמוד מבוסס פולימר hydrogels13,18. בעוד DMA באפשרותך להחיל כוח קבוע פרוטוקולים biomaterials, זה דורש מודולים של יאנג מעל 10 kPa ואמצעי אחסון מדגם גדולים של יותר מ-200 µL19. בשל מגבלות אלו, חלבון hydrogels הם בדרך כלל יותר מדי רכים להיחקר על ידי שיטה זו. Polyproteins הנדסה קשים יותר לסנתז מאשר פולימרים, מכיוון שהם דורשים מערכת חיה כדי לייצר, שאמצעי אחסון גבוהה אלה הם יעיל,4,הטוב ביותר15. יתר על כן, רוב רקמות ביולוגיות, רכים יותר 10 kPa. מספר גישות פותחו עבור דגימות ביולוגיות, במיוחד במחקר של שריר אלסטיות20,21. טכניקות אלה יכולים לפעול גם תחת משוב להפעיל כוח קבוע אבל הממוטבות דגימות עם צווארונים קטנים אטומים מפליז (בטווח מיקרון) חשופים לכפות לזמנים קצרים מאוד (בדרך כלל פחות מ- 1 s).
Hydrogels חלבון מבוססת נחקרו בהצלחה עם טכניקות rheometry שונה. לדוגמה, השלכת את הידרוג בצורת הטבעת מאפשרת את השימוש rheometry הארכת כדי למדוד את השינוי בחיל מנוסים כפונקציה של סיומת4,22. גישות אחרות ללמוד את מאפייני rheological מבוססי חלבונים hydrogels שימוש מבוקר מאמץ גזירה-rheometry. שיטות אלה ניתן גם להשיג נפח דגימה נמוכים, לסבול חומרים רכים. עם זאת, אלה שיטות חוסר היכולת לחקות את משיכת כוחות כי הסיבה חלבון התגלגלות ויוו, מודול האלסטיות הוא מחושב בהתבסס על תיאוריות מורכבות הדורשות הנחות והתיקונים השונים23.
לאחרונה דיווחנו גישה חדשה אשר מנצל נפח קטן של חלבונים, polymerized בתוך צינורות עם קטרים < 1 מ מ. היישום הראשון שלנו של טכניקה זו היה פועל במצב אורך-קלאמפ, שבו הג'ל הוארך בעקבות הרצוי פרוטוקול ה-15. בשיטה זו, החלבונים לחוות שינוי רציף סיומת והן כוח בזמן התחומים מתגלגלים, שהופך את פרשנות הנתונים מסורבלת. לאחרונה, אנו מדווחים על טכניקה rheometry כוח-קלאמפ חדשה, שבו לולאת משוב יכול לחשוף בנפח נמוך חלבון hydrogels על פרוטוקול כוח מראש7 (איור 2). מערכת PID אנלוגי משווה את כוח נמדד על ידי חיישן כוח עם הנקודה סט הנשלחים מהמחשב ומתאים את הסיומת ג'ל על-ידי הזזת את הגליל קול כדי למזער את ההבדל בין שתי כניסות. זה 'מחבר חובק למעקה' של הכוח מאפשר כעת סוגים חדשים של ניסויים כדי למדוד את ביומכניקה של חלבון hydrogels.
במצב כוח-כבש, חוויות הידרוג חלבון עגינה על עליה מתמדת וירידה בכוח עם הזמן. ה-PID מפצה על כל דפורמציה viscoelastic על ידי שינוי הסיומת באופן ליניארי, בהתאם לסוג של חלבון ו הידרוג ניסוח. היתרון העיקרי של כוח הרמפה הוא שהיא מאפשרת כימות של פרמטרים סטנדרטיים, כגון מודול האלסטיות, פיזור אנרגיה, בשל התגלגלות של refolding של חלבון תחומים.
במצב קבוע-כוח, הכוח שהוחל משתנה אופנה כמו שלב. במצב זה, הג'ל מרחיב חוזים elastically כאשר הכוח או ההגברה, בהתאמה, ואחריו עיוות תלויי-זמן. דפורמציה viscoelastic הזה, המתרחשים בזמן הג'ל חוויות כוח קבוע, קשור ישירות לתחום התגלגלות/refolding. בצורה פשוטה, הרחבה זו ניתן לראות המקבילה של מספר עקבות מולקולה בודדת מיליארד בממוצע יחד ומדדתי את הכל בבת אחת. פרוטוקולים קבוע-כוח ניתן ללמוד על השרץ ורגיעה של חלבון hydrogels כפונקציה של כוח וזמן. כפונקציה של כוח, למען hydrogels חלבון מבוסס-BSA, לאחרונה הראינו שיש תלות לינארית בין סיומת אלסטי, viscoelastic ובצינתם עם זן יישומית7.
