Summary
الإخصاب في المختبر هو تقنية شائعة الاستخدام مع مجموعة متنوعة من الكائنات الحية النموذجية للحفاظ على مجموعات المختبرات وإنتاج الأجنة المتزامنة للتطبيقات النهائية. هنا، نقدم بروتوكول اطبق هذه التقنية لمختلف مجموعات الأسماك المكسيكية رباعي، Astyanax mexicanus.
Abstract
Astyanax mexicanus آخذ في الظهور ككائن حي نموذجي لمجموعة متنوعة من مجالات البحث في العلوم البيولوجية. جزء من النجاح أخيرة من هذا [تلّوست] سمكة نوع أنّ يملك هو يملك [إنترفيتيل] كهف و [ريفر-رلأيشن] مجموعة. وهذا يمكّن من رسم الخرائط الجينية للصفات القابلة للوراثة التي تم إصلاحها أثناء التكيف مع البيئات المختلفة لهذه التجمعات السكانية. في حين يمكن الحفاظ على هذا النوع وتربيته في المختبر، فإنه من الصعب على حد سواء الحصول على الأجنة خلال النهار وخلق الأجنة الهجينة بين سلالات. وقد استخدم الإخصاب في المختبر (IVF) مع مجموعة متنوعة من الكائنات الحية النموذجية المختلفة لتربية الحيوانات بنجاح وبشكل متكرر في المختبر. في هذا البروتوكول، نبين كيف، من خلال التأقلم مع A. mexicanus إلى دورات الضوء المختلفة إلى جانب التغيرات في درجة حرارة المياه، يمكننا تحويل دورات تربية إلى وقت مختار من اليوم. في وقت لاحق، نعرض كيفية تحديد الأسماك الأبوية المناسبة، وجمع الجيمات صحية من الذكور والإناث، وإنتاج ذرية قابلة للحياة باستخدام التلقيح الاصطناعي. وهذا يمكّن الإجراءات ذات الصلة مثل حقن المنشآت الوراثية أو تحليل النمو من أن تحدث خلال ساعات العمل العادية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية لخلق هجين بين الكهوف والسكان الذين يعيشون على السطح، وبالتالي تمكين دراسة الأساس الوراثي للتكيفات الفينوتية إلى بيئات مختلفة.
Introduction
في السنوات الأخيرة، أصبحت Astyanax mexicanus كائن حي نموذجي في مجالات مختلفة مثل البيولوجياالتنموية، والبيولوجيا التطورية، والبيولوجيا السلوكية، وعلم وظائف الأعضاء 1،2،3،4 . تفرد هذا النظام يأتي من هذا النوع وجود العديد من morphotypes التي تكيفت مع بيئات مختلفة جدا. يعيش النمط المورفي للمسكن السطحي في الأنهار حيث يوجد تنوع بيولوجي كبير والكثير من المصادر الغذائية للأسماك. وعلى النقيض من ذلك، فإن أنواع الكهوف من A. mexicanus، وسمك الكهف ، تعيش في الكهوف حيث التنوع البيولوجي ، ومصادر الغذاء ، والأكسجين تتضاءل بشكل كبير1. أسماك الكهف تختلف عن الأسماك السطحية في مجموعة متنوعة من الأنماط الظاهرية مثل غياب العينينوالتصبغ، ومقاومة الأنسولين، والقدرة على تخزين الدهون 2،3،4. ومع ذلك، فإن الأسماك السطحية وأسماك الكهف لا تزال تنتمي إلى نفس النوع، وبالتالي فهي التداخلية.
