Summary
La fécondation in vitro est une technique couramment utilisée avec une variété d'organismes modèles pour maintenir les populations de laboratoire et produire des embryons synchronisés pour des applications en aval. Ici, nous présentons un protocole qui met en œuvre cette technique pour différentes populations du poisson tétra mexicain, Astyanax mexicanus.
Abstract
Astyanax mexicanus est en train d'émerger comme un organisme modèle pour une variété de domaines de recherche en sciences biologiques. Une partie du succès récent de cette espèce de poisson téléostéen est qu'elle possède des populations interfertiles de caverne et de rivière. Cela permet la cartographie génétique des caractères héritables qui ont été fixés lors de l'adaptation aux différents environnements de ces populations. Bien que cette espèce puisse être maintenue et élevée en laboratoire, il est difficile à la fois d'obtenir des embryons pendant la journée et de créer des embryons hybrides entre les souches. La fécondation in vitro (FIV) a été utilisée avec une variété d'organismes modèles différents pour élever avec succès et à plusieurs reprises des animaux en laboratoire. Dans ce protocole, nous montrons comment, en acclimatant A. mexicanus à différents cycles de lumière couplés avec des changements de température de l'eau, nous pouvons déplacer les cycles de reproduction à un moment choisi de la journée. Par la suite, nous montrons comment identifier les poissons parentaux appropriés, recueillir des gamètes sains chez les mâles et les femelles, et produire une progéniture viable à l'aide de la FIV. Cela permet aux procédures connexes telles que l'injection de constructions génétiques ou l'analyse du développement de se produire pendant les heures normales de travail. En outre, cette technique peut être utilisée pour créer des hybrides entre les populations de grottes et de surface, et ainsi permettre l'étude de la base génétique des adaptations phénotypiques à différents environnements.
Introduction
Ces dernières années, Astyanax mexicanus est devenu un organisme modèle dans différents domaines tels que la biologie du développement, la biologie évolutive, la biologie comportementale, et la physiologie1,2,3,4 . L'unicité de ce système vient de cette espèce ayant plusieurs morphotypes qui se sont adaptés à des environnements très différents. Le morphotype d'habitation de surface vit dans les rivières où il y a une grande biodiversité et beaucoup de sources de nourriture pour les poissons. En revanche, les morphotypes des grottes de A. mexicanus, le poisson des cavernes, vivent dans des grottes où la biodiversité, les sources alimentaires et l'oxygène sont considérablement diminués1. Le poisson des cavernes diffère des poissons de surface dans une variété de phénotypes tels que l'absence d'yeux et de pigmentation, la résistance à l'insuline, et la capacité de stocker la graisse2,3,4. Cependant, les poissons de surface et les poissons des cavernes appartiennent toujours à la même espèce et sont donc interfertiles.
Pour les deux morphotypes, un ensemble de conditions a été défini pour permettre l'entretien et la reproduction de routine dans des conditions de laboratoire5,6. Cependant, les modifications génétiques, les études de développement embryonnaires appropriées et la création d'hybrides sont encore difficiles pour plusieurs raisons. A. mexicanus fraye principalement pendant les heures de nuit, ce qui est gênant pour les expériences ultérieures sur les premiers stades embryonnaires tels que l'injection de constructions génétiques ou la surveillance des premiers processus de développement embryonnaire. En outre, la génération d'hybrides de surface et de cavernes est difficile en utilisant le frai naturel, puisque les morphotypes de caverne ont un rythme circadien altéré7 qui affecte finalement la production des ovules viables. Des procédures de FIV réussies, mais invasives, ont été décrites pour d'autres espèces d'Astyanax, où la production de gamètes et le comportement de frai ont été amorcés à l'aide d'injections hormonales8,9. Des procédures de FIV moins invasives (c.-à-d. l'obtention de gamètes à partir de frai manuel sans l'injection de préparations hormonales) ont été décrites, mais ne tiennent pas compte des différences dans le cycle de frai entre les morphotypes de grotte et de surface de A. mexicanus 6.
D'autres organismes modèles de poissons, comme le poisson zèbre, peuvent facilement être génétiquement modifiés et étudiés à un niveau embryonnaire parce que les obstacles mentionnés ci-dessus ont été résolus avec succès. La mise en œuvre de techniques de reproduction normalisées, la fécondation in vitro et la cryoconservation des spermatozoïdes ont tous poussé le poisson zèbre vers l'avant et solidifié l'utilisation du modèle dans les sciences biologiques10. Par conséquent, l'extension de ces techniques à A. mexicanus le renforcera davantage en tant que système modèle.
Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la FIV qui aidera à rendre A. mexicanus plus accessible. Nous présenterons une configuration de reproduction qui permet de déplacer les cycles de lumière du poisson de jour en nuit afin que les ovules viables puissent être obtenus pendant les heures de jour sans injection de préparations hormonales. Nous fournissons ensuite une description détaillée de la façon d'obtenir les ovules et les milt utilisés pour la FIV. Cette méthode permettra la production d'embryons pendant les heures normales de travail et rendra d'autres applications en aval plus réalisables que l'utilisation d'embryons issus de frai naturel.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) du Stowers Institute for Medical Research.
1. Manipulation de cycle léger
- Installez des réservoirs de poissons dans un système aquacole opaque et entièrement clos (protection de la lumière), qui contient plusieurs rangées de réservoirs (figure 1).
REMARQUE : Le système d'écoulement, tel qu'il est indiqué à la figure 1, utilise l'eau du système pour rincer les déchets à travers le tuyau de support arrière de chaque réservoir et se jette dans un puisard qui se vide dans un drain sanitaire. Dans cette expérience, un taux de change de l'eau d'un gallon (US) par heure par un émetteur au goutte-à-goutte a été utilisé. - Maintenir la température de chaque réservoir avec un élément de chauffage indépendant qui est utilisé pour modifier manuellement la température pendant le processus d'amorçage.
- Configurez des lignes individuelles de manière à activer des photopériodes séparées dans chacune d'elles. Installez des portes sur chaque rangée qui peuvent être fermées pour empêcher la lumière d'entrer ou de s'échapper.
REMARQUE : Le contrôleur automatisé peut permettre la manipulation de toutes les photopériodes avec le moins de perturbation pour le poisson. - Équipez le support d'un feu de travail rouge et de rideaux occultants pour l'accès pendant les heures sombres.
2. Ajustement de la photopériode et de l'amorçage du poisson pour la collecte des gamètes
- Retirez le poisson désiré (Figure 2a) des grilles du système général et placez-le dans les grilles de reproduction pour permettre l'ajustement de la photopériode 14 jours avant l'amorçage.
REMARQUE : Cela permet aux poissons de s'acclimater à un nouvel environnement. - Maintenez le poisson à 22,8 oC (73 oF) pendant cette période à l'aide du système de chauffage aquatique installé. La photopériode normale est de 6 h à 20 h et de 20 h à 6 h. Pour le support de cycle de lumière, déplacez la photopériode de 22 h à 12 h et de 12 h à 22 h en ajustant la minuterie qui alimente la lumière à l'intérieur du support.
REMARQUE : Les mâles et les femelles sont logés dans le même réservoir pour permettre des comportements d'amorçage naturels. Bien que le frai puisse avoir lieu dans le réservoir, les poissons peuvent encore être utilisés pour la fécondation in vitro puisque les gamètes sont libérés aux étapes11. - Une fois que les poissons sont acclimatés, commencez à amorcer les animaux pour frayer5 comme décrit dans les étapes 2.3.1 à 2.3.5.
REMARQUE : Cette procédure prend six jours au total. Au cours de cette période, modifiez la température pour amorcer la production d'ovules à l'aide d'un système de chauffage aquatique installé. À l'aide des chauffe-eau aquatiques 50W (voir Tableau des matériaux),le chauffe-eau a réglé directement la température (l'échelle sur le chauffe-eau est en Fahrenheit) donnée dans le protocole à chaque étape. Selon la taille du réservoir et le débit de l'eau, le temps d'ajustement de la température peut différer. Dans cette expérience, la température a été ajustée à midi et l'équilibre de température a pris plus de 18 h.- Le jour 1, faites passer la température de 22,8 oC à 24,4 oC (76 oF).
- Le jour 2, faites passer la température de 24,4 oC à 26,1 oC (79 oF).
- Les jours 3 et 4, maintenir la température à 26,1 oC (79 oF). Les poissons seront prêts à frayer pendant la journée et la FIV peut être effectuée.
