Summary
여기에서 우리는 VirWaTest를 제시, 이는 사용 시점에서 물 샘플에서 바이러스의 농도 및 검출을위한 간단하고 저렴하고 휴대용 방법입니다.
Abstract
인간과 동물에 의해 배설된 바이러스는 수원을 오염시키고 이 물이 음주, 식품 관개, 세척 등에 사용될 때 인간의 건강에 위험을 초래할 수 있습니다. 고전적인 대변 박테리아 표시기는 항상 바이러스 성 병원체의 존재를 검사하지 않으므로 바이러스 성 병원체 및 바이러스 지표의 검출은 특히 인도주의적 시나리오및 지역에서 위험 완화 조치를 채택하기 위해 관련이 있습니다. 수인성 바이러스 발병이 빈번한 경우.
현재, 대변 지표 박테리아 (FIB)의 정량화를 허용하는 몇몇 상업적인 시험은 사용의 시점에서 시험을 위해 유효합니다. 그러나, 이러한 상업적 인 테스트는 바이러스의 검출을 위해 사용할 수 없습니다. 환경 용수 샘플에서 바이러스를 검출하려면 몇 리터를 더 작은 부피로 농축해야 합니다. 더욱이, 일단 집중되면, 바이러스의 검출은 바이러스 게놈의 핵산 추출 및 분자 검출(예를 들어, 중합효소 연쇄 반응[PCR]-기반 분석법)과 같은 방법에 의존한다.
여기에 설명된 방법은 10 L 물 샘플에서 바이러스의 농도뿐만 아니라 사용 시점에서 바이러스 성 핵산의 추출을 간단하고 휴대용 장비로 허용합니다. 이를 통해 여러 바이러스에 대한 사용 시점에서 물 샘플을 테스트할 수 있으며, 인도주의 적 시나리오뿐만 아니라 장착 된 실험실을 사용할 수없는 모든 상황에서 유용합니다. 양자택일로, 방법은 추가 분석을 위해 상온에서 실험실에 물 견본및 농축물의 선적에 존재하는 바이러스를 집중시키는 것을 허용합니다.
Introduction
인도주의적 비상 사태의 첫 단계 동안 깨끗한 물 공급, 위생 및 위생에 대한 접근은 영향을받는 사람들의 생존에 매우 중요합니다. 따라서 수질 모니터링은 수인성 발생을 방지하는 것이 최우선 과제입니다. 오염된 물은 질병의 기원이 빈번하게 알려져 있지만, 기존의 실험실 방법의 가용성에도 불구하고 E형 간염 바이러스 (HEV)와 같은 바이러스 발병의 원인을 결정하는 것은 종종 어렵습니다. 수질의 제어는FIB1,2,3,4의정량화를 기반으로합니다. 그러나, FIB의 부재와 로타바이러스(RoV), 노로바이러스(NoV) 또는 HEV5,6과같은 바이러스 성 수인성 병원균의 존재 사이에 상관관계가 없다는 것이 광범위하게 문서화되어 있다. 따라서, FIB에 근거한 수질 기준을 사용하면 수인성 바이러스 성 병원균의 존재와 관련된 위험의 과소 평가가 발생할 수 있습니다. 인간 아데노바이러스(HAdV) 또는 특정 병원체와 같은 지표 바이러스의 감시는 바이러스 성 병원체에 대한 노출을 정의하고인간 감염의 잠재적 원인을 식별하는 데 도움이 될 것입니다 7,8, 9,도 10 및 위생 대책 의 효능을 검증하는데 11.
지금까지 이러한 시나리오에서 바이러스를 탐지하는 것은 숙련된 직원과 복잡한 물류에 의존했습니다. VirWaTest (virwatest.org)는 사용 시점에서 물 샘플에서 바이러스의 농도 및 후속 검출을위한 간단하고 저렴하고 휴대용 방법의 개발을 목표로한다.
바이러스 농도는 10 L 물 샘플의 유기 응고 원리에 기초하며, 바이러스가12,13더 작은 양으로 회수됩니다. flocs는 수집되고 바이러스를 용해하고 2 주 이상 실온에서 저장될 때 핵산이 분해되는 것을 방지하는 완충제에 추가됩니다.
핵산 추출 방법은 핵산이 흡착되는 자기 입자의 사용을 기반으로합니다. 그들은 입자가 부착하는 자기 파이펫을 사용하여 한 세척 버퍼에서 다른 세척 버퍼로 마지막으로 용출 버퍼로 전송될 수 있습니다. 얻어진 바이러스 성 핵산 현탁액은 PCR에 근거를 둔 분자 방법을 사용하여 검출이 수행될 수 있는 기준 실험실로 발송될 수 있습니다. 각 핵산 추출에 대해, 2개의 다른 양은 견본에 기인한 효소 억제를 배제하기 위하여 시험됩니다. 또는 최소한의 장비 가용성으로 PCR 테스트를 사용 지점에서 실행할 수 있습니다. 전체 프로세스는 전원 공급 장치와 독립적으로 수행되도록 설계되었습니다(그림 1).
인간에 의해 배설되고 고농도의 폐수 샘플에서 발견되는 HAdV를 검출하는 정량적 PCR 분석은 사용 시점에서 실행되도록 조정되었습니다. HAdV는 인간의 배설물 바이러스 지표로 사용됩니다. MS2 박테리오파지의 정량화를 위한 PCR은 MS2가 VirWaTest에서 공정 제어로 사용되기 때문에 적응되었습니다. 이 방법은 관심 있는 바이러스의 검출을 위해 사용자 정의할 수 있다.
개발 후 VirWaTest 메서드는 중앙 아프리카 공화국 (RCA) 및 에콰도르에서 두 가지 다른 설정에서 사용자에 의해 적용 되었습니다., 실제 상황에서 프로토콜의 응용 프로그램에 대 한 피드백을 제공 하 고.