כאן אנחנו פירוט המבצע של rheometer כוח-קלאמפ באמצעות ג'ל ללא הפרדות צבע עשוי תערובת של חלבון L (8 תחומים24, ו"כדור L8) וגם מבנה החלבון L-eGFP (L-eGFP), מה שהופך את הידרוג הכוללת פלורסנט וקל להפגין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. נוגדנים פתרון הכנה
- הכן פתרון חלבון המוצא על ידי המסת/דילול של החלבון עניין לריכוז הרצוי, שימוש ב בופר טריס [20 מ מ טריס (hydroxymethyl) aminomethane ו- 150 מ מ NaCl, pH 7.4].
הערה: ריכוז החלבון הקטן ביותר עבור כשבסופו cross-linking hydrogels תלוי החלבון משמש, בדרך כלל > 1 מ מ. - להכין מלאי של קירור (APS) (1 מ') tris(bipyridine)ruthenium(II) כלוריד ([Ru(bpy)3]2 +) (6.67 מ מ) פתרונות על ידי המסת APS ואבקות [Ru(bpy)3]2 + במאגר טריס.
2. חלבון מבוסס הידרוג סינתזה
- לתקן מחט 23 גרם על מזרק 1 מ"ל עם פומפה לחוץ.
- חותכים בעזרת סכין גילוח צינור טפלון (PTFE) 10 ס מ (עם הקוטר הפנימי של 0.022 ב ו של הקוטר החיצוני של 0.044 ב). לצרף קצה אחד של הצינור PTFE מחט של מזרק.
- להכניס את הקצה השני של הצינור פתרון silane ולמלא את הצינור על ידי מפסק הבוכנה מזרק. השאר את השפופרת ~ 30 דקות.
- הסר את הפתרון silane ויבש ברכבת התחתית עם אוויר דחוס.
הערה: ודא כי הפתרון silane הוא מיובש כי לא נמצאו שאריות שנשאר בצינור. - לערבב את הפתרון חלבון עם APS, [Ru (bpy) 3]2 + צינור 1.5 mL באמצעות יחס נפח קבוע [למשל, 15:1:1 או 15:0.5:0.5 (v: v: v)].
- מערבולת הפתרון photoactive עד שהוא מעורב לחלוטין.
- Centrifuge את המיקס במהירות המרבית (למשל, 14,000 x g) כדי להסיר את כל הבועות מהפתרון.
- להכניס את הקצה הפתוח של הצינור PTFE שטופלו לתערובת photoactive וצייר את הפתרון לתוך הצינור על ידי מפסק הבוכנה מזרק.
- מקם את הצינור טעון ~ 10 ס מ מן מנורת כספית 100 W כדי למנוע חימום זה ולשמור אותו שם למשך עד 30 דקות בטמפרטורת החדר (איור 1B).
הערה: על במקרים מסוימים, זמן החשיפה לאור יכול להיות נמוך כמו ס' 30 קצר יותר פעמים gelation משמשים כאן ג'ל פלורסנט, להגביל את photobleaching. - הסר את הצינורית של המחט, לחתוך את הקצוות של הצינור ליד הקצוות הידרוג עם סכין גילוח.
- השתמש מחט 24 G קהות כדי הבלטת את הידרוג בתוך תמיסת טריס (איור 1C).
הערה: מחטים קהות משמשים כדי למנוע כל החריצים או נזק המדגם הידרוג. - מבחינה ויזואלית לבדוק את ג'ל על כל פגמים שנגרמו אולי יוצרים במהלך ההבלטה או עקב בועות ולמחוק את ג'ל עם פגמים.
3. חלבון מבוסס הידרוג מצורף ולהגדרה Rheometer כוח-קלאמפ
- הפעלת התוכנית בקרת מכשיר. הפעל את קול-סליל המנוע. הגדר את מיקום סליל ערך לקראת סוף הטווח (למשל, 7.5 מ מ).
הערה: המיקום סליל קול מומלץ להיות לקראת הסוף של טווח התנועה המרבי, כדי למקסם את הארכת הידרוג אפשרי. - תחסיר הווים z-כיוון וליישר אותן על העיקול ה- x-כיוון (אשר הקואורדינטה מושך; ראה איור 2B). להקליט את הערכים של הברגים מיקרומטר עבור ה- x-כיוון.
- חותכים 2 תפרים סטרילי גדילים באורך שווה (2-3 ס"מ; ראה איור 3A ו- B).
