Summary
כאן אנו מתארים את ההטמעה והפרשנות של התוצאות של שיטת ההתחדשות הכמותית העצמית של ממוגרפיה.
Abstract
בלוטת החלב מתאפיינת ביכולת התחדשות נרחבת, כאשר היא עוברת שינויים הורמונליים מסיבי במהלך מחזור החיים של הנקבה. תפקידה של תאי גזע הפטמות מלמד באופן נרחב הן בהקשר הפיזיולוגי/ההתפתחותי והן ביחס לסרטן השד. בהיבט זה, מחקרים vivo ex התמקדו במאפייני MaSC מבוקשים מאוד אחרי. תרביות ממוגרפיה מייצגות תחליף של היווצרות איברים והפכו לכלי רב ערך עבור מחקר בסיסי וטרנסלייתי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור הדור של התרבויות הראשיות של murine וכימות של תכונות הצמיחה של MaSC. הפרוטוקול כולל איסוף ועיכול בלוטת החלב, בידוד תאי האפיתל הראשוניים של החלב (MECs), הקמת תרבויות ממוגרפיה ראשיות, הפסנות סדרתית, כימות ממוגרפיה של פרמטרי גדילה ופרשנות של התוצאות. כדוגמה, אנו מציגים את ההשפעה של ביטוי ברמה נמוכה מכונן Myc על נורמלי MECs המוביל לחידוש עצמי מוגבר והתפשטות.
Introduction
בידוד ובתרבות החוץ-גופית בתאי הגזע האפיתל של הפטמות הפכו להיות חיוניים להבנת המאפיינים שלהם בביולוגיה של תאי החלב. שושלת היוחסין אלגנטי השתלת סדרתי בחני הופעלו המחקר של תאי גזע (ה scs) וקבוצות מערכות אחרות של רקמות בהקשר של שלהם vivo נישה. עם זאת, גישה זו היא זמן רב ודורש את הדור של מודלים העכבר הכתבת1,2,3,4,5. לכן, בתרבות החוץ-גופית ובהפצת תאי גזע הפטמות (מצות) תוך שמירה על תכונות מרכזיות של מפתח, כלומר התחדשות עצמית ויכולת בידול, הוא אחד האתגרים הגדולים ביותר בתחום. בשנים האחרונות, שיטת ממוגרפיה היתה בשימוש נרחב כדי לדגמן הן רקמת החלב הרגיל ואת הצמיחה סרטן השד, כדי לכמת ה scs נורמלי או סרטן (CSCs) ולהעריך יכולת התחדשות עצמית שלהם ככתב פונדקאית של פעילותם בהתאמה שלהם vivo ההקשר6,7,8,9,10,11.
שיטת הממוגרפיה הינה גישה יעילה וחסכונית, שבה תאי האפיתל מבודדים טריים (MECs) הם מתורבתים בתנאים שאינם מחסיד, עם ההנחה שרק מסקארי ישרוד ויוצרים כדורים בהשעיה בעוד כל סוגי התא האחרים ימותו על ידי אנואיקיס. יתרה מזאת, היכולת ליצור מספר דורות של ממוגרפיה במעברים סדרתיים לא-מיוצרים קשורה ליכולת ההתחדשות העצמית של מסקארי6,9,11. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט של שיטת ממוגרפיה כמותית, אשר פותחה בתחילה על ידי dontu ועמיתיו7 כשינוי של הגדרת הנוירוספירה החלוצית12, המאפשר צמיחה של הבנה ה scs בתנאים ללא מחסיד, סרום ללא התוספת של גורמי הצמיחה המתאימים7,12.
Protocol
בהליכים vivo בוצעו בהתאם להנחיות האיחוד האירופי 2010/63 ולאחר אישור ועדת האתיקה המוסדית שלנו (האורגניזם לרווחתם של בעלי חיים-OPBA) ומשרד הבריאות האיטלקי (מספרי IACUC 762/2015 ו537/2017).
1. איסוף ועיכול בלוטת החלב מוריין
- לניסוי טיפוסי, הקריבו 8-10 שבועות עכברים נקבה בתולה על ידי CO2 שאיפת. בהתאם למטרות הניסוי, השתמש ב5-30 עכברים. הניחו את העכברים על לוחות החיתוך מתחת למכסה המנוע. השתמש במחטים כדי למתוח את הפורליבס ולשטוף את הפרווה של בעל החיים באתנול.
