Summary
Her beskriver vi gjennomføringen og tolkning av resultatene av en in vitro mammosphere selv fornyelse kvantitativ analysen.
Abstract
Melke kjertelen er preget av omfattende regenerering kapasitet, som det går gjennom massive hormonelle forandringer gjennom hele livssyklusen til en kvinnelig. Rollen til melke stamceller (MaSCs) er viden studert både i fysiologiske/utviklingsmessige sammenheng og med hensyn til brystkreft. I dette aspektet, ex vivo studier fokusert på maske egenskaper er svært ettertraktet. Mammosphere kulturer representerer et surrogat av organ formasjon og har blitt et verdifullt verktøy for både grunnleggende og translational forskning. Her presenterer vi en detaljert protokoll for generering av murine primære mammosphere kulturer og kvantifisering av maske vekst egenskaper. Protokollen omfatter bryst kjertel Oppsamling og fordøyelse, isolering av primær bryst epitelceller (MECs), etablering av primære mammosphere kulturer, seriell passaging, kvantifisering av mammosphere vekst parametre og tolkning av resultatene. Som et eksempel presenterer vi effekten av lavt nivå konstituerende myC uttrykk på normal MECs fører til økt selv-fornyelse og spredning.
Introduction
Isolasjon og in vitro kultur av bryst epitel stammen og stamceller har blitt avgjørende for å forstå deres egenskaper i bryst cellebiologi. Elegant avstamning tracing og seriell transplantasjon analyser har aktivert studiet av stamceller (SCs) og andre vev delsett i sammenheng med deres in vivo nisje. Imidlertid er denne tilnærmingen tidkrevende og krever generering av reporter mus modeller1,2,3,4,5. Derfor, in vitro kultur og forplantning av melke stamceller (MaSCs) mens sparing viktige stemness funksjoner, nemlig selv-fornyelse og differensiering evne, er en av de største utfordringene i feltet. I de siste årene har mammosphere analysen blitt mye brukt til å modellere både normale melke vev og brystkreft vekst, for å kvantifisere normal eller kreft SCs (CSCs) og vurdere deres selv-fornyelse evne som surrogat reporter av sin aktivitet i sine respektive in vivo sammenheng6,7,8,9,10,11.
Den mammosphere analysen er en effektiv og kostnadseffektiv tilnærming, der ferske isolerte bryst epitelceller (MECs) er kultivert i ikke-tilhenger forhold, med forutsetningen at bare MaSCs vil overleve og danne kuler i suspensjon, mens alle de andre celletyper vil dø av anoikis. Videre er evnen til å danne flere generasjoner av mammospheres i serielle ikke-tilhenger passasjer knyttet til selv fornyelse evne til MaSCs6,9,11. Her beskriver vi en detaljert protokoll av en kvantitativ mammosphere analysen, som opprinnelig ble utviklet av Dontu og kolleger7 som en modifikasjon av den banebrytende neurosphere analysen12, slik at veksten av antatte SCs i ikke-tilhenger, serum-frie forhold med tillegg av passende vekstfaktorer7,12.
Protocol
In vivo prosedyrer ble utført i samsvar med EU-direktiv 2010/63 og etter godkjennelse fra vår institusjonelle etikk komité (organisme for dyr velvære-OPBA) og den italienske Helsedepartementet (IACUC Numbers 762/2015 og 537/2017).
1. murine bryst kjertel samling og fordøyelse
- For en typisk eksperiment, offer 8-10 uker gamle jomfru kvinnelige mus av CO2 inhalasjon. Avhengig av målene for eksperimentet, bruk 5-30 mus. Plasser musene på disseksjon boards under en hette. Bruk nåler til å strekke forelimbs og vaske pelsen av dyret med etanol.
- Løft huden med pinsett og utføre en vertikal snitt som starter på nivået av bekkenområdet og flytte hele veien til livmorhalsen, slik at peritoneum intakt. For å unngå rupturing av huden eller peritoneum, bruk rund-kantet saks.
- Forsiktig løsne huden fra kroppen med milde bevegelser av saksen over den laterale aksen av kroppen.
- Når huden er helt løsrevet fra bryst og abdominal området, utføre fire snitt over de fire lemmer av dyret og PIN ned huden med nåler. Bruk saksen og tang for å løsne kroppen av dyret fra den utvidede huden.
