Summary
Veranderde Nuclease activiteit is in verband gebracht met verschillende menselijke omstandigheden, die onderliggende zijn potentieel als een biomarker. De modulaire en eenvoudig te implementeren screenings methodiek die in dit document wordt gepresenteerd, maakt het mogelijk specifieke nucleïnezuur voelers te selecteren voor het benutten van Nuclease activiteit als een biomarker van de ziekte.
Abstract
Nucleasen zijn een klasse van enzymen die nucleïnezuren afbreken door de hydrolyse van de fosfodiësterbindingen die de ribose-suikers koppelen, te katalyseren. Nucleasen vertonen een verscheidenheid aan vitale fysiologische rollen in prokaryotische en eukaryote organismen, variërend van het handhaven van genoom stabiliteit tot het bieden van bescherming tegen pathogenen. Veranderde Nuclease activiteit is geassocieerd met verschillende pathologische aandoeningen, waaronder bacteriële infecties en kanker. Om dit te doen, Nuclease activiteit heeft aangetoond groot potentieel om te worden uitgebuit als een specifieke biomarker. Een robuuste en reproduceerbare screeningsmethode op basis van deze activiteit blijft echter zeer wenselijk.
Hierin introduceren we een methode die screening mogelijk maakt voor Nuclease activiteit met behulp van nucleïnezuur sondes als substraten, met de reikwijdte van het differentiëren tussen pathologische en gezonde omstandigheden. Deze methode biedt de mogelijkheid van het ontwerpen van nieuwe probe-Bibliotheken, met toenemende specificiteit, op een iteratieve manier. Zo zijn meerdere screenings rondes nodig om het ontwerp van de probes te verfijnen met verbeterde functies, waarbij gebruik wordt maken van de beschikbaarheid van chemisch gemodificeerde nucleïnezuren. Het aanzienlijke potentieel van de voorgestelde technologie ligt in de flexibiliteit, hoge reproduceerbaarheid en veelzijdigheid voor de screening van Nuclease activiteit in verband met ziekte omstandigheden. Verwacht wordt dat deze technologie de ontwikkeling van veelbelovende diagnostische hulpmiddelen mogelijk maakt met een groot potentieel in de kliniek.
Introduction
Nucleasen zijn een klasse van enzymen die in staat zijn om de fosfodiësterbindingen die de ruggengraat structuur van nucleïnezuur moleculen vormen, te cleaven. De enorme diversiteit van nucleasen maakt hun classificatie nogal moeilijk. Er zijn echter enkele gemeenschappelijke criteria die worden gebruikt om nucleasen te beschrijven, zoals substraat voorkeur (deoxyribonucleïnezuur (DNA) of ribonucleïnezuur (RNA)), decolleté (endonucleases of exonucleases), of metaalionen afhankelijkheid, onder andere1. Nucleasen zijn sterk geconjugeerde katalytische enzymen die fundamentele rollen hebben in zowel prokaryote als eukaryote organismen en zijn gebruikt, en blijven worden gebruikt, als gen editing tools2. Ze zijn ook fundamentele actoren in DNA-onderhoud en-replicatie, helpen om genoom stabiliteit te houden en deel te nemen aan proof-reading processen3. In bacteriën, bijvoorbeeld, nucleasen zijn geïdentificeerd als belangrijke virulentie factoren, in staat om bacteriële overleving te bevorderen door het verminderen van de werkzaamheid van het immuunsysteem van de gastheer4,5,6,7 ,8. Bij zoogdieren zijn nucleasen gesuggereerd om betrokken te zijn bij apoptosis9, mitochondriale biogenese en onderhoud10 en bemiddeling van antibacteriële en antivirale aangeboren immuunresponsen11. Niet verrassend, Nuclease activiteit veranderingen, of verbetering of gebrek aan, zijn betrokken bij een breed scala van menselijke ziekten. Deze ziekten variëren van een breed scala aan kankers12,13 tot cardiale hypertrofie10 of auto-immuunziekten14. Daarom zijn nucleasen interessante kandidaten geworden als biomarkers voor een heterogene groep menselijke aandoeningen. In feite hebben nucleasen al hun potentieel aangetoond als succesvolle diagnostische hulpmiddelen voor het opsporen van infecties veroorzaakt door specifieke bacteriële agentia, zoals Staphylococcus aureus of Escherichia coli15, 16. in veel soorten kanker is expressie van stafylokokken Nuclease Domain-bevattende proteïne 1 (SND1) ribonuclease indicatief voor slechte prognose17. Bij patiënten met pancreaskanker zijn verhoogde ribonuclease I (RNase I) serumspiegels gemeld18 en voorgesteld om te worden geassocieerd met kankerachtige cel fenotypes19. In ischemische hartaandoeningen, zoals myocardinfarct of instabiele angina pectoris, deoxyribonuclease i (DNase i) serumspiegels is aangetoond dat een geldige diagnostische marker20,21.