우리의 지식에, 이것은 어떤 전원 공급 장치, 대형 장비 및 동결 / 냉각 조건과 관계없이 사용 시점에서 바이러스의 농도 및 검출을 허용하는 첫 번째 절차입니다. 강력한 결과를 얻으려면 각 물 샘플의 두 개의 복제를 수집하는 것이 좋습니다.
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Protocol
1. 준비 및 포장
참고: 포장할 재료/장비는 표1에 나와 있습니다. 장갑을 사용하여 공정 제어, 농도 시약, 핵산 추출 시약 및 검출 시약에 필요한 시약을 처리합니다. 핵산 추출에 필요한 시약을 처리하기 위해 보호 안경을 착용하십시오.
- 공정 제어
- ISO 절차 10705-1:199514에따라 실험실에서 1 x 1010 PFU/mL을 포함하는 MS2 박테리오파지 스톡 컬쳐(미국식 문화 컬렉션[ATCC] 15597-B1)를 준비한다.
- 이어서, 10 mL 튜브내로 1 x 108 PFU를 함유하는 튜브당 현탁액의 10 μL을 알리쿼트하고 37°C에서 물이 증발하게 한다. 물 샘플 당 하나의 튜브를 사용합니다.
- 또한, 수집된 샘플당 멸균 증류수 10mL를 함유하는 튜브 1개를 준비합니다.
- 농도 시약
- 미리 flocculated 탈지 우유 용액 (PSM)를 위해, 5 개의 10 L 물 견본을 집중하기 위하여 다음 양을 이용하십시오.
- 탈지 우유 5g이 들어있는 플라스틱 튜브를 준비합니다.
- 바다 소금 16.66g이 들어있는 지퍼 비닐 봉지를 준비합니다.
- 증류수 500mL가 들어있는 플라스틱 병을 준비합니다.
- pH 조정에 필요한 시약을 준비합니다. 다음 양을 사용하여 PSM의 pH및 5개의 10 L 물 샘플의 pH를 조절한다.
- 10 mL 플라스틱 튜브에 구연산 1-하이드레이트 5 g을 넣습니다.
주의: 구연산은 눈과 접촉할 때 심각한 자극을 일으킵니다. 이런 일이 발생하면 몇 분 동안 물로 조심스럽게 눈을 헹구하십시오. 자극이 지속되면 의사의 조언을 구하십시오. - 수산화 나트륨 2 g을 10 mL 플라스틱 튜브에 넣습니다.
주의: 수산화나트륨은 심한 피부 화상과 눈 손상을 일으킬 수 있습니다. 삼켰을 경우 입을 헹구세요. 구토를 유도하지 마십시오. 눈에 닿으면 몇 분 동안 물로 조심스럽게 헹구하십시오. 그런 다음 의사의 조언을 구하십시오. - 멸균 증류수 25mL를 플라스틱 용기에 넣습니다.
- 멸균 증류수 50mL를 플라스틱 용기에 넣습니다.
- 10 mL 플라스틱 튜브에 구연산 1-하이드레이트 5 g을 넣습니다.
- 응집에 사용되는 샘플 컨디셔닝 봉지, 핵산을 보존하는 데 사용되는 방부제 용액, 폐기된 물과 물질을 중화하기 위해 중화 된 봉지를 준비하십시오. 시험할 각 10L 물 샘플에 대해 다음 양을 사용하십시오.
- 바다 소금 15g과 구연산 1g 8g을 컨디셔닝 봉지에 지퍼 비닐 봉지에 넣습니다.
- 5 mL 튜브에 2mL의 라시스 버퍼 (재료 표)와 핵산 보존제 (재료 표)의 0.3 mL를 추가합니다.
주의: 용해 완충제에는 구니딘 티오티아네이트와 트리톤 X-100이 함유되어 있다. 산과의 접촉은 독성 가스를 해방하고, 삼키거나, 흡입하거나, 피부에 접촉하면 유해합니다. 삼켰을 경우 입을 헹구세요. 구토를 유도하지 마십시오. 피부에 닿으면 충분한 물로 씻으시고 씻어주세요. 그런 다음 의사의 조언을 구하십시오. 핵산 보존제는 피부와 눈의 자극을 유발하며 삼키면 유해합니다. 피부나 눈과 접촉하면 몇 분 동안 풍부한 물로 헹구어 주세요. 어떤 경우에, 특히 삼키고 기분이 좋지 않은 경우 의사의 진찰을 받으십시오. - 40g의 세제 파우더를 지퍼 비닐 봉지에 넣습니다.
주의: 파우더 세제는 눈 자극을 유발합니다. 눈과 접촉하면 몇 분 동안 풍부한 물로 헹구어 두지 하십시오. 자극이 지속되거나 삼켰을 경우 의사의 진찰을 받으십시오.
- 미리 flocculated 탈지 우유 용액 (PSM)를 위해, 5 개의 10 L 물 견본을 집중하기 위하여 다음 양을 이용하십시오.
- 핵산 추출 시약
- 자기 입자 50 μL(재료 표)과 에탄올 1 mL96 %를 결합 버퍼를 구성하는 5 mL 튜브에 넣습니다.
주의: 자기 입자 버퍼에는 산이나 중금속 이온과 접촉할 때 독성 가스를 형성하는 나트륨 아지드가 포함되어 있으며, 섭취하거나 피부에 닿을 때 독성이 있습니다. 섭취하거나 피부에 닿으면 입이나 피부를 풍부한 물로 헹구고 의사의 진찰을 받으십시오. 에탄올은 인화성이 높은 액체 및 증기이며 심각한 눈 자극을 일으킵니다. 열, 뜨거운 표면, 스파크 및 기타 발화원을 피하십시오. 피부나 눈과 접촉하면 풍부한 물로 헹구어 주세요. 다량의 물을 섭취하거나 흡입한 경우, 신선한 공기로 외부로 나가라. 어쨌든 의사의 진찰을 받으십시오. - 세척 버퍼 1, 2 및 3의 500 μL, 600 μL 및 200 μL을 각각 3 개의 2 mL 튜브에 추가합니다.