- Bruk tang til å forsiktig løfte bryst fett pads som nå er fullt eksponert og forsiktig løsne dem fra huden ved hjelp av saksen. Samle de nedre bryst og abdominal brystkjertler av hver mus og dyppe dem i Dulbecco ' s fosfat bufret saltvann (DPBS), i en 50 mL konisk rør. Samle opp til 20 kjertler per tube. Hold vevet på isen.
Merk: Hvis det er nødvendig, kan kjertlene forbli på isen over natten. Dette er et trygt stoppested. Følgende trinn bør utføres under sterile forhold. - Forbered og Filtrer fordøyelsen medium: Dulbecco ' s modifiserte Eagle ' s medium (DMEM) supplert med 2 mM glutamin, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL Streptomycin, 200 U/mL kollagenase og 100 μg/mL Hyaluronidase (se tabell over materialer).
- Overfør opp til 20 kjertler til en 100 mm Petri parabol og hakke vevet ved hjelp av en skalpell eller buet saks. Unngå å overføre store volumer av DPBS til parabolen.
- Tilsett 10 mL fordøyelsen medium til hver Petri parabolen og overføre hakket vev til en 50 mL konisk rør, ved hjelp av en 25 mL serologisk pipette.
- Forsegle rørene med parafilm og plassere dem på en rotator. Sett Rotator ved en lav hastighet (0,03 x g) og ruge for 2,5 t ved 37 ° c i en fuktig atmosfære som inneholder 5% co2.
- Inspiser suspensjonen visuelt før du går videre til de neste trinnene. Hvis store deler av vevet forblir ufordøyd, forlenger du inkubasjons ved 37 ° c i ytterligere 30 min..
Merk: Som et alternativ, kan fordøyelsen utføres over natten på 37 ° c, 5% CO2, ved hjelp av en mild kollagenase/Hyaluronidase enzym Mix13.
2. isolering av primær murine MECs
- Stopp Rotator og fjerne rørene fra inkubator. Juster en P1000 tupp ved åpningen av en 5 mL serologisk pipette. Hvis suspensjonen passerer gjennom P1000 spissen, går du videre til de neste trinnene. Ellers, forlenge inkubasjons ved 37 ° c for ytterligere 30 min.
- Sentrifuger ved 100 x g, i 5 min ved 4 ° c. Forsiktig Dekanter supernatanten og resuspend pellet av hvert rør i 3 mL DPBS.
Merk: Den lave sentrifugering hastigheten tillater fjerning av lymfocytter og fettvev celler. Lett manipulasjon er nødvendig for å unngå dislodging pellet på dette trinnet. - Filter celle suspensjonen i hvert rør separat, ved hjelp 100, 70 og 40 μm celle siler. Ved hvert filtrerings trinn vasker du siler med 2 mL DPBS før du samler inn pass-through.
Merk: Fra dette punktet, kan cellen suspensjoner bli gruppert og behandlet sammen. - Sentrifuger ved 300 x g, i 5 min ved 4 ° c. Nøye Dekanter supernatanten og resuspend cellene i det gjenværende volumet av DPBS.
- Fortsett til den røde blod cellen (RBC) lyse ved å legge til et lik volum av ammonium-klorid-kalium (ACK) lyseringsbuffer (se tabell over materialer). Bland med pipettering og ruge på isen i opptil 5 min.
- Tilsett 10 mL DPBS og sentrifuger ved 300 x g, i 5 min ved 4 ° c. Forsiktig Dekanter supernatanten og visuelt inspisere pellet. Hvis pellet er hvit, gå videre til neste trinn. Ellers gjentar du RBC lyse steg (trinn 2,5).
- Resuspend celle pellet i 1-5 mL mammosphere medier: bryst epitel cellevekst basal medium (MEBM), supplert med 2 mM glutamin, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL Streptomycin, 5 μg/mL insulin, 0,5 μg/mL Hydrocortisone, 2% B27, 20 ng/mL epidermal vekstfaktor (EGF), 20 ng/mL grunnleggende Fibroblast vekstfaktor (bFGF) og 0,4 IU/mL heparin (se tabell over materialer).
3. seriell Mammosphere re-plating
- For etablering av mammosphere kulturer, plate cellene på ikke-vev kultur behandlet (ultra-lav vedheft) 6-brønn plater ved en tetthet av 200 000 levedyktige celler/mL i mammosphere medium. Ruge cellene for 7-10 dager ved 37 ° c, 5% CO2.