Het heeft zijn veronderstelde dat de globale blauwdruk van Nuclease activiteit kan verschillen in gezonde en ziektetoestanden. In feite hebben recente rapporten gebruik gemaakt van verschillen in Nuclease activiteit om onderscheid te maken tussen gezonde en kankerachtige fenotypes22 of om pathogene bacteriële infecties te identificeren op een soortspecifieke manier15,23. Deze bevindingen hebben een nieuwe laan geopend voor het gebruik van nucleasen als biomarkers van de ziekte. Daarom bestaat er een noodzaak voor de ontwikkeling van een uitgebreide screeningsmethode die in staat is om systematisch met de ziekte samenhangende verschillen in Nuclease activiteit te identificeren, wat van cruciaal belang kan zijn bij de ontwikkeling van nieuwe diagnostische instrumenten.
Hierin introduceren en beschrijven we een nieuwe in-vitro screening aanpak (Figuur 1) om gevoelige en specifieke sondes te identificeren die kunnen discrimineren tussen Nuclease activiteit in gezond en ongezond, of activiteit specifiek voor een type cel of bacteriën. Door gebruik te maken van de modulariteit van nucleïnezuren, ontwierpen we een initiële bibliotheek van gebluste fluorescerende oligonucleotide sondes bestaande uit een uitgebreide set van verschillende sequenties en chemici, beide zijn belangrijke parameters voor het ontwerp van de bibliotheek. Deze oligonucleotide sondes worden geflankeerd door een de (fluorescein amidite, fam) en een dorstlesser (Tide dorstlesser 2, TQ2) aan respectievelijk 5 ' en 3 ' uiteinden (tabel 1). Door gebruik te maken van deze fluorometrische assay op basis van fluorescerende resonantie energie overdracht (FRET) om de kinetiek van enzymatische afbraak te meten, konden we kandidaatsondes identificeren met het potentieel om differentiaal patronen van Nuclease activiteit te discrimineren geassocieerd met gezonde of ziektetoestanden. We ontwierpen een iteratief proces, waarin nieuwe bibliotheken worden gemaakt op basis van de beste kandidaat-sondes, die het mogelijk maakt om steeds specifiekere kandidaat-sondes te identificeren in volgende screenings stappen. Bovendien maakt deze aanpak gebruik van de katalytische aard van nucleasen om de gevoeligheid te verhogen. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van de activeerbaar aard van de reporter sondes en het vermogen van nucleasen om substraat moleculen voortdurend te verwerken, die beide belangrijke voordelen ten opzichte van alternatieve antilichamen of kleine op moleculen gebaseerde screeningsmethoden vertegenwoordigen.
Deze aanpak biedt een zeer modulair, flexibel en eenvoudig te implementeren screening tool voor de identificatie van specifieke nucleïnezuur voelers die kunnen discrimineren tussen gezonde en ziektetoestanden, en een uitstekend platform voor de ontwikkeling van nieuwe diagnostische hulpmiddelen die kunnen worden aangepast voor toekomstige klinische toepassingen. Als zodanig werd deze benadering gebruikt om de Nuclease activiteit te identificeren die is afgeleid van salmonella typhimurium (hierna salmonellagenoemd) voor de specifieke identificatie van deze bacteriën. In het volgende Protocol rapporteren we over een methode voor het scherm voor bacteriële Nuclease-activiteit met behulp van kinetische analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ontwerp en voorbereiding van een oligonucleotide-bibliotheek
- Bibliotheek ontwerp
- Op basis van de volgende criteria ontwerp een bibliotheek van afgeschrikt fluorescerende oligonucleotide sondes tussen 8 en 12-Mer lang om secundaire structuur vorming te voorkomen, met gelijke lengte voor alle sondes.
- Omvatten ten minste één DNA en één RNA willekeurige sequentie met een combinatie van adenine (A), Guanine (G), cytosine (C) en thymine (T)/uracil (U) (DNA-en RNA-sondes in tabel 1).
Opmerking: de DNA-en RNA-sequenties beschreven in tabel 1 zijn nuttig geweest als de eerste substraten voor het classificeren van een onbekend type Nuclease activiteit, ofwel DNase of RNase. Deze twee sequenties worden aanbevolen als uitgangspunt voor elke screening, omdat ze een breed vermogen hebben aangetoond om Nuclease-activiteitsprofielen in bacteriën en weefselmonsters te detecteren. Als Nuclease activiteit niet wordt waargenomen met deze DNA-en RNA-sequenties, is het ontwerp van extra oligonucleotiden vereist. - Neem polynucleotide sequenties op die bestaan uit één type nucleotide om de sequentie afhankelijkheid voor een bepaalde Nuclease activiteit te bepalen (DNA-poly A, DNA-poly T, DNA-poly C, DNA-Poly G, RNA-poly A, RNA-poly U, RNA-poly C en RNA-Poly G in tabel 1).
- Met behulp van dezelfde sequentie van nucleotide residuen als de initiële DNA en RNA sequenties, omvatten sequenties die nucleoside analogen harkotteren chemische modificaties op de 2 '-positie van de ribose suiker, zoals 2 '-fluoro en 2 '-O-methyl bevatten, als een strenge stap voor het verhogen van de selectiviteit van de nucleasen.
