Summary
מחקר זה דוחות דיגום הדם של וריד הזנב בעכברים באמצעות מערכת צינור שאיבת ואקום עם זכוכית מגדלת מוכספת. השיטה שלנו קל לתרגל, ניתן להשתמש עבור לקיחת דמים חוזרים בעכברים.
Abstract
איסוף דגימת דם הוא בסיס ניסיוני מחקר בבעלי חיים. זה חשוב כדי להשיג דגימות דם נאותה למטרות מחקר שונים. הורידים הזנב של עכברים קטנים, זה לפעמים קשה להשיג את נפח הדם הנדרשת על ידי שיטות לנקב קונבנציונלי. מחקר זה בוחן את העליונות של אוסף דגימת דם חוזרות ונשנות מן הורידים הזנב של עכברים באמצעות שימוש דם ואקום אוסף מערכת ומנקה מגדלת (קבוצת הניסוי) לעומת שיטות דגימה דם קונבנציונאלי (קבוצה קונבנציונלי) , המבוצעת על ידי למתחילים ולמתקדמים, בהתאמה. עם העזרה של מוכספת ' זכוכית מגדלת ', טיפ המחט פרפר מוכנס לתוך וריד הזנב העכבר כל קבוצת הניסוי. כאשר הווריד הוא שחדר בהצלחה, דגימת דם נאסף בצינור אוסף אבק על ידי החדרת בסוף גומי מחט הפרפר לתוך הצינור אוסף דם ואקום. הבוכנה משמש לאחר מכן לאסוף דם ללא העזרה של זכוכית מגדלת מוכספת בקבוצה קונבנציונלי. אחוזי ההצלחה של איסוף דגימת דם על ידי למתחילים ולמתקדמים הוצגו 70% לעומת 100% (p < 0.01) קבוצה ניסיונית, 35% לעומת 85% (p < 0.01) בקבוצה קונבנציונלי. הן למתחילים והן מומחים, ניקוב הזמנים הנדרשים להשגת דגימת דם הנדרשים היו נמוכים משמעותית בקבוצת הניסוי בהשוואה לקבוצת קונבנציונאלי (2.40 ± 0.75 לעומת 2.90 ± 0.31, 0.05 < p; 1.15 ± 0.37 לעומת 1.55 ± 0.76, p < 0.05). לסיכום, שיטת דגימה דם הציג ריאלי ופשוט לאימון ומאפשר תכופים דגימה של דם נאותה כרכים של עכברים שאינם מרדימים.
Introduction
בדיקת דם מעורב בניסויים בבעלי חיים היא טכניקה מחקר בסיסי. ישנם כמה טכניקות זמינים עבור איסוף דם של עכברים, כולל הזנב חיתוכים, ניקב הלב, מקלעת רטרו-מסלולית, ומוחלף, וריד סימטרית, ו הנבוב. באופן אידיאלי, צריך לאסוף דם בצורה פולשנית, עם השפעה מינימלית על בריאותו של בעל החיים. עם זאת, הטכניקות הנפוצות ביותר לעתים קרובות ממיטים לחץ על בעלי חיים, יכול להשפיע על תוצאות מחקר1. דם מהאוסף מקלעת רטרו-מסלולית ניתן להשיג מספיק נפח דם של עכברים2. עם זאת, הוא יכול לגרום נזק לרקמות חמור, אינו מאפשר קבלת הדם שוב ושוב ב מרווחי זמן קצר3.
הווריד סימטרית הוא מיקום מעולה עבור איסוף דם, הגורם פגיעה מינימלית על עכברים. עם זאת, הורידים הזנב של עכברים דק, זה לפעמים קשה להשיג מספיק דם דרך הטכניקה לנקב קונבנציונלי. במקרים מסוימים, דקירות חוזרות נדרשים להשיג את נפח הדם הרצויה. הרדמה מומלץ בדרך כלל גם כדי להקל על לקיחת דמים מן הורידים הזנב של עכברים. יתר על כן, האזמל, שוליים ישרים גילוח או מספריים חדות עשוי להיות נחוץ כדי להסיר את הקצוות של זנבות כדי להשיג את דגימות הדם הנדרשת4. בעבר דיווחנו איסוף דם מוצלחת מן הורידים הזנב של חולדות שאינם מרדימים על ידי מערכת איסוף דגימת דם ואקום, אשר הפחיתה את הסיכון לזיהום דם, נמנע הצורך דקירות חוזרות5. המחקר מדווח שיטה דומה של איסוף הדם בעכברים שאינם מרדימים.