- Forbered og Filtrer 1% Poly-HEMA løsning i 95% etanol (se tabell over materialer). Coat ultra-lav vedheft 6-brønn plater for følgende passasjer, ved å legge 400 μL av 1% Poly-HEMA løsning per brønn og la etanol tørke helt. For bedre resultater, gjenta belegget to ganger.
Merk: Bruken av ikke-belagt plater i løpet av første passasje gjør selektiv fjerning av fibroblaster fra kulturen. - På slutten av 7-10 dager kultur, samle den primære mammospheres fra alle brønnene og sentrifuger på 300 x g, i 5 min ved 4 ° c.
- Forsiktig Dekanter supernatanten og Fortsett til den mekaniske dissosiasjon av mammospheres ved hjelp av en P200 pipette med filtrerte tips. Pipetter for ca 100 ganger og visuelt inspisere suspensjonen for tilstedeværelsen av store spheroids.
Merk: En kort inkubasjons (2-5 min.) av kulen pellet i et lavt volum (0,2-0,5 mL) av Trypsin eller Accutase ved 37 ° c, 5% CO2, kan brukes til å lette mekaniske dissosiasjon. Forbered friskt mammosphere medium (trinn 2,7) for plating av hvert passasje. - Resuspend i 1-5 mL fersk mammosphere medium og telle levedyktige celler. Hvis det er aktuelt, deler du cellene i behandlingsgrupper eller kultur forhold.
- Plate 20 000 levedyktige celler/mL på Poly-HEMA-belagt ultra-lav vedheft 6-brønn plater og ruge ved 37 ° c, 5% CO2.
Merk: Mammospheres nå sin maksimale størrelse innen 5-7 dager etter celle plating. Når det er mulig, distribuerer du cellene i hver prøve eller betingelse til flere brønner for å få tekniske replikeres. Plating tetthet bør holdes lavt for å unngå celle aggregering. Maksimalt 20 000 celler/mL anbefales for 6-brønn plater og 5 000 celler/mL for 24-brønn plater. - Etter 5-7 dager, telle antall kuler per brønn. Dette kan gjøres enten manuelt, ved hjelp av et mikroskop utstyrt med en 10x forstørrelse linse, eller ved hjelp av digital bildeanalyse (se trinn 4).
- Samle mammospheres av hver brønn separat og sentrifuger på 300 x g, i 5 min ved 4 ° c.
- Forsiktig Dekanter supernatanten og Fortsett til den mekaniske dissosiasjon av mammospheres ved hjelp av en P200 pipette med filtrerte tips. Pipetter for ca 100 ganger og visuelt inspisere suspensjonen for tilstedeværelsen av store spheroids.
- Resuspend i 1 mL fersk mammosphere medium og telle levedyktige celler. Samle cellene i hver prøve eller tilstand, og gjenta trinn 3.6-3.10. Registrer antall celler belagt og antall kuler og celler telles per brønn for hvert avsnitt. Gå videre til trinn 5 for beregning av akkumulert vekst.
4. Sphere opplisting bruke Digital Image Analysis (DIA)
- På slutten av hver passering, skanne hele overflaten av alle brønnene og tilegne seg bilder av kulene ved hjelp av et digitalt kamera montert på en stereoscope. Lagre bildene som TIF-filer.
- Importer de stereoscope bildene som en bildesekvens ved hjelp av ImageJ14. Angi skalaen og bildetypen til 8-biters.
- Dupliser bunken med bilder og velg trekk fra bakgrunn fra kategori prosessen på menylinjen. Sjekk alternativene lys bakgrunn og skyve paraboloide og klikk på knappen OK. Behandle alle bilder av stabelen.
- Velg Juster og deretter terskel fra kategori bildet i menylinjen. Ved å klikke på Påfør, vises et dialogvindu med tittelen Konverter stabel til binær . Velg standard som metode og lys som bakgrunn. Merk av i boksen Beregn terskel for hvert bilde og klikk på knappen OK.
- Velg sekvensielt kommandoene vannskille, Åpne og ødelegge fra binær listen under kategorien prosessen i menylinjen. Behandle alle bilder av stabelen ved å klikke på knappen Ja av dialogboksen som vises.