- Omvatten volledig gemodificeerde sequenties die volledig bestaan uit 2 '-fluoro nucleoside analogen of 2 '-O-methyl nucleoside analogen (alle 2 '-F en alle 2 '-OMe, tabel 1)
- Omvatten chimerische sequenties bestaande uit niet-gemodificeerde natuurlijke purines en 2 '-fluoro pyrimidine nucleoside analogen (RNA Pyr-2'F, tabel 1).
- Omvatten chimerische sequenties bestaande uit niet-gemodificeerde natuurlijke purines en 2 '-O-methyl pyrimidine nucleoside analogen (RNA Pyr-2'OMe, tabel 1).
- Omvatten chimerische sequenties bestaande uit niet-gemodificeerde natuurlijke pyrimidinen en 2 '-fluoro purine nucleoside analogen (RNA PUR-2'f, tabel 1).
- Omvatten chimerische sequenties bestaande uit niet-gemodificeerde natuurlijke pyrimidinen en 2 '-O-methyl purine nucleoside analogen (RNA PUR-2'ome, tabel 1).
- Omvatten ten minste één DNA en één RNA willekeurige sequentie met een combinatie van adenine (A), Guanine (G), cytosine (C) en thymine (T)/uracil (U) (DNA-en RNA-sondes in tabel 1).
- Op basis van de volgende criteria ontwerp een bibliotheek van afgeschrikt fluorescerende oligonucleotide sondes tussen 8 en 12-Mer lang om secundaire structuur vorming te voorkomen, met gelijke lengte voor alle sondes.
- Voorbereiding en opslag van oligonucleotide sonde
Opmerking: oligonucleotiden worden gesynthetiseerd door de fosforamidtische methode. Na synthese worden de oligonucleotiden gezuiverd met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) en wordt de massa gemeten met massaspectrometrie.- Draai de gelyofiliseerde oligonucleotide sondes met een centrifuge af en Verdun ze in tris-EDTA (TE) buffer om Nuclease afbraak te voorkomen. Bepaal het verdunningsvolume volgens de opbrengst van elke sonde om een stamoplossing met een concentratie van 500 pmol/μL te genereren.
- Bewaar gelyofiliseerd oligonucleotiden bij 4 °c of op kamertemperatuur voor een korte termijn. Voor lange termijn opslag (maanden tot jaren), bewaar gelyofiliseerd oligonucleotiden bij-20 °c. Bij resuspensie van gelyofiliseerde oligonucleotiden in TE, bewaar de stamoplossingen bij-20 °C of bij voorkeur bij-80 °C.
2. bacteriële cultuur
- Neem een poreuze glazen kraal van de cryogene opslag flacon onder steriele omstandigheden.
- Om individuele bacteriële kolonies (salmonella en E. coli) te isoleren, gebruikt u de Kwadrant methode24 door de kraal direct op een Petri schaaltje met tryptische soja agar (TSA) medium, aangevuld met gedefibreerde schapen, te streaking/te rollen Bloed.
- Incuberen de cultuur bij 37 °C gedurende 24 uur.
3. supernatant voorbereiding
- Breng een enkele kolonie over van vaste media naar 50 mL Tryptische soja Bouillon (TSB) en inincuberen bij 37 °C gedurende 24 uur bij 200 rpm.
- Verdun de kweek (1:500) in TSB (subcultuur) en incuberen bij 37 °C gedurende 24 uur bij 200 rpm in een schud incubator.
NB: verwacht wordt dat na 24 uur incubatie de bacterieculturen in stationaire fase waarden van meer dan 109 kve/ml bereiken. - Na de incubatieperiode, breng de culturen over naar afgetopte steriele buizen en Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 4.500 x g .
- Verzamel het supernatant en gebruik het onmiddellijk. U ook de supernatanten bewaren bij 4 °c of-20 °c.
4. Nuclease activiteit assay
- Voorbereiding van werkoplossingen
- Bereid een werkoplossing van 20 μL voor elke sonde in 1,5 mL Nuclease vrije microcentrifuge buizen door verdunning (1:10 ratio) de stamoplossing (500 pmol/μL) voor een uiteindelijke werkconcentratie van 50 pmol/μL. Meng hiervoor 18 μL fosfaat buffer zout (PBS) met MgCl2 en CACL2 met 2 μL sonde voorraadoplossing.
Opmerking: Houd er rekening mee dat in de werkoplossing de oligonucleotiden kwetsbaarder zijn voor Nuclease afbraak, daarom wordt het aanbevolen om de werkoplossingen te bereiden vlak voordat de reactie wordt ingesteld. - Vermijd direct licht contact tijdens de bereiding en houd in het donker (verpakt in folie), bij het omgaan met fluoroforen.
- Bereid een werkoplossing van 20 μL voor elke sonde in 1,5 mL Nuclease vrije microcentrifuge buizen door verdunning (1:10 ratio) de stamoplossing (500 pmol/μL) voor een uiteindelijke werkconcentratie van 50 pmol/μL. Meng hiervoor 18 μL fosfaat buffer zout (PBS) met MgCl2 en CACL2 met 2 μL sonde voorraadoplossing.
- Reactie ingesteld
- Verwarm de fluometer (bv. Cytatie 1) voor op 37 °C.