- הרם את העור עם מלקחיים ובצע חתך אנכי החל ברמה של אזור האגן והזזת כל הדרך אל צוואר הרחם, מותיר את הצפק ללא פגע. כדי להימנע מלבשל את העור או את הצפק, השתמש במספריים מעוגלים.
- מנתק בזהירות את העור מהגוף בתנועות עדינות של המספריים מעבר לציר הרוחב של הגוף.
- לאחר העור הוא מנותק לחלוטין מאזור החזה והבטן, לבצע ארבעה חתכים על פני ארבע הגפיים של החיה ולהצמיד את העור עם מחטים. השתמש במספריים ומלקחיים כדי לנתק באופן מלא את גוף החיה מהעור המורחב.
- השתמש מלקחיים כדי להרים בעדינות את רפידות שומן החלב כי הם חשופים עכשיו לגמרי ובזהירות לנתק אותם מן העור בעזרת המספריים. לאסוף את בלוטות החלב התחתון ואת הבטן הפטמות של כל עכבר ולטבול אותם בתמיסת פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS), בצינור 50 mL. לאסוף עד 20 בלוטות לכל צינור. . השאר את הרקמות על הקרח
הערה: במקרה הצורך, הבלוטות יכולות להישאר על קרח בלילה. . זו נקודת עצירה בטוחה יש לבצע את הפעולות הבאות בתנאים סטריליים. - להכין ולסנן את מדיום העיכול: מדיום שונה של Dulbecco של הנשר (DMEM) שיושלם עם 2 מ"מ גלוטמין, 100 U/mL פניצילין, 100 μg/mL סטרפטומיצין, 200 U/mL הקולגן ו100 μg/mL hyaluronidase (ראה טבלת חומרים).
- העברת עד 20 בלוטות לצלחת פטרי 100 מ"מ והוא את הרקמה באמצעות אזמל או מספריים מעוקלים. הימנע העברת כמויות גדולות של DPBS למנה.
- הוסיפו 10 מ ל של מדיום העיכול לכל צלחת פטרי והעבירו את הרקמה הקצוצה לצינור החרוט ב50 מ"ל, באמצעות פיפטה בגודל 25 מ ל.
- אטום את הצינורות עם parafilm ולמקם אותם על מסובבי. הגדר את הסובבי במהירות נמוכה (0.03 x g) ו-דגירה עבור 2.5 h ב 37 ° צ' באווירה לח המכיל 5% CO2.
- בחן באופן חזותי את ההשעיה לפני שתמשיך בשלבים הבאים. אם הרקמה הגדולה של רקמות נשארות לא מתעכלת, הארך את הדגירה ב-37 ° צ' לעוד 30 דקות.
הערה: כחלופה, את העיכול ניתן לבצע לילה ב 37 ° c, 5% CO2, באמצעות הקולגן העדין/הhyaluronidase האנזים מיקס13.
2. בידוד של משפחת מוריין הראשי
- לעצור את המסובבי ולהסיר את הצינורות מן החממה. התאימו טיפ P1000 בפתיחת פיפטה בגוון של 5 מ ל. אם ההשעיה עוברת דרך הקצה P1000, המשך לשלבים הבאים. אחרת, הארך את הדגירה ב-37 ° c לעוד 30 דקות.
- צנטריפוגה ב 100 x g, עבור 5 דקות ב 4 ° c. והשהה את הגלולה של כל צינור ב 3 מ ל של DPBS.
הערה: מהירות צנטריפוגה נמוכה מאפשרת הסרה של לימפוציטים ותאי רקמת השומן. מניפולציה עדינה נדרשת כדי להימנע מפירוק הגלולה בשלב זה. - מסננים את התא הבולם בכל צינור בנפרד, באמצעות 100, 70 ו 40 יקרומטר משתמשים בתאים. בכל שלב סינון, לשטוף את הסטרוונים עם 2 מ ל של DPBS לפני איסוף המעבר.
הערה: מנקודה זו והלאה, השעיות התא יכולות להיות מעובדות ומעובדים יחד. - צנטריפוגה ב 300 x g, עבור 5 דקות ב 4 ° c. הענק בקפידה את הסופרנטאנט והשהה מחדש את התאים בנפח הנותר של DPBS.