REMARQUE : Selon les poissons individuels, les femelles peuvent frayer le jour 3 et/ou le jour 4. Nous vous recommandons d'essayer d'obtenir des ovules le jour 3 et/ou le jour 4 en fonction du succès de la collection d'ovules. - Le jour 5, abaisser la température de 26,1 oC (79 oF) à 24,4 oC (76 oF).
- Le jour 6, abaisser la température de 24,4 oC (76 oF) à 22,8 oC (73 oF).
REMARQUE : Prévoir un écart de 7 jours avant de répéter ce cycle de température. Il est recommandé de continuer à garder le poisson dans cette photopériode, car cela réduira le temps global nécessaire par les poissons pour s'adapter à ce cycle de lumière décalé.
3. Collection de gamètes féminins
- Commencez par insérer une lingette de tissu humidifiée dans un couvercle de vaisselle Petri et fermer le plat pour créer une chambre humidifiée et empêcher les ovules de se dessécher pendant le processus de collecte.
- Choisissez ensuite une femelle pour la collection. Les poissons gravidés avec de grands abdomens saillants seront probablement le meilleur choix pour cette procédure (Figure 2a).
REMARQUE: Pour différencier entre les mâles et les femelles de l'adulte A. mexicanus, la méthode de la boule de coton a été utilisé12. - Immobiliser une femelle à l'aide d'eau froide et la placer en position de supine dans un porte-éponge humidifié. Pour ce faire, placez les poissons dans de l'eau du système de 4 oC pendant au moins 30 s ou jusqu'à ce que le poisson soit immobilisé (c.-à-d. perte de mouvement branchial, voir Ross et Ross13 pour plus de détails).
REMARQUE : Travaillez rapidement et essayez d'éviter de réchauffer le poisson jusqu'à ce que la procédure soit terminée. Cela peut inclure tremper périodiquement les bouts gantés des doigts dans l'eau froide ou offrir une anesthésie supplémentaire. D'autres méthodes d'anesthésie (p. ex., MS-22213) peuvent également être utilisées. En vertu des lignes directrices de l'IACUC de l'Institut Stowers de recherche médicale, la collecte manuelle des ovules est considérée comme une procédure non invasive, qui ne nécessite pas d'anesthésie complète (p. ex., par mS-222). - Une fois positionné, effacer le côté ventral du poisson avec une lingette délicate de tissu pendant que le contact avec l'eau causera les ovules pour activer.
- Tenez la femelle entre le pouce et l'index. Presser doucement contre les côtés latéraux de la cavité coelomic dans la direction de l'ouverture urogénitale tout en roulant légèrement les doigts. Recueillir les ovules exprimés à l'aide d'une spatule jetable.
- Transférer ces ovules dans le plat Petri humidifié.
REMARQUE : Plusieurs embrayages d'ovules peuvent être combinés dans le même plat si des données de filiation spécifiques ne sont pas nécessaires. Les ovules peuvent être stockés à 24 oC et sont les meilleurs lorsqu'ils sont utilisés pour la FIV dans les 30-60 minutes après la collecte. - Après la collecte, retourner délicatement les poissons dans un réservoir de récupération rempli d'eau du système.
REMARQUE : Placez le poisson de nouveau dans le réservoir foncé d'armoire pour la collection future d'ovules si nécessaire.
4. Collection de gamètes masculins
- Choisissez un mâle pour la collection.
REMARQUE : Il n'y a aucun signe visible extérieurement de la qualité masculine de gamète. Cependant, les poissons doivent apparaître en bonne santé en apparence avant utilisation dans cette procédure. Pour différencier les mâles et les femelles de l'adulte A. mexicanus, la méthode de la boule de coton a été utilisée12. - Immobiliser un mâle à l'aide d'eau froide et le placer en position de supine dans un porte-éponge humidifié. Immobiliser en plaçant le poisson dans l'eau du système de 4 oC pendant au moins 30 secondes ou jusqu'à ce que le poisson soit immobilisé (c.-à-d., perte de mouvement branchial, voir Ross et Ross13 pour plus de détails).
REMARQUE : Travaillez rapidement et essayez d'éviter de réchauffer le poisson jusqu'à ce que la procédure soit terminée. Cela peut inclure tremper périodiquement les bouts gantés des doigts dans l'eau froide ou offrir une anesthésie supplémentaire. D'autres méthodes d'anesthésie (p. ex., MS-22213) peuvent également être utilisées ici. En vertu des lignes directrices de l'IACUC de l'Institut Stowers de recherche médicale, la collecte manuelle de spermatozoïdes est considérée comme une procédure non invasive, qui ne nécessite pas d'anesthésie complète (p. ex., par mS-222). - Blot le côté ventral du poisson avec une lingette délicate de tissu pendant que le contact avec l'eau activera le milt.
