Summary
Questo studio segnala il prelievo di sangue dalla vena caudale nei topi utilizzando un sistema di tubo di aspirazione con lente di ingrandimento per occhiali. Il nostro metodo è facile da praticare e poteva essere utilizzato per il campionamento di anima di ripetizione nei topi.
Abstract
Raccolta del campione di sangue è la base di ricerca sperimentale su animali. È di importanza per ottenere campioni di sangue adeguato per vari scopi di ricerca. Le vene di coda dei topi sono piccole, e a volte è difficile ottenere il volume di sangue richiesto dai metodi convenzionali di puntura. Questo studio indaga la superiorità della raccolta del campione di sangue ripetute dalle vene di coda di topi attraverso l'uso di un vuoto di sangue collezione sistema e monocolo magnifier (gruppo sperimentale) rispetto ai metodi di campionamento convenzionali del sangue (gruppo convenzionale) , eseguita da principianti ed esperti, rispettivamente. Con l'aiuto di una lente di ingrandimento per occhiali, una punta ad ago farfalla è inserita nella vena della coda di ogni mouse nel gruppo sperimentale. Quando la vena è penetrata con successo, un campione di sangue raccolti nel tubo sottovuoto raccolta di inserimento dell'estremità di gomma di un ago a farfalla nel tubo di raccolta di sangue sotto vuoto. Lo stantuffo viene quindi utilizzato per raccogliere il sangue senza l'aiuto della lente di ingrandimento per occhiali nel gruppo convenzionale. Tassi di successo della raccolta del campione di sangue per i principianti e gli esperti sono stati indicati per essere 70% vs 100% (p < 0,01) nel gruppo sperimentale e il 35% vs 85% (p < 0,01) nel gruppo convenzionale. Per principianti ed esperti, puntura volte necessarie per ottenere il campione di sangue richiesto erano significativamente più bassi nel gruppo sperimentale rispetto al gruppo convenzionale (2,40 ± 0.75 vs 2,90 ± 0,31, p < 0.05; 1.15 ± 0,37 vs 1,55 ± 0,76, p < 0,05). In conclusione, la tecnica di campionamento di sangue presentato è fattibile e facile da praticare e consente campionamento frequente di volumi di sangue adeguato dai topi non anestetizzati.
Introduction
Prelievo di sangue da animali coinvolti negli esperimenti è una tecnica di ricerca di base. Ci sono alcune tecniche disponibili per la raccolta del sangue dai topi, tra cui coda furbetta e perforatura del cuore, del plesso retro-orbitale, vena giugulare, vena caudale e della vena cava. Idealmente, il sangue dovrebbe essere raccolto in modo minimamente invasivo, con un impatto minimo sulla salute dell'animale. Tuttavia, le tecniche più comunemente usate spesso infliggono stress su animali e possono influenzare i risultati di ricerca1. Prelievo di sangue dal plesso retro-orbitale può essere utilizzato per ottenere abbastanza volume di sangue da topi2. Tuttavia, esso può provocare danno di tessuto severo e non consente di ottenere sangue ripetutamente in breve tempo gli intervalli3.
La vena caudale è una posizione superiore per la raccolta del sangue, che infligge danno minimo al momento di topi. Tuttavia, le vene di coda dei topi sono sottili, e a volte è difficile ottenere abbastanza sangue attraverso la tecnica di foratura convenzionale. In alcuni casi, punture ripetute sono necessari per ottenere il volume di sangue desiderata. L'anestesia è anche comunemente raccomandato per facilitare il prelievo di sangue dalle vene coda di topi. Inoltre, è necessario rimuovere le estremità delle code per ottenere i campioni di sangue richiesto4un bisturi, rasoio bordo dritto o forbici affilate. Precedentemente abbiamo segnalato successo del sangue dalle vene della coda dei ratti non anestetizzati dal sistema di raccolta del campione di sangue di vuoto, che ha ridotto il rischio di contaminazione del sangue ed ha evitato la necessità di punture ripetute5. Questo studio segnala un simile metodo di raccolta di sangue in topi non anestetizzati.
Protocol
1. allevamento
- Utilizzare 12 settimana vecchi topi di Kunming.
Nota: Abbiamo usato i topi (n = 40, 20 maschi, 37 – 46 g, media ± 42.38 2,39 g) da sperimentali animali centro di Tongji Medical College. - Casa i topi in condizioni standard con accesso gratuito per cibo e acqua potabile. Tenere due topi in una gabbia di2 cm 530 con rasatura di legno biancheria da letto.