주의: 세척 완충제에는 구니디늄 티오치아네이트와 구니디늄 염화물이 함유되어 있으며, 흡입또는 삼키거나 피부와 눈을 자극할 경우 유해합니다. 산과의 접촉은 매우 독성 가스를 방출합니다. 피부나 눈과 접촉하면 풍부한 물로 헹구세요. 삼키면 풍부한 물로 입을 헹구세요. 구토를 유도하지 마십시오. 항상 의사의 조언을 구하십시오. - 0.5 mL 튜브에 용출완충제(재료 표)를 120 μL 추가합니다.
- 자기 입자 50 μL(재료 표)과 에탄올 1 mL96 %를 결합 버퍼를 구성하는 5 mL 튜브에 넣습니다.
- HAdV 및 MS2 검출 시약
참고: 8-well 열자전거러를 사용하는 경우 각 PCR 분석에서 두 가지 다른 핵산 추출 반응을 동시에 분석할 수 있습니다. 모든 PCR 아세에 대해, 1.5 mL 튜브에 aliquoted 분자 생물학 물을 준비합니다.-
HAdV 감지
- 22.5 μM AdF 포워드 프라이머10 μL, 22.5 μM AdR 역프라이머 10 μL, 11.25 μM AdP프로브의 5 μL을 함유하는 혼합물을 준비한다(표 2).
- 2.5 μL의 혼합물을 튜브 스트립의 튜브 1 ~ 8에 추가합니다. 실온에서 건조시키고 튜브를 닫고 빛으로부터 보호하십시오.
- 튜브 1-5 및 튜브 6-8 : 두 개의 스트립으로 나누어 스트립을 잘라.
- 증폭된 HAdV 영역의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 현탁액의 직렬 희석을 준비한다. 1 x 105,1 x 10 7, 1x 109 GC/mL을 튜브 6-8에 포함하는 1 μL의 공기 건조.
참고: 프라이머, 프로브 및 공기 건조 현탁액이 들어 있는 튜브를 빛으로부터 보호하십시오.
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MS2 감지
- 25 μM 펙손-2F 포워드 프라이머10 μL, 25 μM 펙손-2R 역프라이머의 10 μL, 25 μM PecP-2프로브의 2.5 μL을 함유하는 혼합물을 준비한다(표 2).
- 2.25 μL의 혼합물을 튜브 스트립의 튜브 1 ~ 8에 추가합니다. 실온에서 건조시키고 튜브를 닫고 빛으로부터 보호하십시오.
- 튜브 1-5 및 튜브 6-8 : 두 개의 스트립으로 나누어 스트립을 잘라.
- 1.4.1.4 단계에서와 같이 진행하지만 대신 MS2용으로 설계된 표준 서스펜션을 사용하십시오.
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HAdV 감지
2. 바이러스 농도
참고: 샘플 수집, 시약 준비, 응고, 플록 수거 및 폐기물 처리 절차 중에 항상 장갑을 사용하십시오. 시약 준비 절차 중에 보호 안경을 착용하십시오.
- 샘플 수집
- 뚜껑이 있는 평평한 바닥 양동이에 10L의 물 샘플을 모읍시다. 각 샘플에 대해 최소 2개의 복제를 수집합니다.
참고: 투명 버킷을 사용하여 펠릿을 시각화하는 것이 중요합니다. 물 샘플에 부유 물질 (예 : 모래, 조류)이 포함되어 있는 경우 퇴적물을 한 다음 새 양동이에 물 상류물을 수집합니다. - 각 물 샘플에 대해 수집된 볼륨과 위치 및 수집 날짜를 등록합니다.
- 배터리에 연결된 마그네틱 교반기를 버킷 지지대 아래에 놓고 물 샘플이 들어 있는 버킷을 지지대에 놓습니다.
참고: 신선한 장소에서 평평한 표면을 찾아 직사광선이 들어오는 물 샘플을 담은 양동이를 보관하십시오.
- 뚜껑이 있는 평평한 바닥 양동이에 10L의 물 샘플을 모읍시다. 각 샘플에 대해 최소 2개의 복제를 수집합니다.
- 시약 준비
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pH 조정 시약
- 구연산 분말과 수산화 나트륨 펠릿을 각각 증류수 25 및 50 mL을 함유 한 냄비에 붓습니다.
- 구연산과 수산화 나트륨이 완전히 녹을 때까지 손으로 부드럽게 흔들어 주세요.
주의: 수산화 나트륨 펠릿에 물을 붓지 마십시오. 대신, 물에 수산화 나트륨 펠릿을 부어.
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전향성 탈지 우유
- 스탠드업 백을 마그네틱 교반기 위에 놓고 500 mL의 증류수를 붓습니다. 교반 자석을 가방 안에 넣고 마그네틱 교반기의 켜기.
- 바다 소금 봉지와 탈지 된 우유 튜브의 내용물을 스탠드 업 백에 붓고 중간 속도로 5 분 동안 저어서 녹입니다.
- 파스퇴르 파이펫을 사용하여 PSM 용액에 3 mL의 구연산을 추가하여 pH가 3.4에서 3.6 사이에 있는지 확인합니다. pH 표시기 스트립을 사용하여 PSM 용액의 pH를 측정합니다. pH가 3.5에 가까워질수록 더 적은 양의 구연산과 수산화나트륨을 첨가합니다.
- 마그네틱 교반기의 끄기와 플록이 보이는지 확인합니다. 손전등을 사용하여 flocs를 시각화하는 데 도움이됩니다.
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pH 조정 시약
- 응집
- 교반 자석을 물에 떨어뜨리고 마그네틱 교반기의 속도를 최대 속도로 설정한 다음 켭니다. 교반 자석이 회전하기 시작했는지 확인합니다.
