Summary
Cette étude rend compte de prélèvement de sang de la veine caudale chez la souris à l’aide d’un système de tube d’aspiration avec loupe pour lunettes. Notre méthode est facile à pratiquer et pourrait être utilisé pour le prélèvement de sang répétées chez les souris.
Abstract
Prélèvement d’échantillons de sang est la base de recherches expérimentales sur les animaux. Il est important d’obtenir des échantillons de sang adéquat à des fins de recherches diverses. Les veines de queue de souris sont petites, et il est parfois difficile d’obtenir le volume sanguin requis par les méthodes conventionnelles de ponction. La présente étude examine la supériorité du prélèvement d’échantillons de sang répétées des veines de queue de souris grâce à l’utilisation d’un vide de sang collection système et les lunettes loupe (groupe expérimental) par rapport aux méthodes conventionnelles de prélèvements (groupe conventionnel) , interprété par les débutants et les experts, respectivement. Avec l’aide d’une loupe pour lunettes, une pointe d’aiguille papillon est insérée dans la veine caudale de chaque souris dans le groupe expérimental. Quand la veine est pénétrée avec succès, un échantillon de sang est prélevé dans le tube de prélèvement sous vide en insérant l’extrémité en caoutchouc d’une aiguille à ailettes dans le tube de prélèvement sanguin sous vide. Le piston est ensuite utilisé pour recueillir le sang sans l’aide de la loupe pour lunettes dans le groupe conventionnel. Taux de réussite de prélèvement d’échantillons de sang par les débutants et les experts se sont avérés être de 70 % et 100 % (p < 0,01) dans le groupe expérimental et 35 % par rapport à 85 % (p < 0,01) dans le groupe conventionnel. Pour les débutants et experts, ponction fois nécessaires pour obtenir l’échantillon sanguin requis étaient significativement plus faibles dans le groupe expérimental par rapport au groupe conventionnel (2,40 ± 0,75 vs 2.90 ± 0,31, p < 0,05 ; 1,15 ± 0,37 contre 1,55 ± 0,76, p < 0,05). En conclusion, la technique de prélèvement du sang présentés est faisable et facile à pratiquer et permet fréquemment d’échantillonnage des volumes de sang adéquat des souris non-anesthésiés.
Introduction
Prélèvement de sang de l’animal impliqué dans des expériences est une technique de recherche fondamentale. Il existe quelques techniques disponibles pour la collecte de sang de souris, y compris les cisailles de queue et de perforer du coeur, plexus rétro-orbitaire, veine jugulaire, veine caudale et veine cave. Idéalement, le sang doit être recueilli de façon mini-invasive, avec un impact minimal sur la santé de l’animal. Cependant, les techniques les plus couramment utilisés souvent infligent stress des animaux et peuvent affecter les résultats de la recherche1. Collecte de sang du plexus rétro-orbitaire permet d’obtenir assez de volume sanguin de souris2. Toutefois, il peut entraîner des lésions tissulaires graves et ne permet pas pour l’obtention de sang à plusieurs reprises dans des intervalles de temps court3.
La veine caudale est un emplacement supérieur pour la collecte de sang, qui inflige des blessures minimes sur la souris. Toutefois, les veines de queue de souris sont minces, et il est parfois difficile d’obtenir suffisamment de sang grâce à la technique de ponction classiques. Dans certains cas, les ponctions répétées sont nécessaires pour obtenir le volume sanguin désirée. L’anesthésie est aussi couramment recommandé pour faciliter la prise de sang dans les veines de queue de souris. En outre, un scalpel, rasoir bord droit ou ciseaux pointus peut être nécessaire d’enlever les extrémités de la queue pour obtenir les échantillons de sang nécessaire4. Nous avons déjà rapporté collection réussie de sang dans les veines de queue de rats non anesthésiés par le système de collecte d’échantillon sanguin sous vide, qui réduit le risque de contamination du sang et évite la nécessité pour les ponctions répétées5. Cette étude décrit une méthode de collecte de sang similaire chez les souris non anesthésiés.
Protocol
1. l’élevage
- Utilisez la souris de Kunming âgés de 12 semaines.
NOTE : Nous avons utilisé des souris (n = 40, 20 mâles, 37 – 46 g, moyenne ± 42.38 2,39 g) du collège expérimental animaux centre of Tongji Medical. - Maison des souris dans des conditions normalisées avec libre accès à la nourriture et l’eau potable. Garder deux souris dans une cage de2 530 cm avec rasage bois de literie.