- המשך לליזה תא הדם האדום (RBC) על ידי הוספת נפח שווה של מאגר הליזה אמוניום-כלוריד (ACK) (ראה טבלת חומרים). מערבבים על ידי ליטוף ו הדגירה על הקרח עד 5 דקות.
- הוסף 10 מ ל של DPBS ו צנטריפוגה ב 300 x g, עבור 5 דקות ב 4 ° c. שימו לב לגבי הסופרנטאנט ובדקו באופן חזותי את הגלולה. , אם הגלולה לבנה. המשך לשלב הבא לאחר מכן חזור על שלב הליזה RBC (שלב 2.5).
- השהה מחדש את הגלולה בתא 1-5 מ ל של ממוגרפיה: הגידול בתוך התאים האפיתל של הפטמות בינונית (MEBM), שיושלם עם 2 מ"מ גלוטמין, 100 U/mL פניצילין, 100 μg/mL סטרפטומיצין, 5 μg/mL אינסולין, 0.5 μg/mL הידרוקורטיזון, 2% B27, 20 ng/mL גידול באפידרמיס (EGF), 20 ng/mL מקדם גדילה בסיסי הצמיחה (bFGF) ו 0.4 IU/mL הפארין (ראה טבלת חומרים
3. ציפוי מחדש של ממוגרפיה טורית
- להקמת תרבויות ממוגרפיה, צלחת התאים על התרבות הלא רקמה שטופלו (הדבקה נמוכה במיוחד) 6-היטב צלחות בצפיפות של 200,000 תאים קיימא/mL במדיום ממוגרפיה. דגירה את התאים עבור 7-10 ימים ב 37 ° c, 5% CO2.
- להכין ולסנן 1% פולי-HEMA פתרון ב 95% אתנול (ראה טבלת חומרים). מעיל הדבקה נמוכה 6-צלחות היטב עבור המעברים הבאים, על ידי הוספת 400 μL של 1% פולי-HEMA פתרון לכל טוב ומאפשר לאתנול להתייבש לחלוטין. לקבלת תוצאות טובות יותר, חזור על הציפוי פעמיים.
הערה: השימוש בלוחות שאינם מצופים במהלך המעבר הראשון מאפשר הסרה סלקטיבית של פיברופומטרים מהתרבות. - בסוף התרבות 7-10 ימים, לאסוף את הממוגרפיה העיקריים מכל הבארות והצנטריפוגה ב 300 x g, עבור 5 דקות ב 4 ° c.
- השתמש בזהירות על הסופרנט והמשך לדיסוציאציה המכנית של הממוגרפיה באמצעות פיפטה P200 עם עצות מסוננות. פיפטה במשך כ 100 פעמים ולבחון באופן חזותי את ההשעיה לנוכחות של מיורואידים גדולים.
הערה: דגירה קצרה (2-5 דקות) של כדור הכדור בנפח נמוך (0.2-0.5 mL) של טריפסין או המאקיאז ב-37 ° c, 5% CO2, ניתן להשתמש כדי להקל על דיסוציאציה מכנית. הכינו בינונית ממוגרפיה טרייה (שלב 2.7) לציפוי של כל מעבר. - השהה מחדש ב-1-5 mL של אמצעי ממוגרפיה טריים וספור את התאים הניתנים לקיימא. אם ישים, פצל את התאים בקבוצות טיפול או בתנאי תרבות.
- הלוח 20,000 תאים קיימא/mL על פולי HEMA-מצופה הדבקה נמוכה במיוחד 6-היטב צלחות ו דגירה ב 37 ° c, 5% CO2.
הערה: כדורי ממוגרפיה מגיעים לגודלם המירבי בתוך 5-7 יום לאחר ציפוי התאים. במידת האפשר, הפץ את התאים של כל דוגמה או תנאי למספר בארות כדי להשיג שכפול טכני. צפיפות הציפוי צריכה להישמר כנמוכה כדי להימנע מצבירת תאים. מקסימום של 20,000 תאים/mL מומלץ עבור הצלחות 6-טוב ו 5,000 תאים/mL עבור לוחות 24-טוב. - לאחר 5-7 ימים, ספור את מספר הספירות בבאר. ניתן לבצע זאת גם באופן ידני, באמצעות מיקרוסקופ המצויד בעדשת הגדלה של 10x, או באמצעות ניתוח תמונה דיגיטלי (ראה שלב 4).