لكل من المورفوتاي، تم تحديد مجموعة من الشروط للسماحبالصيانة الروتينية والتكاثر في ظل الظروف المختبرية 5،6. ومع ذلك، لا تزال التعديلات الوراثية، والدراسات التنموية الجنينية السليمة، وخلق الهجينة تشكل تحديا لعدة أسباب. A. المكسيكية تفرخ في المقام الأول خلال ساعات الليل وهو أمر غير مريح للتجارب اللاحقة على المراحل الجنينية المبكرة مثل حقن المنشآت الوراثية أو رصد عمليات النمو الجنيني المبكر. وبالإضافة إلى ذلك، جيل من الهجينة السطحية والكهف هو التحدي باستخدام التفريخ الطبيعي، منذ morphotypes الكهف لديها إيقاع circadian تغيير7 التي تؤثر في نهاية المطاف على إنتاج البويضة قابلة للحياة. وقد تم وصف إجراءات التلقيح الاصطناعي الناجحة، ولكن الغازية، لأنواع أخرى من Astyanax، حيث تم إعداد إنتاج الجاميت والسلوك التفريخ باستخدام الحقن الهرمونية8،9. وقد تم وصف إجراءات التلقيح الاصطناعي أقل الغازية (أي الحصول على gametes من التفريخ اليدوي دون حقن الاستعدادات الهرمونية) ولكن لا تنظر في الاختلافات في دورة التفريخ بين الكهف والأنماط المورفولوجية السطحية من A. mexicanus 6.
ويمكن بسهولة تعديل الكائنات الحية النموذجية الأخرى للأسماك، مثل سمك الحمار الوحشي، ودراستها وراثيا على المستوى الجنيني لأن العقبات المذكورة أعلاه قد تم حلها بنجاح. وقد دفع تنفيذ تقنيات التربية الموحدة، والإخصاب في المختبر، والحفاظ على الحيوانات المنوية بالتبريد جميعها سمك الحمار الوحشي إلى الأمام وعزز استخدام النموذج في العلوم البيولوجية10. ولذلك، فإن توسيع نطاق هذه التقنيات إلى A. mexicanus سيزيد من تعزيزها كنظام نموذجي.
هنا، نقدم بروتوكول مفصل للإخصاب خارج الرحم من شأنها أن تساعد على جعل A. mexicanus أكثر سهولة. وسوف نقدم إعداد تربية التي تمكن من تحويل دورات الضوء من الأسماك من النهار إلى الليل بحيث يمكن الحصول على البويضة قابلة للحياة خلال ساعات النهار دون حقن المستحضرات الهرمونية. ثم نقدم وصفا مفصلا لكيفية الحصول على ova وmilt المستخدمة في التلقيح الاصطناعي. وستمكن هذه الطريقة من إنتاج الأجنة خلال ساعات العمل العادية وتجعل المزيد من التطبيقات النهائية أكثر جدوى مقارنة باستخدام الأجنة من التفريخ الطبيعي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) التابعة لمعهد أبراج للبحوث الطبية.
1. ضوء دورة التلاعب
- إنشاء خزانات الأسماك داخل غير شفاف، مغلقة بالكامل (حماية الضوء)، وتدفق منخلال نظام تربية الأحياء المائية التي تحتوي على صفوف متعددة من الدبابات (الشكل 1).
ملاحظة: يستخدم نظام التدفق من خلال كما هو موضح في الشكل 1 مياه النظام لطرد النفايات من خلال الأنابيب الخلفية من كل خزان ويتدفق إلى مستنقع يفرغ في استنزاف صحي. وفي هذه التجربة، استخدم سعر صرف المياه غالون واحد (الولايات المتحدة) في الساعة من خلال باعث بالتنقيط. - الحفاظ على درجة حرارة كل خزان مع عنصر التدفئة المستقلة التي تستخدم لتغيير درجة الحرارة يدويا أثناء عملية فتيلة.
- قم بإعداد صفوف فردية بطريقة لتمكين فترات ضوئية منفصلة في كل منها. تثبيت الأبواب على كل صف التي يمكن إغلاقها لمنع الضوء من الدخول أو الهروب.
ملاحظة: يمكن تمكين وحدة التحكم التلقائية معالجة كافة الفترات الضوئية مع أقل اضطراب في الأسماك. - جهز الحامل بضوء عمل أحمر وستائر تعتيم للوصول خلال ساعات الظلام.
2. ضبط photoperiod وفتيلة الأسماك لجمع gamete
- إزالة الأسماك المطلوبة(الشكل 2أ)من رفوف النظام العام ووضعها في رفوف تربية للسماح لتعديل الفترة الضوئية 14 يوما قبل فتيلة.