- 공정 제어 튜브에 증류수 10mL를 추가합니다. 튜브를 몇 번 반전하여 바이러스 성 스톡을 재수화하고 용액을 물에 붓습니다.
- 한 샘플 컨디셔닝 봉지의 내용물을 물에 붓고 5 분 동안 저어줍니다.
- pH 표시기 스트립을 사용하여 물 샘플의 pH를 측정합니다. pH가 3.4에서 3.6 사이인지 확인하기 위해 물 샘플에 구연산 또는 수산화 나트륨 몇 방울을 추가하십시오. pH가 3.5에 가까워질수록 더 적은 양의 구연산과 수산화나트륨을 첨가합니다.
- 100 mL 컨테이너를 사용하여 PSM 용액의 100 mL를 추가합니다.
- 뚜껑으로 양동이를 밀봉하고 자기 교반기의 최소 속도를 설정하고 물을 8 시간 동안 저어 둡니다.
- 마그네틱 교반기를 끄고 물이 적어도 5시간 동안 남아 서 플록이 가라앉을 수 있도록 하십시오.
- 플록 컬렉션
- 파이펫 컨트롤러, 파이펫 2개, 플라스틱 튜브로 구성된 사이펀 시스템을 구축하여 플로크에서 물을 배출하기 위해 상급물을 흡인합니다.
- 파이펫 컨트롤러에 10mL 테이프 엔드 파이펫을 부착합니다. 그런 다음 파이펫 끝을 플라스틱 튜브에 부착합니다.
- 핀셋을 사용하여 10mL 오픈 팁 파이펫의 필터를 제거하고 플라스틱 튜브에 파이펫을 부착합니다.
- 빈 양동이를 바닥에 놓습니다.
- 오픈 팁 파이펫의 끝을 물에 담그고 있습니다. flocs를 방해하지 않도록 수면에 가까이 두십시오. 테이프 엔드 파이펫에 도달할 때까지 물 상류물을 흡인합니다.
- 테이프 엔드 파이펫에 부착된 끝으로 플라스틱 튜브를 꼬집고 파이펫에서 분리합니다.
- 튜브를 빈 양동이에 놓습니다. 물이 빈 양동이로 흐르게하기 위해 튜브의 압력을 놓습니다.
- 플라스틱 튜브를 꼬집어 수위가 교반 자석에 도달하려고 할 때 물 흐름을 중지하고 양동이에서 파이펫을 이동합니다.
- 양동이를 흔들어 플록을 다시 일시 중단하고 500mL 스탠드업 비닐 봉지에 붓습니다. flocs가 1 시간 더 정착할 수 있도록 하십시오.
- 50mL 파이펫과 수동 파이펫 컨트롤러를 사용하여 물 상급물을 조심스럽게 흡인하여 플로크를 방해하지 않도록 하십시오.
- 100 mL 파이펫을 사용하여 flocs를 흡인하고 50 mL 의 원심 분리튜브로 옮김을 전달합니다. 시료 농축액의 최종 부피를 기록하고 1 mL을 파저피펫을 사용하여 방부제를 함유하는 5 mL 튜브로 옮김을 넣습니다.
참고 : 농축 된 샘플의 최종 부피를 가능한 한 정확하게 측정하고 등록 할 수 있도록 원심 분리튜브를 졸업하는 것이 중요합니다. - 현장에서 핵산 추출을 수행합니다. 또는 바이러스를 함유하는 방부제를 최대 15일 동안 20-30°C에 저장하거나 추가 분석을 위해 기준 실험실로 발송합니다.
- 파이펫 컨트롤러, 파이펫 2개, 플라스틱 튜브로 구성된 사이펀 시스템을 구축하여 플로크에서 물을 배출하기 위해 상급물을 흡인합니다.
- 폐기물 처리 및 자재 재사용
- 버려진 물을 포함하는 양동이에 중화제 봉지의 내용을 추가합니다. 물을 섞은 다음 30 분 동안 그대로 둡니다.
- 처리된 물을 일반 폐기물로 폐기합니다.
- 파이펫과 플라스틱 튜브를 버킷 내부에 넣습니다. 양동이에 물을 채우고 중화제 봉지 한 봉지의 내용물을 붓습니다.
- 적어도 30 분 동안 씻어 살균하고 남은 중화제를 제거하기 위해 풍부한 깨끗한 물로 헹구십시오.
3. 핵산 추출
참고: 장갑을 착용하고 핵산 추출 시 항상 보호 안경을 착용하십시오.
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마그네틱 파이펫 작동
- 추출을 수행하기 전에 자기 파이펫의 작동에 익숙해지십시오.
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핵산 추출
- 바인딩 버퍼, 세척 버퍼 및 용출 버퍼 : 왼쪽에서 오른쪽으로 랙에서 추출에 필요한 시약을 포함하는 튜브를 정렬합니다. 분석되는 샘플 또는 복제물의 수에 따라 적절한 튜브 수를 설정합니다.
- 일회용 파스퇴르 피펫을 사용하여 결합 완충액을 함유하는 튜브에 샘플 농축액 1 mL을 이송한다. 튜브를 8x 에서 10x로 반전하여 용액을 균질화합니다.
- 태양열 궤도 또는 수동으로 사용하여 지속적으로 혼합하면서 실온에서 10 분 동안 용액을 배양하십시오.
- 세 개의 세척 버퍼에 재사용할 수 있는 마그네틱 파이펫과 클린 팁을 사용하여 자기 입자를 수집합니다.
- 세척 완충제 1의 500 μL을 포함하는 관으로 자기 입자를 풀어 놓습니다. 30s의 팁으로 용액을 부드럽게 흔들어 서 씻고 수집하십시오.
- 세척 버퍼 2의 600 μL을 포함하는 튜브에 자기 입자를 전송합니다. 30s의 팁으로 용액을 부드럽게 흔들어 서 씻고 수집하십시오.
- 세척 버퍼 3의 200 μL을 포함하는 튜브에 자기 입자를 전달한다. 30s의 팁으로 용액을 부드럽게 흔들어 서 씻고 수집하십시오.