- Placez délicatement l'extrémité d'un tube capillaire à l'ouverture urogénitale.
- Expulser milt en appliquant une pression douce sur les côtés du poisson avec le pouce et l'index. Commencez distal aux branchies, se déplaçant vers l'ouverture urogénitale.
- Recueillir le milt à l'extrémité d'un tube capillaire. Une aspiration douce peut être nécessaire à l'aide d'un tube aspirateur. Évitez les excréments qui peuvent être expulsés avec le milt.
- Distribuer le milt dans un tube vide de centrifugeuse de 1,5 mL et diluer avec deux fois le volume de Sperm Extender E400 (voir Tableau des matériaux). Restez sur la glace.
REMARQUE : Le Milt de plusieurs mâles peut être mis en commun si des données de filiation spécifiques ne sont pas nécessaires. Cette étape peut être utilisée pour prolonger le temps de travail du milt pendant plusieurs heures, mais elle n'est pas nécessaire pour une fécondation immédiate. - Après la collecte, retourner délicatement les poissons dans un réservoir de récupération rempli d'eau du système.
REMARQUE : Placez le poisson dans un réservoir sombre pour la collecte future des spermatozoïdes si nécessaire.
5. Fécondation in vitro
- À l'aide d'une nouvelle pipette pour chaque bouillon, mélanger le sperme par pipetting et/ou agiter le côté du tube avant de fertiliser comme sperme dans le milt peut s'installer dans la solution E400 au fil du temps.
- Distribuer la solution de milt ou de milt étendu dans les ovules fraîchement récoltés.
- Ajouter rapidement 1 ml d'eau du système à l'embrayage pour activer le sperme et les ovules pour la fécondation. Évitez de mélanger ou d'agiter le contenu du plat et laissez 2 min pour la fécondation de se produire.
REMARQUE : Le mélange et l'agitation réduisent considérablement les taux de fécondation et devraient donc être évités14. - Ajouter E2 Embryo Media pour remplir le plat 2/3rd plein.
REMARQUE : Selon la procédure subséquente, les embryons peuvent être utilisés immédiatement (p. ex., pour l'injection de constructions génétiques telles que décrites avant15ans) ou les embryons peuvent être incubés dans E2 Embryo Media à 23 oC jusqu'à ce qu'ils atteignent 5 dpf. À ce stade, transférer les embryons au système de logement principal de recirculation à l'aide de l'eau du système.
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Representative Results
Le protocole présenté ici est principalement basé sur un protocole précédemment publié6. Cependant, puisque A. mexicanus fraye pendant les heures de nuit, nous avons conçu un support de logement pour l'élevage des poissons qui peut changer la photopériode indépendamment des heures de travail (figure 1). Le cycle de lumière des poissons est modifié dans un système aquacole entièrement fermé et fluide contenant trois rangées de réservoirs (figure 1). Chaque réservoir contient un élément de chauffage indépendant qui est utilisé pour augmenter manuellement la température pendant le processus d'amorçage. Des étagères individuelles peuvent être mises sur des photopériodes séparées et peuvent être fermées pour empêcher la lumière d'entrer ou de s'échapper. Toutes les photopériodes peuvent être manipulées au moyen d'un contrôleur automatisé positionné sur le côté du support de cycle lumineux. Pour l'accès pendant les heures sombres, le rack est équipé d'un feu de travail rouge et rideaux occultants. A. mexicanus fraye après une augmentation de la température de 23 à 26 oC avec une augmentation de 1,5 oC par jour16. Pour ce faire, dans nos armoires sombres, nous avons utilisé des radiateurs d'aquarium submersibles dans chaque réservoir (Figure 1).