- לקשור קשר בוהן כפול רופף את אחד הגדילים ולמקם את 2 לולאות על הקרס מחובר החיישן כוח (3C איור ותלת מימד).
- למלא את התא ניסיוני עם מאגר טריס ולהעביר את הדגימה הידרוג אל החדר מלא באמצעות מלקחיים רפואיים.
- למקם את הגליל קול, כוח חיישן ווים קרוב לפני השטח פתרון וליישר הווים לכל הכיוונים באמצעות ה- x/y/z-מיצוב סימולטורי.
- באמצעות פינצטה רפואי, לתלות בשני הצדדים של המדגם הידרוג חלבון על הווים מחובר הקול סליל ולאלץ חיישן (איור 3C).
- להדק 1 תפר לולאה סביב המדגם הידרוג על הקרס סליל קול על ידי מחזיק בשני קצוות הלולאה תפר עם מלקחיים רפואיים ומושך אותם בו זמנית (דמות תלת-ממד).
- חזור על צעד 3.8 הלולאה מחובר החיישן כוח (דמות תלת-ממד).
הערה: להימנע הידוק קיצוני של התפרים כדי למנוע כל נזק מבני, חיתוך חציה של המדגם הידרוג. - להדק את לולאות התפר על העיקולים של כל וו כדי למנוע כל גלישה; שימוש אלה כפיפות כהפניה נקודות כדי למצוא את ההפרדה אפס בין הווים בשלב 3.2. חותכים את אורך עודף של התפרים באמצעות מספריים רפואיים (דמות תלת-ממד).
- להזיז את הידרוג המחוברים באמצעות z-סימולטורי לאורך z-ציר לכיוון החדר ניסיוני לטבול את הידרוג בפתרון ניסיוני.
- יישר את הדגימה הידרוג ב- y-z באמצעות המניפולטורים כך הג'ל אינו נתון בלחץ.
- אפס את חיישן כוח ולהפריד בין שני ווים באמצעות ה- x-מיקרומטר שלבים עד הג'ל מתחיל לחוות כוח. ברגע שזה יקרה, מעט אחורה את הבורג מיקרומטר ב ה- x-כיוון.
- להקליט את המיקום של שני סימולטורי קול סליל המנוע ואת החיישן ולהשתמש ההבדל בין ערכים אלה לבין אלה נמדדו בשלב 3.2 כדי לחשב את המרחק המדויק בין ווים tethering בתחילת הניסוי.
- להגדיר את הטווח עבור העקומה מרווח ~1.5 - 2 מ מ ולמדוד את החסר ג'ל (איור 4A).
הערה: עבור כל אחת מהמידות מרווח, נסו לשמור את תחילת המשטר מרווח ליד העמדה סליל קול הראשונית, המאפשרות מספר אופטימלי של נקודות נתונים כדי להתאים המשטרים 2 (איור 4A). אורך ג'ל יכול להיקבע עם רזולוציה מיקרון מההפרדה בין הווים במפגש בין המשטרים 2 ב החסר באמצעות עקומת (ראה גם שלב 5.1). כמו החיישן בכוח עלול להיסחף עם הזמן בשל הבדלים בתנאי ניסיוני, החלק של העקומה מרווח שבו הג'ל אינו תחת כוח דוחות על הסחף הזה אפשרי. התוכנית שליטה הכלי מפצה באופן אוטומטי על הבדל זה בעת שליחת בפקודה קבע-נקודה הלולאה PID (איור 4A שיבוץ).
4. חלבון המבוסס על אפיון הידרוג שימוש מבוקר בכוח-שיפוע ומדידות קבוע-כוח
-
ניסויים כוח-כבש
- כדי לבצע מחזור כח-שיפוע על ידי הגדלת הכוח קצב הטעינה הרצוי (למשל, mN 0.01/s), קלט הכוחות התחלה הסופית וכן את משך הזמן של הפרוטוקול הפוכה בצורת v". לאחר מכן, החזק את הג'ל-0 mN (או נמוך כוח) עבור > 200 s לאפשר על התחומים חלבון כדי לקפל את הגמישות ג'ל להתאושש.
- שמור את האיתור.
-
כוח קבוע-ניסויים
- לבצע נוהל קבוע-כוח על-ידי החלת כוח נמוך (למשל, 0.1 mN) עבור 30 s ו ואז להגדיל הכוח כוח קבוע (למשל, 1 אם אן) עבור כמות מוגדרת של זמן (למשל, 120 s), ואחריו להרוות את הכוח בחזרה אל אותו נמוך ערך (למשל, 0.1 mN) עבור > 300 s לאפשר על התחומים חלבון כדי לקפל את הגמישות ג'ל כדי להתאושש.