Protocol
1. גידול
- השתמש עכברים קונמינג 12 בן שבועיים.
הערה: השתמשנו עכברים (n = 40, 20 גברים, g 37-46, מתכוון 42.38 ± 2.39 g) מהמכללה ניסיוני חיות מרכז טונגג'י הרפואה. - בית העכברים בתנאים סטנדרטיים עם גישה חופשית מזון ומים לשתיה. לשמור על שני עכברים בכלוב2 ס מ 530 עם גילוח עץ מצעים.
- לשמור על טמפרטורת חדר בין 21-23 מעלותצלזיוס.
- להאכיל עכברים עם דיאטה דלת מלח רגיל (0.3% NaCl) לאורך כל תקופת המחקר.
2. איסוף דגימת דם
- הכנת הציוד הבא: שפופרת ריק (1 מ"ל), המחט פרפר, זכוכית מגדלת מוכספת, פלסטיק מחזיק הרחקה. למקם אותם על משטח סטרילי (איור 1).
- הכנס עכבר בעל הרחקה פלסטיק ולשטוף את זנבו במים חמים (20-30 °C). נגב את הזנב עם כדורי צמר גפן ספוג אתנול 70% כדי להרחיב את הווריד. בחר את וריד הזנב ימינה או שמאלה עבור לקיחת דמים. לאחוז בעדינות את החלק התחתון של הזנב, לשמור על הזנב ישר במהלך איסוף דגימת דם.
- לאסוף את הדם. אם השוואה בין שיטות, לאסוף דם בשתי קבוצות: "ניסיוני" באמצעות ההליך פיתחנו, המובאת להלן, וקבוצת "קונבנציונאלי" באמצעות שיטה המקובלת, גם שיובאו להלן.
- אוסף ניסיוני:
- ללבוש של זכוכית מגדלת מוכספת כדי לשפר את הצפייה עבור ניקוב של הווריד של הזנב. הכנס קצה המחט פרפר 22 גרם לאחד הוורידים הזנב לרוחב עמדה בערך חצי המרחק רחוק מהקצה של הזנב-אנג'ל כ 10°, נע לכיוון הבסיס של הזנב לדוגמאות מרובים.
- הכנס הסוף גומי של המחט פרפר לתוך הצינור אוסף דם ואקום כדי לאסוף את הדם (איור 2).
הערה: אם הדם יפסיק לזרום החוצה במהלך איסוף דם, הזווית המחט צריך להיות במהירות מותאם. כדי למנוע קרישת דם במחט, והאחר לנקב צריך לבחור אם הדם יפסיק לזרום החוצה לאחר 15 s.
- השיטה המקובלת:
- את המחט מחובר מזרק לתוך אחד העורקים לרוחב כשליש המרחק רחוק מהקצה של הזנב.
- כאשר הדם מופיע ב- hub, למשוך בחזרה על הבוכנה לאט כדי לאסוף את הדם (איור 3)7.
הערה: להבהיר עוד יותר את ההשפעות של ניסיון בדרגות שונות עם איסוף דם, המתחיל והמומחה נבחרו כדי לאסוף דגימות דם תוך שימוש בשיטות ניסיוני, המקובלת בו זמנית.
- אוסף ניסיוני:
- לאחר איסוף דם, הסר את המחט ולחץ על נקודת חדירה כדי לעצור את הדימום. לאחר מכן, שחרר את לחצן העכבר ממחזיק הרחקה פלסטיק וחוזרים העכבר בכלוב.