- Maintenir une température ambiante entre 21 et 23 °C.
- Nourrir la souris avec une diète normale (0,3 % NaCl) tout au long de l’étude.
2. prélèvement d’échantillons de sang
- Préparer le matériel suivant : tube à vide (1 mL), aiguille à ailettes, loupe pour lunettes et support plastique de retenue. Placez-les sur une surface stérile (Figure 1).
- Placer une souris dans un support en plastique restrictif et laver sa queue à l’eau tiède (20 – 30 °C). Essuyer la queue avec des boules de coton saturée d’éthanol 70 % d’élargir la veine. Sélectionnez la veine queue droite ou gauche pour les prélèvements sanguins. Saisir la partie inférieure de la queue doucement et garder la queue tout droit pendant le prélèvement d’échantillons de sang.
- Recueillir le sang. Si l'on compare les méthodes, recueillir le sang dans deux groupes : le groupe « expérimentale » à l’aide de la procédure, nous avons développé, présentés ci-dessous, et le groupe « classique », à l’aide d’une méthode conventionnelle, également présentée ci-dessous.
- Collection expérimentale :
- Porter une loupe lunettes afin d’améliorer la visualisation pour la ponction de la veine caudale. Insérez la pointe d’aiguille 22 G papillon dans un des nervures latérales arrière à mesure environ la moitié de la distance dans la partie distale de l’extrémité de la queue à un ange environ 10°, vers la base de la queue pour des échantillons multiples.
- Insérez l’extrémité en caoutchouc de l’aiguille à ailettes dans le tube de prélèvement sanguin sous vide pour recueillir le sang (Figure 2).
Remarque : Si le sang cesse de couler dehors pendant la collecte de sang, l’angle de l’aiguille doit être ajusté rapidement. Pour éviter la coagulation du sang dans l’aiguille, une autre position de ponction doit être sélectionnée si le sang cesse de couler dehors après 15 s.
- Méthode classique :
- Insérer l’aiguille relié à une seringue dans l’une des nervures latérales environ un tiers de la distance dans la partie distale de l’extrémité de la queue.
- Quand le sang apparaît dans le moyeu, tirez le piston lentement afin de recueillir le sang (Figure 3),7.
Remarque : Pour plus amples élucider les effets des diverses expériences avec prélèvement sanguin, un débutant et expert ont été choisis pour prélever des échantillons de sang à l’aide de méthodes expérimentales et conventionnelles en même temps.
- Collection expérimentale :
- Après le prélèvement de sang, retirer l’aiguille et appuyez sur le point de ponction pour arrêter le saignement. Ensuite, relâchez le bouton de la souris du support plastique restrictif et regagner sa cage de la souris.
NOTE : Il a été rapporté que jusqu'à 10 % du sang total volume peut être en toute sécurité retirés d’un animal en santé à intervalles de 2 semaines8, donc environ 175 µL de sang ont été recueillis chaque fois conformément aux principes éthiques. - Utiliser des tubes EDTA à plasma de recueillir et utiliser des tubes sans anticoagulants pour recueillir le sérum. Doucement, inverser le tube plusieurs fois et placez-les verticalement sur la glace.
- Centrifuger les tubes de prélèvement sanguin échantillon dans une centrifugeuse réfrigérée à 1 000 x g pendant 10 min séparer le sérum et le plasma.
NOTE : Prélèvement sanguin réussie est définie comme obtenir un volume de 175 µL chaque fois. Pas plus de trois crevaisons doivent être tentées, et une collection de sang ayant échoué est définie comme un volume de sang total de moins de 175 µL après la troisième piqûre. La durée d’échantillonnage est définie comme le temps de la ponction veineuse de queue à l’élimination de l’aiguille après prélèvement sanguin. - Recueillir le sang deux fois à intervalles de 2 semaines8.
3. analyse statistique
- Utiliser un logiciel statistique commercialement disponible pour analyse. Présenter des données comme valeur moyenne ± écart-type, en utilisant p < 0,05 comme le seuil de signification statistique.
