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Medicine

विवो और इन विट्रो प्रयोगों के लिए गुशुकंग (जीएसके) ग्रंथों की तैयारी

Published: May 9, 2019 doi: 10.3791/59171
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education, 4School of Rehabilitation Science, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

Summary

यह लेख पशु अध्ययन और इन इन विट्रो प्रयोगों के लिए सीरम युक्त GSK granule sausukang granules के एक काम समाधान तैयार करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल हर्बल दवाओं के औषधीय जांच के लिए लागू किया जा सकता है के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दोनों vivo में और इन विट्रो प्रयोगों के लिए नुस्खे.

Abstract

पारंपरिक चीनी हर्बल दवा कई बीमारियों के इलाज में एक वैकल्पिक विधि के रूप में एक भूमिका निभाता है, जैसे रजोनिवृत्ति के बाद ऑस्टियोपोरोसिस (पीओपी)। गुसुकांग (GSK) granules, चीन में एक विपणन पर्चे, पॉप के इलाज में हड्डी की सुरक्षा त्मक प्रभाव पड़ता है. शरीर के लिए प्रशासन से पहले, एक मानक तैयारी प्रक्रिया आमतौर पर आवश्यक है, जो कच्चे जड़ी बूटियों से सक्रिय घटकों की रिहाई को बढ़ावा देने और औषधीय प्रभाव के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चिकित्सीय परिणामों को बढ़ाने के उद्देश्य. इस अध्ययन में वीवो में और इन विट्रो प्रयोगात्मक परख में GSK granules का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का प्रस्ताव है. वजन, भंग, भंडारण, और प्रशासन: लेखकों पहले vivo जांच में के लिए granules के पशु उपयुक्त खुराकों की गणना करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. दूसरा, यह आलेख माइक्रो-सीटी स्कैनिंग और हड्डी पैरामीटर की माप के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। नमूना तैयारी, माइक्रो-सीटी मशीन चलाने के लिए प्रोटोकॉल और हड्डी मानकों के परिमाणीकरण का मूल्यांकन किया गया। तीसरा, सीरम युक्त जीएसके ग्रेन्युल्स तैयार किए जाते हैं, और दवा युक्त सीरम इन विट्रो ऑस्टियोक्लेस्टोजेनेसिस और ऑस्टियोब्लास्टोजेनेसिस के लिए निकाला जाता है। जीएसके ग्रेन्युल्स को लगातार तीन दिनों तक चूहों को प्रतिदिन दो बार प्रशासित किया जाता था। रक्त तो एकत्र किया गया था, centrifuged, निष्क्रिय, और फ़िल्टर. अंत में, सीरम पतला था और ऑस्टियोक्लेस्टोजेनेसिस और ऑस्टियोब्लास्टोजेनेसिस के प्रदर्शन के लिए इस्तेमाल किया गया था। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल हर्बल पर्चे दवाओं के औषधीय जांच के लिए एक संदर्भ माना जा सकता है, इस तरह के granules के रूप में.

Introduction

पारंपरिक चीनी चिकित्सा (टीसीएम) ऑस्टियोपोरोसिस के इलाज के लिए महत्वपूर्ण पूरक और वैकल्पिक तरीकों में से एक है1,2. जल का काढ़ा सूत्र3का मूल और सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला रूप है. हालांकि, कमियां भी मौजूद हैं: बुरा स्वाद, गाड़ी के लिए असुविधा, कम शेल्फ जीवन और असंगत प्रोटोकॉल, उपयोग ों को सीमित करने के साथ ही उपचारात्मक प्रभाव. उपर्युक्त नुकसानों से बचने के साथ-साथ बेहतर प्रभावों को आगे बढ़ाने के लिए, कणिकाओं का विकास किया गया और इसका व्यापक रूप से उपयोग किया गया है4. हालांकि कई अध्ययनों से granules से एक या एक से अधिक प्रभावी घटकों के औषधीय तंत्र का पता लगाया है5,6,7, सटीक तंत्र और अंतर्निहित औषधीय प्रक्रियाओं अभी भी कर रहे हैं की पहचान करने के लिए मुश्किल है. इसका कारण यह है कि एक कण से बहुत अधिक प्रभावी घटक एक साथ समान या विरोधित प्रभाव डाल सकतेहैं 4. इसलिए, एक मानक प्रोटोकॉल के विकास के लिए शरीर को देने से पहले granules तैयार न केवल चिकित्सीय परिणामों पर एक बड़ा प्रभाव पड़ेगा, लेकिन यह भी दोनों में विवो और इन विट्रो परख के लिए आवश्यक है.

इसके अलावा, क्लिनिक में granules के उपचारात्मक प्रभाव की पुष्टि करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं और वास्तव में इन विट्रो या पूर्व vivo अध्ययन में उपयोग की पहचान, जो एक चुनौती पैदा करता है क्योंकि औषधीय तंत्र बहुत जटिल हैं. इसे हल करने के लिए, दवा युक्त सीरम की तैयारी पहली बार 1980 के दशक8में तशीनो द्वारा प्रस्तावित की गई थी। तब से, कई शोधकर्ताओं ने हर्बल दवा के लिए दवा युक्त सीरम लागू किया , जिसमें ग्रेन्युल्स9,10,11शामिल हैं . वर्तमान में, इन विट्रो जांच के लिए दवा युक्त सीरम का चुनाव एक रणनीति के रूप में माना जाता है जो शारीरिक स्थितियों की बारीकी से नकल करता है।