- בעקבות שהפעימה הראשונה, התאם את הגדרות PID להגדיל את זמן התגובה של המשוב לולאה (ראה איור דו-ממדי).
הערה: ג'לים נוקשות ולקבלת שינויים קטנים בכוח, זמן התגובה של הלולאה מוגבל על ידי האלקטרוניקה של החיישן כוח, זמן התגובה של הסליל, והוא יכול להיות נמוך כמו 5 מילי-שניות7. ג'ל רך יותר, שינויים גדולים, כוח, זמן התגובה מוכתב על ידי האלסטיות של hydrogels (איור דו-ממדי). - שמור את האיתור.
5. ניתוח נתונים
- ניצול ההפרדה נמדד בין הווים את המיקום סליל מחושב, כאשר הג'ל מתחיל לחוות כוח (Δx ב תותב איור 4A ), לחשב את אורך ג'ל L באמצעות המשוואה:
L = L0 + ∆x
כאן, L0 הוא ההפרדה בין הווים, נמדד מתוך העמדה של הברגים מיקרומטר לפני הניסוי (שלב 3.14).
הערה: עבור ג'ל עם ריכוז חלבון נמוכה כי לא התוצאה שלמה cross-linking, האורך נמדד ישתנה ממעקב-כדי-מעקב. גם, על פני פרקי זמן ארוכים, חלבונים בתוך hydrogels עשוי לחוות תופעות הזדקנות25, והתוצאה הארכת הכוללת של הג'ל. - לנרמל את הסיומת נמדד לאורך ג'ל כדי להשיג את המתח.
- לנרמל את כוח נמדד פני השטח ואלכסוני באמצעות הקוטר הפנימי של הצינור משמש את הפילמור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1A מציג את ערכת התגובה photoactive בשימוש לסנתז את הידרוג8 L-EGP/L. איור 1B מציג את התערובת הידרוג בצינור PTFE לפני ואחרי photoactivation. איור 1C מציג את הידרוג-8 של L-eGFP-L מעוקם בתוך פתרון טריס. המדגם הידרוג יש מסויד כגון חריצים. צריך להיות מושלך Hydrogels עם נזק ברור לעין.
עיבוד של שהורכב על תצוגות מנופחות של rheometer כוח-קלאמפ מוצגים באיור 2A ו- 2B. איור 2C מציג את ערכת rheometer של כוח-קלאמפ, איפה הדגימה הידרוג קשורה בין ווים מחובר הקול-סליל ליניארי, החיישן כוח ואתה שקוע בתמיסת בופר. מערכת PID אנלוגי מתאים הסיומת הידרוג על ידי שליטה המיקום סליל ליניארי-קול לעקוב אחרי הנקודה ערכת כוח. איור דו-ממדי מציג את כוונון של ה-PID באמצעות במרווחים שונים לרווח נפרד.
איור 3 מראה תהליך קובץ מצורף טיפוסי של מדגם הידרוג. לאחר קשירה של הידרוג בין ווים מיושר, לולאות התפר הם התהדקו סביב הידרוג ליד עיקולים כדי למנוע החלקה הדגימה ולאפשר מצפני האורך הידרוג מדויק.
כוח-סרגל מדידה וניתוח של חלבון מבוססת Hydrogels:
מדידות נציג של פרוטוקול כוח-שיפוע מוצגים באיור 4A - 4 C. כל משיכה חדש מתחיל עם מידה מרווח, כפי שמוצג באיור 4A. לאחר מכן, עקומת כוח מתקבל על-ידי החלת פרוטוקול "V" הפוך כמו העומס עליות וירידות באופן ליניארי עם הזמן. לאחר מכן, הידרוג מתקיים כוח 0 mN עבור 200 s, כדי לאפשר את התחומים חלבון בתוך המדגם הידרוג כדי לקפל את (איור 4B). במהלך מתח, מערכת PID שינוי הסיומת הידרוג מיוצג על ידי המיקום סליל לעקוב אחרי הנקודה ערכת כוח מוגדרים מראש. עבור כל עקומה מרווח, אנחנו מתאימים 2 קווים (איור 4C). הקו הכחול משמש כדי להתאים את המשטר הראשון כאשר את recoils הידרוג ואת הקו הכתום משמש כדי להתאים את המשטר הידרוג הופך מרווח. הצומת בין שני הקווים משמש כדי לחשב את אורך ג'ל אמיתי עם רזולוציה מיקרומטר (איור 4A). לאחר מכן, ההרחבה של המדגם הידרוג מחושבת על-ידי חיסור העמדה הראשונית סליל מהעקבות עמדה סליל (איור 4D). איור 4F מציג עקומת מאמץ-זן. הלחץ הוא מחושב על ידי חלוקת הכוח שהוחלו על-ידי האזור חתך הרוחב של המדגם הידרוג ואת המתח הוא מחושב על ידי חלוקת הסיומת (איור 4E) לפי אורך ג'ל נכון שמחושבים העקומה מרווח כפי שהוצג ב- איור 4A .