Merk: Disse prosessene gir mulighet for visuell segmentering av objekter som berører, objekt utjevning og fjerning av piksler fra kanten av objektene. - Velg funksjonen analyser partikler fra menyen analyser. Angi minimums størrelses terskelen ved 10 000 μm2 og sirkularitet mellom 0,50 og 1,00. Velg alternativet ellipser fra rullegardinmenyen Vis . Sjekk oppsummere, ekskludere på kanter og in situ Vis og klikk på knappen OK. Behandle alle bilder av stakken.
- Visuelt inspisere korrespondanse av ellipser med kuler og, om nødvendig, korrigere partikkel telling tilsvarende. Sum teller fra alle rammene av hver brønn for å oppnå den totale greven av mammospheres per brønn.
5. kumulativ vekst kurve beregning
Merk: Antall mammospheres som telles i hver brønn på slutten av hvert avsnitt (Pn) reflekterer antall mammosphere celler som starter i begynnelsen av Pn.
- For hvert avsnitt (PN) registrerer du antall belagte celler og antall celler og kuler som telles per brønn. Beregn sfære størrelse på slutten av hvert avsnitt:
sfære størrelse Pn (celler/sfære) = celler telles pn /kuler telles pn
Merk: Kule størrelsen på Pn er et mål på det proliferativ potensialet til hver mammosphere celle seeded på pn. - Antyde antall belagte kuler ved å dele antall celler belagt for PN av sfæren størrelse beregnet på slutten av forrige passering (Pn-1):
kuler belagt Pn = celler belagt pn /Sphere størrelse Pn-1
Merk: Ved konvensjonen, er sfæren størrelsen antas stabil under den første passasjen av kulturen (dvs. sfære størrelse P0 = Sphere størrelse p1). Hvis flere brønner brukes som tekniske replikerer, bruker du den gjennomsnittlige kule størrelsen på PN-1 som nevner. - Beregn kumulativ celle og sfære for hver brønn per passasje:
Kumulativt antall Pn = (antall pn /belagt pn) X kumulativ nummer pn-1.
Merk: Ved konvensjonen, Kumulativ nummer P0 = belagt P1. Hvis flere brønner brukes som tekniske replikerer, beregner du det gjennomsnittlige kumulative antallet per prøve eller betingelse for hvert skriftsted. - Tegne inn datapunktene på en halv logaritmisk skala. Vis skriftsted nummeret (P0 til PN) på x-aksen (lineær skala) og akkumulert celle-eller sfære nummer på y-aksen (logaritmisk skala).
- Tilpasse en eksponentiell trend-linje til datapunktene og beregne koeffisient av besluttsomhet (R2) for å måle godhet av passform.
Merk: Trendlinjen som er montert på datapunktene, bør være omtrentlig en eksponentiell kurve, som forventet for en cellepopulasjon som vokser eller dør med en konstant hastighet. R2 tar verdier mellom 0 og 1, med verdier nærmest 1 som angir en bedre passform. - Skildre ligningen av trenden-linjen som en naturlig eksponentiell funksjon for å antyde vekstrate (GR) av kulturen:
y = y0 e(gr) x, der y0 er verdien av y når x = 0.
Representative Results
MyC overuttrykte i normal MECs, fører til en økt frekvens av mammosphere initiere celler. Dette oppnås gjennom en dobbel mekanisme: myC øker frekvensen av maske symmetriske divisjoner og hyppigheten av Stam omprogrammering inn i nye MaSCs11. For å teste effekten av lav konstituerende myC uttrykk, brukte vi Rosa26-MycER transgene Mouse-modellen, der myC aktivitet kan bli indusert av 4-hydroxytamoxifen (4-OHT)15. Vi først belagt MECs på ultra-lav vedheft 6-brønn plater for å fjerne fibroblaster, i fravær av 4-OHT. Etter den første passasjen, splittet vi kulturen i to: to brønner ble holdt ubehandlet (kontroll) og to brønner ble behandlet med 200 nM 4-OHT (MycER). Vi telte sfæren og celle tall på 5 sammenhengende passasjer for tre uavhengige eksperimenter (tabell 1). Den kumulative celle-og sfære tall per passasje vises i tabell 2. Induksjon med 4-OHT fører til økt sfære og cellevekst, som vist i figur 1.