Gusukang (GSK) granules TCM के सिद्धांत के प्रकाश में नैदानिक अभ्यास के आधार पर postmenopausal ऑस्टियोपोरोसिस (पीओपी) के इलाज के लिए विकसित किए गए थे। GSK granules अंडाणु में ovariectomized (OVX) चूहों में हड्डी की हानि को रोकने, ऑस्टियोब्लास्टी हड्डी अवशोषण को बाधित, और ऑस्टियोब्लास्टिक हड्डी गठन को प्रोत्साहित4. नतीजतन, ली एट अल12 ने पाया कि GSK granules हड्डी गठन को प्रोत्साहित करने के लिए कैल्शियम रिसेप्टर की गतिविधियों को बढ़ाने के द्वारा OVX चूहों में हड्डी सुरक्षात्मक प्रभाव है. हड्डी की सुरक्षा के प्रभाव के साथ ही GSK granules के औषधीय प्रभाव की पुष्टि करने के लिए, लेखक यहाँ काम समाधान और दवा (GSK granule) युक्त सीरम की तैयारी के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदान करते हैं. इसके अलावा, यह लेख एक OVX प्रेरित ऑस्टियोपोरोटिक माउस मॉडल और जी एस के कणिका युक्त सीरम में इन विट्रो ऑस्टियोक्लेस्टोजेनेसिस/ऑस्टियोब्लास्टोजेनेसिस में जीएसके ग्रैन्युल्स के आवेदन का वर्णन करता है।

GSK granules कई जड़ी बूटियों से बना रहे हैं13,14 और पूरी तरह से नमकीन में आसानी से भंग किया जा सकता है. इसलिए, नमकीन वाहन के रूप में कार्य करता है. शाम संचालित चूहों (शाम) और OVX चूहों कणिका प्रशासित चूहों के रूप में नमकीन की एक ही मात्रा प्रशासित किया गया. माउस के लिए जीएसके ग्रेन्युल्स की समतुल्य खुराक की गणना मीह-रूबनर समीकरण15के आधार पर की गई थी। इस समीकरण न केवल सुरक्षित खुराकों प्राप्त करने का लाभ है, लेकिन यह भी औषधीय प्रभाव की गारंटी देताहै 15. GSK granules के तीन खुराकों निम्नानुसार उत्पन्न किए गए थे: (1) GSKL: OVX + कम खुराक GSK granules, 2 ग्राम / (2) GSKM: OVX + मध्यम खुराक GSK granules, 4 ग्राम / (3) GSKH: OVX + उच्च खुराक GSK granules, 8 g/ जीएसकेएल, जीएसकेएम और जीएसकेएच समूहों में चूहे को इंट्रागैस्ट्रिक रूप से जीएसके ग्रेन्युल्स प्रशासित किया गया था। कैल्शियम कार्बोनेट (600 mg/tablet) विटामिन डी 3 (125 अंतरराष्ट्रीय इकाई/टेबलेट) के साथ, उदाहरण के लिए, एक परिपक्व और विपणन उत्पाद में (उदाहरण के लिए, ऑस्टियोपोरोसिस के इलाज और रोकथाम के लिए Caltrate [CAL]), एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था।

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Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को शंघाई विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के अनुमोदन से किया गया था (एसजेडवाई201604005)।