קבוע-כוח מדידה וניתוח של חלבון מבוססת Hydrogels:
מדידות נציג של פרוטוקול קבוע-כוח מוצגות באיור 5A איור - 5 D. כוח קבוע 0.1 mN מוחל על המדגם הידרוג ב-30 s, הכוח משתנה ואז mN 1 תמורת 120 s, ולבסוף, הכוח הוא מתרצה לחזור mN 0.1 300 s כדי לאפשר את התחומים חלבון לקפל את (איור 5A). במהלך ה-30 הראשונים s לעבר כוח נמוך, אין שינוי הבולטים בסיומת ג'ל. בעת הגדלת הכוח כדי 1 mN, הידרוג מציגה סיומת מהר אלסטי. בעקבות הרחבה הראשונית זו, הידרוג ממשיך להתפשט לאורך זמן, תוך שמירה על כוח קבוע (1 mN). לאחר מכן, הכוח הוא מתרצה בחזרה אל הערך ההתחלתי נמוך (0.1 mN) ומשחזרת הידרוג שלו אורך הראשונית (איור 5B). ההרחבה של המדגם הידרוג (איור 5C) ואת הכוח משמשים כדי לחשב את המתח (למעלה) והלחץ (למטה) באופן דומה כמו המדידות כבש כוח (איור 5D).
איור 1: L-eGFP/(L)8-מבוסס הידרוג סינתזה. (א) לוח זה מראה התרשימים L-eGFP/(L)8 חלבון הידרוג באמצעות סינתזה של תגובה photoactivated. החלבון מעורבב עם APS [Ru(bpy)3]2 + ו נחשפים אור לבן, אשר מקדמת את היווצרות קשרים הדדיים בין חומצות האמינו טירוזין סמוכים (פנימי). (B) לוח זה מראה על L-eGFP/(L)8-, [Ru(bpy)3]2 +-, ו APS-תערובת נטען לתוך צינור PTFE באמצעות מחט 23 גרם לפני חשיפה לאור לבן (למעלה) ואחרי (למטה). (ג) לוח זה מראה L-eGFP/(L) מעוקם8-מבוסס הידרוג לתוך פתרון טריס. שיבוץ מראה תמונה מוגדלת של L-eGFP/(L)8-מבוסס הידרוג. התפלגות קוטר הוא 552 μm ± 8, מסכים עם הקוטר הפנימי של הצינור PFTE ששימש את הפילמור (558 μm). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הקמה ועיצוב rheometer של כוח-קלאמפ. (א) עיבוד של rheometer הידרוג חיל שהורכב-קלאמפ. ההצגות שיבוץ מדגם הידרוג מבוססי חלבונים המחוברים הקול סליל, כוח חיישן ווים בתוך החדר פתרון. (B) עיבוד של תצוגה מורחבת של rheometer הידרוג כוח-קלאמפ: (a - c) המניפולטוריםz x-y- להתאמת הקול-הסליל וו מיקום, (ד) הגליל קול ליניארי המנוע, (e) הכוח מתמר, (נ) הכוח מחזיק מתמר, קאמרית (g) הפתרון, ו (h - אני) ה- x-y סימולטורי עבור התאמת המיקום מתמר כוח. (ג) בסכמה קביעת rheometer הידרוג כוח-קלאמפ. ערכת מראה מדגם הידרוג חלבון מבוססת מחובר חיישן כוח, קול הגליל ווים בעזרת תפרים רפואי. מערכת PID אנלוגית ישנה את אורך הידרוג שינוי תנוחת קול-סליל לעקוב אחרי הנקודה ערכת כוח. התגובה של המערכת (D) PID באמצעות ערכים שונים של אינטגרל-רווח (אני) כדי להגיע את הכוח לקבוע נקודת (קו מקווקו). עקבות הצבעוניים מייצגים את כוח נמדד (למטה), זן (למעלה) נגזר מן התגובה מערכת PID. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: L-eGFP/(L)8-מבוסס הידרוג מצורף תהליך. צילום מקרוב (A) תצוגה של לולאה התפירות, עם קשר בוהן כפול רופף משמש כדי לצרף את הדגימה הידרוג הווים. לולאות התפר (B) השניים ממוקמים על הקרס חיישן כוח בשימוש הידרוג חלבון מבוססת קובץ מצורף. (ג) L-eGFP/(L)8-הידרוג מבוסס דגימה נתלה בין הווים (מסומן בחצים). (ד) התפר לולאות בצד קול הגליל (משמאל), הקרס חיישן כוח (מימין) הם התהדקה סביב המדגם הידרוג-העיקול של כל וו כדי למנוע את הדגימה גולשות במהלך המדידות. לאחר מכן, התפרים עודף, נסגרים באמצעות מספריים רפואיים (מסומן בחצים אדומים) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: נציג חיל-סרגל מדידה ונתונים ניתוח עקומות עבור L-eGFP/(L)8-המבוסס על מדגם הידרוג- (א) מדידה מרווח טיפוסי עקומה (אדום) כדי לקבוע הכוח אפס של החיישן כוח ואורך הידרוג נכון. שתי עקומות ליניארי (הכחול ואת הקווים הכתומים) משמשים כדי להתאים שני המשטרים: ראשית, כאשר הג'ל הוא תחת כוח (קו כחול), ושנית, כאשר הג'ל הופך מרווח (קו מישור - כתום). הצומת בין שני הקווים משמש כדי לחשב את אורך הידרוג נכון לעבר כוח אפס. החץ מראה את הכיוון של התנועה. שיבוץ מראה את המיקום של אפס כוח התיקון של אורך הידרוג. (B) נציג חיל-שיפוע עקומת חלה על המדגם הידרוג. מעקב (C) המייצג את תנועת העמדה סליל כפונקציה של הזמן. הגליל מתחיל מתוך עמדה ראשונית שהוגדר בפרוטוקול בשלב 3.1 (7.5 מ מ). (ד) עקומת נציג ההרחבה של המדגם הידרוג כפונקציה של הזמן. הסיומת מחושבת העקירה בין המיקום נמדד סליל עמדתה הראשונית. (E) נציג זן -נגד-זמן עקומה. המתח הוא מחושב על ידי חלוקת הסיומת לפי אורך ג'ל נכון שמחושבים המדידה מרווח. (F) עקומת הלחץ נציג-זן של מדגם הידרוג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: מדידת כוח קבוע וניתוח הנתונים. (א) נציג מעקב של פרוטוקול קבוע-כוח המוחל על הידרוג. הידרוג חשופים mN 0.1 ל 30 s, אז הכוח עלה ל mN 1 תמורת 120 s, ולבסוף, הכוח הוא מתרצה לחזור 0.1 mN עבור 300 הופעות (B) בלוח זה ס' סליל מיקום מעקב נגד הזמן המייצג בשינוי האורך של ה מדגם ydrogel בעקבות פרוטוקול כוח. (ג) לוח זה מראה את הסיומת ג'ל נמדד מאמצע העקירה הקול-סליל. (ד) דמות ייצוגית של מתח (למטה) עקבות המתח (למעלה) לאחר ניתוח הנתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במסמך זה, אנו מתארים שיטה rheometry כוח-קלאמפ לחקור את התגובה ביו-מכני של hydrogels חלבון מבוססת בנפח נמוך. בנוסף, פרוטוקול מסופק לסנתז מדגם הידרוג חלבון בנפח נמוך גלילי אחיד. פרוטוקול מוצג גם המתאר איך לקשור סוגים שונים של חלבון מבוססת hydrogels עם elasticities שונים מבלי לגרום לכל דפורמציה מכאנית או נזק דגימות חלבון מבוססת הידרוג או גלישה של הג'ל על הווים. מערכת PID אנלוגי, יחד עם סליל ליניארי קול, החיישן כוח, מאפשרים היישום של כוח מבוקר פרוטוקולים כגון כבש כוח וכוח מתמדת. לאחרונה, טכניקה זו שימש ללמוד את התגובה ביו-מכני של ריכוזים שונים צולבים של מבוסס-BSA hydrogels ב פתרונות שונים ניסיוני7.