- 용출 버퍼를 포함하는 튜브에 자기 입자를 방출하고 팁을 폐기.
- 태양열 궤도를 사용하여 지속적으로 혼합하면서 실온에서 5 분 동안 용액을 배양하십시오.
참고: 용출 버퍼에 자기 입자를 혼합하는 것은 매우 중요한 단계입니다. 궤도가 결여된 경우, 인큐베이션 시간 동안 지속적으로 손으로 혼합한다. - 마그네틱 파이펫의 팁을 새 파이펫으로 교체하고 용출 버퍼에서 자기 입자를 수집합니다. 분자 검출 방법을 방해할 수 있기 때문에 용출 버퍼에서 자기 입자를 완전히 제거해야 합니다.
- 파티클이 부착된 팁을 폐기합니다. PCR 분석을 진행하거나 용출 버퍼를 기준 실험실로 배송하거나 용출 버퍼를 4°C에서 저장하여 추가 분석을 진행합니다.
4. 배터리 작동 식 8 튜브 실시간 열자전거로 바이러스 검출
참고: 핵산 검출 절차 중에 장갑을 착용하고 항상 보호 안경을 착용하십시오. 교차 오염을 방지하기 위해 새로운 PCR 실험을 수행할 때 장갑을 새 장갑으로 교체하십시오.
-
HAdV 정량 PCR
- 튜브 2, 4 및 5에 14 μL의 뉴클레아제 없는 물을 넣습니다.
- 튜브 1-5에 4 μL의 PCR 혼합물을 추가합니다.
- 샘플 A에서 튜브 1에 14 μL의 핵산 추출을 추가하고 샘플 B에서 튜브 3에 14 μL을 추가합니다.
- 샘플 A에서 튜브 2에 추출된 핵산 2 μL을 추가하고 샘플 B에서 튜브 4로 2 μL을 추가합니다. 5튜브 스트립을 닫습니다.
- 튜브 6, 7 및 8에 14 μL의 뉴클레아제 없는 물을 추가합니다.
- 튜브 6, 7 및 8에 이 혼합물의 4 μL을 넣고 닫습니다.
- 두 스트립을 열전자전거에 넣고 적절한 실행을선택합니다(표 3).
- 물 튜브를 버리고 추출 된 핵산을 냉동실에 보관하거나 가능하면 두 번째 테스트를 수행해야하는 경우 빛으로부터 보호되는 신선한 장소에서 보관하십시오.
- 마이크로파이펫, 랙, 작업 재료 및 모든 재료를 핵산 클리너로 올바르게 청소하고 사용된 팁, 장갑 및 튜브가 들어있는 비닐 봉지를 폐기하십시오.
주의: 핵산 제거제는 매우 인화성 액체 및 증기입니다. 스프레이 미스트에서 호흡하지 말고 눈이나 피부에 액체가 닿지 않도록 하십시오. 그렇지 않으면 즉시 풍부한 물로 헹구고 의사의 진찰을 받으십시오. - 결과를 수집하고 얻은 데이터를 분석합니다.
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MS2 정량적 PCR
- 튜브 2, 4 및 5에 14 μL의 뉴클레아제 없는 물을 넣습니다.
- 4 μL의 PCR 혼합물과 0.5 μL의 역전사 효소를 튜브 1-5에 첨가합니다.
- 샘플 A에서 튜브 1에 14 μL의 핵산 추출을 추가하고 샘플 B에서 튜브 3에 14 μL을 추가합니다.
- 샘플 A에서 튜브 2에 추출된 핵산 1 μL을 추가하고 샘플 B에서 튜브 4로 1 μL을 추가합니다. 5튜브 스트립을 닫습니다.
- 튜브 5, 6, 7 및 8에 15.5 μL의 뉴클레아제 없는 물을 넣고 닫습니다.
- 4 μL의 PCR 혼합물과 0.5 μL의 역전사 효소를 튜브 6, 7 및 8에 첨가합니다.
- 두 스트립을 열전자전거에 넣고 적절한 실행을선택합니다(표 3).
- 4.1.8 단계 4.1.10에 설명된 대로 진행합니다.
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Representative Results
방법 개발
이 절차는 GenIUL과 옥스팜 인터몬의 협력으로 물과 식품의 바이러스 오염 물질 실험실에서 개발되었습니다. 그것은 세 가지 단계로 구성되어 있습니다. 제 1, 바이러스 입자 농도는, 앞서 설명한12,17,18에기재된 탈지 우유 응집 방법의 적응이다. 원래 방법은 전원 공급 장치와 독립적으로, 더 간단하고 원심 분리 단계없이 수정되었습니다.
VirWaTest 농도 방법의 회수는 HAdV 및 MS2 박테리오파지 스파이크 지하수 샘플에서 시험하였다. VirWaTest 농도 및 추출 방법의 바이러스 성 회수는 MS2에 대해 3.01 % ~ 18.02 %, HAdV에 대한 17.52 % ~ 44.22 %로 추정되었다. 이러한 회수는 이러한 바이러스 성 주식의 공지된 농도로 이들을 스파이크한 후 물 샘플에서 HAdV 및 MS2의 초기 농도와 비교하여 방법의 개발 동안 정량적 PCR에 의해 얻어진 값으로부터 계산되었다.
VirWaTest 자기 핵산 추출은 실험실에서 사용되는 열 기반 추출 방법인 상업용 RNA 미니 키트(예: QIAamp Viral RNA Mini Kit)와 비교하여 HAdV 및 MS2로 급증한 33개의 강 및 지하수 샘플을 테스트하고 농축했습니다. 탈지 우유 응고에 의해. 비교 결과는 VirWaTest 방법 복구가 MS2(표 4)뿐만 아니라 HAdV의 경우 23/33례에서 더 높았다는 것을 보여주었습니다. Wilcoxon 테스트는 HAdV에 대한 0.0005569의 p-값과 MS2의 0.02791을 보였다. VirWaTest 핵산 추출은 상업적인 것보다 훨씬 더 높은 바이러스 회수를 제공합니다.