- אספו את ממוגרפיה של כל באר בנפרד וצנטריפוגה ב 300 x g, עבור 5 דקות ב 4 ° c.
- השתמש בזהירות על הסופרנט והמשך לדיסוציאציה המכנית של הממוגרפיה באמצעות פיפטה P200 עם עצות מסוננות. פיפטה במשך כ 100 פעמים ולבחון באופן חזותי את ההשעיה לנוכחות של מיורואידים גדולים.
- השהה מחדש 1 מ ל של בינונית ממוגרפיה טרייה וספור את התאים הניתנים לקיימא. מאגר התאים של כל דוגמה או תנאי וחזור על שלבים 3.6-3.10. הקלט את מספר מצופה התאים ואת מספר הספירות והתאים שנספרו לכל מעבר. המשך לשלב 5 עבור חישוב הגידול המצטבר.
4. ספירת כדור באמצעות ניתוח תמונה דיגיטלית (DIA)
- בסוף כל מעבר, לסרוק את המשטח כולו של כל הבארות ולרכוש תמונות של התחומים באמצעות מצלמה דיגיטלית רכוב על סטריאוסקופ. שמור את התמונות כקבצי tif.
- יבא את תמונות הסטריאוסקופ כרצף תמונות באמצעות imagej14. הגדר את קנה המידה ואת סוג התמונה ל-8 סיביות.
- שכפל את ערימת התמונות ובחר ' הפחת רקע ' מתהליך הטאב בשורת התפריטים. בדוק את האפשרויות רקע אור הזזה paraboloid ולחץ על לחצן אישור. עבד את כל התמונות של המחסנית.
- בחר ' התאם ' ולאחר מכן לסף מתמונת הטאב של שורת התפריטים. על-ידי לחיצה על החל, חלון דיאלוג שכותרתו המרת מחסנית לבינארי יופיע. בחר באפשרות ברירת מחדל כפעולת שירות ואור כרקע. בדוק את סף חישוב התיבה עבור כל תמונה ולחץ על הלחצן אישור.
- בחר ברצף את פרשתהדרך של הפקודות, פתח ולשחוק מהרשימה הבינארית תחת תהליך הטאב של שורת התפריטים. לעבד את כל התמונות של המחסנית על ידי לחיצה על לחצן כן של תיבת הדו שמופיעה.
הערה: תהליכים אלה מאפשרים פילוח חזותי של אובייקטים הנוגעים, החלקת אובייקטים והסרת פיקסלים מקצה האובייקטים. - בחר את הפונקציה לנתח חלקיקים מהתפריט לנתח. הגדר את סף הגודל המינימלי ב-10,000 יקרומטר2 ומעגליות בין 0.50 ל-1.00. בחר את האפשרות אליפסות מהתפריט הנפתח Show . בדוק סיכום, להוציא על הקצוות באתרו הצג ולחץ על הכפתור אישור. עבד את כל התמונות של המחסנית.
- בחן באופן חזותי את התכתובת של האליפסות עם הספירות, ובמידת הצורך, תקן את ספירת החלקיקים בהתאם. סכם את הספירות מכל המסגרות של כל באר כדי לקבל את הספירה הכוללת של ממוגרפיה בבאר.
5. חישוב עקומת הצמיחה המצטבר
הערה: מספר כדורי הממוגרפיה שנספרו בכל באר בסוף כל מעבר (Pn) משקף את מספר התאים המתחילים בממוגרפיה הנזרע בתחילת Pn.
- עבור כל מעבר (PN), רשום את מספר התאים הנמצאים בציפוי ואת מספר התאים והספירות הנספרות בטוב. חישוב גודל הכדור בסוף כל מעבר:
גודל הספרה Pn (תאים/כדור) = תאים שנספרו pn /כדורים שנספרו pn
הערה: גודל הספרה ב-Pn הוא מידה של הפוטנציאל הגדול של כל ממוגרפיה-תא היוזם שנזרע ב PN. - להסיק את מספר התחומים המצופים על-ידי חלוקת מספר התאים המצופים ב-Pn לפי גודל הספירה המחושב בסוף המעבר הקודם (Pn-1):
כדורים מצופה Pn = תאים מצופה pn /כדור גודל PN-1
הערה: באמצעות האמנה, גודל הספירה הוא הניח יציב במהלך המעבר הראשון של התרבות (כלומר, גודל הספירה P0 = כדור גודל p1). אם מספר בארות משמשות כעותקים טכניים, השתמש בגודל התחום הממוצע ב-P N-1 כמכנה. - חשב את מספר התאים והספרה המצטברים עבור כל מקטע:
מספר מצטבר Pn = (ספירה pn /מצופה pn) X מספר מצטבר pn-1.
