Summary
Denne undersøgelse rapporter udtagning af blodprøve fra hale vene i mus ved hjælp af et vakuum rør-udsugning med monokel Forstørrelsesglas. Vores metode er nem at praksis og kunne bruges til gentagne blod prøveudtagning i mus.
Abstract
Blod prøve samling er grundlaget for eksperimenterende dyreforsøg. Det er vigtigt at få tilstrækkelig blodprøver for forskellige forskningsformål. Hale årerne af mus er små, og det er undertiden vanskeligt at opnå den krævede blodvolumen af konventionelle punktering metoder. Dette studie undersøger overlegenhed af gentagne blod prøve samling fra hale vener af mus gennem brug af et vakuum blod samling system og monokel Forstørrelsesglas (eksperimentelle gruppe) i forhold til konventionelle blod prøveudtagningsmetoder (konventionelle gruppe) , udført af begyndere og eksperter, henholdsvis. Med hjælp fra en monokel Forstørrelsesglas indsættes en sommerfugl nål tip i halen vene af hver mus i den eksperimentelle gruppe. Når venen gennemtrænges med succes, er en blodprøve indsamlet i vakuum collection tube ved indsættelse af gummi slutningen af en sommerfugl nål i vakuum blod collection tube. Stemplet bruges derefter til at indsamle blod uden hjælp fra monokel Forstørrelsesglas i den konventionelle gruppe. Succesrate af blod prøve samling af begyndere og eksperter blev vist sig at være 70% vs 100% (p < 0,01) i den eksperimentelle gruppe og 35% vs. 85% (p < 0,01) i den konventionelle gruppe. For både begyndere og eksperter var punktering gange kræves for at opnå kræves blodprøven signifikant lavere i gruppen eksperimenterende i forhold til den konventionelle gruppe (2,40 ± 0,75 vs 2,90 ± 0.31, p < 0,05, 1,15 ± 0,37 vs 1.55 ± 0,76, p < 0,05). Sammenfattende præsenteres blod prøveudtagning teknik er muligt og let at praksis og giver mulighed for hyppige prøveudtagning af tilstrækkelige blod diskenheder fra ikke-bedøvede mus.
Introduction
Udtagning af blodprøve fra dyr, der er involveret i forsøg er en teknik, grundlæggende forskning. Der er nogle tilgængelige teknikker til indsamling af blod fra mus, herunder hale klip og punktering af hjertet, retro-orbital plexus, halsfedt, caudale vene og vena cava. Ideelt set bør blod indsamles i en minimalt invasiv måde og med minimal indvirkning på dyrets sundhed. Men de mest almindeligt anvendte teknikker ofte påføre stress på dyr og kan påvirke forsknings resultater1. Indsamling fra retro-orbital plexus kan bruges til at få nok blodvolumen fra mus2. Men det kan resultere i alvorlige vævsskader og giver ikke mulighed for at få blod gentagne gange i kort tid mellemrum3.
Den caudale vene er en overlegen placering for blod samling, som påfører minimal skade på mus. Men hale årerne af mus er tynde, og det er undertiden vanskeligt at få nok blod gennem konventionelle punktering teknik. I nogle tilfælde kan er gentagne punkteringer forpligtet til at opnå den ønskede blodvolumen. Anæstesi er også almindeligt anbefalede at lette udtagning af blodprøve fra hale venerne i mus. Desuden kan en skalpel, straight edge barberblade eller skarpe sakse være nødvendigt at fjerne enderne af haler at opnå den krævede blod prøver4. Vi har tidligere rapporteret succesfuld blod samling fra hale årerne af ikke-bedøvet rotter af vakuum blod prøve indsamlingssystem, som reduceret risiko for kontaminering, blod og undgå behovet for gentagne punkteringer5. Denne undersøgelse rapporter en lignende blod samling metode i ikke-bedøvede mus.
Protocol
1. dyrehold
- Bruge 12 uge gammel Kunming mus.
Bemærk: Vi brugte mus (n = 40, 20 hanner, 37-46 g, mener 42.38 ± 2.39 g) fra eksperimentelle dyr Center af Tongji Medical College. - Hus mus under standardbetingelser med fri adgang til fødevarer og drikkevand. Holde to mus i et 530 cm2 bur med træ barbering sengetøj.
- Fastholde en rumtemperatur mellem 21-23 °C.
- Feed mus med den normale salt kost (0,3% NaCl) i hele undersøgelsen.