- Mantenere una temperatura tra 21 – 23 °C.
- Nutrire topi con una normale dieta di sale (0,3% NaCl) in tutto lo studio.
2. raccolta del campione di sangue
- Preparare la seguente attrezzatura: tubo a vuoto (1 mL), ago a farfalla, lente di ingrandimento per occhiali e restrittivo di supporto in plastica. Posizionarli su una superficie sterile (Figura 1).
- Posizionare un mouse in un supporto di plastica restrittivo e lavare la coda con acqua tiepida (20 – 30 °C). Pulire la coda con le sfere di cotone saturato di etanolo 70% per espandere la vena. Selezionare la vena di destra o sinistra della coda per il prelievo di sangue. Afferrare delicatamente la parte inferiore della coda e tenere la coda diritta durante il prelievo di sangue.
- Raccogliere il sangue. Se il confronto tra i metodi, raccogliere il sangue in due gruppi: il gruppo "sperimentale", utilizzando la procedura che abbiamo sviluppato, presentate di seguito, e il gruppo "convenzionale" utilizzando un metodo convenzionale, anche presentato di seguito.
- Collezione sperimentale:
- Indossare una lente d'ingrandimento per occhiali per migliorare la visualizzazione per la puntura della vena della coda. Inserire la punta dell'ago di farfalla 22 G in una delle vene coda laterale in una posizione circa la metà della distanza distalmente dalla punta della coda a un angelo circa 10°, in movimento verso la base della coda per campioni multipli.
- Inserire l'estremità di gomma dell'ago farfalla nel tubo di raccolta di sangue sotto vuoto per raccogliere il sangue (Figura 2).
Nota: Se il sangue smette di scorrere fuori durante il prelievo, l'angolo dell'ago deve essere rapidamente regolata. Per evitare la coagulazione del sangue nell'ago, un'altra posizione di puntura deve essere selezionata se il sangue smette di scorrere fuori dopo 15 s.
- Metodo convenzionale:
- Inserire l'ago collegato ad una siringa in una delle vene laterali circa un terzo della distanza distalmente dalla punta della coda.
- Quando viene visualizzata la finestra di sangue nell'hub, tirare indietro lo stantuffo lentamente per raccogliere il sangue (Figura 3)7.
Nota: Per più ulteriormente delucidare gli effetti di diversa esperienza con raccolta del sangue, un principiante ed esperto sono stati scelti per raccogliere campioni di sangue usando metodi sperimentali e convenzionali simultaneamente.
- Collezione sperimentale:
- Dopo la raccolta del sangue, rimuovere l'ago e premere il punto di puntura per fermare l'emorragia. Quindi, rilasciare il mouse dal supporto di plastica restrittivo e tornare il mouse alla sua gabbia.
Nota: È stato segnalato che fino al 10% del sangue totale volume può essere tranquillamente rimosso da un animale sano alla settimana 2 intervalli8, così circa 175 µ l di sangue è stato raccolto ogni volta in conformità con i principi etici. - Utilizzare provette con EDTA per raccogliere plasma e utilizzare provette senza anticoagulanti per raccogliere il siero. Delicatamente capovolgendo la provetta e metterli su ghiaccio verticale.
- Centrifugare i tubi di raccolta del campione di sangue in una centrifuga refrigerata a 1.000 x g per 10 min separare il siero e plasma.
Nota: Successo del sangue è definito come ottenendo un volume di 175 µ l di ogni tempo. Non più di tre forature dovrebbero essere tentate, e una raccolta di sangue non riuscita viene definita come un volume di sangue totale di meno di 175 µ l dopo la terza puntura. La durata del campionamento è definita come il tempo dalla puntura della vena della coda alla rimozione dell'ago dopo la raccolta del sangue. - Raccogliere il sangue due volte a intervalli di 2 settimane8.
3. elaborazione statistica
- Utilizzare commercialmente disponibile software statistico per l'analisi. Presentare i dati come valore medio ± deviazione standard, utilizzando p < 0,05 come il cut-off per la significatività statistica.