Le facteur clé pour une procédure réussie de FIV dans A. mexicanus est la qualité des ovules rassemblés. Gravid, les poissons femelles avec de grands abdomens saillants sont les plus susceptibles de libérer des ovules viables, qui semblent clairs et même en apparence ( Figure 2a-d). L'ajout du milt recueilli à ces ovules entraîne le développement d'embryons fécondés habituellement dans les 20-30 min (figure 2e). Les embryons fécondés viables deviendront légèrement plus translucides avant d'entrer dans le stade cellulaire du cycle de développement, tandis que les ovules non fécondés apparaîtront plus inégaux et opaques (figure2e). Les embryons qui en résultent sont conservés dans des plats Petri dans ZIRC E2 Embryo Media et incubés à 23 oC dans un cycle 14/10 lumière/obscurité. Les embryons sont ensuite transférés dans le système de recirculation principal à 5 jours après la fécondation pour l'élevage.
Pour démontrer l'importance de la technique, nous montrons comment le phénotypage des hybrides pour des traits spécifiques tels que la taille des yeux et la pigmentation du corps peut aider à déchiffrer leur base génétique. Les poissons des cavernes diffèrent clairement des poissons de surface dans leur taille des yeux et leur pigmentation du corps. Pour comprendre la base génétique de ces traits, nous avons traversé la surface et le poisson des cavernes (F0) et généré des populations hybrides F1 et F2 en utilisant la FIV pour observer la variation phénotypique obtenue (figure 3). La taille des yeux est plus petite dans la génération F1 indiquant que la présence des yeux est un trait partiellement dominant (Figure 3). Dans les hybrides F2 de surface-cave, nous obtenons un large éventail de tailles d'oeil, indiquant qu'il y a les loci multiples qui commandent la taille d'oeil dans A. mexicanus, le faisant un trait quantitatif (figure 3). Un autre exemple est la pigmentation. En observant l'hybride F1 de la surface et du poisson des cavernes, on peut conclure que la pigmentation du corps est un trait dominant puisque les poissons sont entièrement pigmentés (figure 3). Dans la génération F2, la variation de la pigmentation du corps pointe à nouveau vers un trait quantitatif. La combinaison de ces données phénotypiques avec des données de séquençage peut indiquer les loci génétiques sous-jacents responsables de ces phénotypes. Ces populations f2 sont une bonne ressource pour comprendre la base génétique de divers traits et ces populations ont été utilisées précédemment pour étudier ces caractères17,18,19. Une technique normalisée de FIV peut grandement rationaliser la génération d'hybrides, permettant la cartographie génétique des loci contrôlant ces traits et nous aidant à comprendre comment certains phénotypes sont désavantageux dans certains habitats et adaptatifs dans d'autres.
Figure 1 : Conception de racks pour décaler les cycles jour/nuit de A. mexicanus. (a) La configuration générale de ce système de rack permet la manipulation de photoperiod, donnant une simulation de la nuit pendant les heures de jour quand les portes sont fermées, et les lumières d'étagère sont éteintes. ( b) L'amorçage du poisson pour stimuler la maturation des ovules est réalisé à l'aide de radiateurs submersibles (voir Tableau des matériaux)installés dans des réservoirs individuels qui peuvent être ajustés séparément (flèches rouges). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Exemples de femelles appropriées pourla collecte d'ovules et illustration représentative d'ovules viables et non viables. (a) Gravid, les poissons femelles avec de grands abdomens saillants sont plus appropriés pour la collecte manuelle d'ovules que (b) femelles avec un abdomen rationalisé formé. ( c) Les ovules viables (c.-à-d. les ovules produisant des embryons viables lorsqu'ils sont fécondés) peuvent être identifiés par leurapparence claire et uniforme, tandis que les ovules non viables (c.-à-d., les ovules ne produisant pas d'embryons viables lorsqu'ils sont fécondés), comme le montre(e) ont un apparence. (e) Après une fécondation réussie, les embryons viables deviennent plus translucides et entrent dans le stade d'une cellule tandis que les ovules non fécondés (flèches rouges) se désintègrent lentement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Analyse génétique de la taille des yeux et des traits de pigmentation du corps. Pedigree montrant des photos de poissons de surface parentaux (F0) (en haut à gauche) et de poissons des cavernes (en haut à droite), d'hybrides F1 (deuxième rangée) et des hybrides F2. Les poissons F1 ont une taille intermédiaire des yeux et sont entièrement pigmentés tandis que les poissons F2 montrent une grande variation dans les deux traits morphologiques: la taille des yeux et la pigmentation. Toutes les données originales sous-jacentes à ce chiffre peuvent être consultées à partir du dépôt de données d'origine Stowers à http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1365. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Bien que la FIV soit une méthode normalisée pour de nombreux organismes modèles différents tels que le poisson zèbre, les protocoles existants pour A. mexicanus ne tiennent pas compte du fait que cette espèce fraye naturellement pendant les heures de nuit6. Étant donné que les poissons des cavernes et les poissons de surface diffèrent considérablement dans leurs rythmes circadiens, le cycle de maturation des ovules diffère également entre les morphotypes de la grotte et ceux de surface. Tandis que les températures et les temps de mise en scène pour la surface A. mexicanus sont bien étudiés12,les poissons des cavernes peuvent différer dans leur comportement de frai et cycle de maturation. Les méthodes conventionnelles de production hybride sont donc très difficiles et incertaines en raison de la perte de rythme circadien dans le morphotype de grotte de A. mexicanus7, ce qui entraîne une modification des temps de frai de ces poissons. En déplaçant la photopériode, nous pouvons fournir des embryons hybrides spécifiques au temps sans avoir à compter sur des événements de frai naturels rares entre les deux morphotypes. Le fait de séparer la grotte et les poissons de surface empêche également les morphes agressifs de surface d'avoir un effet néfaste sur la reproduction.