1. जीएसके कार्य समाधान की तैयारी और प्रशासन

  1. माउस के लिए GSK granules के बराबर खुराक की गणना.
    1. मेह-रूबनर समीकरण15के आधार पर शरीर की सतह की गणना करें: शरीर की सतह ख् एक्स (शरीर का वजन2/3)/1000, जहाँ K मान मानव के लिए 10.6 और माउस के लिए 9.1 हैं। यह मानते हुए कि मानव शरीर का भार 70 किलोग्राम है, तब मानव शरीर की सतह (उ2) - 10ण्6 x (702/3)/1000 ] 1.8 उ2. 20 ग्राम (0.02 किग्रा; उदा., 1 माह का, मादा, C57/BL6) का माउस शरीर का वजन मानते हुए, फिर माउस शरीर की सतह (उ2)- 9.1 x (0.022/3) /
    2. परिकलित शरीर की सतह के आधार पर, मानव और माउस के लिए शरीर रूपांतरण अनुपात की गणना. मानव: 70 किग्रा/1.8 m2 ] 39. माउस: 0.02 किग्रा/0.0067 उ2 ] 3. जीएसके कणिका - 20 g/70 किग्रा x 39/3 ] 3ण्72 ग्राम/
    3. माउस प्रति 20 ग्राम के शरीर के वजन के आधार पर, माउस के लिए समतुल्य खुराक की गणना करें: 4 g/kg x 0.02 शह र् 0ण्08 g.
    4. प्रति समूह 20 चूहों और 3 महीने (90 दिनों के लिए स्थायी हस्तक्षेप) के आधार पर GSK granules के तीन समकक्ष खुराक की गणना करें: (1) GSKL (OVX + कम खुराक GSK granules [2 g/kg/day]): 0.04 g माउस/day x 20 micex x 90 दिन [ 72 g. (2) GSKMX + मध्यम खुराक GSK granules / दिन]: 0.08 g mouse/day x 20 चूहे x 90 दिन ] 144 g. (3) GSKH (OVX + उच्च खुराक GSK granules [8 g/kg/day]): 0.12 g mouse/day x 20 चूहे x 90 दिन ] 216 g.
      नोट: नुकसान को ऑफसेट करने के लिए अभ्यास में GSK granules का एक अतिरिक्त 20% तैयार करें।
  2. शरीर के वजन के आधार पर प्रति माउस GSK ग्रेन्युल की मात्रा की गणना15:उदा., आयतन (V) र् 0ण्24 mL/माउस/दिन.
    नोट: माउस के लिए intragastric प्रशासन के लिए मात्रा 0.12 एमएल/
  3. GSK granules के तीन खुराक के 10 दिन के मूल्य वजन. वजन 8 ग्राम, 16 ग्राम, और 24 ग्राम GSK granules और GSKL, GSKM, और GSKH के रूप में क्रमशः सेवा करते हैं.
  4. के रूप में कदम 1.1.1.1 और 1.1.2: CAL खुराक ] 2 गोली /70 किलो x 39/3 0.372 गोली /kg के रूप में 15 के आधार पर माउस के लिए विटामिन डी 3 (CAL) के साथ कैल्शियम कार्बोनेट के बराबर खुराक की गणना करें 0.4 गोली /
  5. माउस प्रति 20 ग्राम के शरीर के वजन के आधार पर (उदाहरण के लिए, 1 महीने पुराने, महिला, C57/BL6), माउस के लिए CAL के बराबर खुराक की गणना: 0.4 गोली / फिर समूह के प्रति 20 चूहों और 3 महीने (90 दिनों के लिए स्थायी हस्तक्षेप) के आधार पर CAL के बराबर खुराक की गणना: 0.008 गोली x 20 x 90 ] 14.4 गोलियाँ. 10 दिनों के वजन के 'केल (1.6 गोलियाँ) के लायक.
  6. विघटन
    1. 50 एमएल ट्यूब में 8 ग्राम जीएसके ग्रेन्युल्स रखें। पूरी तरह से भंग करने के लिए नमकीन और हिला ट्यूब के 48 एमएल जोड़ें।
      नोट: पूर्ण विघटन के लिए मानक तलछट का अभाव है। पूर्ण विघटन आगे की पुष्टि की जा सकती है अगर एक gavage सुई काम कर समाधान आकर्षित कर सकते हैं और फिर इसे आसानी से निष्कासित.
    2. 16 ग्राम और 24 ग्राम GSK granules के साथ कदम 1.5.1 दोहराएँ.
    3. एक 50 एमएल ट्यूब में CAL के 1.6 गोलियाँ (10 दिन के लायक) रखें. पूरी तरह से भंग करने के लिए नमकीन और हिला ट्यूब के 48 एमएल जोड़ें।
      नोट: काम समाधान -4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और हर 10 दिन तैयार किया।
  7. इंट्रागैस्ट्रिक प्रशासन
    1. माउस के पीछे पकड़ (1 महीने पुराने, महिला, C57/BL6) माउस के साथ आगे का सामना करना पड़ रहा है और यह सुनिश्चित करें कि यह उस स्थिति में मजबूती से रहता है. प्रशासन से पहले 2 "3 मिनट के लिए माउस शांत रखें.
      नोट: सुनिश्चित करें कि शोधकर्ता स्पष्ट रूप से माउस के सामने देख सकते हैं. माउस के काटने को रोकने के लिए दस्ताने पहनें, विशेष रूप से नए शोधकर्ताओं के लिए।
    2. जीएसके ग्रेन्युल्स के कार्य समाधान में गैवेज सुई (आकार: #12, 40 मिमी) रखें और कार्य समाधान के 0.24 एमएल को ड्रा करें।
    3. गाव की सुई को उसके मुंह के एक तरफ से माउस में तब तक रखें जब तक कि गाव की सुई पेट तक न पहुंच न दे।
      नोट: gavage सुई की पुष्टि करने के लिए पेट तक पहुँच गया है: (1) gavage सुई प्रतिरोध की भावना का सामना करना पड़ता है. इस बीच, माउस gavage सुई घेघा के भौतिक संकुचन गुजरता से पहले निगलने की कार्रवाई से पता चलता है. (2) माउस में काम कर रहे समाधान के लगभग 0.5 एमएल इंजेक्शन और 1 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। यदि माउस से कोई समाधान नहीं आ रहा है, तो इसका मतलब है कि गाव की सुई पेट तक पहुंच गई है।
    4. जीएसके ग्रेन्युल (0.24 एमएल/माउस) के कार्य समाधान को पेट में इंजेक्ट करें और फिर गैवेज सुई को बाहर निकालें। माउस को पिंजरे में वापस कर ें।
    5. CAL समाधान के साथ चरण 1.6.4 दोहराएँ और प्रति माउस 0.24 एमएल CAL समाधान इंजेक्ट करें.
      नोट: CAL समाधान का वॉल्यूम चरण 1.2 में के रूप में परिकलित की जाती है।

2. माइक्रो-सीटी स्कैनिंग

  1. टी आइबिया कटाई और तैयारी
    1. 90 दिन के हस्तक्षेप के बाद दिन में 300 एमएल/100 ग्राम 80 मिलीग्राम/किलोग्राम केटामाइन के साथ इंट्रापेरिटोनली एनेस्थेटाइज माउस। माउस पूरी तरह से एनेस्थेटाइज़्ड है कि क्या यह पुष्टि करने के लिए एक सुई चुटकी का उपयोग करें। कोई प्रतिक्रिया सफल संज्ञाहरण इंगित करता है. तो गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के साथ माउस को मार डालो.
    2. परास के साथ फोम पर दोनों हाथ और पैरों के साथ माउस को ठीक करें।
    3. कैंची (आकार: 8.5 सेमी) और tweezers (आकार: 10 सेमी) के साथ पैरों के निकट से distal अंत करने के लिए और फिर फसल tibias के साथ त्वचा कट.
    4. तुरंत 70% एथिल शराब में tibias डाल दिया और 3 बार के लिए धो लें.
  2. स्पंज फोम के साथ माउस के बाएं टिबिया लपेटें और एक नमूना ट्यूब (35 मिमी व्यास, 140 मिमी लंबाई) में डाल दिया।
    नोट: नमूना की लंबी धुरी नमूना ट्यूब के साथ होना चाहिए. टिबिया अंक के निकट अंत ऊपर की ओर सुनिश्चित करें।
  3. माइक्रो-सीटी 80 स्कैन मशीन चल रहा है
    1. कमरे के तापमान पर माइक्रो-सीटी 80 स्कैन मशीन शुरू करें।
    2. नमूना ट्यूब को माइक्रो-सीटी 80 में सेट करें और निम्न स्कैनिंग पैरामीटरके साथ क्रॉस-सेक्शन स्कैनिंग शुरू करें: पिक्सेल आकार 15.6 डिग्री मीटर, ट्यूब वोल्टेज 55 केवी, ट्यूब वर्तमान 72 $A, एकीकरण समय 200 एमएस, स्थानिक रिज़ॉल्यूशन 15.6 $m, पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन 15.6 डिग्री, और छवि मैट्रिक्स 2048 x 2048.
      नोट: cancellous हड्डी पूर्व स्कैनिंग द्वारा cortical हड्डी से प्रतिष्ठित है. टिबिया के स्कैन क्षेत्र को टिबियल पठार के नीचे 5 मिमी से दूर अंत तक रद्द अस्थि क्षेत्र के रूप में परिभाषित किया गया है।
  4. हड्डी पैरामीटर का परिमाणीकरण
    1. पार अनुभाग स्कैनिंग पूरा करने के बाद, बाएँ tibias की छवियों को प्राप्त करते हैं.
    2. घनत्व सीमा को 245 डिग्री 1000 पर सेट करें। निम्नअस्थि ोंगाशों को मापने के लिए माइक्रो-सीटी मूल्यांकन प्रोग्राम V6.6 का उपयोग करें: अस्थि खनिज घनत्व (बीएमडी), कुल मात्रा (बीवी/टीवी), ट्रैबेकुलर हड्डी संख्या (Tb.N), ट्रैबेकुलर हड्डी मोटाई (Tb.Th), साथ ही हड्डी ट्रैबेकुलर हड्डी जुदाई ( टी.बी.एस.पी.)।