ملاحظة: هذا يسمح للأسماك للتأقلم مع بيئة جديدة. - الحفاظ على الأسماك في 22.8 درجة مئوية (73 درجة فهرنهايت) خلال هذه الفترة باستخدام نظام التدفئة المائية المثبتة. والفترة الضوئية العادية هي من الساعة 00/6 إلى الساعة 00/20، ومن الساعة 00/20 إلى الساعة 00/6 في الظلام. بالنسبة لرف دورة الضوء، قم بتحويل الفترة الضوئية إلى الساعة 10 مساءً إلى الساعة 12 ظهراً وضوء الساعة 12 ظهراً إلى الساعة 10 مساءً في الظلام عن طريق ضبط جهاز ضبط الساعة الذي يقوي الضوء داخل الرف.
ملاحظة: يتم إيواء الذكور والإناث في نفس الخزان للسماح لسلوكيات فتيلة الطبيعية أن يحدث. في حين أن التفريخ قد يحدث في الخزان، لا يزال يمكن استخدام الأسماك للإخصاب في المختبر منذ يتم الإفراج عن اللجام في مراحل11. - وبمجرد أن يتم التأقلم مع الأسماك، ابدأ في تحضير الحيوانات لتفرخ5 على النحو المبين في الخطوات 2-3-1 إلى 2-3-5.
ملاحظة: يستغرق هذا الإجراء ستة أيام في المجموع. خلال هذا الوقت، تغيير درجة الحرارة إلى رئيس إنتاج البويضة باستخدام نظام التدفئة المائية المثبتة. باستخدام سخانات المائية 50W (انظر جدولالمواد)، تعيين سخان مباشرة إلى درجة الحرارة (مقياس على سخان هو في فهرنهايت) نظرا في البروتوكول في كل خطوة. اعتمادا على حجم الخزان ومعدل التدفق من خلال المياه، قد يختلف وقت تعديل درجة الحرارة. في هذه التجربة، تم تعديل درجة الحرارة عند الظهر والمساواة في درجة الحرارة استغرق أكثر من 18 ساعة المقبل.- في اليوم الأول، ارفع درجة الحرارة من 22.8 درجة مئوية (73 درجة فهرنهايت) إلى 24.4 درجة مئوية (76 درجة فهرنهايت).
- في اليوم 2، رفع درجة الحرارة من 24.4 درجة مئوية (76 درجة فهرنهايت) إلى 26.1 درجة مئوية (79 درجة فهرنهايت).
- في اليوم 3 و 4، والحفاظ على درجة الحرارة عند 26.1 درجة مئوية (79 درجة فهرنهايت). الأسماك ستكون جاهزة لتفرخ خلال النهار ويمكن إجراء التلقيح الاصطناعي.
ملاحظة: اعتمادا على الأسماك الفردية، يمكن للإناث تفرخ في اليوم 3 و / أو اليوم 4. نوصي بمحاولة الحصول على أوفا في اليوم 3 و / أو اليوم 4 اعتمادا على نجاح جمع ova. - في اليوم 5، خفض درجة الحرارة من 26.1 درجة مئوية (79 درجة فهرنهايت) إلى 24.4 درجة مئوية (76 درجة فهرنهايت).
- في اليوم 6، خفض درجة الحرارة من 24.4 درجة مئوية (76 درجة فهرنهايت) إلى 22.8 درجة مئوية (73 درجة فهرنهايت).
ملاحظة: توفير فجوة 7 أيام قبل تكرار دورة درجة الحرارة هذه. فمن المستحسن الاستمرار في الحفاظ على الأسماك في هذه الفترة الضوئية لأن هذا سوف يقلل من الوقت الإجمالي الذي تحتاجه الأسماك للتكيف مع هذه الدورة الخفيفة تحول.
3. جمع الجيمت الإناث
- ابدأ بإدخال مناديل مبللة في غطاء طبق بيتري وإغلاق الطبق لإنشاء غرفة رطبة ومنع البويضة من الجفاف أثناء عملية الجمع.
- المقبل اختيار أنثى لجمع. الأسماك الجاذبة مع البطن كبيرة، جاحظ من المرجح أن يكون الخيار الأفضل لهذا الإجراء (الشكل2a).