Certaines limitations existent avec cette méthode comme les variations de la qualité des ovules. L'identification d'une femelle (poisson de surface ou poisson des cavernes) avec des ovules matures n'est pas anodine et nécessite des observations minutieuses du comportement du poisson. En général, les femelles gravid prêtes pour le frai ont de plus grands abdomens et se brossent à plusieurs reprises contre la surface inférieure du réservoir ou le piège de collecte d'embryons20.
Nous avons observé que la qualité du sperme est constante tout au long du cycle jour/nuit. L'étape critique du succès de la FIV (succès en termes de génération d'embryons fécondés) est d'obtenir des ovules viables et de bonne qualité. Par conséquent, il est extrêmement important de recueillir les ovules des poissons qui sont sur le point de frayer naturellement (Figure 2a). Une fois les ovules recueillis, ils peuvent être observés sous un microscope de dissection pour examiner la qualité. La collecte d'ovules viables pendant la nuit, cependant, est gênant et difficile pour le chercheur. La configuration que nous présentons ici permet de déplacer le cycle de maturation des ovules, de sorte que la FIV peut être utilisée pour générer des embryons synchronisés pour l'application en aval pendant les heures normales de travail.
Avec l'avancement de la cryoconservation du milt (par exemple, comme il est décrit dans le poisson zèbre21), la FIV deviendra un outil puissant pour établir et maintenir des lignées génétiques pour le système modèle émergent A. mexicanus. En combinaison avec des méthodes de modification génétique15 et de morpholino à base knockdown17, ces procédures fourniront la plate-forme méthodologique pour étudier les fondements génétiques et développementaux des adaptations à différents habitats dans A. mexicanus.
En résumé, le protocole présenté ici permettra la production d'embryons synchronisés de A. mexicanus pour d'autres applications en aval, telles que l'injection de constructions génétiques ou l'étude des phénotypes embryonnaires précoces. La principale force du protocole est qu'il permet une production efficace d'hybrides de surface-cave qui peuvent être utilisés pour cartographier génétiquement les différences phénotypiques entre les poissons de surface et les poissons des cavernes grâce à l'analyse QTL (quantitative trait loci). Pris ensemble, l'obtention d'ovules viables pendant la journée pour la FIV est une technique puissante qui sera bénéfique pour une variété d'études futures dans différents domaines des sciences biologiques.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs souhaitent remercier Philippe Noguera et Kimberly Bland pour leur soutien à la production vidéo. Les auteurs aimeraient également remercier toute l'équipe aquatique de l'Institut Stowers pour l'élevage. Ce travail a été soutenu par un financement institutionnel à la DPB et à NR. NR a reçu le soutien de la Fondation Edward Mallinckrodt et de la FRDJ. RP a été soutenu par une subvention de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (PE 2807/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tube | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm Petri Dishes | VWR International | #25384-302 | |
| Aspirator Tube | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes | Drummond | #2-000-001 | |
| Dispolable Spatulas | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W Aquatic Heaters | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pipette Tips | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 incubator | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| Sperm Extender E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ?C for up to 6 months. |
||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| System Water | Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm. Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %) | ||
| Tissue Wipes | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks. |
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