3. इन विट्रो प्रयोगों के लिए रक्त सीरम की तैयारी

  1. गणना
    1. 0.2 किलो (1 महीने पुराने, महिला, Sprague-Dawley) के एक चूहे शरीर के वजन के आधार पर, GSK ग्रेन्युल की खुराक की गणना: मानव खुराक / दिन x शरीर के वजन मानव x K/शरीर के वजन के चूहे का $ 20 g/70 किलो x 70 किलो x K (K ] 0.018) /0.2 किलो $ 2 g/kg/day.
      नोट: K मानव और माउस15 (K $ 0.018) के बीच औषधीय रूपांतरण गुणांक है।
    2. कदम दोहराएँ 3.1.1 और निम्नलिखित खुराकों की गणना.
      1. जीएसकेएल की खुराक की गणना करें: 10 g/70 kg/day x 70 kg x K/0.2 kg ] 1 g/kg/day.
      2. जीएसकेएम की खुराक की गणना करें: 20 g/70 kg/day x 70 kg x K/0.2 kg ] 2 g/kg/day.
      3. जीएसकेएल की खुराक की गणना करें: 40 g/70 kg/day x 70 kg x K/0.2 kg ] 4 g/kg/day.
      4. CAL की खुराक की गणना करें: 2 गोली /70 kg/day x 70 kg x K/0.2 kg ] 0.2 गोली/
    3. GSK ग्रेन्युल और CAL की कुल खुराक की गणना.
      1. GSKL के लिए कुल खुराक की गणना: 1 g/kg/दिन x 0.2 kg x 6 चूहे x 3 दिन - 3.6 ग्राम.
      2. जीएसकेएम के लिए कुल खुराक की गणना करें: 2 g/kg/day x 0.2 kg x 6 चूहे x 3 दिन - 7.2 g.
      3. GSKH के लिए कुल खुराक की गणना: 4 g/kg/दिन x 0.2 kg x 6 चूहे x 3 दिन ] 14.4 ग्राम.
      4. CAL खुराक की गणना करें - 0.2 गोली/kg/दिन x 0.2 kg x 6 चूहे x 3 दिन ] 0.72 गोली.
        नोट: 100 एमएल संस्कृति माध्यम (20% GSK ग्रेन्युल युक्त सीरम) तैयार करने के लिए जीएसके ग्रेन्युल युक्त सीरम के कुल 10 एमएल की आवश्यकता है। प्रत्येक चूहे (6 चूहे/समूह) से सेंट्रीफ्यूगेशन के बाद जीएसके ग्रेन्युल युक्त सीरम के 1.5 डिग्री 2 एमएल प्रदान करने की उम्मीद है।
    4. शरीर के वजन के आधार पर चूहे केअनुसार लगाए गए जीएसके कणिकाओं की मात्रा की गणना कीजिए: उदा., आयतन (ट) र् 2 एमएल/रट/दिन।
      नोट: चूहे के लिए इंट्रागैस्ट्रिक प्रशासन के लिए मात्रा 0.1 एमएल/
  2. GSK granules के तीन खुराक के 3 दिन के मूल्य वजन. वजन 3.6 ग्राम, 7.2 ग्राम, और 14.4 ग्राम GSK granules और GSKL, GSKM, और GSKH के रूप में क्रमशः सेवा करते हैं. CAL समूह के लिए वजन 0.72 गोली.
  3. 7.2 ग्राम जीएसके कणिकाओं को 50 एमएल ट्यूब में रखें। पूरी तरह से भंग करने के लिए नमकीन और हिला ट्यूब के 36 एमएल जोड़ें। इसे 3.6 ग्राम और 14.4 ग्राम जीएसके ग्रेन्युल्स के साथ दोहराएं।
  4. GSK कार्य समाधान के 2 एमएल के साथ इंट्रागैस्ट्रिक प्रशासन के लिए धारा 1.6 दोहराएँ।
    नोट: सीरम तैयार करने के लिए नमकीन (2 एमएल प्रति चूहे) की एक ही मात्रा प्रशासन और इन विट्रो परख के लिए एक खाली नियंत्रण समूह के रूप में कार्य करता है.
  5. जीएसके युक्त सीरम की तैयारी
    1. GSK granules के अंतिम प्रशासन के बाद 300 एमएल/100 ग्राम 80 मिलीग्राम/kg केटामाइन 1 ज के साथ चूहों को एनस्थेटाइज करें। चूहे पूरी तरह से एनेस्थेटाइज़्ड है कि क्या पुष्टि करने के लिए एक सुई चुटकी का उपयोग करें। कोई प्रतिक्रिया सफल संज्ञाहरण इंगित करता है.
    2. त्वचा और peritoneum छेदकरने के बाद सीधे ऑपरेटिंग कैंची का उपयोग कर चूहों के छाती के नीचे करने के लिए पेट को उजागर.
      नोट: शल्य चिकित्सा उपकरण का उपयोग करने से पहले उच्च तापमान और उच्च दबाव पर बाँझ किया जाना चाहिए। रक्त संग्रह के दौरान शल्य चिकित्सा क्षेत्र 70% इथेनॉल के साथ बाँझ होना चाहिए।
    3. बर्तन को स्पष्ट रूप से बेनकाब करने के लिए ऊतक कागज के साथ पेट के आवरा के संयोजी ऊतक निकालें।
    4. एक 10 एमएल, 22 जी सिरिंज का उपयोग कर पेट के वार्ता से रक्त ड्रा। फिर सुई को हटा दें और रक्त को 15 एमएल बाँझ ट्यूब में स्थानांतरित करें। आमतौर पर, एक चूहे से 6 डिग्री 8 एमएल रक्त प्राप्त किया जा सकता है।
      नोट: प्रत्येक चूहे जब रक्त ड्राइंग जीवित रखा जाना चाहिए। एक संकेत यह है कि जब चूहा जीवित होता है तो पेट का वाता स्पंदित हो जाता है। रक्त खींचने के बाद चूहा मर चुका है।
    5. ट्यूब 30 डिग्री 60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ईमानदार ट्यूब रखें जब तक रक्त ट्यूब में clotted है. इसके बाद 20 मिनट के लिए 500 डिग्री 600 x ग्राम पर ट्यूब को अपकेंद्रण करें। सभी सुपरनेटेंट (सीरम) को एक समूह (6 चूहे) से एक 50 एमएल बाँझ ट्यूब में स्थानांतरित करें और मिश्रण करने के लिए हिलाएं।
    6. 30 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में इनक्यूबेट करके सीरम को निष्क्रिय करें। सीरम को 0.22-मीटर-पोर-आकार हाइड्रोफिलिक पोलिथिक पोलिथिक पोलिथर्सुलफोन सिरिंज फिल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर करें। लंबी अवधि के उपयोग (कम से कम 1 वर्ष) के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: फ़िल्टर किए गए सीरम का उपयोग इन विट्रो ऑस्टियोक्लेस्टोजेनेसिस और ऑस्टियोब्लास्टोजेनेसिस के लिए किया जा सकता है।
  6. अनुप्रयोग
    1. इन विट्रो ऑस्टियोक्लेस्टोजेनेसिस
      1. जीएसके युक्त सीरम (GSKL, GSKM, GSKH) के तीन खुराकों को कम से कम ईगल के मध्यम (जेड-एमईएम) के साथ 1:4 के अनुपात में कम से कम एल-ग्लूटामाइन, राइबोन्यूक्लिओसाइड्स, और deoxyribonucleosides युक्त।
        नोट: सुनिश्चित करें कि इन विट्रो ऑस्टियोक्लेस्टोजेनेसिस और ऑस्टियोब्लास्टोजेनेसिस में जीएसके युक्त सीरम की अंतिम एकाग्रता 20% है।
      2. पतला GSK युक्त सीरम जोड़ें (200 $L/well) चरण से 3.6.1.1 अस्थि मज्जा मैक्रोफेज (बीएम) से 4 "6 सप्ताह पुराने C57BL/6 चूहों ऑस्टियोक्लेस्टोजेनेसिस के लिए और मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ, 10 एनजी/एमएल) और रिसेप्टर activator के साथ बीएमएम को प्रोत्साहित परमाणु कारक के लिए-जेडबी लिगन्ड (RANKL, 100 ng/mL) जैसा कि पहले वर्णित2.
    2. इन विट्रो ऑस्टियोब्लास्टोजेनेसिस
      1. चरण 3.6.1.1 दोहराएँ.
      2. पतला GSK युक्त सीरम जोड़ें (2 एमएल/well) हड्डी mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के लिए (BMSCs) से 4 "6 सप्ताह पुराने C57BL/6 चूहों के रूप में पहले वर्णित16अस्थिकोटक उत्पन्न करने के लिए .