ملاحظة: للتمييز بين الذكور والإناث من الكبار A. mexicanus، تم استخدام طريقة الكرة القطنية12. - تعطيل أنثى باستخدام الماء المبرد ووضعها في موقف supine في حامل الحيوان الإسفنج مبللة. القيام بذلك عن طريق وضع الأسماك في 4 درجة مئوية نظام المياه لمدة 30 ق على الأقل أو حتى يتم تعطيل الأسماك (أي، فقدان حركة الخياشيم، انظر روس وروس13 لمزيد من التفاصيل).
ملاحظة: العمل بسرعة ومحاولة تجنب ارتفاع درجة حرارة الأسماك حتى يتم الانتهاء من الإجراء. وقد يشمل ذلك غمس أطراف الأصابع المحبوبة بشكل دوري في الماء البارد أو تقديم التخدير التكميلي. ويمكن أيضا استخدام أساليب التخدير الأخرى (على سبيل المثال، MS-22213). بموجب المبادئ التوجيهية للمعهد الدولي للبحوث الطبية، يعتبر الجمع اليدوي للأوا إجراء غير جراحي، والذي لا يتطلب تخديرًا كاملًا (على سبيل المثال، من خلال MS-222). - مرة واحدة في وضع، وصمة عار الجانب البطني من الأسماك مع مسح الأنسجة الحساسة كما الاتصال بالماء سوف يسبب البويضة لتنشيط.
- عقد الأنثى بين الإبهام والسبابة. الضغط بلطف ضد الجانبين الجانبي من تجويف coelomic في اتجاه فتح الجهاز البولي التناسلي في حين المتداول الأصابع قليلا. جمع البويضة أعرب باستخدام ملعقة المتاح.
- نقل هذه البويضة إلى طبق بيتري المرطبة.
ملاحظة: قد يتم دمج العديد من براثن ova في نفس الطبق إذا لم تكن هناك حاجة إلى بيانات النسب محددة. يمكن تخزين البويضة في 24 درجة مئوية وهي الأفضل عند استخدامها للإخصاب خارج الرحم في غضون 30-60 دقيقة بعد جمعها. - بعد جمع، إعادة بلطف الأسماك إلى خزان الانتعاش مليئة المياه النظام.
ملاحظة: ضع السمك مرة أخرى في خزان مجلس الوزراء الظلام لجمع البويضة في المستقبل عند الضرورة.
4. جمع gamete الذكور
- اختيار ذكر لجمع.
ملاحظة: لا توجد علامات مرئية ظاهرياً من نوعية gamete الذكور. ومع ذلك، يجب أن تظهر الأسماك صحية في المظهر قبل استخدامها في هذا الإجراء. للتمييز بين الذكور والإناث من الكبار A. mexicanus، تم استخدام طريقة الكرة القطنية12. - تعطيل الذكور باستخدام الماء المبرد ووضعه في موقف supine في حامل الحيوان الإسفنج مبللة. تعطيل عن طريق وضع الأسماك في 4 درجة مئوية نظام المياه لمدة 30 ثانية على الأقل أو حتى يتم تعطيل الأسماك (أي، فقدان حركة الخياشيم، انظر روس وروس13 لمزيد من التفاصيل).
ملاحظة: العمل بسرعة ومحاولة تجنب ارتفاع درجة حرارة الأسماك حتى يتم الانتهاء من الإجراء. وقد يشمل ذلك غمس أطراف الأصابع المحبوبة بشكل دوري في الماء البارد أو تقديم التخدير التكميلي. يمكن استخدام طرق التخدير الأخرى (على سبيل المثال، MS-22213)هنا أيضًا. بموجب المبادئ التوجيهية IACUC من معهد أبراج للبحوث الطبية، ويعتبر الجمع اليدوي للنمنوة إجراء غير الغازية، والتي لا تتطلب التخدير الكامل (على سبيل المثال، من خلال MS-222). - لطخة الجانب البطني من الأسماك مع مسح الأنسجة الحساسة كما الاتصال بالماء سوف تنشيط ميلت.
- وضع بلطف نهاية أنبوب الشعرية في افتتاح الجهاز البولي التناسلي.