Representative Results
Massa, volumi di raccolta del sangue e le durate di campionamento dei due gruppi
I campioni di sangue sono stati raccolti da 20 topi (10 maschi) due volte a intervalli di 2 settimane in ogni gruppo. La massa corporea medio dei topi era simile tra i gruppi sperimentali e convenzionali per principianti ed esperti, rispettivamente (42,40 g ± 1,42 g vs 42,65 g ± 1,14 g, p > 0.05; 42,55 g ± 2,91 g vs 43,20 g ± 2,69 g, p > 0.05). Volumi di sangue prelevato e durate di campionamento erano simili tra i due gruppi di esperti (184.25 µ l ± 11.95 µ l vs 171.75 µ l ± 25,61 µ l, p > 0.05; 1,85 min ± 0,68 min vs 2,17 min ± 0,80 min, p > 0.05). Tuttavia, i maggiori volumi di sangue prelevato e durate più brevi di campionamento sono state vedute nel gruppo sperimentale rispetto al gruppo convenzionale in principianti (172,00 µ l ± 15,17 µ l vs 148,50 µ l ± 30,22 µ l, p < 0.01; 3,11 min ± 0,44 min vs 4,08 min ± 0,61 min, p < 0.01). Rispetto ai principianti, esperti raccolti maggiori volumi di sangue e ha mostrato di campionamento inferiore volte utilizzando metodi sperimentali e convenzionali (184.25 µ l ± 11.95 µ l vs 172,00 µ l ± 15,17 µ l, p < 0.01; 171.75 µ l ± 25,61 µ l vs 148,50 µ l ± 30,22 µ l, p < 0.05; 1,85 min ± 0,68 min vs 3,11 min ± 0,44 min, p < 0.01; 2.17 min ± 0,80 min vs 4,08 min ± 0,61 min, p < 0,05) (tabella 1).
Tassi di successo e puntura volte dei due gruppi
Il confronto dei tassi di successo tra i principianti e gli esperti era 70% (14/20) vs 100% (20/20) (p < 0,01) nel gruppo sperimentale e il 35% (7/20) vs 85% (17/20) (p < 0,01) nel gruppo convenzionale. Più alti tassi di successo inoltre sono stati veduti nel gruppo sperimentale rispetto al gruppo convenzionale in principianti [70% (14/20) vs 35% (7/20), p < 0,05]. Principianti ed esperti, il numero di punture era significativamente più basso nel gruppo sperimentale rispetto al gruppo convenzionale (2,40 ± 0.75 vs 2,90 ± 0,31, p < 0.05; 1.15 ± 0,37 vs 1,55 ± 0,76, p < 0,05). Rispetto ai principianti, tempi di puntura più bassi per gli esperti sono stati osservati con metodi convenzionali e sperimentali. (1,15 ± 0,37 vs 2.40 ± 0,75, p < 0.01; 1,55 ± 0,76 vs 2,90 ± 0,31, p < 0.01) (Tabella 1).
Figura 1: apparecchiature. Vengono mostrati i tubi di raccolta del sangue di vuoto di 1 mL e un ago a farfalla 22 G (a sinistra), una lente di ingrandimento per occhiali (al centro) e un supporto di plastica restrittivo (a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: successo del sangue nel gruppo sperimentale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: prelievo di sangue di successo nel gruppo convenzionale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Gruppo sperimentale | Gruppo convenzionale | |||
| principiante | esperto | principiante | esperto | |
| Massa del corpo (g) | 42.4±1.42 | 42.55±2.91 | 42.65±1.14 | 43.20±2.69 |
| Volume di sangue prelevato (µ l) | 172.00±15.17 | 184.25±11.95# | 148.50±30.22* | 171.75±25.61# |
| Durata di campionamento (min) | 3.11±0.44 | 1.85±0.68# | 4.08±0.61* | 2.17±0.80# |
| Tempi di raccolta del sangue | 20 | 20 | 20 | 20 |
| Numero medio di forature | 2.40±0.75 | 1.15±0.37# | 2.90±0.31* | 1.55±0.76# # * |
| Una sola puntura tempo | 3 | 17 | 0 | 12 |
| Puntura di due volte | 6 | 3 | 2 | 5 |
| Puntura di tre volte | 5 | 0 | 5 | 0 |
| Non riuscita | 6 | 0 | 13 | 3 |
| Tasso di successo | 70% | 100%# | 35%* | 85%# |
Tabella 1: confronto dei risultati fra i gruppi sperimentali e convenzionali. * p < 0,05, * * p < 0.01, metodo sperimentale vs metodo convenzionale. #p < 0.05, n. #p < 0.01, principiante vs esperto.