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Representative Results

माइक्रो-सीटी स्कैनिंग परिणामों से संकेत मिलता है कि OVX चूहों लवण नियंत्रण चूहों की तुलना में महत्वपूर्ण हड्डी हानि दिखाया (चित्र 1A). जीएसके ग्रेन्युल्स के हस्तक्षेप (90 दिनों) ने बीएमडी में बहुत वृद्धि की, विशेष रूप से जीएसकेएम समूह में (चित्र 1 बी) । अस्थि संरचना पैरामीटर, जैसे बीएमडी, बीवी/टीवी, टीबीएन, और Tb.Th, मात्रा निर्धारित की गई थी। GSK ग्रेन्युल उपचार वृद्धि हुई बीएमडी, बीवी Tb.Th/

टार्टरेट प्रतिरोधी अम्ल फॉस्फेटाज (ट्रैप) दागने से ओवीएक्स चूहों में ऑस्टियोक्लेस्ट की संख्या में नियंत्रण चूहों की तुलना में वृद्धि हुई है (चित्र 2क)। GSK ग्रेन्युल उपचार OVX समूह की तुलना में TRAP-सकारात्मक ऑस्टियोक्लेस्ट में कमी आई। इन निष्कर्षों की पुष्टि ट्रेप-पॉजीटिव क्षेत्र के ट्राबेकुलर हड्डी की सतह (ओसी/बीएस%) के अनुपात की गणना करके की गई थी। और अस्थि क्षेत्र में ऑस्टियोक्लेस्ट संख्याका अनुपात (ओसी/ इन मात्रात्मक परिणामों से ओवीएक्स समूह की तुलना में जीएसके समूहों में ऑस्टियोक्लेस्टों की संख्या में उल्लेखनीय कमी दिखाई दी (चित्र 2ठ, ब्) ।