- طرد milt عن طريق تطبيق ضغط لطيف على جانبي الأسماك مع الإبهام والسبابة. بدء البعد إلى الخياشيم، والانتقال نحو فتح الجهاز البولي التناسلي.
- جمع milt في نهاية أنبوب الشعرية. قد يكون الشفط اللطيف ضروريًا باستخدام أنبوب الأسبرين. تجنب أي براز التي قد تكون طرد مع ميلت.
- الاستغناء عن milt في أنبوب الطرد المركزي فارغة 1.5 مل وتخفيف مع ضعف حجم الحيوانات المنوية الموسع E400 (انظر جدولالمواد). حافظ على الثلج
ملاحظة: Milt من الذكور متعددة قد يتم تجميع معاً إذا لم تكن هناك حاجة إلى بيانات النسب محددة. ويمكن استخدام هذه الخطوة لتمديد وقت عمل milt لعدة ساعات، ولكن ها هو غير مطلوب للإخصاب الفوري. - بعد جمع، إعادة بلطف الأسماك إلى خزان الانتعاش مليئة المياه النظام.
ملاحظة: وضع الأسماك مرة أخرى في خزان مجلس الوزراء الظلام لجمع الحيوانات المنوية في المستقبل عند الضرورة.
5. الإخصاب في المختبر
- باستخدام ماصة جديدة لكل سهم، مزيج الحيوانات المنوية عن طريق الأنابيب و / أو تحريك جانب الأنبوب قبل تخصيب الحيوانات المنوية في milt يمكن أن يستقر في الحل E400 مع مرور الوقت.
- الاستغناء عن milt أو تمديد milt الحل في البويضة التي تم جمعها حديثا.
- بسرعة إضافة 1 مل من مياه النظام إلى مخلب لتنشيط الحيوانات المنوية والبيض للإخصاب. تجنب خلط أو تحريك محتويات الطبق والسماح 2 دقيقة للإخصاب أن يحدث.
ملاحظة: خلط وإثارة يقلل إلى حد كبير من معدلات الإخصاب، وبالتالي، ينبغيتجنب14. - إضافة E2 الوسائط الجنين لملء طبق 2/3rd كامل.
ملاحظة: اعتمادا على الإجراء اللاحق، يمكن استخدام الأجنة إما على الفور (على سبيل المثال، لحقن المنشآت الوراثية كما هو موضح قبل15)أو يمكن احتضان الأجنة في E2 الجنين وسائل الإعلام في 23 درجة مئوية حتى تصل إلى 5 ديسيبل. عند هذه النقطة نقل الأجنة إلى نظام الإسكان الرئيسي إعادة تدوير باستخدام مياه النظام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويستند البروتوكول المعروض هنا أساسا إلى بروتوكول سبق نشره6. ومع ذلك، منذ A. المكسيكية تفرخ خلال ساعات الليل، قمنا بتصميم رف الإسكان لتربية الأسماك التي يمكن أن تغير الفترة الضوئية مستقلة عن ساعات العمل (الشكل1). يتم تغيير دورة ضوء الأسماك داخل نظام تربية الأحياء المائية المغلقةبالكامل، وتدفق من خلال تحتوي على ثلاثة صفوف من الدبابات (الشكل 1). كل خزان يحتوي على عنصر التدفئة المستقلة التي تستخدم لزيادة درجة الحرارة يدويا أثناء عملية فتيلة. يمكن وضع الرفوف الفردية على فترات ضوئية منفصلة ويمكن إغلاقها لمنع الضوء من الدخول أو الهروب. يمكن التلاعب بجميع الفترات الضوئية عن طريق وحدة تحكم آلية المتمركزة على جانب رف دورة الضوء. وللوصول خلال ساعات الظلام، تم تجهيز الحامل بضوء عمل أحمر وستائر معتمة. A. المكسيكية تفرخ بعد زيادة في درجة الحرارة من 23 - 26 درجة مئوية مع زيادة قدرها 1.5 درجة مئوية في اليوم16. لتحقيق ذلك في خزانات الظلام لدينا، استخدمنا سخانات حوض السمكالغاطسة في كل خزان (الشكل 1).