2. blod prøve indsamling
- Forberede følgende udstyr: vakuum rør (1 mL), sommerfugl nål, monokel forstørrelsesglas og plast fastholdende indehaveren. Læg dem på en steril overflade (figur 1).
- Placere en mus i en plastik fastholdende indehaveren og vaske sin hale med varmt vand (20-30 °C). Tør halen med 70% ethanol-mættet bomuld bolde at udvide venen. Vælg den højre eller venstre hale vene for udtagning af blodprøve. Forstå den nederste del af halen blidt og holde halen lige under blod prøve samling.
- Indsamle blod. Hvis man sammenligner metoder, indsamle blod i to grupper: den "eksperimentelle" ved hjælp af den procedure, vi har udviklet, præsenteres nedenfor, og "konventionelle" gruppen ved hjælp af en konventionel metode, også præsenteres nedenfor.
- Eksperimentel indsamling:
- Bære en monokel forstørrelsesglas for at forbedre visning for punktering af hale vene. Indsæt 22 G sommerfugl nål tip i en af laterale hale venerne på en position cirka halvdelen afstand distalt fra spidsen af halen på en engel ca. 10°, for flere prøver på vej mod bunden af halen.
- Indsæt gummi slutningen af sommerfugl nålen i vakuum blod collection tube at indsamle blod (figur 2).
Bemærk: Hvis blod standser flyder ud under blod indsamlingen, nål vinkel bør hurtigt justeres. For at undgå blodets koagulation i nålen, en anden punktering position skal vælges, hvis blod standser flyder ud efter 15 s.
- Konventionelle metode:
- Indsætte nålen tilsluttet en sprøjte ind i en af de laterale vener ca. en tredjedel af afstanden distalt fra spidsen af halen.
- Når blodet forekommer i hub'en, trække sig tilbage i stemplet langsomt for at indsamle blod (figur 3)7.
Bemærk: For at yderligere belyse virkningerne af forskellig erfaring med indsamling, en nybegynder og ekspert blev valgt til at indsamle blodprøver ved hjælp af eksperimentelle og konventionelle metoder samtidig.
- Eksperimentel indsamling:
- Efter indsamling, fjerne nålen og tryk på punktering punkt til at stoppe blødninger. Derefter slipper musen fra plast fastholdende indehaveren og returnere musen til sit bur.
Bemærk: Det er blevet rapporteret, at op til 10% af total blod volumen kan sikkert fjernes fra et sundt dyr på 2 ugers intervaller8, så omkring 175 µL af blod blev indsamlet hver gang i overensstemmelse med etiske principper. - Brug rør med EDTA at indsamle plasma og bruge rør uden antikoagulantia for at indsamle serum. Forsigtigt Vend røret flere gange og lægger dem på is lodret.
- Der centrifugeres blod prøve indsamling rør i en nedkølet centrifuge på 1.000 x g i 10 min. at adskille plasma og serum.
Bemærk: Vellykket blod samling er defineret som at få et volumen på 175 µL hver gang. Ikke mere end tre punkteringer bør forsøges, og en mislykket blod samling er defineret som en total blodvolumen af mindre end 175 µL efter den tredje punktering. Prøveudtagning varighed defineres som tiden fra hale vene punktering til fjernelse af nålen efter blod samling. - Indsamle blod to gange med intervaller på 2 uger8.
3. den statistiske analyse
- Bruge kommercielt tilgængelige statistiske software til analyse. Præsentere data som gennemsnit ± standardafvigelse, bruger p < 0,05 som cutoff for Statistisk signifikans.
Representative Results
Kropsmasse, blod samling diskenheder og prøveudtagning varigheder for de to grupper
Blodprøver blev indsamlet fra 20 mus (10 hanner) to gange med 2 ugers mellemrum i hver gruppe. Den gennemsnitlige kropsmasse af mus var ens mellem de eksperimentelle og konventionelle grupper for begyndere og eksperter, henholdsvis (42.40 g ± 1,42 g vs 42.65 g ± 1,14 g, p > 0,05; 42.55 g ± 2,91 g vs 43.20 g ± 2,69 g, p > 0,05). Indsamlede blod diskenheder og prøveudtagning varigheder var ens mellem de to grupper i eksperter (184.25 µL ± 11.95 µL vs 171.75 µL ± 25.61 µL, p > 0,05; 1.85 min ± 0,68 min vs 2.17 min ± 0,80 min, p > 0,05). Dog blev højere indsamlede blod diskenheder og kortere prøveudtagning varigheder set i den eksperimentelle gruppe i forhold til den konventionelle gruppe begyndere (172,00 µL ± 15.17 µL vs 148.50 µL ± 30.22 µL, p < 0,01; 3.11 min ± 0,44 min vs 4.08 min ± 0,61 min, p < 0,01). I forhold til begyndere, eksperter indsamlet højere blod diskenheder og viste lavere prøveudtagning gange benytter eksperimentelle og konventionelle metoder (184.25 µL ± 11.95 µL vs 172,00 µL ± 15.17 µL, p < 0,01; 171.75 µL ± 25.61 µL vs 148.50 µL ± 30.22 µL, p < 0,05, 1.85 min ± 0,68 min vs 3.11 min ± 0,44 min, p < 0,01; 2.17 min ± 0,80 min vs 4.08 min ± 0,61 min, p < 0,05) (tabel 1).