- Bereid een set (één buis/sonde) van 1,5 mL Nuclease vrije microcentrifuge buizen voor elk monster (TSB, E. coli en salmonella) en etiket dienovereenkomstig.
- Voeg voorzichtig 96 μL TSB steriele kweekmedia, salmonella supernatant of E. coli supernatant toe (uit de stap 3,4.). Voeg vervolgens 4 μL/buis van de probe-werkoplossing dienovereenkomstig toe. Deze stap bij kamertemperatuur uitvoeren.
Opmerking: 10 sondes werden gebruikt voor de eerste ronde van de screening en 6 sondes voor de tweede ronde. - Meng grondig door Pipetteer op en neer om een homogene oplossing te verkrijgen. Vermijd het inbrengen van luchtbellen in de monsters tijdens het mengen.
- Laad 95 μL van elke oplossing (sonde + supernatant of cultuur media) in een aparte put van een zwarte bodem, niet-behandelde 96 goed plaat. Minimaliseer de vorming van bubbels in de putten bij het laden door voorzichtig te doseren met de punt dicht bij de wand van de put.
- Dek de plaat af met het deksel. Inspecteer het deksel visueel en controleer op penmarkeringen of ophoping van stofdeeltjes die meet artefacten kunnen introduceren. Vervang het deksel voor een nieuwe als dat het geval is.
- Instellen van de meting
- Open de verwervings software (GEN5 3,05) door te klikken op het pictogram Software snelkoppeling (figuur S1A).
- Selecteer nu lezen in het venster Taakbeheer en kies Nieuw... om het Kinetic MEASUREMENT Protocol (afbeelding S1B) te maken.
- Klik op temperatuur instellen in het dialoogvenster met de titel Procedure en selecteer 37 °c. Bevestig en sla de instellingen op door op OK te drukken (afbeelding S1C).
- Klik op Start kinetiek in het dialoogvenster met de titel procedure. Selecteer vervolgens in het pop-upvenster Kinetic Step, 2 h in het invoerveld voor de runtime en 2 min in het interval invoerveld. Bevestig en sla de instellingen op door op OK te drukken (afbeelding S1D).
- Klik op lezen in het dialoogvenster met de titel procedure. Vervolgens in het pop-upvenster met de titel leesmethode, selecteer intensiteit fluorescentie als een detectiemethode, endpoint/Kinetic als een lees type en filters als optica type. Bevestig en sla de instellingen op door op OK te drukken (afbeelding S1E).
- Selecteer groen in de Filtersetin het pop-upvenster met de titel Read Step (Kinetic). Bevestig en sla de instellingen op door op OK te drukken (afbeelding S2A).
- In het dialoogvenster met de titel procedure, selecteer deksel gebruiken en klik op valideren om ervoor te zorgen dat het gemaakte Protocol geldig is. Dit wordt bevestigd door een pop-upvenster (afbeelding S2b).
- Selecteer protocol in de menubalk en kies procedure (afbeelding S2C).
- Definieer in het dialoogvenster met de titel procedurede putjes die moeten worden gemeten (figuur S2D).
- Voer de naam van het experiment in de bestandsnaam invoer vak (afbeelding S2E).
- Laad de plaat met het deksel in de plaat lezer. Zorg ervoor dat de plaat zich in de juiste richting bevindt.
- Start de overname door te klikken op nieuwe knop lezen op de werkbalk (afbeelding S2F).
- Data-analyse
- Klik op een van de gemeten putjes in het dialoogvenster met de titel Plate 1 (afbeelding S3A).
- Klik op Wells selecteren en neem alle gemeten putten op in het dialoogvenster goed selecteren . Bevestig en sla de instellingen op door op OKte drukken. (Afbeelding S3B).
- Selecteer gegevens in het dialoogvenster met de titel plaat 1 om de getabelleerde resultaten te visualiseren (afbeelding S3C).
- Exporteer de gegevens naar een spreadsheet door snel exporteren te selecteren in het contextmenu (afbeelding S3C).
- Label in het spreadsheet de gegevenskolommen dienovereenkomstig voor elk monster en elke sonde.
- Genereer kinetische grafieken, met behulp van lijn met markers stijl, door het uitzetten van relatieve fluorescentie eenheden (RFU) versus tijd (x-as: tijdlijn van de reactie en y-as: rfus).
Opmerking: de beschrijving van het genereren van een grafiek is van toepassing bij het gebruik van spreadsheet programma's (bijvoorbeeld Excel). Andere Programma's kunnen echter worden gebruikt om grafieken te genereren uit de verkregen onbewerkte gegevens, door RFU versus tijd te plotten. - Bereken de snelheid van de enzymatische reactie voor elk gemeten interval volgens de volgende formule25: rate =
, waarbij if is RFU op het maximale INTERVALTIJD punt en II is RFU op het minimale intervaltijd punt, en TF en Ti zijn respectievelijk de maximale en minimale intervaltijd punten. - Selecteer de snelheid met de hoogste waarde (RMax) voor elke curve. Als er meer dan één RMax per sample, selecteert u degene die plaatsvindt op het vroegste meet tijdpunt.