Discussion
Lo studio presente descrive un metodo di raccolta di sangue facile da imparare in topi che è superiore alle tecniche convenzionali. In primo luogo, il metodo può essere facilmente acquistato padronanza di con un alto tasso di successo. In secondo luogo, si basa sul principio di pressione negativa di vuoto e permette per disegno continuo di sangue con una riduzione del rischio di esposizione al sangue diretto, che inoltre riduce il rischio di contaminazione ed emolisi9. In terzo luogo, questo metodo è fattibile per il campionamento frequente di sangue con volumi adeguati dai topi in un breve periodo di tempo per vari scopi di ricerca. Inoltre, la procedura infligge solo minimo danno al momento di topi, e raccolta del sangue può essere eseguita senza l'uso di anestetici; così, l'influenza della risposta allo stress e anestetici sui campioni di sangue può essere evitato.
La vena della coda è una posizione superiore per il prelievo di sangue secondo il protocollo approvato7. Tuttavia, non è sempre facile da ottenere un volume sufficiente sangue dalle vene di coda sottile con flussi di sangue basso. In questo caso, la pelle è tagliata solitamente aperta e vena è penetrata da una lancetta, o alla fine della coda viene rimosso rapidamente da un rasoio.
Questo protocollo mira a migliorare la metodologia di raccolta del sangue dai topi utilizzando il sistema di raccolta di sangue sotto vuoto, che richiede un vuoto provetta da prelievo campione, ago a farfalla e lente di ingrandimento per occhiali. Questo sistema di prelievo ematico sottovuoto viene solitamente utilizzato per la raccolta di campioni di sangue dai pazienti nella quotidiana pratica clinica10. Con l'aiuto di una lente d'ingrandimento del monocolo, il punto perfetto puntura di una vena della coda è più facile da individuare. Quando la punta di un ago viene inserita nella vena caudale, sangue scorrerà automaticamente nel tubo di aspirazione a causa della pressione negativa. Dopo aver ritirato l'ago dalla vena della coda, il sangue che è bloccato nel catetere scorrerà nel tubo di aspirazione raccolta a causa del vuoto.
I seguenti suggerimenti sono importanti per la riuscita applicazione del metodo. In primo luogo, il peso corporeo di ogni mouse dovrebbe essere 40 g o superiore per diminuire la difficoltà di perforatura e ottenere abbastanza sangue. In secondo luogo, nel caso di raccolta del sangue non riuscita, sperimentatori dovrebbero cercare di ritirare l'ago lentamente fino a quando il sangue continua a fluire fuori. In terzo luogo, è fondamentale per estendere la coda per evitare qualsiasi movimento durante il prelievo di sangue. Tenendo l'ago delicatamente può aiutare a mantenere la punta dell'ago nella vena come la coda di topo si muove. In quarto luogo, se il sangue smette di scorrere fuori durante il prelievo, l'angolo dell'ago dovrebbe essere regolata in modo tempestivo. Per evitare la coagulazione del sangue nell'ago, un'altra posizione di puntura deve essere selezionata se il sangue smette di scorrere fuori dopo 15 s. Infine, la cooperazione di due operatori è raccomandata durante l'utilizzo di questa tecnica per raccogliere il sangue dai topi.
In breve, il metodo di raccolta sangue vuoto adottato per l'uso nei topi è sicuro, fattibile e facile da praticare. Questo metodo consente frequente prelievo di sangue con volumi di sangue adeguato dai topi non anestetizzati.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla concessione della provincia di Hubei, Cina [Grant No. 2018CFB761] Nature Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double-pointed needle | Shanghai Kang Nong medical instrument co., LTD, China | 20163151718 | 22G (0.7 mm x 25 mm) |
| Eyeglass magnifier | Vergroberung | 1.5x | |
| Normal salt diet for mice | Mice received a normal salt diet (0.3% NaCl) throughout the study. | ||
| Plastic holder | Shanghai Kang Nong medical instrument co., LTD, China | 35-45 g rat hoder | |
| SPSS software for statistical analysis | SPSS Inc, Chicago; USA | Version 17.0. | |
| Syringe | Shandong wego Medical polymer products co. LTD., China | 20160911A | 1 mL (Matching needle size: 0.45×16RW LB) |
| Vacuum blood collection system | Wuhan Zhi Yuan, medical science and technology co., LTD, China | 20171222 | 1 mL (Φ12.4×L75) |
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