Figur 1: representative resultater. Kumulativ sfære (A) og celle (B) vekst kurver av kontroll og MycER mammospheres. Gjennomsnittlig og standardavvik på 3 uavhengige eksperimenter vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| første plating | 2. plating | tredje plating | fjerde plating | femte plating | ||||||||||||
| Celler belagt | Antall celler | Antall sfære | Celler belagt | Antall celler | Antall sfære | Celler belagt | Antall celler | Antall sfære | Celler belagt | Antall celler | Antall sfære | Celler belagt | Antall celler | Antall sfære | ||
| Exp1 | Kontroll | 77 000 | 50 000 | 31 | 65 000 | 58 500 | 41 | 57 000 | 30 000 | 32 | 30 000 | 22 000 | 5 | 22 000 | 0 | 0 |
| 77 000 | 81 000 | 41 | 65 000 | 55 000 | 23 | |||||||||||
| MycER | 77 000 | 31, 0000 | 193 | 80 000 | 375 000 | 323 | 80 000 | 380 000 | 217 | 80 000 | 220 000 | 223 | 80 000 | 170 000 | 155 | |
| 77 000 | 110 000 | 142 | 80 000 | 505 000 | 396 | 80 000 | 270 000 | 149 | 80 000 | 290 000 | 194 | 80 000 | 250 000 | 160 | ||
| Exp2 | Kontroll | 75 000 | 75 000 | 71 | 60 000 | 17 000 | 34 | 28 000 | 45 000 | 29 | 45 000 | 13 000 | 2 | 13 000 | 0 | 0 |
| 75 000 | 47 000 | 45 | 60 000 | 11 000 | 47 | |||||||||||
| MycER | 75 000 | 200 000 | 188 | 80 000 | 225 000 | 277 | 80 000 | 230 000 | 155 | 80 000 | 210 000 | 211 | 80 000 | 100 000 | 95 | |
| 75 000 | 250 000 | 192 | 80 000 | 202 500 | 283 | 80 000 | 305 000 | 185 | 80 000 | 160 000 | 237 | 80 000 | 100 000 | 133 | ||
| Exp3 | Kontroll | 82 500 | 130 000 | 121 | 80 000 | 45 000 | 105 | 80 000 | 110 000 | 86 | 80 000 | 58 500 | 75 | 58 500 | 58 500 | 78 |
| 82 500 | 125 000 | 177 | 80 000 | 71 250 | 42 | |||||||||||
| MycER | 82 500 | 325 000 | 457 | 80 000 | 610 000 | 327 | 80 000 | 367 000 | 309 | 80 000 | 500 000 | 260 | 80 000 | 115 000 | 146 | |
| 82 500 | 475 000 | 463 | 80 000 | 455 000 | 392 | 80 000 | 415 000 | 204 | 80 000 | 470 000 | 295 | 80 000 | 185 000 | 161 | ||
Tabell 1: antall kuler som telles og antall celler som er belagt og telt ved hvert skriftsted.
Tabell 2: beregning av belagt sfære tall og kumulativ sfære og celle tall. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne tabellen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Discussion
Her beskriver vi en protokoll for den kvantitative beskrivelsen av maske vekst egenskaper in vitro. Som et eksempel presenterer vi effekten av lavt nivå konstituerende myC uttrykk på normal murine MaSCs. Denne tilnærmingen kan imidlertid brukes likt på ulike kontekster. Menneskelige eller murine primære celler, så vel som etablerte cellelinjer, kan være kultivert i forankring selvstendige forhold for å etablere mammosphere kulturer som kan serielt passert. Gene overuttrykte og RNA forstyrrelser kan lett innføres i protokollen med tillegg av en viral Transduction trinn på slutten av den første passasjen (etter trinn 3,5). Alternativt kan celler bli smittet i vedheft og deretter belagt som mammospheres.