היבט חשוב בעת גיבוש ועבודה עם חלבון hydrogels הוא הפארמצבטית את המידות. אם ג'לים מנוסחות עם ריכוז חלבון נמוכה מדי או cross-linking לא שלם, דפורמציות פלסטיק קבוע יופיעו במהלך הרחבת7. דפורמציות פלסטיק אלה באופן דרסטי להגביל הפרשנות נתונים, כמו ההשפעות viscoelastic יגיע גם התפתחות התחום וגם את הסידור המולקולרי החדש בתוך הג'ל. מבחן קל לראות אם יש להשלים cross-linking הוא לטבול את הידרוג ב denaturants כימיים, כגון M-guanidinium-כלוריד-1. במקרה זה, לא אמור כל תופעות viscoelastic ב הלחץ -נגד-זן עקומות, כמו כל התחומים פרש כימית הינם המולקולות עכשיו מתנהג כמו פולימרים פשוט4,7,26. יתר על כן, הג'ל צריך לשחזר את האלסטיות הראשונית שלו כשהוא שקוע בחזרה מאגר ראשוני7.
אם קיימות וריאציות בתגובה נמדד בין עקבות שהושג עם ג'לים שונים, יש לקחת בחשבון מספר היבטים לפתרון: צבירה החלבון בתמיסה, אי-הומוגניות ערבוב של החלבון עם cross-linking חומרים, הנוכחות של בועות, הכריכה של הידרוג חלבון מבוססת על הצינור PFTE עקב silanization שגוי. שאריות של silane על הקירות צינור עשוי לזהם את הידרוג ולהוביל פגמים מבניים. כדי להימנע משגיאה זו, אוויר דחוס יותר יש צורך להבטיח להסרה מוחלטת של silane באמצעות הרכבת התחתית. בנוסף, בועות יכולים ליצור במהלך היניקה של המיקס photoactive הידרוג לתוך הצינור PTFE. הבועות האלה יכול להוביל לטעום נזק ומשפיעים על התגובה ביו-מכני של הידרוג. כדי למנוע כל היווצרות בועה, הקצה של הצינור PTFE להיות בתוך תמהיל פתרון בעת תהליך הטעינה ועל הבוכנה המזרק יש אפשרות להכניס לאט. שגיאה אופיינית נוספת היא יתר הידוק של לולאות התפר סביב הדגימות הידרוג במהלך תהליך קובץ מצורף, דבר שעלול להוביל צורה חריץ, את חיתוך הידרוג. הטווח נע של הסליל קול מגביל ההרחבה המרבית של המדגם הידרוג המצורפת. מגבלה זו צריכה להילקח בחשבון כאשר מדידת ג'לים להאריך כמה מאות אחוזים אורך הראשונית שלהם. לדוגמה, כדי להרחיב את הידרוג עבור יותר מ- 200%, אורך הראשונית של פחות מ- 4 מ מ נדרש.
Hydrogels מבוססי חלבונים הם סוג ייחודי של biomaterials בשל הביו שלהם גבוהה stretchability נגזר חלבונים ליחידות הבניין הראשי שלהם, את המעבר מתקפלים הגלום זה מאפיין של חלבונים. בנוסף, hydrogels אלה יש פוטנציאל מצוין של הנדסת רקמות, מערכות של דיו ביולוגיים (bioink) עבור הדפסת תלת-ממד27 Rheometer הידרוג כוח-קלאמפ יכול לשמש כדי לחקור מגוון גדול של חלבונים. יתר על כן, rheometer כוח-קלאמפ מאפשר היישום של כוח קבוע-פרוטוקולים על דגימות הידרוג מצומצמות. ניסויים אלה לאפשר סופגת מאופני הפעולה אלסטי, viscoelastic, ללמוד מכניקה מתקפלים (האו ם) בגישה גורפת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו להכיר תמיכה כספית מן המחקר צמיחה יוזמה (פרס מס 101 X 340), הקרן הלאומית למדע, מחקר מכשור חוגי (מענק מס ' PHY-1626450), מילווקי גדול קרן (זוכה פרס שאו) ומערכת של אוניברסיטת ויסקונסין (מחקר יישומי גרנט).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SI-KG4A force transducer | World Precision Instruments (WPI) | SI-KG4A | |
| Linear Voice Coil Motor | Equipement Solutions | LFA2010 | |
| Bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals (RMBIO) | BSA-AAF-1XG / 100 G | |
| Trizma | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 248614-100G | |
| Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride | Sigma-Aldrich | 544981-1G | |
| EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK | Fisher Scientific | NC0395626 | |
| 1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip | BD | 309628 | |
| Silane, Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | |
| Hypodermic Needle, 23 Gauge | Healthcare Supply Pros | 305194 | |
| Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips - 24 gauge | KIMCO | JG24-1.5X | |
| USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp | ALB | USH-103D USHIO | |
| Medical Tweezers | |||
| Medical scissors | |||
| Olympus | |||
| The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author. |
References
- Cao, Y., Li, H. How do chemical denaturants affect the mechanical folding and unfolding of proteins? Journal of Molecular Biology. 375 (1), 316-324 (2008).
- Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: a comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).
- Wiita, A. P., et al. Probing the chemistry of thioredoxin catalysis with force. Nature. 450 (7166), 124-127 (2007).
- Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
- Plumere, N., et al. A redox hydrogel protects hydrogenase from high-potential deactivation and oxygen damage. Nature Chemistry. 6 (9), 822-827 (2014).
- Kong, N., Peng, Q., Li, H. B. Rationally Designed Dynamic Protein Hydrogels with Reversibly Tunable Mechanical Properties. Advanced Functional Materials. 24 (46), 7310-7317 (2014).
- Khoury, L. R., Nowitzke, J., Shmilovich, K., Popa, I. Study of Biomechanical Properties of Protein-Based Hydrogels Using Force-Clamp Rheometry. Macromolecules. 51 (4), 1441-1452 (2018).
- Auton, M., Rosgen, J., Sinev, M., Holthauzen, L. M. F., Bolen, D. W. Osmolyte effects on protein stability and solubility: A balancing act between backbone and side-chains. Biophysical Chemistry. 159 (1), 90-99 (2011).
- Popa, I., Kosuri, P., Alegre-Cebollada, J., Garcia-Manyes, S., Fernandez, J. M. Force dependency of biochemical reactions measured by single-molecule force-clamp spectroscopy. Nature Protocols. 8 (7), 1261-1276 (2013).
- Aioanei, D., Brucale, M., Tessari, I., Bubacco, L., Samori, B. Worm-Like Ising Model for Protein Mechanical Unfolding under the Effect of Osmolytes. Biophysical Journal. 102 (2), 342-350 (2012).
- Wheeldon, I. R., Gallaway, J. W., Barton, S. C., Banta, S. Bioelectrocatalytic hydrogels from electron-conducting metallopolypeptides coassembled with bifunctional enzymatic building blocks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (40), 15275-15280 (2008).
- Sathaye, S., et al. Rheology of peptide- and protein-based physical hydrogels: are everyday measurements just scratching the surface? Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 7 (1), 34-68 (2015).
- Ma, X., et al. A Biocompatible and Biodegradable Protein Hydrogel with Green and Red Autofluorescence: Preparation, Characterization and In Vivo Biodegradation Tracking and Modeling. Scientific Reports. 6, 19370 (2016).
- Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (11), 6020-6024 (1999).
- Saqlain, F., Popa, I., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. A Novel Strategy for Utilizing Voice Coil Servoactuators in Tensile Tests of Low Volume Protein Hydrogels. Macromolecular Materials and Engineering. 300 (3), 369-376 (2015).
- Sun, F., Zhang, W. B., Mahdavi, A., Arnold, F. H., Tirrell, D. A. Synthesis of bioactive protein hydrogels by genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 11269-11274 (2014).
- Thompson, M. S., et al. Self-assembling hydrogels crosslinked solely by receptor-ligand interactions: tunability, rationalization of physical properties, and 3D cell culture. Chemistry. 21 (8), 3178-3182 (2015).
- Kocen, R., Gasik, M., Gantar, A., Novak, S. Viscoelastic behaviour of hydrogel-based composites for tissue engineering under mechanical load. Biomedical Materials. 12 (2), (2017).
- Desai, M. S., et al.
- Fusi, L., Brunello, E., Yan, Z., Irving, M. Thick filament mechano-sensing is a calcium-independent regulatory mechanism in skeletal muscle. Nature Communications. 7, (2016).
- McDonald, K. S. Ca2+ dependence of loaded shortening in rat skinned cardiac myocytes and skeletal muscle fibres. Journal of Physiology-London. 525 (1), 169-181 (2000).
- Wu, J. H., et al. Rationally designed synthetic protein hydrogels with predictable mechanical properties. Nature Communications. 9, (2018).
- Bharadwaj, N. A., Ewoldt, R. H. Single-point parallel disk correction for asymptotically nonlinear oscillatory shear. Rheologica Acta. 54 (3), 223-233 (2015).
- Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28 (17), 174003 (2017).
- Valle-Orero, J., et al. Mechanical Deformation Accelerates Protein Ageing. Angewandte Chemie International Edition. 56 (33), 9741-9746 (2017).
- Fang, J., et al. Forced protein unfolding leads to highly elastic and tough protein hydrogels. Nature Communications. 4, (2013).
- Gungor-Ozkerim, P. S., Inci, I., Zhang, Y. S., Khademhosseini, A., Dokmeci, M. R. Bioinks for 3D bioprinting: an overview. Biomaterial Science. , (2018).