הערה: באמצעות האמנה, מספר מצטבר P0 = מצופה p1. אם משתמשים בבארות מרובות כעותקים טכניים, חשב את המספר המצטבר הממוצע לכל דוגמה או תנאי עבור כל מעבר. - התווה את נקודות הנתונים בקנה מידה חצי לוגריתמי. הצגת מספר המעבר (P0 עד PN) בציר x (קנה מידה ליניארי) ומספר התא או הספרה המצטבר בציר y (סרגל לוגריתמי).
- התאם קו מגמה אקספוננציאלי לנקודות הנתונים וחשב את מקדם הנחישות (R2) כדי למדוד את טוב ההתאמה.
הערה: שורת המגמה המותאמת לנקודות הנתונים צריכה להיות משוערת לעקומה מעריכית, כמצופה עבור אוכלוסיית תאים הגדלה או מתה עם קצב קבוע. R2 מקבל ערכים בין 0 ל-1, עם ערכים הקרובים ל-1 המציינים התאמה טובה יותר. - מתארים את המשוואה של קו המגמה כפונקציה מעריכית טבעית כדי להסיק את קצב הצמיחה (GR) של התרבות:
y = y0 e(GR) x, כאשר y0 הוא הערך של y כאשר x = 0.
Representative Results
Myc ביטוי יתר ברגיל MECs, מוביל לתדר מוגבר של ממוגרפיה ליזום תאים. הדבר מושג באמצעות מנגנון כפול: Myc מגדיל את שיעור החלוקה הסימטרית של MaSC ואת תדירות התכנות מחדש לתוך מסקארי חדשים11. כדי לבדוק את ההשפעה של ביטוי מכונן נמוך, השתמשנו Rosa26-Myc מודל העכבר הטרנסגניים, שבו פעילות Myc יכול להיגרם על ידי 4-הידרוקסיטמוקסיפן (4-OHT)15. אנו מצופה לראשונה את MECs על הדבקה נמוכה במיוחד 6-צלחות להסרת פיברוהפיצוצים, בהעדר של 4-OHT. לאחר המעבר הראשון, נחלק את התרבות בשתיים: שתי בארות לא טופלו (שליטה) ושתי בארות טופלו עם 200 ננומטר 4-OHT (MycER). ספרנו את הספרה ואת מספרי הטלפון של 5 מעברים רצופים לשלושה ניסויים עצמאיים (שולחן 1). מספרי התאים והספירה המצטברים לכל מעבר מוצגים בטבלה 2. האינדוקציה עם 4-OHT מוביל את הספירה מוגברת שיעורי צמיחה התא, כפי שמוצג באיור 1.
איור 1: תוצאות מייצגות. כדור מצטבר (A) ו-Cell (ב) הצמיחה עקומות של שליטה ומיסר ממוגרפיה. ממוצע וסטיית התקן של 3 ניסויים עצמאיים מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| ציפוי ראשון | ציפוי שנייה | ציפוי שלישי | ציפוי 4 | ציפוי 5 | ||||||||||||
| ציפוי תאים | ספירת תאים | ספירת הספירה | ציפוי תאים | ספירת תאים | ספירת הספירה | ציפוי תאים | ספירת תאים | ספירת הספירה | ציפוי תאים | ספירת תאים | ספירת הספירה | ציפוי תאים | ספירת תאים | ספירת הספירה | ||
| Exp1 | פקד | 77,000 | 50,000 | 31 | 65,000 | 58,500 | 41 | 57,000 | 30,000 | 32 | 30,000 | 22,000 | מיכל 5 | 22,000 | 0 | 0 |
| 77,000 | 81,000 | 41 | 65,000 | 55,000 | 23 | |||||||||||
| מינצר | 77,000 | 31, 0000 | 193 | 80,000 | 375,000 | 323 | 80,000 | 380,000 | 217 | 80,000 | 220,000 | 223 | 80,000 | 170,000 | 155 | |
| 77,000 | 110,000 | 142 | 80,000 | 505,000 | 396 | 80,000 | 270,000 | 149 | 80,000 | 290,000 | 194 | 80,000 | 250,000 | 160 | ||
| Exp2 | פקד | 75,000 | 75,000 | 71 | 60,000 | 17,000 | 34 | 28,000 | 45,000 | 29 | 45,000 | 13,000 | 2 | 13,000 | 0 | 0 |