הערה: בעבר דווח כי עד ל-10% של דם סה כ נפח ניתן בבטחה להסיר בעל חיים בריא-שבוע 2 מרווחי8, µL כל כך על 175 של דם נאסף בכל פעם על פי עקרונות אתיים. - השתמש צינורות עם EDTA לאסוף פלזמה ולהשתמש צינורות ללא תרופות נגד קרישת דם כדי לאסוף את הנסיוב. בעדינות היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים ולשים אותם על קרח אנכית.
- Centrifuge את צינורות אוסף דגימת דם צנטריפוגה בקירור ב 1000 g x 10 דקות להפריד בין פלזמה וסרום.
הערה: איסוף דם מוצלחת מוגדרת קבלת נפח של 175 µL בכל פעם. דקירות לא יותר משלושה שכדאי לנסות, אוסף דם שנכשלו מוגדר נפח הדם הכולל של µL פחות מ-175 לאחר הניקוב השלישי. משך דגימת מוגדר מעת הניקוב וריד הזנב להסרת של המחט לאחר איסוף דם. - לאסוף דם פעמיים במרווחי זמן של שבועיים8.
3. ניתוח סטטיסטי
- השתמש בתוכנה סטטיסטית זמינים מסחרית לניתוח. הצגת נתונים כמו הערך הממוצע ± סטיית תקן, שימוש p < 0.05 החיתוך עבור מובהקות סטטיסטית.
Representative Results
מסת הגוף דם אוסף כרכים על הדגימה המשכים של שתי הקבוצות
דגימות דם נאספו מ- 20 עכברים (10 אנשים) פעמיים במרווחים שבועיים בכל קבוצה. מסת הגוף אכזרי של עכברים היה דומה בין הקבוצות ניסיוני, המקובלת למתחילים מומחים, בהתאמה (42.40 g ± g 1.42 ג ' יגה לעומת 42.65 g ± 1.14 g, 0.05 > p; 42.55 g ± g 2.91 לעומת 43.20 g ± 2.69 g, 0.05 > p). אמצעי אחסון הדם שנאספו משך דגימת היו דומים בין שתי הקבוצות במומחים (184.25 µL ± 11.95 µL לעומת 171.75 µL ± 25.61 µL, 0.05 > p; 1.85 min ± 0.68 דקות לעומת 2.17 min ± מין 0.80, 0.05 > p). עם זאת, אחסון הדם שנאספו גבוה ומשכי דגימה קצרה יותר נראו ב קבוצת הניסוי בהשוואה לקבוצת קונבנציונלי ' ב מתחילים (172.00 µL ± 15.17 µL לעומת 148.50 µL ± 30.22 µL, p < 0.01; 3.11 min ± 0.44 דקות לעומת ± 4.08 דקות דקות 0.61, p < 0.01). בהשוואה ללמתחילים, מומחים שנאסף כרכים דם גבוהה והראה דגימה נמוכים זמני באמצעות שיטות ניסיוני, המקובלת (184.25 µL µL ± 11.95 לעומת 172.00 µL ± 15.17 µL, p < 0.01; 171.75 µL µL ± 25.61 לעומת 148.50 µL ± 30.22 µL, p < 0.05; 1.85 min ± 0.68 מין לעומת מינימום 3.11 ± 0.44 דקות, p < 0.01; 2.17 ± דקות דקות 0.80 לעומת ± 4.08 דקות דקות 0.61, p < 0.05) (טבלה 1).
שיעורי הצלחה והשעות ניקוב של שתי הקבוצות
השוואת שיעורי הצלחה בין למתחילים ולמתקדמים היה 70% (14/20) לעומת 100% (20/20) (p < 0.01) בתוך קבוצת הניסוי ו- 35% (7/20) לעומת 85% (17/20) (p < 0.01) בקבוצה קונבנציונלי. שיעור הצלחה גבוה יותר היו גם אצל קבוצת הניסוי בהשוואה לקבוצת קונבנציונלי ' ב מתחילים [70% (14/20) לעומת 35% (7/20), p < 0.05]. הן למתחילים והן מומחים, מספר דקירות היה נמוך באופן משמעותי בקבוצת הניסוי בהשוואה לקבוצת קונבנציונאלי (2.40 ± 0.75 לעומת 2.90 ± 0.31, 0.05 < p; 1.15 ± 0.37 לעומת 1.55 ± 0.76, p < 0.05). בהשוואה ללמתחילים, פעמים חדירה נמוך יותר עבור מומחים נצפו בשיטות ניסיוני, המקובלת. (1.15 ± 0.37 לעומת 2.40 ± 0.75, p < 0.01; 1.55 ± 0.76 לעומת 2.90 ± 0.31, p < 0.01) (טבלה 1).