- Bereken de verhouding tussen RMax en de gemiddelde waarde van het tijdsinterval waarbij rMax optreedt: tarief coëfficiënt =
- Bereken het vouw verschil (FD) tussen de tarief coëfficiënt van salmonella en E. coli voor elke sonde.
- Overweeg een vouw verschil waarde hoger dan 3 als significant.
- Overweeg de belangrijke sondes met de hoogste vouw verschil waarden (FD) als kandidaat-voelers en als basis voor het bibliotheek ontwerp in de volgende screening ronde.
, waarbij if is RFU op het maximale INTERVALTIJD punt en II is RFU op het minimale intervaltijd punt, en TF en Ti zijn respectievelijk de maximale en minimale intervaltijd punten.
5. selectie criteria voor de screening rondes (Figuur 1)
- Eerste screening ronde
- Voer de Nuclease-activiteitstest (zoals beschreven in rubriek 4) uit met behulp van DNA-, RNA-en polynucleotide-sondes.
- Evalueer de voorkeur voor DNA-chemie of RNA-chemie door het aantal en de prestaties (FD-waarde) van DNA-en RNA-kandidaat-sondes te vergelijken.
- Selecteer het type nucleïnezuur chemie die het grootste aantal kandidaatsondes weergeven, zoals geïllustreerd in Figuur 1.
- Tweede screening ronde
- Voer de Nuclease activiteit assay (zoals beschreven in sectie 4) met behulp van volledig gemodificeerde sondes en CHIMERE sondes ontworpen op basis van het nucleïnezuur substraat geselecteerd in de eerste screening ronde.
- Evalueer de voorkeur naar sequenties met 2 '-fluoro en 2 '-O-methyl nucleoside analogen door vergelijking van de resultaten verkregen voor 2 '-fluoro en 2 '-O-methyl gemodificeerde kandidaat-sondes.
- Selecteer het type nucleoside analoge modificatie die het grootste aantal kandidaat-sondes weergeven, zoals geïllustreerd in Figuur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de werkstroom van deze methodologie, die is onderverdeeld in twee screenings rondes. In de eerste screening ronde gebruikten we 5 DNA-sondes (DNA, DNA poly A, DNA poly T, DNA poly C en DNA Poly G) en ook 5 RNA sondes (RNA, RNA poly A, RNA poly U RNA poly C en RNA Poly G). De ruwe gegevens van deze screening ronde zijn te vinden in aanvullende tabel 1. In de tweede ronde werden chemisch gemodificeerde sondes gesynthetiseerd door de RNA-sequentie te vervangen door chemisch gemodificeerde nucleosiden (alle 2 '-fluoro en alle 2 '-omethyl) of door de combinatie van RNA en purines of pyrimidinen die chemisch gemodificeerd zijn (RNA Pyr-2'f, RNA Pyr-2'OMe, RNA PUR-2'F en RNA PUR-2'OMe). De ruwe gegevens van deze screening ronde zijn te vinden in aanvullende tabel 2. In tabel 1 vindt u een gedetailleerde beschrijving van de sequenties. De resultaten van de eerste screenings ronde zijn te zien in Figuur 2, waar salmonella -cultuur supernatanten een duidelijke voorkeur geven aan RNA-sondes over DNA-sondes. E. coli en culture media Controls vertonen daarentegen zeer beperkte mogelijkheden om RNA-sondes te degraderen. Daarnaast hebben we het vouw verschil (FD) berekend tussen de tarief coëfficiënten van salmonella en E. coli (aanvullende tabel 3 en aanvullende tabel 4) om de best presterende sondes te identificeren. De berekeningen zijn uitgevoerd zoals beschreven in de sectie Protocol.
Deze resultaten suggereren de aanwezigheid van een RNase soort activiteit afgeleid van salmonella. Op basis van de identificatie van RNA als het voorkeurstype nucleïnezuur voor salmonella nucleasen, hebben we een nieuwe bibliotheek ontworpen met behulp van chemisch gemodificeerde nucleotiden die moeten worden gebruikt in de tweede screening ronde, gericht op het verhogen van de specificiteit van de Sondes. Figuur 3 toont de kinetische profielen van de sondes die chemisch gemodificeerde nucleotiden bevatten. Belangwekkend, RNA Pyr-2'OMe en RNA PUR-2'OMe tonen de best presterende kinetische gedrag in vergelijking met RNA Pyr-2'F en RNA PUR-2'F, respectievelijk.
Deze resultaten suggereren dat salmonella een belangrijke RNase-activiteit heeft die kan worden gebruikt voor het selecteren van sondes die deze bacteriën specifiek kunnen herkennen. Bovendien, we waargenomen dat 2 '-OMe chemisch gemodificeerde nucleosiden zijn meer geschikt voor het type van RNAses uitgescheiden door salmonella. Met dit in gedachten, het protocol beschreven in deze bijdrage biedt de mogelijkheid van het verkennen van het gebruik van Nuclease activiteit als een biomarker.