En kritisk del av analysen presenteres her er seeding celle tetthet, som bør være lav nok til å unngå generering av aggregater forstyrrer tolkningen av resultatene16,17. Den morfologi av mammospheres kan være informativ å løse denne tvetydighet. Bare kompakte, runde kuler skal listes på slutten av hvert skriftsted. Både sirkularitet av spheroids og størrelsen bør tas i betraktning. Ved hjelp av den automatiserte prosessen av DIA, er dette trinnet sikres med de riktige terskler på en objektiv og absolutt måte. Ofte vil forfedre danne acinar strukturer eller mindre klynger av celler som bør utelukkes fra mammosphere teller. Som en tommelfingerregel bruker vi en terskel på 100 μm diameter. Til slutt, forsiktighet bør utvises for å unngå overføring av intakt eller ikke-fullt dissosiert mammopsheres fra en passasje til den neste. På den annen side vil overflødig pipettering føre til økt celle død. Således, hvis slike vanskeligheter oppstår, anbefaler vi å bruke mild trypsinization eller Accutase behandling og passerer dissosiert kuler gjennom en 40 μm sil for å sikre generering av enkelt celle suspensjoner.
Sfære forming effektivitet (SFE) har blitt brukt Alternativt, som et surrogat for SC eller CSC kvantifisering ex vivo i mammosphere kulturer. SFE er virkelig et mål på stilk-lignende celler i en gitt celle befolkning. Men det representerer en mindre samvittighetsfull tilnærming siden det gir informasjon bare på forskjellige tidspunkt poeng. Beregningen av kumulativ sfære tall og generering av kumulativ vekst kurver, i stedet, gjør det mulig å slutning vekstraten av kulturen fra den første cellen seeding trinn før kulturen eksos eller, i tilfelle av udødeliggjort kulturer, for ønsket antall passasjer. Vurderingen av vekst egenskaper gjør at evalueringen av avviket fra den eksplosive veksten gjennom koeffisienten R2 og, på et annet trinn, VURDERINGEN av gr verdien selv.
Viktigere, Kumulativ mammosphere vekst kurver kan brukes til å evaluere effekten av små molekyl hemmere eller andre kjemoterapeutiske stoffer selektivt på CSC nivå6,11. I motsetning til normale primære mammospheres, som funksjonelt eksos i 5-7 passasjer, tumor mammospheres tendens til å ekspandere på ubestemt tid. Denne funksjonen er knyttet til ubegrenset CSC selv fornyelse evne. Effektene på spredning og CSC selv fornyelse kan bli lokomotivet gjennom generering av tumor celle og mammosphere vekst kurver, henholdsvis. En CSC-spesifikk effekt er forventet å resultere i en reduksjon i den kumulative mammosphere vekst, med eller uten virkning på den kumulative cellevekst raten6,11.
Til slutt, et annet område av interesse er en av voksen vev SC omprogrammering. Fullt dyrket mammospheres består av en phenotypically heterogen celle befolkning, der bare en mindre brøk beholder Stem-lignende funksjoner, inkludert mammosphere-initiering evne og bryst kjertel regenerering ved transplantasjon i vivo6,9,11,18,19. Bryst forfedre kan således isoleres enten ved bruk av in vitro-etikett-og analyser6,9,11 eller, ex Vivo, ved bruk av etablerte overflate markører2,3. Spesielt, melke forfedre ikke overleve anoikis og er ute av stand til å danne mammospheres. Håndhevet myC uttrykk har vist å tildele mammosphere initiering potensial til bryst forfedre isolert som PKHneg11, noe som resulterer i generering av en kultur som kan passert på ubestemt tid. Tilsvarende kan forstyrrelser av negative regulatorer av fysiologiske omprogrammering testes ved hjelp av samme analysen. I denne konteksten er et vanlig problem som kan oppstå, det begrensede antallet celle inn data. Hvis cellen input er lavere enn 10 000 celler, anbefaler vi seeding i 24-brønn plater (maksimalt 5 000 levedyktige celler/mL). Likevel kan forankring uavhengige kultur forhold bevises å være for harde for scoring omprogrammering, spesielt i tilfeller der omprogrammering effekten er ikke umiddelbar. I slike tilfeller kan bruken av en støttende matrise og 3-dimensjonale organoid kulturer være mer passende20.