Succesrate og punktering tidspunkter for de to grupper
Sammenligning af succesrate mellem begyndere og eksperter var 70% (14/20) vs 100% (20/20) (Pedersen < 0,01) i den eksperimentelle gruppe og 35% (7/20) vs 85% (17/20) (Pedersen < 0,01) i den konventionelle gruppe. Højere succesrate blev også set i den eksperimentelle gruppe i forhold til den konventionelle gruppe begyndere [70% (14/20) vs 35% (7/20), Pedersen < 0,05]. I både begyndere og eksperter var antallet af punkteringer signifikant lavere i gruppen eksperimenterende i forhold til den konventionelle gruppe (2,40 ± 0,75 vs 2,90 ± 0.31, p < 0,05, 1,15 ± 0,37 vs 1.55 ± 0,76, p < 0,05). I forhold til begyndere, blev lavere punktering gange for eksperter observeret ved hjælp af eksperimentelle og konventionelle metoder. (1,15 ± 0,37 vs 2,40 ± 0,75, p < 0,01; 1.55 ± 0,76 vs 2,90 ± 0.31, p < 0,01) (Tabel 1).
Figur 1: udstyr. Vist er 1 mL vakuum blod indsamling rør og en 22 G sommerfugl nål (til venstre), en monokel Forstørrelsesglas (i midten) og en plastik fastholdende indehaveren (til højre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: vellykket blod samling i den eksperimentelle gruppe. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: vellykket blod samling i den konventionelle gruppe. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Eksperimenterende gruppe | Konventionelle gruppe | |||
| nybegynder | ekspert | nybegynder | ekspert | |
| Kroppen massen (g) | 42.4±1.42 | 42.55±2.91 | 42.65±1.14 | 43.20±2.69 |
| Indsamlede blodvolumen (µL) | 172.00±15.17 | 184.25±11.95# | 148.50±30.22* | 171.75±25.61# |
| Prøveudtagning varighed (min) | 3.11±0.44 | 1.85±0.68# | 4.08±0.61* | 2.17±0.80# |
| Blod samling gange | 20 | 20 | 20 | 20 |
| Gennemsnitligt antal punkteringer | 2.40±0.75 | 1.15±0.37# | 2.90±0.31* | 1.55±0.76## * |
| Én gang punktering | 3 | 17 | 0 | 12 |
| To gange punktere | 6 | 3 | 2 | 5 |
| Tre gange punktere | 5 | 0 | 5 | 0 |
| Mislykkedes | 6 | 0 | 13 | 3 |
| Succesrate | 70% | 100%# | 35%* | 85%# |
Tabel 1: sammenligning af resultater mellem de eksperimentelle og konventionelle grupper. * p < 0,05, ** p < 0,01, eksperimentelle metode vs. konventionel metode. #p < 0,05, ##p < 0,01, nybegynder vs ekspert.
Discussion
Den nuværende undersøgelse beskriver en nem-at-lære blod samling metode i mus, som er overlegen i forhold til de konventionelle teknikker. Først, kan metoden styres nemt med en høj succesrate. For det andet, det er baseret på princippet om vakuum undertryk og giver mulighed for kontinuerlig tegning af blod med en reduceret risiko for direkte blod eksponering, hvilket også reducerer risikoen for forurening og hæmolyse9. For det tredje, denne metode er muligt for hyppige prøveudtagning af blod med tilstrækkelige mængder fra mus over en kort periode for forskellige forskningsformål. Desuden proceduren påfører kun minimal skade på mus, og blodet samling kan udføres uden brug af anæstetika; således kan påvirkning af stressrespons og anæstesiologi blodprøver undgås.