GSK ग्रेन्युल युक्त सीरम अस्थि मज्जा मैक्रोफेज (बीएम) से 4 "6 सप्ताह पुराने C57BL/6 चूहों को ऑस्टियोक्लेस्ट उत्पन्न करने के लिए प्रशासित किया गया था और ऑस्टियोक्लेस्ट की संख्या TRAP धुंधला द्वारा विश्लेषण किया गया था। परिणामों से पता चला कि जीएसके ग्रैन्युल युक्त सीरम नियंत्रण समूह की तुलना में जीएसके समूहों में ट्रैप-पॉजीटिव ऑस्टियोक्लेस्ट की संख्या में कमी आई है (चित्र 3क, बी)।

क्षारीय फॉस्फेटस (एएलपी) के दाग से पता चला कि जीएसके ग्रैन्युल-मेडीकेटेड सीरम ने सी 57बीएल/6 चूहों से एमएससी के साथ ऑस्टियोब्लास्टोजेनेसिस पर उत्तेजक प्रभाव डाला। एएलपी दाग से पता चला कि जीएसके ग्रेन्युल-मेडीकेटेड सीरम के सभी तीन समूहों ने नियंत्रण समूह की तुलना में एएलपी (चित्र4ए, बी) की गतिविधि में वृद्धि की थी।

Figure 1
चित्र 1: GSK ग्रेन्युल OVX प्रेरित चूहों में हड्डी हानि से बचाता है. (ए) चूहे का इलाज जीएसके ग्रेन्युल्स के साथ 3 महीने तक किया गया और माइक्रो-सीटी विश्लेषण करने के लिए छोड़ दिया गया tibias काटा गया। प्रतिनिधि तीन आयामी (3 डी) बाईं tibias के trabecular हड्डी के पुनर्निर्माण छवियों को दिखाया गया. स्केल बार - 0.5 मिमी (बी) अस्थि खनिज घनत्व (बीएमडी) को मापा और परिमाणित किया गया था। (सी) सभी समूहों में ट्राबेकुलर हड्डी संरचना से संबंधित ट्रैबेकुलर बोन नंबर (टीबीएन), कुल मात्रा (बीवी/टीवी), ट्रैबेकुलर हड्डी मोटाई (Tb.Th) और ट्रैबेकुलर हड्डी जुदाई (टीबीएसपी) जैसे बाएं टिबियास के अस्थि पैरामीटर दिखाए गए थे. GSKL, GSKM, और GSKH समूहों नियंत्रण के साथ तुलना की गई (कॉन; शर्म + नमकीन) और OVX समूह (एन $ 6, *पी एंड एलटी; 0.05, बनाम नियंत्रण; *पी एंड एलटी; 0.05, बनाम OVX). CAL: विटामिन डी 3 के साथ कैल्शियम कार्बोनेट. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: GSK granules OVX चूहों में ऑस्टियोक्लेस्ट की संख्या को दबा. (क) जी एस के उपचारित चूहों की कटाई के बाद काठ की कशेरुकी 3 (एल 3) पर ट्रैप दाग लगाया गया था। नियंत्रण से TRAP परिणाम (शाम + नमकीन), OVX (OVX + नमकीन), CAL (OVX + Caltrate), GSKL (OVX + कम खुराक GSK, 2 जी / स्केल बार ] 100 डिग्री (शीर्ष चित्र) या 50 डिग्री (नीचे छवियों)। (बी) अस्थि सतह पर ऑस्टियोक्लेस्ट-आकवरसतह सतह का परिमाणीकरण। (ग) ऑस्टियोक्लेस्ट संख्या. मान ों को माध्य (SEM) की मानक त्रुटि के रूप में व्यक्त किया गया था। *पी एंड एलटी; 0.05, OVX बनाम नियंत्रण (कॉन); *पी एंड एलटी; 0.05, केएल या जीएसकेएल/जीएसकेएम/जीएसकेएच बनाम ओवीएक्स समूह के समूह। सभी परख कम से कम 3 चूहों के साथ दोहराया गया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: जीएसके ग्रैन्युल मेडीकल-सीरम अस्थि मज्जा मैक्रोफेज (बीएम) से ऑस्टियोक्लेस्टोजेनेसिस कम हो जाती है। (ए) C57BL/6 चूहों (4]6 सप्ताह पुराने) से बीएम काटा गया था, और एम-सीएसएफ (10 एनजी/एमएल) और RANKL (100 एनजी/एमएल) (नियंत्रण), एम-सीएसएफ और RANKL प्लस जीएसके, या कैल औषधीय सीरम के साथ सुसंस्कृत। ऑस्टियोक्लेस्टोजेनेसिस का मूल्यांकन दिन 4 डिग्री 6 पर ट्रैप धुंधला द्वारा किया गया था। स्केल बार ] 100 डिग्री मी. (ख) ऑस्टियोक्लेस्ट की संख्या का परिमाण निर्धारित किया गया था। *पी एंड एलटी; 0.05, जीएसकेएल/जीएसकेएम/जीएसकेएच बनाम नियंत्रण के समूह। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: जीएसके ग्रेन्युल-मेडीकेटेड सीरम ऑस्टियोब्लास्टोजेनेसिस को बढ़ावा देता है। (क) सी 57बीएल/6 चूहों (4 डिग्री 6 सप्ताह पुराने) से अस्थि मेसेन्काइमल स्टेम सेल (एमएससी) को अलग-थलग कर दिया गया था और जीएसके या कैल औषधीय सीरम के साथ इलाज किया गया था। ऑस्टियोब्लास्टोजेनेसिस का आकलन करने के लिए पहले दिन 7 दिन में एएलपी दाग प्रदर्शन किया गया था। स्केल बार ] 100 डिग्री मी. (ख) अस्थिविस्फोटों की संख्या का परिमाण निर्धारित किया गया था। *पी एंड एलटी; 0.05, CAL या GSKL/GSKM/GSKH बनाम नियंत्रण के समूह. सभी परख कम से कम 3 चूहों या 3 बार के साथ दोहराया गया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