| 75,000 | 47,000 | 45 | 60,000 | 11,000 | 47 | |||||||||||
| מינצר | 75,000 | 200,000 | 188 | 80,000 | 225,000 | 277 | 80,000 | 230,000 | 155 | 80,000 | 210,000 | 211 | 80,000 | 100,000 | 95 | |
| 75,000 | 250,000 | 192 | 80,000 | 202,500 | 283 | 80,000 | 305,000 | 185 | 80,000 | 160,000 | 237 | 80,000 | 100,000 | 133 | ||
| Exp3 | פקד | 82,500 | 130,000 | 121 | 80,000 | 45,000 | 105 | 80,000 | 110,000 | 86 | 80,000 | 58,500 | 75 | 58,500 | 58,500 | 78 |
| 82,500 | 125,000 | 177 | 80,000 | 71,250 | 42 | |||||||||||
| מינצר | 82,500 | 325,000 | 457 | 80,000 | 610,000 | 327 | 80,000 | 367,000 | 309 | 80,000 | 500,000 | 260 | 80,000 | 115,000 | 146 | |
| 82,500 | 475,000 | 463 | 80,000 | 455,000 | 392 | 80,000 | 415,000 | 204 | 80,000 | 470,000 | 295 | 80,000 | 185,000 | 161 | ||
טבלה 1: מספרי כדורים שנספרו ומספרים של תאים מצופים ונספרים בכל מעבר.
טבלה 2: חישוב מספרי כדור מצופה ומספרי כדור מצטבר ותאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של טבלה זו. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
Discussion
כאן, אנו מתארים פרוטוקול לתיאור כמותי של מאפייני צמיחה MaSC בתוך מבחנה. כדוגמה, אנו מציגים את ההשפעה של ביטוי מכונן מסתורי ברמה נמוכה על מסקארי מורטין רגיל. גישה זו, עם זאת, ניתן להחיל באופן שווה על הקשרים שונים. התאים הראשוניים אנושיים או מורקיים, כמו גם קווי התאים הקבועים, יכולים להיות מתורבתים באנקורג ' תנאים עצמאיים כדי ליצור תרבויות ממוגרפיה שיכול להיות החוצה באופן סדרתי. ביטוי גנטי יתר והפרעות RNA ניתן להציג בקלות בפרוטוקול עם תוספת של צעד ויראלי התמרה בסוף המעבר הראשון (אחרי שלב 3.5). לחילופין, ניתן להידבק בתאים ולאחר מכן מצופים בהם כספירות ממוגרפיה.
היבט קריטי של הבקשה המוצגת כאן הוא צפיפות התא זריעה, אשר צריך להיות נמוך מספיק כדי למנוע את הדור של אגרגטים להפריע הפרשנות של התוצאות16,17. המבנה של הממוגרפיה יכול להיות אינפורמטיבי כדי לפתור את העמימות הזו. יש לספור רק כדורים דחוסים בסוף כל מעבר. יש לקחת בחשבון גם את המעגל של הספרואידים ואת הגודל. באמצעות התהליך האוטומטי של ה-DIA, שלב זה מובטחת עם סף מתאים באופן אובייקטיבי ומוחלט. לעתים קרובות, ושלתי יוצרים מבנים שכבתית או אשכולות קטנים יותר של תאים שצריכים להיות כלולים בספירות הממוגרפיה. ככלל אגודל, אנו משתמשים מסף של קוטר 100 יקרומטר. לבסוף, יש לנקוט בטיפול כדי למנוע העברה של ממעברות שלמות או לא-מלאה ממעבר אחד למשנהו. מצד שני, ליטוף עודף יוביל למוות תאים מוגבר. לפיכך, אם נתקלים בקשיים כאלה, מומלץ להשתמש בטריסיזציה קלה או בטיפול במאהבורסה ולהעביר את הספירות השבולים באמצעות מסננת של 40 יקרומטר כדי להבטיח את הדור של השעיות בתאים בודדים.