VirWaTest 방법으로 농축된 환경용 수질 시료에서 HAdV 검출
2017년 3월 방기(RCA)에 위치한 옥스팜 수자원, 위생 및 위생(WASH) 팀은 현장에서 바이러스 농도에 대한 개발방법을 테스트하기 위해 5개의 우물 수질 샘플에서 바이러스를 수집하고 농축하였다.
또한 2016년과 2017년 지진의 영향을 받은 페데르날레스(에콰도르) 지역에서는 2017년 2월 옥스팜 워시 팀이 6개의 우물 시료를 채취했으며, VirWaTest 농도 법에 의해 바이러스가 집중되었습니다. 두 설정에서 바이러스 농축체는 VirWaTest 핵산 추출 및 바이러스 정량화를 위해 바르셀로나의 실험실로 보내졌습니다.
에콰도르에서 자연발생성 HAdV는 분석된 6개의 샘플 중 6개에서 검출되었으며, 농도 값은 3.27 x 10에서 1.80 x 102 GC/L에 이르는 반면, 5개 샘플 중 1개는 Banghi(RCA)에서 수집및 농축된 것으로 확인되었습니다. HAdV에 대해 3.46 x 102 GC/L(표 5)의 농도로 양수입니다.
내부 공정 제어로 테스트된 모든 샘플에 추가된 MS2는 테스트된 모든 샘플에서 검출되었으며, 이 방법이 농도에서 검출까지 올바르게 수행되었다는 것을 보여줍니다.
그림 1 : VirWaTest 방법. VirWaTest 메서드가 구성되는 단계의 개요입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 자료 | 농도 | 핵산 추출 | 검색 |
| 장비 | 마그네틱 교반기 (2 유닛) 배터리 (2 대) 배터리/교반기 커넥터(2대) 전원 어댑터(2대) 버킷 지지대(2대) 로프 (1 단위) 교반 자석 (3 개) 족집게 (1 단위) 실리콘 튜브 (1 단위) 파이펫 컨트롤러(1단위) 마커(1단위) |
마그네틱 파이펫 (1 단위) 태양광 회전 플랫폼(1유닛) 멀티 사이즈 튜브 랙 (1 단위) 타이머 (1 단위) |
열순환 장치(1개) 배터리(1개) 컴퓨터 튜브 랙 (1 단위) 0.5 μL - 10 μL 마이크로파이펫 (1 단위) 2 μL - 20 μL 마이크로파이펫 (1 단위) |
| 소모품 및 시약(물 샘플/복제물 2개당) | 버킷 (3 대) pH 인디케이터 스트립 테이프 엔드 10 mL 파이펫 (2 개) 오픈 팁 10 mL 파이펫 (2 개) 테이프 엔드 50 mL 파이펫 (2 개) 테이프 엔드 100 mL 파이펫 (2 개) 파스퇴르 파이펫 (4 대) 스탠드업 비닐 백 (4 대) 증류수 25 mL (1 단위)가있는 플라스틱 용기 증류수 50 mL (1 단위)가있는 플라스틱 용기 100 mL 빈 용기 (1 단위) 장갑 (6 쌍) 공정 제어(튜브 2개) 증류수 10 mL (2 단위) 구연산 (1 튜브) 수산화나트륨 (튜브 1개) 탈지 우유 (1 튜브) 구연산 봉지 (1 단위) 증류수 (1 500 mL 병) 샘플 컨디셔닝(봉지 2개) 방부제 용액 (2 튜브) 중화제 (4 봉지) |
마그네틱 파이펫 팁(2유닛) 파스퇴르 파이펫 (2 대) 바인딩 버퍼(튜브 2개) 세탁 버퍼 1 (2 튜브) 세탁 버퍼 2 (2 튜브) 세탁 버퍼 3 (2 튜브) 용출 버퍼 (2 튜브) 장갑 (6 쌍) |
10 μL 마이크로파이펫 팁(1박스) 20 μL 마이크로파이펫 팁(1박스) DNA qPCR 믹스 (1 튜브) RNA qPCR 믹스 (1 튜브) 역전사 효소 (1 튜브) 분자 생물학 물 (1 튜브) 프라이머, 프로브 및 표준 (1 단위)와 HAdV 튜브 스트립 프라이머, 프로브 및 표준(1단위)이 있는 MS2 튜브 스트립 핵산 제거제 장갑 (6 쌍) |
표 1: VirWaTest 내용. 두 개의 물 샘플/복제물에서 바이러스의 농도, 추출 및 검출을 위해 준비해야 하는 장비, 소모품 및 시약.
| 바이러스 | 뇌관 | 겐뱅크 가입 번호 | 위치 | 시퀀스(5'\u20123') | 길이 | 참조 | ||
| 인간 아데노바이러스 (HAdV) | Adf | J01917.1 | 18869\u201218887 | CWTACATGCACATCKCSGG | 19세 | 헤른로스 외, 2002년15 | ||
| Adr | 18919\u201218937 | CRCGGGCRAAYTGCACCACCAG | 19세 | |||||
| AdP1 | 18890\u201218916 | 6-FAM-CCGGGCTCAggACTGCGTCCT-BMN-Q535 | 27세 | |||||
| MS2 박테리오파지 (MS2) | 펙슨-2F | NC_001417.2 | 344\u2012363 | 아그트GCCTACAAGCGAAGT | 20개 | 펙슨 외, 2009년 16 | ||
| 펙슨-2R | 659\u2012678 | TTCGTTTAGGGCAAGGTAGC | 20개 | |||||
| 펙P-2 | 369\u2012388 | 6-FAM-ATCGGGGGTCGCGCGTACG-BHQ-1 | 20개 | |||||
표 2: 정량적 PCR 실험을 위한 올리고뉴클레오티드. HAdV 및 MS2의 핵산 서열에 결합하도록 설계된 프라이머 및 프로브.