TCM एजेंटों के Granules योगों या नुस्खे के लिए आम विकल्पों में से एक बन गए हैं. GSK granules नैदानिक अनुभवों या TCM सिद्धांत के आधार पर कई हर्बल दवाओं से बना रहे हैं, और वे कम साइड इफेक्ट के साथ बेहतर उपचारात्मक प्रभाव लागू4. पानी का काढ़ा के साथ तुलना में, granules इन फायदे हैं: अच्छा स्वाद, वितरण की सुविधा, दीर्घकालिक भंडारण, मानक प्रोटोकॉल और लगातार उपचारात्मक प्रभाव, साथ ही उच्च उत्पादकता. वर्तमान में, granules TCM में सबसे अधिक इस्तेमाल किया फार्मेसी संरचनाओं में से एक हैं. हालांकि, औषधीय प्रभाव के अंतर्निहित तंत्र अभी भी शायद ही कभी अध्ययन कर रहे हैं. अंतर्निहित औषधीय तंत्र की जांच करने के लिए granules की तैयारी में महत्वपूर्ण चरणों का निर्धारण करने के लिए आवश्यक है।

पिछले दशकों में, हर्बल दवा से एक या एक से अधिक प्रतिनिधि प्रभावी घटक आमतौर पर उनके संरचनात्मक स्पष्टता के कारण आणविक परख और औषधीय परिणामों प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. टीसीएम जड़ी बूटियों5,6,7 से प्रभावी घटकों के साथ उपचारात्मक प्रभावों को समझने के लिए कई जांच की गईहै. हालांकि, यह अभी भी नकल करने के लिए मुश्किल है क्या जटिल वातावरण के कारण एक रोगी में क्या होगा, कई प्रभावी घटकों के साथ एक साथ काम कर रहे. इस समस्या को हल करने के लिए, granules के साथ जांच औषधीय प्रक्रियाओं का पता लगाने और प्रभावी घटकों के साथ जांच की तुलना में आणविक अध्ययन प्रदर्शन में एक विकल्प हैं.

granules के लिए काम समाधान की तैयारी चार बुनियादी कदम शामिल हैं. पहला कदम विघटन है। ग्रैन्यूल्स आमतौर पर आगे की जांच से पहले भंग करने के लिए भंग करने के लिए सरगर्मी के बाद नमकीन में मिश्रित कर रहे हैं। मात्रा और granules की संपत्ति समय और विघटन की प्रक्रिया के दौरान granules की स्थिरता को प्रभावित करता है. विघटन के समय और स्थिरता में भिन्नता जड़ी बूटियों पर निर्भर करती है, क्योंकि उनकी भौतिक, रासायनिक और औषधीय विशेषताओं17. उचित मिलाते हुए और उच्च तापमान आमतौर पर बढ़ावा देने और granules के पूर्ण विघटन सुनिश्चित करते हैं। अगले कदम एकाग्रता है. पशुओं के लिए gavage प्रशासन की उचित मात्रा ध्यान से माना जाता है और काम कर समाधान की मात्रा से निर्धारित होता है. उच्च सांद्रता पर मौखिक gavages, जैसे 10 एमएल/kg या अधिक, कई अवशोषण से संबंधित समस्याओं के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. ग्रहणी में granules के काम समाधान के तेजी से शंटिंग एक आम समस्या है. एसोफैगस में ग्रेन्युल्स के कार्य समाधान के निष्क्रिय भाटा के कारण आकांक्षा निमोनिया जैसी अन्य समस्याएं भी18पाई जाती हैं। निस्पंदन तीसरा कदम है, जो gavage सुई मात्रा में कमी करने में मदद करता है और यह हर्बल granules के साथ भरा जा रहा से रोकता है, साथ ही एड्स granules के पाचन. चौथा चरण संग्रहण है। कम तापमान पर granules के काम समाधान का भंडारण (-20 डिग्री सेल्सियस) बेहतर परिणाम की गारंटी देता है.

पशु bioequivalent खुराक की गणना करने के लिए दृष्टिकोण TCM के अभ्यास में granules के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है. शरीर का वजन (mg/kg) और प्रजातियों आमतौर पर माना जाता है. शरीर की सतह क्षेत्र (mg/m2) अक्सर गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है19 क्योंकि चयापचय दर व्यक्तिगत जानवर के आकार से संबंधित है. यह शरीर की सतह क्षेत्र और शरीर के वजन दोनों पर विचार करने के लिए सामान्य ज्ञान है, और इसलिए, Meeh-Rubner समीकरण का इस्तेमाल किया गया था, जो औषधीय अध्ययन19,20में विवो जांच में आम है.

कई प्रकार के जानवरों को दवा युक्त सीरम तैयारी के लिए चुना जाता है, जैसे खरगोश, गिनी सूअर, चूहे, और चूहे। विवो जांच में, एक ही प्रजाति को प्राथमिकता दी जाती है। चूहे का चयन किया गया क्योंकि वे न केवल चूहों की तुलना में अधिक सीरम प्रदान करते हैं बल्कि अन्य जानवरों की तुलना में विकास के मामले में चूहों के करीब भी हैं। विवो में बराबर खुराक (रैट: 7-गुना बराबर खुराक) और रोगियों के लिए नैदानिक उपयोग की भी सिफारिश की जाती है। सीरम प्रदत्त पशुओं की समतुल्य खुराक सामान्यतः विवो जांच में लागू नहीं होतीहै क्योंकि उपचारित कोशिकाएं या अंग संभावित विषाक्त प्रतिक्रियाओं का कारण बन सकते हैं। इंजेक्शन, त्वचा प्रशासन, और साँस लेना जैसे तरीके विवो प्रशासन के अनुसार आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रशासन प्रक्रियाओं रहे हैं। गाव सुई द्वारा मौखिक प्रशासन वर्तमान अध्ययन में चुना गया था. ग्रेन्युल प्रशासन आवृत्ति प्रति दिन एक बार से दो बार भिन्न होती है, और हस्तक्षेप की अवधि 3 डिग्री 14 दिन है। रक्त का अंतिम संग्रह प्राय : अंतिम प्रशासन22,23के बाद 2 ज के भीतर किया जाता है , जब रक्त में कणिकाओं की सांद्रता अपेक्षाकृत स्थिर होती है और पिछले अध्ययन24के अनुसार शिखर स्तर पर होती है .