השימוש בספירה יעילות (SFE) שימש לחילופין, כתחליף לvivo SC או CSC לשעבר לפני הספירה בתרבויות ממוגרפיה. SFE הוא אכן מדד של תאים כמו גזע באוכלוסיית תאים נתונה. עם זאת, היא מייצגת גישה פחות מצפונית, שכן היא מספקת מידע רק בנקודות זמן נפרדות. החישוב של מספרי כדור מצטבר והדור של עקומות גדילה מצטברות, במקום זאת, מאפשר את היסק של שיעור הצמיחה של התרבות מן הצעד הראשוני הזריעה התאים עד התרבות מתיש או, במקרה של תרבויות מונצח, עבור מספר הפסקאות הרצוי. הערכת המאפיינים של הצמיחה מאפשרת את הערכת הסטייה מהגידול האקספוננציאלי דרך המקדם R2 , ובשלב השני, הערכה של ערך ה-GR עצמה.
חשוב לעשות זאת, ניתן להשתמש בעקומות הצטברות ממוגרפיה מצטברת כדי להעריך את ההשפעה של מעכבי מולקולות קטנות או תרופות כימותרפיות אחרות באופן סלקטיבי ב-CSC level6,11. בניגוד ממוגרפיה ראשונית נורמלי, אשר מבחינה פונקציונלית הפליטה ב 5-7 מעברים, ממוגרפיה הגידול נוטים להתרחב ללא הגבלת זמן. תכונה זו מקושרת ליכולת החידוש העצמי הבלתי מוגבלת של CSC. ההשפעות על הפצת ו CSC עצמית התחדשות יכול להיות בלתי מצמידים באמצעות הדור של תאים סרטניים ממוגרפיה הצמיחה עקומות, בהתאמה. אפקט מסוים של CSC צפוי לגרום לירידה בקצב הגדילה המצטבר של ממוגרפיה, עם או ללא השפעה על קצב צמיחת התאים המצטבר6,11.
בסופו של דבר, תחום אחר של עניין הוא אחד הרקמה למבוגרים SC תכנות מחדש. בגדלים מסוימים של ממוגרפיה מורכב מאוכלוסיית תאים הטרוגנית בדרך כלל, בה רק שבר מזערי שומר על תכונות כמו גזע, כולל יכולת התחלת ממוגרפיה והתחדשות בלוטת החלב על השתלת vivo6,9,11,18,19. ושלתי הפטמות יכול להיות מבודד כך גם באמצעות התווית מחוץ ליחידה שמירה בחני6,9,11 או, ex vivo, באמצעות סמנים שטח הוקמה2,3. בעיקר, ושלתי הפטמות אינן שורדות אנואיקיס ואינן מאפשרות ליצור כדורים ממוגרפיה. ביטוי Myc שנאכף הוכח להעניק פוטנציאל חניכה של ממוגרפיה לושלתי הפטמות מבודדים כ-PKHneg ינוס11, וכתוצאה מכך הדור של תרבות שיכול להיות מיושן לנצח. באופן דומה, ניתן לבדוק הפרעות של הרגולטורים השליליים של תכנות משנה פיזיולוגית תוך שימוש באותה שיטת. בהקשר זה, בעיה נפוצה שעלולה להתעורר היא המספר המוגבל של קלט תאים. אם הקלט תא נמוך מ-10,000 תאים, אנו ממליצים לזריעה בלוחות 24-לוחות (מקסימום 5,000 תאים בעלי קיימא/mL). אף על פי כן, האנקורג ' התנאים העצמאיים התרבות יכול להיות הוכח קשה מדי עבור הבקיע מתכנות, במיוחד במקרים שבהם אפקט התיכנות מתכנות אינו מיידי. במקרים כאלה, השימוש במטריצה תומכת ובתרבויות תלת ממדיות של האורגנואיד יכול להיות מתאים יותר ל-20.