Figuur 1: bacterieculturen en workflow van het screeningproces. Bereiding van bacterieculturen en supernatanten (links). Beschrijving van de workflow voor de twee screenings rondes. Eerste screening: de voorkeur voor DNA of RNA wordt geëvalueerd met behulp van 10 sondes. Tweede screening: op basis van nucleïnezuur voorkeur worden aanvullende sondes met chemisch gemodificeerde nucleotiden geëvalueerd om de best presterende substraten voor een bepaalde Nuclease activiteit te identificeren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: eerste kinetische screening ronde. Kinetische profielen van salmonella, E. coli en culture media (TSB) met behulp van DNA en RNA sondes. Nuclease activiteit wordt vertegenwoordigd door relatieve fluorescentie eenheden (RFU). De grafieken zijn representatief voor ten minste 3 individueel uitgevoerde experimenten. De verschillende voorbeelden zijn gelabeld zoals aangegeven in de legenda van de grafiek. Fold difference (FD) waarden werden berekend met behulp van de tarief coëfficiënten van salmonella en E. coli voor elke sonde. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: tweede kinetische screening ronde. Kinetische profielen van salmonella, E. coli en culture media (TSB) met behulp van chemisch gemodificeerde sondes. Nuclease activiteit wordt vertegenwoordigd door relatieve fluorescentie eenheden (RFU). De grafieken zijn representatief voor ten minste 3 individueel uitgevoerde experimenten. De verschillende voorbeelden zijn gelabeld zoals aangegeven in de legenda van de grafiek. Fold difference (FD) waarden werden berekend met behulp van de tarief coëfficiënten van salmonella en E. coli voor elke sonde. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Tabel 1: nucleïnezuur sonde sequenties. Lijst van alle nucleïnezuur sondes gebruikt in deze studie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 1: meting ingesteld. Knop klikken en dialoogvensters waarin het stapsgewijze proces wordt beschreven dat in de verwervings software wordt uitgevoerd om de verschillende Meetparameters in te stellen. (A) bureaubladpictogram. (B) Taakbeheer dialoogvenster. (C) dialoogvensters voor procedure en temperatuur instellen. (D) dialoogvensters procedure en kinetische stap. (E) procedure en leesmethode dialoogvensters. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 2: meting ingesteld. Knop klikken en dialoogvensters waarin het stapsgewijze proces wordt beschreven dat in de verwervings software wordt uitgevoerd om de verschillende Meetparameters in te stellen. (A) procedure en lees stap (kinetische) dialoogvensters. (B) dialoogvenster procedure (C) menubalk "protocol". (D) dialoogvenster voor goed selecteren. (E) invoerveld voor de bestandsnaam. (F) Voer een nieuw pictogram uit dat wordt gebruikt om de acquisitie binnen de software te starten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 3: gegevensanalyse. Knop klikken en dialoogvensters waarin het stapsgewijze proces wordt beschreven dat is uitgevoerd in de acquisitie software om verkregen gegevens te exporteren naar een spreadsheet voor verdere analyse. (A) het dialoogvenster plaat matrix. (B) dialoogvensters voorplaat en goed selecteren. (C) dialoogvenster plaat en contextmenu voor snelle export . Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 4: derde screening ronde (optimalisatie van sequentie voorkeuren). Beschrijving van de verschillende stappen die betrokken zijn bij een aanvullende screening ronde ter beoordeling van sequentie variaties. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 5: vierde screening ronde (specificiteits evaluatieronde). Beschrijving van de verschillende stappen die betrokken zijn bij een aanvullende screening ronde gericht op het verhogen van de specificiteit. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 6: vijfde screening ronde (optimalisatie van de reactie parameter). Beschrijving van de verschillende stappen die betrokken zijn bij een aanvullende screening ronde gericht op het verminderen van niet-doelwit Kruisreactiviteit door het moduleren van Nuclease activiteit. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende tabel 1: onbewerkte gegevens uit de eerste screening ronde. Voor elke sonde (gelabeld in rood, bovenop), de acquisitie tijd en de ruwe fluorescentie waarden werden gerapporteerd voor TSB, E. coli en salmonella, samen met de berekende tarief waarde voor elk interval. De berekeningen werden uitgevoerd zoals beschreven in de sectie methoden. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 2: onbewerkte gegevens uit de tweede screening ronde. Voor elke sonde (gelabeld in rood, bovenop), de acquisitie tijd en de ruwe fluorescentie waarden werden gerapporteerd voor TSB, E. coli en salmonella, samen met de berekende tarief waarde voor elk interval. De berekeningen werden uitgevoerd zoals beschreven in de sectie methoden. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 3: gegevensanalyse voor de eerste screening ronde. Voor elke sonde (gelabeld in rood, bovenop), de volgende waarden werden verkregen voor TSB, E. coli en salmonella: maximale snelheid waarden, minimale en maximale intervaltijd punten, rate coëfficiënt, fold verschil waarden tussen salmonella en e. coli over TSB en fold verschil waarden tussen salmonella en e. coli (gemarkeerd in geel). De berekeningen werden uitgevoerd zoals beschreven in de sectie methoden en de berekeningsformules en de stap voor stap berekeningen worden weergegeven in het werkblad. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 4: gegevensanalyse voor de tweede screening ronde. Voor elke sonde (gelabeld in rood, bovenop), de volgende waarden werden verkregen voor TSB, E. coli en salmonella: maximale snelheid waarden, minimale en maximale intervaltijd punten, rate coëfficiënt, fold verschil waarden tussen salmonella en e. coli over TSB en fold verschil waarden tussen salmonella en e. coli (gemarkeerd in geel). De berekeningen werden uitgevoerd zoals beschreven in de sectie methoden en de berekeningsformules en de stap voor stap berekeningen worden weergegeven in het werkblad. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Veranderingen van Nuclease activiteit zijn in verband gebracht met een breed scala aan ziekten fenotypes, met inbegrip van verschillende soorten kanker en bacteriële infecties. Deze wijzigingen worden voorgesteld als de veroorzaker van een aandoening14, terwijl in andere gevallen zij het gevolg zijn van een schadelijk fysiologisch voorval20 of pathogene agens16,26. Niet verrassend, pogingen om nucleasen en Nuclease activiteit als een diagnostische biomarker te gebruiken zijn beschreven15,22,23,26, met een aanzienlijke belofte. Daarom lijkt de vaststelling van een robuuste en reproduceerbare screening benadering voor de systematische evaluatie van Nuclease activiteit bij ziekte en voor de identificatie van specifieke en gevoelige reporter relevant. Om deze noodzaak aan te pakken, hebben we een robuust, Modulair en eenvoudig te implementeren screening platform ontwikkeld op basis van een fluorescentie test, die de ontdekking van nieuwe ziekte biomarkers mogelijk maakt en de identificatie van gevoelige en specifieke nucleïnezuur sondes in Parallel, door gebruik te maken van de katalytische werking van nucleasen.
Krachtige screening tools zoals Small molecule High throughput screening (HTS)27, systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (Selex)28 of faag display29 zijn eerder gemeld, waardoor de identificatie van moleculen met hoge affiniteit herkenning (bijv. kleine moleculen, aptamers of bindende peptiden). Ter vergelijking, de screening aanpak hier gepresenteerd u de selectie van probes die bekende en onbekende Nuclease activiteit kunnen identificeren. Bovendien is deze aanpak compatibel met in vitro, ex vivo en in vivo screening modellen. Bovendien, het reactieve karakter van nucleasen verleent een duidelijk voordeel ten opzichte van de bovengenoemde benaderingen, in dat de sonde-Nuclease interactie is niet een statisch, maar een dynamisch proces. Dit betekent dat de nucleasen ' activiteit wordt een intrinsieke signaal versterkings module voor de reporter probes omdat verschillende reporter sondes kunnen communiceren met een enkele Nuclease.
Net als bij elke andere screeningsmethode is het genereren en beheren van de initiële bibliotheek essentieel. De aard van nucleïnezuur probes biedt grote flexibiliteit in het ontwerp en de creatie van een bibliotheek en maakt de invoering van verschillende mate van complexiteit afhankelijk van de screening toepassing. De complexiteit van de bibliotheek kan op verschillende niveaus worden geïntroduceerd, waaronder sequentie motieven, nucleotide-chemie, fosfaat-backbone-chemie en oligonucleotide-lengte. Het moduleren van de complexiteit van de bibliotheek maakt het mogelijk om sondes te identificeren, niet alleen voor hun capaciteit om Nuclease activiteit geassocieerd met ziekte te identificeren, maar ook voor eigenschappen die compatibel zijn met volgende in vivo toepassingen. Bovendien biedt een basis bibliotheek van nucleïnezuur verschillende voordelen ten opzichte van zijn antilichamen of peptide tegenhangers. Aan de ene kant is de productie van antilichamen bekend als omslachtig, waarbij dieren of complexe eukaryotische kweeksystemen nodig zijn, die de kosten verhogen en batch variabiliteit introduceren30,31. Bovendien beperken het hoge molecuulgewicht en de immunogeniciteit hun toepassing28,32. Aan de andere kant vereist de generatie van biologische peptide bibliotheken meestal ofwel virale of bacteriële expressie systemen29,30, waardoor de complexiteit van het screeningproces toeneemt. Chemische peptide Bibliotheken voorkomen dit probleem, ten koste van het gebruik van ingewikkelde kraal-gebaseerde systemen of meerdere rondes van dure peptide synthese33. Al deze problemen worden omzeild met behulp van een nucleïnezuur bibliotheek. Zodra de initiële bibliotheek is opgericht, zijn de screeningsmethoden snel en ongecompliceerd. De hierin beschreven methode fungeert als een platform voor extra screening rondes, zoals sequentie optimalisatie (aanvullend figuur 4), specificiteits evaluatie (aanvullend figuur 5) of optimalisatie van modulerende elementen van Nuclease activiteit, zoals metaal cofactoren (typisch divalente kationen) en chelatoren, die zeer nuttig zijn om de specificiteit van de geselecteerde sondes te vergroten (aanvullend figuur 6).