איור 1: ציוד. מוצגות 1 מ"ל דם ואקום אוסף צינורות 22 גרם פרפר (משמאל), עם זכוכית מגדלת מוכספת (באמצע), ו מחט בעל הרחקה פלסטיק (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: איסוף דם מוצלחת בקבוצה ניסיוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: איסוף דם מוצלחת בקבוצה קונבנציונאלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| קבוצת הניסוי | קבוצה קונבנציונלי | |||
| למתחילים | מומחה | למתחילים | מומחה | |
| מסת הגוף (g) | 42.4±1.42 | 42.55±2.91 | 42.65±1.14 | 43.20±2.69 |
| נפח הדם שנאספו (µL) | 172.00±15.17 | 184.25±11.95# | 148.50±30.22* | 171.75±25.61# |
| משך דגימת (שלי) | 3.11±0.44 | 1.85±0.68# | 4.08±0.61* | 2.17±0.80# |
| דם אוסף פעמים | 20 | 20 | 20 | 20 |
| המספר הממוצע של דקירות | 2.40±0.75 | 1.15±0.37# | 2.90±0.31* | 1.55±0.76# * |
| ניקוב בפעם אחת | 3 | 17 | 0 | 12 |
| שתי פעמים לנקב | 6 | 3 | 2 | 5 |
| שלוש פעמים לנקב | 5 | 0 | 5 | 0 |
| נכשל | 6 | 0 | 13 | 3 |
| אחוזי הצלחה | 70% | 100%# | 35%* | 85%# |
טבלה 1: השוואה של תוצאות בין קבוצות הניסוי, המקובלת. * p < 0.05, * * p < 0.01, השיטה הניסיונית לעומת השיטה המקובלת. #p < 0.05, ##p < 0.01, המתחיל לעומת מומחה...
Discussion
המחקר הנוכחי מתאר בשיטת איסוף דם קל-כדי-ללמוד בעכברים עדיפה של טכניקות קונבנציונלי. ראשית, השיטה ניתן לשליטה בקלות עם אחוזי הצלחה גבוהים. שנית, הוא מבוסס על העיקרון לחץ שלילי ואקום ומאפשר לרישום רציף של דם עם סיכון מופחת של חשיפה ישירה דם, אשר גם מפחית את הסיכוי לזיהום וזיהום המוליזה9. שלישית, שיטה זו היא ריאלי עבור הדגימה תכופים של דם עם אמצעי אחסון נאותים של עכברים על פני תקופה קצרה של זמן למטרות מחקר שונים. יתר על כן, ההליך גורמת רק מינימלי לפציעה עכברים ולאחר איסוף דם יכול להתבצע ללא השימוש בהרדמה; לפיכך, ניתן להימנע השפעת תגובת המתח ואת חומרי הרדמה על דגימות דם.
תקחי את הזנב הוא מיקום מעולה עבור לקיחת דמים לפי פרוטוקול שאושרו7. עם זאת, זה לא תמיד קל להשיג נפח מספיק דם מן הוורידים זנב דק עם זרימות דם נמוך. במקרה זה, העור הוא בדרך כלל לפתוח וריד, הוא חודר אזמל מנתחים, או סוף הזנב יוסר במהירות על ידי סכין גילוח.