באופן כללי, שיטת הממוגרפיה היא אפשרות חסכונית שניתן לעבוד בקלות עבור מאפיינים כמו גזע הבקיע באוכלוסיות מואליות נורמליות ומוסריות. הגישה הכמותית הנלקחת בפרוטוקול זה מקלה על ההשוואות בין תרבויות שבוצעו בתנאים שונים או חשופים לגירויים מגוונים. כאשר בעקבות בקפדנות, הוא מספק מערכת פשוטה יחסית ex vivo מודל המאפשר uncoupling של שחקנים מרובים המגדירים תכונות גזע ב vivo, המציע את האפשרות של לימודים מפורטים יותר מכונאי.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים לברונו אמאטי על המתנה האדיבה של דגם העכבר הטרנסגניים Rosa26-MycER. עבודה זו ממומנת על ידי מענקים WWCR, AIRC, ERC, ואת משרד הבריאות האיטלקי P.G.P. טלוויזיה ו X.A. נתמכים על ידי FIRC ו-א ' י על ידי מענק FUV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysis buffer | Lonza | 10-548E | Ammonium-chloride-potassium lysis bufer, 100 mL. |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | B27 supplement 50X (10 mL). Final concentration 2% v/v. |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Human recombinant fibroblast growth factor - basic, 50 μg. Stock solution 100 μg/μL in Tris 5 mM pH 7.6. Final dilution 0.02% v/v. |
| Collagenase | Sigma | C2674 | Collagenase from Clostridium histolyticum. Type I-A, lyophilized powder, 1 g. Stock 20,000 U/mL in DMEM. Final dilution 1% v/v. |
| DMEM | Lonza | 12-614F | Dulbecco's modified Eagle's medium |
| DPBS | Microgem | S17859L0615 | Dulbecco's phosphate buffered saline |
| EGF | Tebu-Bio | AF-100-15 | Recombinant human epithelial growth factor. Stock solution 100 μg/mL in sterile dH2O. Final dilution 0.02% v/v. |
| Glutamine | Lonza | 17-605E | L-Glutamine, 200 mM. Final dilution 1% v/v. |
| Heparin | PharmaTex | 34692032 | Stock concentration 5,000 IU/mL. Final dilution 0.008% v/v. |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Type IV-S, powder, 750-3,000 U/mg solid, 30 mg. Stock solution 10 mg/mL in sterile dH2O. Final dilution 1% v/v. |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 μg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
| Insulin | SAFCBiosciences | 91077C | Insulin, human recombinant, dry powder, 250 mg. Stock concentration 1 mg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
| Low attachment 6-well plates | Corning | 351146 | Sterile 6-well not treated cell culture plates with clear flat bottom and lid. |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary epithelial cell growth basal medium |
| Penicllin-Streptomycin mixture | Lonza | 17-602F | Contains 10,000 U potassium penicillin and 10,000 µg streptomycin sulfate per mL in 0.85% saline. Final dilution 1% v/v. |
| Poly-HEMA | Sigma | P3932 | Dissolve in 95% EtOH overnight at 55 °C. Stock concentration 12% w/v. Final dilution 1% v/v in 95% EtOH. Filter (0.22 μm) before use. |
References
- Kordon, E. C., Smith, G. H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- van Amerongen, R., Bowman, A. N., Nusse, R. Developmental stage and time dictate the fate of Wnt/beta-catenin-responsive stem cells in the mammary gland. Cell Stem Cell. 11 (3), 387-400 (2012).
- Van Keymeulen, A., et al. Distinct stem cells contribute to mammary gland development and maintenance. Nature. 479 (7372), 189-193 (2011).
- Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138 (6), 1083-1095 (2009).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Grimshaw, M. J., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Research. 10 (3), R52 (2008).
- Pece, S., et al. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140 (1), 62-73 (2010).
- Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
- Santoro, A., et al. p53 Loss in Breast Cancer Leads to Myc Activation, Increased Cell Plasticity, and Expression of a Mitotic Signature with Prognostic Value. Cell Reports. 26 (3), 624-638 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gao, H., et al. Murine mammary stem/progenitor cell isolation: Different method matters? Springerplus. 5, 140 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Murphy, D. J., et al. Distinct thresholds govern Myc's biological output in vivo. Cancer Cell. 14 (6), 447-457 (2008).
- Bailey, P. C., et al. Single-Cell Tracking of Breast Cancer Cells Enables Prediction of Sphere Formation from Early Cell Divisions. iScience. 8, 29-39 (2018).
- Lombardo, Y., de Giorgio, A., Coombes, C. R., Stebbing, J., Castellano, L. Mammosphere formation assay from human breast cancer tissues and cell lines. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Peng, T., Qinghua, M., Zhenning, T., Kaifa, W., Jun, J. Long-term sphere culture cannot maintain a high ratio of cancer stem cells: a mathematical model and experiment. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Smart, C. E., et al. In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Panciera, T., et al. De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