العامل الرئيسي لإجراء التلقيح الاصطناعي الناجح في A. mexicanus هو نوعية البويضة التي تم جمعها. Gravid، والأسماك الإناث مع البطن كبيرة، جاحظ هي الأكثر احتمالا لإطلاق البويضة قابلة للحياة، والتي تبدو واضحة وحتى في المظهر (الشكل2a-d). إضافة milt التي تم جمعها إلى مثل هذه البويضة النتائج في تطوير الأجنة المخصبة عادة في غضون 20-30 دقيقة (الشكل2ه ). سوف تصبح الأجنة المخصبة القابلة للحياة أكثر شفافية قليلا قبل دخول مرحلة الخلية واحدة من دورة النمو في حين أن البويضة غير المخصبة سوف تظهر أكثر تفاوتا وغير شفاف (الشكل2هـ). يتم عقد الأجنة الناتجة في أطباق بيتري في ZIRC E2 الوسائط الجنينية وحضانة في 23 درجة مئوية في دورة ضوء / الظلام 14/10. ثم يتم نقل الأجنة إلى نظام الإسكان الرئيسي لإعادة الدوران في 5 أيام بعد الإخصاب لتربية.
ولإثبات أهمية هذه التقنية، نبين كيف يمكن أن يساعد النمط الظاهري للهجين لسمات محددة مثل حجم العين وتصبغ الجسم في فك رموز أساسها الوراثي. من الواضح أن أسماك الكهف تختلف عن الأسماك السطحية في حجم العين وتصبغ الجسم. لفهم الأساس الوراثي لهذه الصفات، عبرنا السطح وأسماك الكهف (F0) وولدت الهجين F1 و F2 السكانباستخدام التلقيح الاصطناعي لمراقبة الاختلاف phenotypic التي تم الحصول عليها (الشكل 3). حجم العينين أصغر في جيل F1 مما يشير إلى أن وجود العينينهو سمة مهيمنة جزئيا (الشكل 3). في الكهوف السطحية F2 الهجينة، ونحن الحصول على مجموعة واسعة من أحجام العين، مما يدل على أن هناكمواقع متعددة التي تتحكم في حجم العين في A. mexicanus، مما يجعلها سمة كمية (الشكل 3). مثال آخر هو التصبغ. ملاحظة الهجين F1 من سطح وجراد الكهف، ويمكن استنتاج أن تصبغ الجسم هو سمةمهيمنة كما يتم صبغ الأسماك تماما (الشكل 3). في جيل F2، يشير التباين في تصبغ الجسم مرة أخرى نحو سمة كمية. ويمكن أن يكشف الجمع بين هذه البيانات الفينوتية وبيانات التسلسل عن الموقع الجيني الأساسي المسؤول عن هذه الأنماط الظاهرية. هذه التجمعات F2 هي مورد جيد لفهم الأساس الوراثي لمختلف الصفات وقد استخدمت هذه التجمعات سابقا لدراسة هذه الصفات17،18،19. ويمكن لتقنية التلقيح الاصطناعي الموحدة تبسيط توليد الهجينة إلى حد كبير، مما يتيح رسم الخرائط الوراثية للمكان الذي يسيطر على هذه الصفات ويساعدنا على فهم كيف أن بعض الأنماط الظاهرية غير مواتية في بعض الموائل والتكيف في موائل أخرى.