De kinetische fluorometrische test die in deze studie wordt gebruikt, kan worden geoptimaliseerd voor zowel bacteriële als cellulaire culturen, waarbij de screening wordt uitgevoerd in gebruiksvriendelijke microtiterplaten. In het geval van cellulaire testen, dit protocol is compatibel met zowel, schorsing en monolaag culturen, die, post-optimalisatie, kan worden gebruikt volgens de behoeften van de in vitro model wordt bestudeerd. We hebben verschillende kritieke stappen geïdentificeerd die voorafgaand aan de screening moeten worden geoptimaliseerd. Deze omvatten het celgetal of bacteriële dichtheid te worden getest, sonde concentratie, fluorometer detector gain instellingen of de uitvoering van ingebouwde achtergrondcorrectie methoden. Een beperking van deze technologie is de noodzaak van een veranderde Nuclease activiteit in verband met de pathologische conditie van belang. Zonder deze functie is de screening benadering voor de selectie van kandidaatsondes niet haalbaar. Een andere beperking is het zelfbluchende vermogen van guanines wanneer ze zich in de nabijheid van de fluorophore bevinden. Deze eigenschap moet worden overwogen bij het ontwerpen van de bibliotheek.
Het enzymatische karakter van de gemeten reactie maakt het noodzakelijk om de laadtijden van de plaat te overwegen. Het minimaliseren van laadtijden zal de achtergrond verschillen tussen verschillende experimentele omstandigheden verminderen. Er zijn verschillende opties om dit probleem te verhelpen, zoals het vertragen van de enzymatische reactie tijdens het laden met behulp van ijskoude reagentia, of het gebruik van geautomatiseerde laadsystemen, hoewel de laatste de kosten aanzienlijk verhoogt, maar ook de doorvoer. Bovendien zijn kinetische metingen een grote verbetering ten opzichte van statische metingen, wat een compleet en realistischer beeld geeft van de dynamiek van de katalytische activiteit van nucleasen.
Kortom, ons protocol biedt een veelzijdige, robuuste en reproduceerbare screeningsmethode voor de identificatie van gevoelige en specifieke nucleïnezuur voelers voor de detectie van Nuclease activiteit in verband met de ziekte, die overkomt grote hindernissen van alternatieve screeningsmethoden. We verwachten dat deze screening technologie de ontwikkeling van nieuwe diagnostische hulpmiddelen in een veelheid aan omstandigheden mogelijk maakt, met gemakkelijke translatability naar de kliniek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Luiza I. Hernandez (Linköping University) erkennen voor haar zorgvuldige revisie van het manuscript en waardevol advies. Dit werk werd gesteund door de Stichting Knut en Alice Wallenberg en de strategische onderzoeksruimte van de Zweedse overheid in Materials Science over geavanceerde functionele materialen aan de Universiteit van Linköping (faculteits subsidie SFO-mat-LiU nr. 2009-00971).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black bottom, non-treated 96 well plate | Fisher Scientific | 10000631 | |
| Cytation1 | BioTek | CYT1FAV | |
| Eppendorf tubes | Thermofisher | 11926955 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Microbank cryogenic storage vial containing beads | Pro-Lab Diagnostics | 22-286-155 | |
| Nucleic acid probes | Biomers.net | # | |
| Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2 | Gibco™ | 14040117 | |
| Salmonella enterica subs. Enterica | ATCC | 14028 | |
| Tris-EDTA | Fisher Scientific | 10647633 | |
| Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood | Thermo Fisher Scientific | 10362223 | |
| Tryptic Soy Broth | Sigma Aldrich | 22092 |
References
- Yang, W. Nucleases: diversity of structure, function and mechanism. Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).
- Mason, P. A., Cox, L. S. The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing. Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).
- Berends, E. T., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).
- Kiedrowski, M. R., et al. Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease. PLoS One. 9 (4), 95574 (2014).
- Morita, C., et al. Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity. PLoS One. 9 (8), 103125 (2014).
- Hasegawa, T., et al. Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes. Microbiology. 156, Pt 1 184-190 (2010).
- Moon, A. F., et al. Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae. Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).
- Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria. Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).
- McDermott-Roe, C., et al. Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function. Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).
- Wang, Y. T., et al. A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA. Cell Death & Disease. 7 (11), 2458 (2016).
- Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay. RNA. 24 (5), 739-748 (2018).
- Wan, L., et al. MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors. Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).
- Keyel, P. A.
- Hernandez, F. J., et al. Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe. Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).
- Flenker, K. S., et al. Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity. Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).
- Kannan, N., Eaves, C. J. Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis. Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).
- Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease. International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).
- Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines. European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).
- Fujibayashi, K., et al. Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction. Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).
- Kawai, Y., et al. Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction. Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).
- Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer. Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).
- Machado, I., et al. Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes. Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).
- Worthington Biochemical Corporation. Manual of Clinical Enzyme Measurements. , Worthington Diagnostics. (1972).
- Burghardt, E. L., et al. Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia. PLoS One. 11 (6), 0157234 (2016).
- Bibette, J.
- Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. Aptamers overview: selection, features and applications. Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).
- Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. Phage display: concept, innovations, applications and future. Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).
- Skerra, A. Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities. FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).
- Ku, T. H., et al. Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing. Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).
- Jayasena, S. D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).
- Gray, B. P., Brown, K. C. Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides. Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).