Samlet sett er mammosphere analysen et kostnadseffektivt alternativ som lett kan benyttes for scoring stilk-lignende egenskaper i normal og tumoral MEC populasjoner. Den kvantitative tilnærmingen som tas i denne protokollen, forenkler sammenligningen mellom kulturer som utføres i ulike forhold eller utsettes for ulike stimuli. Når det følges nøye, gir det et relativt enkelt ex vivo modell system som tillater frakobling av flere spillere som definerer Stem egenskaper in vivo, og tilbyr muligheten for mer detaljerte mekanistisk studier.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Bruno Amati for den type gave Rosa26-MycER transgene Mouse-modellen. Dette arbeidet ble finansiert av tilskudd fra WWCR, AIRC, ERC, og det italienske Helsedepartementet til P.G.P. T.V. og X.A. ble støttet av FIRC og A.S. av en FUV stipend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysis buffer | Lonza | 10-548E | Ammonium-chloride-potassium lysis bufer, 100 mL. |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | B27 supplement 50X (10 mL). Final concentration 2% v/v. |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Human recombinant fibroblast growth factor - basic, 50 μg. Stock solution 100 μg/μL in Tris 5 mM pH 7.6. Final dilution 0.02% v/v. |
| Collagenase | Sigma | C2674 | Collagenase from Clostridium histolyticum. Type I-A, lyophilized powder, 1 g. Stock 20,000 U/mL in DMEM. Final dilution 1% v/v. |
| DMEM | Lonza | 12-614F | Dulbecco's modified Eagle's medium |
| DPBS | Microgem | S17859L0615 | Dulbecco's phosphate buffered saline |
| EGF | Tebu-Bio | AF-100-15 | Recombinant human epithelial growth factor. Stock solution 100 μg/mL in sterile dH2O. Final dilution 0.02% v/v. |
| Glutamine | Lonza | 17-605E | L-Glutamine, 200 mM. Final dilution 1% v/v. |
| Heparin | PharmaTex | 34692032 | Stock concentration 5,000 IU/mL. Final dilution 0.008% v/v. |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Type IV-S, powder, 750-3,000 U/mg solid, 30 mg. Stock solution 10 mg/mL in sterile dH2O. Final dilution 1% v/v. |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 μg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
| Insulin | SAFCBiosciences | 91077C | Insulin, human recombinant, dry powder, 250 mg. Stock concentration 1 mg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
| Low attachment 6-well plates | Corning | 351146 | Sterile 6-well not treated cell culture plates with clear flat bottom and lid. |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary epithelial cell growth basal medium |
| Penicllin-Streptomycin mixture | Lonza | 17-602F | Contains 10,000 U potassium penicillin and 10,000 µg streptomycin sulfate per mL in 0.85% saline. Final dilution 1% v/v. |
| Poly-HEMA | Sigma | P3932 | Dissolve in 95% EtOH overnight at 55 °C. Stock concentration 12% w/v. Final dilution 1% v/v in 95% EtOH. Filter (0.22 μm) before use. |
References
- Kordon, E. C., Smith, G. H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- van Amerongen, R., Bowman, A. N., Nusse, R. Developmental stage and time dictate the fate of Wnt/beta-catenin-responsive stem cells in the mammary gland. Cell Stem Cell. 11 (3), 387-400 (2012).
- Van Keymeulen, A., et al. Distinct stem cells contribute to mammary gland development and maintenance. Nature. 479 (7372), 189-193 (2011).
- Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138 (6), 1083-1095 (2009).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Grimshaw, M. J., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Research. 10 (3), R52 (2008).
- Pece, S., et al. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140 (1), 62-73 (2010).
- Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
- Santoro, A., et al. p53 Loss in Breast Cancer Leads to Myc Activation, Increased Cell Plasticity, and Expression of a Mitotic Signature with Prognostic Value. Cell Reports. 26 (3), 624-638 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gao, H., et al. Murine mammary stem/progenitor cell isolation: Different method matters? Springerplus. 5, 140 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Murphy, D. J., et al. Distinct thresholds govern Myc's biological output in vivo. Cancer Cell. 14 (6), 447-457 (2008).
- Bailey, P. C., et al. Single-Cell Tracking of Breast Cancer Cells Enables Prediction of Sphere Formation from Early Cell Divisions. iScience. 8, 29-39 (2018).
- Lombardo, Y., de Giorgio, A., Coombes, C. R., Stebbing, J., Castellano, L. Mammosphere formation assay from human breast cancer tissues and cell lines. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Peng, T., Qinghua, M., Zhenning, T., Kaifa, W., Jun, J. Long-term sphere culture cannot maintain a high ratio of cancer stem cells: a mathematical model and experiment. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Smart, C. E., et al. In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Panciera, T., et al. De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