الشكل 1 تصميم الرفوف لتحويل دورات اليوم / الليل من: أ. مكسيكانوس. (أ) الإعداد العام لهذا النظام الرف يسمح التلاعب الفترة الضوئية، وإعطاء محاكاة للوقت الليلي خلال ساعات النهار عندما يتم إغلاق الأبواب، ويتم إيقاف تشغيل أضواء الجرف. (ب) يتم تحقيق فتيلة الأسماك لتحفيز نضج البويضة باستخدام سخانات غاطسة (انظر جدولالمواد) المثبتة في خزانات فردية التي يمكن تعديلها بشكل منفصل (السهام الحمراء). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 : أمثلة على الإناث المناسبة لجمع البويضة والتوضيح التمثيلي للأوا قابلة للحياة وغير قابلة للحياة. (أ) Gravid، والأسماك الإناث مع البطن كبيرة، جاحظ هي أكثر ملاءمة لجمع البويضة اليدوية من (ب)الإناث مع البطن على شكل مبسط. (ج) يمكن تحديد البويضة القابلة للحياة (أي البويضة المنتجة للأجنة القابلة للحياة عند إخصابها) من خلال مظهرها الواضح، حتى، في حين أن البويضة غير القابلة للحياة (أي، البويضة التي لا تنتج أجنة قابلة للحياة عند إخصابها)، كما هو مبين في (د)، لديها غائم، متفاوت مظهر. (هـ)بعد الإخصاب الناجح، تصبح الأجنة القابلة للحياة أكثر شفافية وتدخل مرحلة الخلية الواحدة في حين أن البويضة غير المخصبة (السهام الحمراء) سوف تتحلل ببطء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 التحليل الجيني لحجم العين وسمات تصبغ الجسم: النسب تظهر صور الأسماك السطحية الأبوية (F0) (أعلى اليسار) وأسماك الكهف (أعلى اليمين)، الهجينة F1 (الصف الثاني) والهجينة F2. الأسماك F1 لديها حجم العين المتوسطة وصبغت تماما في حين أن الأسماك F2 تظهر تباين واسع في الصفات المورفولوجية اثنين: حجم العين والتصبغ. ويمكن الوصول إلى جميع البيانات الأصلية التي يستند إليها هذا الرقم من مستودع البيانات الأصلية في Stowers في http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1365. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في حين أن التلقيح الاصطناعي هو طريقة موحدة للعديد من الكائنات الحية النموذجية المختلفة مثل حمار وحشي، والبروتوكولات القائمة لA. mexicanus لا تأخذ في الاعتبار أن هذا النوع يفرخ بشكل طبيعي خلال ساعات الليل6. وبالنظر إلى أن أسماك الكهف والأسماك السطحية تختلف اختلافا جذريا في إيقاعاتها circadian، ودورة النضج من البويضة يختلف أيضا بين الكهف والكائنات المورفولوجية السطحية. في حين أن درجات الحرارة التدريج والأوقات للسطح A. المكسيكية تدرس جيدا12، يمكن أن تختلف أسماك الكهف في سلوكها التفريخ ودورة النضج. الطرق التقليدية للإنتاج الهجين هي لذلك صعبة جدا وغير مؤكد بسبب فقدان إيقاع circadian في morphotype كهف من A. mexicanus7, مما يؤدي إلى تغيير أوقات التفريخ من هذه الأسماك. من خلال تغيير فترة التصوير، يمكننا توفير الأجنة الهجينة محددة الوقت دون الحاجة إلى الاعتماد على أحداث التفريخ الطبيعية النادرة بين نوعين من المورفو. كما يمنع الحفاظ على فصل الأسماك الكهفية والسطحية ظهور الأسطح العدوانية من التأثير السلبي على التكاثر.
توجد بعض القيود مع هذه الطريقة مثل الاختلافات في جودة البويضة. تحديد أنثى (سطح أو سمك الكهف) مع البويضة الناضجة ليست تافهة ويتطلب ملاحظات دقيقة من سلوك الأسماك. عموما، الإناث الجاذبية على استعداد للتفريخ لديها أكبر البطن وسوف فرشاة مرارا وتكرارا ضد سطح خزان القاع أو الجنين فخ جمع20.
لاحظنا أن نوعية الحيوانات المنوية متسقة طوال اليوم / دورة الليل. الخطوة الحاسمة لنجاح التلقيح الاصطناعي (ناجحة من حيث توليد الأجنة المخصبة) هو الحصول على نوعية جيدة، البويضة قابلة للحياة. ولذلك، فمن المهم للغاية لجمع البويضة من الأسماك التي هي على وشك أن تفرخ بشكل طبيعي (الشكل2أ). مرة واحدة يتم جمع البويضة، ويمكن ملاحظتها تحت المجهر تشريح لفحص الجودة. جمع البويضة قابلة للحياة خلال الليل، ومع ذلك، غير مريح وتحديا للباحث. الإعداد الذي نقدم هنا يسمح لتحويل دورة النضج من البويضة، لذلك يمكن استخدام التلقيح الاصطناعي لتوليد الأجنة متزامنة لتطبيق المصب خلال ساعات العمل العادية.