| 온도 | 시간 | 사이클 | 온도 | 시간 | 사이클 |
| 95 °C | 약 12분 | 1개 | 55 °C | 약 15분 | 1개 |
| 95 °C | 약 10분 | 1개 | |||
| 95 °C | 15 s | 40 | 95 °C | 15 s | 40 |
| 60 °C | 1분 | 60 °C | 1분 |
표 3: 정량적 PCR 실험을 위한 열 조건. HAdV 및 MS2 증폭에 사용되는 온도, 시간 및 사이클.
| 차아겐 (동음이의) | 버와테스트 | 차아겐 (동음이의) | 버와테스트 | ||
| 중간 | 2.53 x 103 | 2.43 x 103 | 4.74 x 104 | 5.13 x 104 | |
| 의미 | 1.74 x 104 | 3.12 x 104 | 4.24 x 104 | 5.97 x 104 | |
| Sd | 5.66 x 105 | 2.23 x 106 | 4.49 x 104 | 1.63 x 105 | |
| HAdV에 대한 p 값 (윌콕슨) : 0.0005569 | |||||
| MS2의 p 값(윌콕슨) : 0.02791 | |||||
| 바이러스 테스트 | 샘플 테스트 완료 | 차아겐 (동음이의) | 버와 테스트 | ||
| 하드프 (주) | 33세 | 10개 | 23세 | ||
| MS2 | 33세 | 10개 | 23세 | ||
표 4: VirWaTest 핵산 추출 개발. HAdV 및 MS2에 대한 33개의 지하수 샘플에서 Qiagen 및 VirWaTest 추출 방법을 비교할 때 얻은 중앙값, 평균 및 SD 값.
| 국가 | 사이트 | 샘플 | HAdV GC/L |
| Rca | 오 드 라 소데카 | 1개 | Nd |
| 일 봉고수아, 빌리지 1 | 2개 | Nd | |
| 일 봉고수아, 빌리지 3 | 3개 | Nd | |
| 방기, 푸이츠 쿼티어 폰도 | 4개 | Nd | |
| 방기, 푸이츠 쿼티어 얌바사 | 5개 | 3.64 x 102 | |
| 에콰도르 | 시추공 A | 6개 | 7.96 x 101 |
| 시추공 B | 7명 | 1.80 x 102 | |
| 시추공 C | 8개 | 8.88 x 101 | |
| 웰 워터 A | 9개 | 6.06 x 101 | |
| 웰 워터 B | 10개 | 1.12 x 102 | |
| 웰 워터 C | 11세 | 3.27 x 101 |
표 5: VirWaTest 방법을 사용하여 HAdV의 정량화. RCA 및 에콰도르에서 수집및 농축된 물 샘플에서 정량화된 HAdV에 대해 GC/리터로 표현된 정량적 PCR 결과.
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Discussion
VirWaTest 방법은 경험이 없는 사용자가 사용하는 시점에서 물 샘플에서 바이러스 및 핵산 추출의 농도를 가능하게 합니다. 저렴하고 빠르며 간단한 프로토콜입니다. 농도는 낮은 pH및 높은 전도성 조건이 탈지 우유 단백질이 바이러스 흡착을 흡착하는 flocs로 집합하게하는 탈지 우유를 사용하여 유기 응고의 원리에 기초한다. flocs 퇴적물은 수집하기 쉬우므로 10L의 물을 농축할 수 있는 반면, 전통적인 초원심분리는 큰 물의 양을 처리할 수 없습니다.
이 방법은 배터리 작동 식 자기 교반기 이외의 전기 장비를 사용하지 않고 샘플링 지점에서 실행 가능하기 위해 수정되었습니다. 물 여과에 근거를 둔 몇몇 그밖 접근은 바이러스의 사격량에 적응되고 또한 사용의 시점에서 수행될 수 있습니다. 그러나, 물 샘플에 존재하는 부유 물질은 종종 필터를 막힘; 따라서, 이러한 시스템에 집중될 수 있는 작은 부피는 심각한 한계이다.
이것은 샘플의 탁도에 관계없이 사용 시점에서 물 샘플에서 바이러스를 집중시키는 방법에 대한 첫 번째 설명입니다. VirWaTest 농도 방법은 적절한 재료를 사용할 수있는 경우 여러 샘플을 동시에 처리 할 수 있습니다. 더욱이, 탈지된 우유 응고는 박테리아 및 기생충 농도19에유용한 것으로 나타났다.
적절한 재료의 준비는 절차를 제대로 수행하는 데 중요합니다. 시약 및 재료의 제조를 위해 시험이 필요한 곳으로 이동하기 전에 분석할 물 샘플의 수를 고려하고 시약과 재료를 준비합니다. 적절한 양의 재료를 사용할 수 있는 경우 여러 샘플을 동시에 처리할 수 있습니다.
물 샘플의 농도를 시작하기 전에, 바이러스 성 스톡의 알려진 농도는 공정 제어로 샘플을 스파이크하는 데 사용됩니다. 이 방법은 사용 시점에서 물 샘플에 추가되기 전에 증류수로 재수화되는 말린 바이러스 성 스톡을 사용합니다. 이는 프로시저 끝에서 거짓 음수 결과를 배제하고 메서드의 성능을 나타내는 데 유용합니다.
VirWaTest를 사용하여 수득된 바이러스 농축액은 VirWaTest 핵산 추출 및 검출 방법을 적용하는 분야에서 추가로 시험될 수 있거나, 대안적으로, 농축액은 실온에서 기준 실험실로 보내질 수 있다. 농축액에 첨가된 방부제 용액을 통해 바이러스는 최대 2주 동안 안정적으로 유지될 수 있습니다(미공개 결과).