Representative Results
Masse, volumes de collecte de sang et la durée d’échantillonnage des deux groupes
Des échantillons de sang ont été prélevés de 20 souris (10 mâles) deux fois à intervalles de 2 semaines dans chaque groupe. La masse moyenne des souris était similaire entre les groupes expérimentaux et conventionnelles pour les débutants et les experts, respectivement (42,40 g ± 1,42 g contre 42,65 g ± 1,14 g, p > 0,05 ; 42,55 g ± 2,91 g vs 43,20 g ± 2,69 g, p > 0,05). Volumes de sang et de la durée d’échantillonnage était similaire entre les deux groupes dans les experts (184.25 µL ± 11.95 µL vs 171.75 µL ± 25,61 µL, p > 0,05 ; 1,85 min ± 0,68 min min 2,17 ± 0,80 min, p > 0,05). Toutefois, des volumes plus élevés de sang et de plus courtes durées d’échantillonnage ont été observées dans le groupe expérimental par rapport au groupe conventionnel dans les débutants (172.00 µL ± 15.17 µL vs 148,50 µL ± 30,22 µL, p < 0,01 ; min 3,11 ± 0,44 min min 4,08 ± 0,61 min, p < 0,01). Par rapport aux débutants, experts recueillis des volumes plus élevés de sang et a montré plus faible échantillonnage fois en utilisant des méthodes expérimentales et classiques (184.25 µL ± 11.95 µL vs 172.00 µL ± 15.17 µL, p < 0,01 ; 171.75 µL ± 25,61 µL vs 148,50 µL ± 30,22 µL, p < 0,05 ; 1,85 min ± 0,68 min min 3,11 ± 0,44 min, p < 0,01 ; 2.17 min ± 0,80 min min 4,08 ± 0,61 min, p < 0,05) (tableau 1).
Taux de réussite et de temps de perforation des deux groupes
La comparaison des taux de réussite entre les débutants et les experts était de 70 % (14/20) par rapport à 100 % (20/20) (p < 0,01) dans le groupe expérimental et 35 % (7/20) par rapport à 85 % (17/20) (p < 0,01) dans le groupe conventionnel. Taux de réussite plus élevés ont également été constatées dans le groupe expérimental par rapport au groupe conventionnel dans les débutants [70 % (14/20) et 35 % (7/20), p < 0,05]. Chez les débutants et experts, le nombre de perforations était significativement plus faible dans le groupe expérimental par rapport au groupe conventionnel (2,40 ± 0,75 vs 2.90 ± 0,31, p < 0,05 ; 1,15 ± 0,37 contre 1,55 ± 0,76, p < 0,05). Par rapport aux débutants, fois de ponction inférieures pour les experts ont été observés en utilisant des méthodes expérimentales et classiques. (1,15 ± 0,37 vs 2,40 ± 0,75, p < 0,01 ; 1,55 ± 0,76 vs 2.90 ± 0,31, p < 0,01) (Tableau 1).
Figure 1 : équipement. Montré, sont les tubes de prélèvement sanguin sous vide 1 mL et une aiguille à ailettes 22 G (à gauche), une loupe pour lunettes (au milieu) et un support en plastique restrictif (à droite). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : collecte de sang avec succès dans le groupe expérimental. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : collecte de sang avec succès dans le groupe conventionnel. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Groupe expérimental | Groupe conventionnel | |||
| débutant | expert | débutant | expert | |
| Masse (g) | 42.4±1.42 | 42.55±2.91 | 42.65±1.14 | 43.20±2.69 |
| Volume de sang (µL) | 172.00±15.17 | 184.25±11.95# | 148.50±30.22* | 171.75±25.61# |
| Durée d’un échantillonnage (min) | 3.11±0.44 | 1.85±0.68# | 4.08±0.61* | 2.17±0.80# |
| Temps de collecte de sang | 20 | 20 | 20 | 20 |
| Nombre moyen de crevaisons | 2.40±0.75 | 1.15±0.37# | 2.90±0.31* | 1.55±0.76## * |
| Une ponction de temps | 3 | 17 | 0 | 12 |
| Perforer deux fois | 6 | 3 | 2 | 5 |
| Percer trois fois | 5 | 0 | 5 | 0 |
| A échoué | 6 | 0 | 13 | 3 |
| Taux de réussite | 70 % | 100 %# | 35 %* | 85 %# |
Tableau 1 : comparaison des résultats entre les groupes expérimentaux et conventionnelles. * p < 0,05, ** p < 0,01, méthode expérimentale vs méthode conventionnelle. #p < 0,05, #p # < 0,01, débutant ou expert.