פרוטוקול זה נועד לשפר את המתודולוגיה של איסוף דם של עכברים באמצעות מערכת איסוף דם ואקום, המחייב של דם ואקום מדגם אוסף שפופרת פרפר, ומחט מוכספת זכוכית מגדלת. מערכת זו דגימה דם ואקום משמש בדרך כלל לאיסוף דגימות דם מחולים יומי הקליני10. עם העזרה של מוכספת ' זכוכית מגדלת ', נקודת חדירה מושלמת של וריד הזנב קל לאיתור. כאשר קצה מחט מוכנס לתוך הווריד של הזנב, דם יזרום באופן אוטומטי לתוך שפופרת הואקום בלחץ שלילי. לאחר נסיגתה המחט מן הווריד של הזנב, דם חסום הקטטר יזרום לתוך שפופרת הואקום איסוף בשל הוואקום.
העצות הבאות חשובים עבור יישום מוצלח של השיטה. קודם כל, משקל הגוף של כל עכבר צריך להיות 40 g או גבוה יותר כדי להקטין את הקושי ניקב וקבלת מספיק דם. שנית, במקרה של איסוף דם שנכשלו, ניסויים צריך לנסות למשוך את המחט לאט עד הדם ממשיך לזרום החוצה. שלישית, זה חיוני כדי להרחיב את הזנב למנוע כל תנועה במהלך לקיחת דמים. אוחז את המחט בעדינות יכול לעזור לשמור את מחט בווריד כמו המהלכים זנב העכבר. רביעית, אם הדם יפסיק לזרום החוצה במהלך איסוף דם, צריך להיות מותאם הזווית המחט מבעוד. כדי למנוע קרישת דם במחט, והאחר לנקב צריך לבחור אם הדם יפסיק לזרום החוצה לאחר 15 s. בסופו של דבר, שיתוף הפעולה של שני אופרטורים מומלץ תוך שימוש בטכניקה זו כדי לאסוף דם של עכברים.
בקיצור, השיטה אוסף דם ואקום המאומץ עבור שימוש בעכברים הוא בטוח, ריאלי וקל להתאמן. שיטה זו מאפשרת בתדירות דגימה של דם עם כמויות דם נאותה של עכברים שאינם מרדימים.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המענק למדע הטבע של הוביי, סין [מענק מס 2018CFB761].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double-pointed needle | Shanghai Kang Nong medical instrument co., LTD, China | 20163151718 | 22G (0.7 mm x 25 mm) |
| Eyeglass magnifier | Vergroberung | 1.5x | |
| Normal salt diet for mice | Mice received a normal salt diet (0.3% NaCl) throughout the study. | ||
| Plastic holder | Shanghai Kang Nong medical instrument co., LTD, China | 35-45 g rat hoder | |
| SPSS software for statistical analysis | SPSS Inc, Chicago; USA | Version 17.0. | |
| Syringe | Shandong wego Medical polymer products co. LTD., China | 20160911A | 1 mL (Matching needle size: 0.45×16RW LB) |
| Vacuum blood collection system | Wuhan Zhi Yuan, medical science and technology co., LTD, China | 20171222 | 1 mL (Φ12.4×L75) |
References
- Grouzmann, E., et al. Blood sampling methodology is crucial for precise measurement of plasma catecholamines concentrations in mice. European Journal of Physiology. 447 (2), 254-258 (2003).
- Heimann, M., Roth, D. R., Ledieu, D., Pfister, R., Classen, W. Sublingual and submandibular blood collection in mice: a comparison of effects on body weight, food consumption and tissue damage. Lab Animal. 44 (4), 352-358 (2010).
- Heimann, M., Kasermann, H. P., Pfister, R., Roth, D. R., Burki, K. Blood collection from the sublingual vein in mice and hamsters: a suitable alternative to retrobulbar technique that provides large volumes and minimizes tissue damage. Lab Animal. 43 (3), 255-260 (2009).
- Hoff, J.
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Kilkenny, C., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: ARRIVE-ing at a solution. Lab Animal. 44 (4), 377-378 (2010).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- Wollowitz, A., Bijur, P. E., Esses, D., John Gallagher, E. Use of butterfly needles to draw blood is independently associated with marked reduction in hemolysis compared to intravenous catheter. Academic Emergency Medicine. 20 (11), 1151-1155 (2013).
- Eder, J. M., Cutter, G. R. A new device for collecting cord blood. Obstetrics and Gynecology. 86 (5), 850-852 (1995).