VirWaTest 핵산 추출은 자기 입자 기반 방법입니다. 그것은 쉽고 빠르며 여러 샘플을 동시에 처리 할 수 있으며 현재 바이러스 성 핵산 추출에 사용되는 방법보다 동등하고 더 나은 회복 효율을 보여줍니다. 핵산은 실온에서 참조 실험실로 보내지거나, 사용자가 분자 검출을 수행하는 데 자신이 있는 경우, 정량적 PCR 분석이 원래 물 샘플의 사용 시점에서 수행될 수 있다.
또한, 작은 실험실 시설을 사용할 수 있는 경우, VirWaTest 농도 프로토콜은 시약을 유지하기 위해 냉동고를 필요로 하지만 사용하는 원심분리기 및 표준 PCR 기반 방법에 의존하는 표준 핵산 추출 키트에 결합될 수 있습니다. 표준 열자전거는 배터리로 작동하는 열자전거보다 저렴합니다.
그러나 전원 공급 장치를 사용할 수 없는 경우도 있기 때문에 MS2 박테리오파지의 검출 방법을 공정 제어 및 HAdV를 바이러스 성 배설기로 최적화했으며, 방법론은 간염과 같은 다른 바이러스에 맞게 사용자 정의할 수 있습니다. 바이러스, RoV, NoV, 또는 다른 사람, 시약의 유지 보수를위한 냉동고없이 현장에서 실행, 또는 기존의 열 자전거하지만 배터리 작동 하나. 여러 배터리 작동 열자전거가 시판되고 있습니다. 대안적으로, 전원 공급 장치를 사용할 수 있는 경우, 다른 통상적인 qPCR 장비가 사용될 수 있다. 8개의 튜브 열자전거러가 사용되는 경우, 최대 2개의 핵산 추출(동일한 샘플에서 2개의 다른 샘플 또는 2개의 복제)을 동일한 PCR 분석실험에서 테스트할 수 있습니다. 각 핵산 추출에 대해, 2개의 다른 양은 견본에 기인한 효소 억제를 배제하기 위하여 시험될 것입니다. 적응은 공기 건조 프라이머, 프로브 및 표준 현탁액에 의해 PCR 튜브의 이전 제조를 기반으로합니다. 여기에 설명된 바와 동일한 절차를 적용하여 사용될 수 있는 몇몇 동종구 상용 qPCR 솔루션이 존재한다. 우리는 우리가 수행하기 쉬운 것으로 간주 한 가지 가능성을 설명했다.
상기 방법의 개발 동안 수행된 비교 분석법은 VirWaTest 의 농도, 추출 및 검출 방법이 물 샘플에서 바이러스의 정량화에 효율적이라는 것을 보여주었다.
설명된 절차의 검출 한계(LOD)는 농도 후에 수집된 부피가 가변적이기 때문에 가변적입니다. 또한 LOD는 다른 바이러스에 대해 약간 다를 수 있습니다. 약 10 L의 부피가 수집되는 경우, HAdV에 대한 LOD는 약 1 x 102 바이러스 성 GC /L이 될 것입니다. 따라서, HAdV의 상대적으로 작은 농도는 VirWaTest 방법에 의해 검출될 수 있다. 페데르날레스(에콰도르)에서 테스트된 6개의 샘플 중 6개는 3.27 x 10 10 1에서 1.80 x 102 GC/L에 이르는 LOD에 가까운 농도로 HAdV를 제시했습니다. Banghi (RCA)에서 HAdV는 분석 된 5 개의 샘플 중 하나에서 3.46 x 102 GC / L의 농도로 검출되었습니다. HAdV의 존재는 테스트된 샘플에서 제어 공정으로서 MS2의 존재뿐만 아니라, 경험이 없는 사용자가 수행하더라도 물 샘플로부터 바이러스 입자의 회수에 유용하다는 것을 보여준다.
지금까지 얻은 피드백은 8 시간 및 5 h 단계가 필요하지만, 샘플의 사용 시점에서 적용 할 때 큰 문제없이, 바이러스 농도가 수행하기 쉬운 절차임을 나타냅니다. 이러한 단계는 사람의 도움없이 발생한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 또한, 여과에 기초한 더 빠른 방법은 비투이비 수역의 대안으로 개발되고 있다. 그러나, 응집은 지금까지 높은 탁도를 제시하는 시료의 농도를 허용하는 독특한 방법인 것 같다. 바이러스 성 농축액은 실온에서 전 세계 모든 실험실로 보내질 수 있으며, 샘플링 영역은 항상 냉각 조건을 제공하는 좋은 운송 서비스가 없기 때문에 바이러스를 쉽게 테스트 할 수 있습니다. 대안적으로, 여기에 제시된 추출 및 검출 프로토콜은 샘플의 사용 시점에서 바이러스 검출을 위한 시험을 허용한다.
우리가 아는 한, 이것은 필드에 있는 근해 견본에 있는 바이러스의 존재에 대한 집중 그리고 시험을 위해 유용하기 위하여 보고된 첫번째 방법입니다. 다른 여러 인도주의적 위기 시나리오에서 관심 있는 인간 바이러스 성 병원균의 존재 평가에 절차를 적용하기 위한 추가 노력이 수행되어야 한다. 또한 사용자의 피드백은 프로시저를 보다 친숙하게 만들기 위해 잠재적구현에 대한 통찰력을 제공해야 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
VirWaTest는 ELHRA의 HIF (인도주의 혁신 기금) 프로그램에 의해 투자 된 연구 프로젝트 (인도주의 적 지원을위한 학습 및 연구 강화). 저자는 이 연구에서 친절하게 협력한 WASH 팀을 인정합니다. 에콰도르의 샘플 분석은 옥스팜 에콰도르와 디레시온 드 인베티가시오네스 드 라 유니버시다드 데 라스 아메리카스(AMB)의 지원을 받았습니다. BRT.17.01). S. 보필 마스는 바르셀로나 대학의 세라 헌터 펠로우입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | - | - | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 - 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor - Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
References
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