Discussion
La présente étude décrit une méthode de collecte de sang facile à apprendre chez la souris qui est supérieure aux techniques conventionnelles. Tout d’abord, la méthode peut être facilement maîtrisée avec un taux de réussite élevé. En second lieu, il repose sur le principe de pression négative sous vide et permet pour dessin continu de sang avec une réduction du risque d’exposition à du sang direct, qui réduit les risques de contamination et l’hémolyse9. Troisièmement, cette méthode est réalisable pour l’échantillonnage fréquent du sang avec des volumes suffisants de la souris sur une courte période de temps à des fins de recherches diverses. En outre, la procédure inflige seulement blessure minime à la souris, et prélèvement sanguin peut être effectué sans l’utilisation d’anesthésiques ; ainsi, l’influence de la réponse au stress et anesthésiques sur des échantillons de sang peut être évité.
La veine caudale est un emplacement supérieur pour les prélèvements sanguins selon le protocole approuvé7. Cependant, il n’est pas toujours facile d’obtenir le volume de sang suffisant des veines de queue mince avec des débits sanguins faibles. Dans ce cas, la peau est habituellement découpée et veine est pénétré par une lancette ou au bout de la queue est éliminé rapidement par un rasoir.
Ce protocole vise à améliorer la méthodologie de collecte de sang de souris en utilisant le système de prélèvement sanguin sous vide, qui nécessite un tube de prélèvement sanguin sous vide échantillon, aiguille à ailettes et loupe pour lunettes. Ce système de prélèvement sanguin sous vide est généralement utilisé pour la collecte des échantillons de sang chez des patients de tous les jours de pratique clinique10. Avec l’aide d’une loupe pour lunettes, le point parfait de ponction d’une veine de la queue est plus facile à localiser. Lorsque la pointe d’une aiguille est insérée dans la veine caudale, sang coulera automatiquement dans le tube à vide en raison de la pression négative. Après le retrait de l’aiguille de la veine caudale, le sang qui est bloqué dans le cathéter s’écoule dans le tube d’aspiration collecte en raison de la dépression.
Les conseils suivants sont importants pour une application réussie de la méthode. Tout d’abord, le poids du corps de chaque souris doit être de 40 g ou supérieur pour diminuer la difficulté de percer et d’obtenir suffisamment de sang. Deuxièmement, dans le cas de la collecte de sang ayant échoué, expérimentateurs devraient essayer de retirer l’aiguille lentement jusqu'à ce que le sang continue à couler dehors. En troisième lieu, il est essentiel d’étendre la queue pour éviter tout mouvement lors de prélèvements sanguins. Maintenant l’aiguille doucement peut aider à garder la pointe de l’aiguille dans la veine sous les coups de queue de souris. Quatrièmement, si le sang cesse de couler dehors pendant la collecte de sang, l’angle de l’aiguille doit être ajustée de façon opportune. Afin d’éviter la coagulation du sang dans l’aiguille, une autre position de ponction doit être sélectionnée si le sang cesse de couler dehors après 15 s. Enfin, la coopération de deux opérateurs est recommandée lorsque vous utilisez cette technique pour recueillir le sang des souris.
En bref, la méthode de collecte de sang de vide adopté pour une utilisation chez les souris est sécuritaire, faisable et facile à pratiquer. Cette méthode permet de fréquents d’échantillonnage du sang avec des volumes de sang adéquat des souris non-anesthésiés.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention de la Fondation Science Nature de la Province de Hubei, Chine [Grant No. 2018CFB761].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double-pointed needle | Shanghai Kang Nong medical instrument co., LTD, China | 20163151718 | 22G (0.7 mm x 25 mm) |
| Eyeglass magnifier | Vergroberung | 1.5x | |
| Normal salt diet for mice | Mice received a normal salt diet (0.3% NaCl) throughout the study. | ||
| Plastic holder | Shanghai Kang Nong medical instrument co., LTD, China | 35-45 g rat hoder | |
| SPSS software for statistical analysis | SPSS Inc, Chicago; USA | Version 17.0. | |
| Syringe | Shandong wego Medical polymer products co. LTD., China | 20160911A | 1 mL (Matching needle size: 0.45×16RW LB) |
| Vacuum blood collection system | Wuhan Zhi Yuan, medical science and technology co., LTD, China | 20171222 | 1 mL (Φ12.4×L75) |
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