इन विट्रो परख के लिए दवा युक्त सीरम उपयोग से पहले अभी भी विवादास्पद है. कुछ शोधकर्ताओं का मानना है कि यह अप्रत्याशित प्रतिक्रियाओं या साइड इफेक्ट में परिणाम हो सकता है, जो सीरम में कई सक्रिय घटकों की उपस्थिति के कारण परिणाम को प्रभावित, एंजाइमों सहित, हार्मोन, एंटीबॉडी, और पूरक25. हालांकि, कुछ शोधकर्ताओं का मानना है कि सक्रिय घटकों को भी निष्क्रियता प्रक्रिया26से हटाया जा सकता है. एक मध्यम जमीन तक पहुँचने के लिए, इस अध्ययन में सीरम 30 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में ऊष्मायन से पहले निष्क्रिय किया गया था। इसके अलावा, एक खाली सीरम समूह शामिल किया गया था, जिसमें नमकीन इलाज जानवरों से सीरम का उपयोग किया जाता है, संभावित दुष्प्रभावों से बाहर शासन करने के लिए. इसलिए, दवा युक्त सीरम औषधीय तंत्र या चिकित्सीय परिणामों की जांच करने के लिए एक संभावित विधि के रूप में काम कर सकते हैं।

इसी तरह की विधियों की तुलना में, यहाँ प्रोटोकॉल निम्नलिखित लाभ है: (1) व्यापकता. दोनों इन विट्रो और विवो विधियों में एक साथ उपयोग किया जाता है और पारस्परिक रूप से औषधीय प्रभाव में एक दूसरे का समर्थन कर सकते हैं. (2) उपयुक्तता। केवल चूहों और चूहों को शामिल किया गया है क्योंकि वे बारीकी से संबंधित हैं। (3) दोहराव। दोनों चूहों और चूहों को आसानी से कम कीमत पर खरीदे जाते हैं, और तरीकों को आसानी से दोहराया जा सकता है. (4) कम लागत. OVX प्रेरित ऑस्टियोपोरोटिक माउस मॉडल आमतौर पर प्रयोग किया जाता है और विश्वसनीय27,28 और आसानी से बनाया या खरीदा जा सकता है. इसलिए, यहाँ प्रोटोकॉल हर्बल दवा के औषधीय प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अन्य तरीकों की तुलना में अधिक उपयुक्त हैं, जैसे granules.

हालांकि, GSK granules के साथ प्रोटोकॉल के लिए कई सीमाएँ हैं। सबसे पहले, तीन खुराकों प्रशासित किया गया, हालांकि granules vivo जांच में के लिए कोई महत्वपूर्ण खुराक पर निर्भर प्रवृत्ति से पता चला. कारण हो सकता है कि पशु अध्ययन के लिए खुराकों संवेदनशील नहीं हैं और हस्तक्षेप समय पर्याप्त रूप से लंबे समय नहीं है, जो आगे परीक्षण की आवश्यकता है. इसके बाद, इन विट्रो समानांतर जांच के लिए हस्तक्षेप की लंबी अवधि की आवश्यकता होती है। दवा युक्त सीरम, हालांकि निष्क्रिय, लंबे समय तक हस्तक्षेप के बाद साइड इफेक्ट का कारण बन सकता है। तीसरा, काम समाधान का केवल एक खंड पशु प्रशासन, जो भविष्य के अध्ययन में संशोधित किया जा सकता है के लिए प्रयोग किया जाता है. अंत में, पशु प्रजातियों दवा युक्त सीरम और प्रशासन दिनचर्या की तैयारी के लिए चुना बदला जा सकता है और आगे के अध्ययन में परीक्षण किया जाएगा.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस अध्ययन चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81804116, 81673991, 81770107, 81603643, और 81330085) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, अभिनव टीम के लिए कार्यक्रम, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय चीन के (2015RA4002 WYJ), कार्यक्रम के लिए अभिनव टीम, चीन के शिक्षा मंत्रालय (IRT1270 WYJ करने के लिए), शंघाई TCM जीर्ण रोग के चिकित्सा केंद्र (2017-01010 WYJ करने के लिए), तीन साल की कार्रवाई पारंपरिक चीनी चिकित्सा योजना के विकास में तेजी लाने के लिए (YY(2018-2020)-CCCX-3003 WYJ करने के लिए, और राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान विकास परियोजनाएं (2018YFC1704302)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-MEM Hyclone
laboratories		 SH30265.018 For cell culture
β-Glycerophosphate Sigma G5422 Osteoblastogenesis
Caltrate (CAL) Wyeth L96625 Animal interventation
C57BL/6 mice SLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		 Random Ainimal preparation
Dexamethsome Sigma D4902
Dimethyl sulfoxide Sigma D2438 Cell frozen
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) Sangon Biotech 60-00-4 Samples treatmnet
Fetal bovine serum Gibco FL-24562 For cell culture
Gushukang granules kangcheng companyin china Z20003255 Herbal prescription
Light microscope Olympus BX50 Olympus BX50 Images for osteoclastogenesis
L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate Sigma A8960-5G Osteoblastogenesis
Microscope Leica DMI300B Osteocast and osteoblast imagine
M-CSF Peprotech AF-300-25-10 Osteoclastogenesis
Μicro-CT Scanco
Medical AG		 μCT80 radiograph microtomograph Bone Structural analsysis
RANKL Peprotech 11682-HNCHF Osteoclastogenesis
Sprague Dawley SLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		 Random Blood serum collection
Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit Sigma-Aldrich 387A-1KT TRAP staining

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References

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