Hale vene er en overlegen placering for udtagning af blodprøve efter den godkendte protokol7. Men det er ikke altid let at opnå tilstrækkelig blodvolumen fra tynde hale vener med lavt blodet flyder. I dette tilfælde, huden er som regel skåret åben og vene gennemtrænges af en lancet, eller slutningen af halen er fjernet hurtigt af en barberkniv.
Denne protokol har til formål at forbedre metoden i blod samling fra mus ved hjælp af vakuum blod samling system, som kræver en vakuum blod prøve collection tube, sommerfugl nål og monokel Forstørrelsesglas. Dette vakuum blod prøveudtagningssystemet er normalt bruges til indsamling af blodprøver fra patienter i daglig klinisk praksis10. Med hjælp fra en monokel Forstørrelsesglas er det perfekte punktering punkt af en hale vene nemmere at finde. Når spidsen af en nål indsættes i halen blodåre, vil blodet automatisk strømme ind vakuum rør på grund af undertryk. Efter hæve nålen fra hale blodåre, vil blodet, der er blokeret i kateteret strømme ind den indsamling vakuum rør på grund af vakuum.
De følgende tips er vigtige for vellykket anvendelse af metoden. Først, kropsvægt hver mus bør være 40 g eller højere for at formindske svært ved punktering og får nok blod. For det andet for mislykkede blod samling, bør eksperimentatorer forsøge at hæve nålen langsomt indtil blod fortsætter med at strømme ud. For det tredje er det afgørende at udvide halen for at undgå enhver bevægelse under udtagning af blodprøve. Holder nål forsigtigt kan bidrage til at holde nålen tip i venen som musen hale bevæger sig. For det fjerde, hvis blod standser flyder ud under indsamling, kanylen vinkel bør justeres i tide. For at undgå blodets koagulation i nålen, en anden punktering position skal vælges, hvis blod standser flyder ud efter 15 s. Endelig anbefales i samarbejde med to operatører, mens du bruger denne teknik til at indsamle blod fra mus.
Kort sagt, er den vedtagne vakuum blod samling metode til brug ved mus sikker, muligt og let at praksis. Denne metode gør det muligt for hyppige prøveudtagning af blod med tilstrækkelige blod diskenheder fra ikke-bedøvede mus.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Nature Science Foundation grant i Hubei-provinsen, Kina [Grant No. 2018CFB761].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double-pointed needle | Shanghai Kang Nong medical instrument co., LTD, China | 20163151718 | 22G (0.7 mm x 25 mm) |
| Eyeglass magnifier | Vergroberung | 1.5x | |
| Normal salt diet for mice | Mice received a normal salt diet (0.3% NaCl) throughout the study. | ||
| Plastic holder | Shanghai Kang Nong medical instrument co., LTD, China | 35-45 g rat hoder | |
| SPSS software for statistical analysis | SPSS Inc, Chicago; USA | Version 17.0. | |
| Syringe | Shandong wego Medical polymer products co. LTD., China | 20160911A | 1 mL (Matching needle size: 0.45×16RW LB) |
| Vacuum blood collection system | Wuhan Zhi Yuan, medical science and technology co., LTD, China | 20171222 | 1 mL (Φ12.4×L75) |
References
- Grouzmann, E., et al. Blood sampling methodology is crucial for precise measurement of plasma catecholamines concentrations in mice. European Journal of Physiology. 447 (2), 254-258 (2003).
- Heimann, M., Roth, D. R., Ledieu, D., Pfister, R., Classen, W. Sublingual and submandibular blood collection in mice: a comparison of effects on body weight, food consumption and tissue damage. Lab Animal. 44 (4), 352-358 (2010).
- Heimann, M., Kasermann, H. P., Pfister, R., Roth, D. R., Burki, K. Blood collection from the sublingual vein in mice and hamsters: a suitable alternative to retrobulbar technique that provides large volumes and minimizes tissue damage. Lab Animal. 43 (3), 255-260 (2009).
- Hoff, J.
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Kilkenny, C., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: ARRIVE-ing at a solution. Lab Animal. 44 (4), 377-378 (2010).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- Wollowitz, A., Bijur, P. E., Esses, D., John Gallagher, E. Use of butterfly needles to draw blood is independently associated with marked reduction in hemolysis compared to intravenous catheter. Academic Emergency Medicine. 20 (11), 1151-1155 (2013).
- Eder, J. M., Cutter, G. R. A new device for collecting cord blood. Obstetrics and Gynecology. 86 (5), 850-852 (1995).