مع تقدم الحفظ بالتبريد من milt (على سبيل المثال، كما هو موضح في حمار وحشي21)،سوف يصبح التلقيح الاصطناعي أداة قوية نحو إنشاء وصيانة خطوط وراثية للنظام النموذجي الناشئ A. mexicanus. جنبا إلى جنب مع طرق التعديل الوراثي15 وضربة قاضية على أساس مورفبولينو17، وسوف توفر هذه الإجراءات منصة منهجية لدراسة الأسس الوراثية والتنموية للتكيف مع مختلف الموائل في أ. المكسيكية.
وباختصار، فإن البروتوكول المعروض هنا سيمكن من إنتاج أجنة متزامنة من A. mexicanus لتطبيقات المصب الأخرى، مثل حقن المنشآت الوراثية أو دراسة الأنماط الظاهرية الجنينية المبكرة. والقوة الرئيسية للبروتوكول هي أنه يسمح بإنتاج فعال للهجين الكهفي السطحي الذي يمكن استخدامه لرسم خريطة جينية للاختلافات الفينوتية بين الأسماك السطحية وأسماك الكهف من خلال تحليل QTL (موضع السمات الكمية). إذا ما أخذنا معاً، فإن الحصول على البويضة القابلة للحياة أثناء النهار من أجل التلقيح الاصطناعي هي تقنية قوية ستكون مفيدة لمجموعة متنوعة من الدراسات المستقبلية في مختلف مجالات العلوم البيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ويود المؤلفان أن يشكرا فيليب نوغيرا وكيمبرلي بلاند على دعمهما لإنتاج الفيديو. ويود المؤلفان أيضاً أن يعترفا بفريق الألعاب المائية بأكمله التابع لمعهد أبراج تربية الحيوانات. وقد تم دعم هذا العمل بتمويل مؤسسي من مكتب دعم التنمية والموارد الطبيعية. وقد حظيت المؤسسة بدعم مؤسسة إدوارد مالينكرودت وشركة JDRF. وكان البرنامج الوطني مدعوما بمنحة من شركة Forschungsgemeinschaft الألمانية (PE 2807/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tube | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm Petri Dishes | VWR International | #25384-302 | |
| Aspirator Tube | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes | Drummond | #2-000-001 | |
| Dispolable Spatulas | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W Aquatic Heaters | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pipette Tips | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 incubator | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| Sperm Extender E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ?C for up to 6 months. |
||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| System Water | Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm. Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %) | ||
| Tissue Wipes | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks. |
References
- Jeffery, W. R.
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5, e1000326 (2009).
- Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555, 647-651 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 297-304 (2018).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through Natural Spawning. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Borowsky, R. In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
- Sato, Y., Sampaio, E. V., Fenerich-Verani, N., Verani, J. R. Reproductive biology and induced breeding of two Characidae species (Osteichthyes, Characiformes) from the São Francisco River basin, Minas Gerais, Brazil. Revista Brasileira Zoology. 23 (1), 267-273 (2006).
- Yasui, G. S., et al. Improvement of gamete quality and its short-term storage: an approach for biotechnology in laboratory fish. Animal. 9 (3), 464-470 (2015).
- Westerfield, M. The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- Simon, V., Hyacinthe, C., Retaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), e0212591 (2019).
- Borowsky, R. Determining the Sex of Adult Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Ross, L. G., Ross, B. Anaesthetic and Sedative Techniques for Aquatic Animals. , 3rd edn, Wiley-Blackwell. (2008).
- Matthews, J. L., et al. Changes to Extender, Cryoprotective Medium, and In Vitro Fertilization Improve Zebrafish Sperm Cryopreservation. Zebrafish. 15 (3), 279-290 (2018).
- Stahl, B. A., et al. Stable transgenesis in Astyanax mexicanus using the Tol2 transposase system. Developmental Dynamics. , 1-9 (2019).
- Elipot, Y., Legendre, L., Pere, S., Sohm, F., Retaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11, 291-299 (2014).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5 (1), e1000326 (2009).
- Jeffery, W. R. Chapter 8. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
- Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17 (5), 452-454 (2007).
- Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8, 155-165 (2011).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiment. (29), (2009).
