Summary
Här beskriver vi genomförandet och tolkningen av resultaten av en in vitro-mammosfär självförnyelse kvantitativ analys.
Abstract
Bröstkörteln kännetecknas av omfattande regenereringskapacitet, eftersom det går igenom massiva hormonella förändringar under hela livscykeln för en hona. Rollen av bröst stamceller (MaSCs) är allmänt studeras både i fysiologiska/utvecklingsmässiga sammanhang och när det gäller bröstcancerogenesen. I denna aspekt, ex vivo studier fokuserade på MaSC egenskaper är mycket eftertraktade. Mammosphere kulturer utgör ett surrogat av orgel formation och har blivit ett värdefullt verktyg för både grundläggande och translationell forskning. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för generering av murina primära mammosphere kulturer och kvantifiering av MaSC tillväxt egenskaper. Protokollet innehåller bröstkörtel insamling och matsmältning, isolering av primära bröst epitelceller (mecs), etablering av primära mammosfär kulturer, seriell passaging, kvantifiering av tillväxt parametrar för mammosphere och tolkning av resultaten. Som ett exempel presenterar vi effekten av låg nivå konstitutiva MYC uttryck på normal MECs leder till ökad självförnyelse och spridning.
Introduction
Isolering och in vitro-kultur av bröstepitelial stam och stamceller har blivit avgörande för att förstå deras egenskaper i bröst cellbiologi. Elegant linje spårning och seriell transplantation analyser har möjliggjort studiet av stamceller (SCs) och andra vävnad undergrupper i samband med deras in vivo nisch. Men detta tillvägagångssätt är tidskrävande och kräver generering av reporter musmodeller1,2,3,4,5. Därför är in vitro-kultur och förökning av bröst stamceller (MaSCs) medan sparande viktiga stemness funktioner, nämligen självförnyelse och differentiering förmåga, en av de största utmaningarna på området. Under de senaste åren, mammosphere analysen har använts i stor utsträckning för att modellera både normal mjölk vävnad och bröstcancer tillväxt, att kvantifiera normal eller cancer SCs (CSCS) och bedöma deras självförnyelse förmåga som en surrogat reporter för sin verksamhet i sina respektive in vivo sammanhang6,7,8,9,10,11.
Den mammosphere analysen är en effektiv och kostnadseffektiv strategi, där nyligen isolerade bröst epitelceller (MECs) odlas i icke-anhängare villkor, med förutsättningen att endast MaSCs kommer att överleva och bildar sfärer i fjädring medan alla andra celltyper kommer att dö av Anoikis. Dessutom är förmågan att bilda flera generationer av mammosfärer i seriella icke-adherent passager relaterade till självförnyelse förmåga MASCS6,9,11. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för en kvantitativ mammosphere-analys, som ursprungligen utvecklades av dontu och kollegor7 som en modifiering av den banbrytande neurosphere-analysen12, vilket möjliggjorde tillväxt av förmodade SCs i icke-adherenta, serum fria förhållanden med tillägg av lämpliga tillväxtfaktorer7,12.
Protocol
In vivo förfaranden utfördes i enlighet med EU-direktiv 2010/63 och efter godkännande från vår institutionella etikkommitté (organism för djurens välbefinnande--OPBA) och det italienska hälsoministeriet (IACUC nummer 762/2015 och 537/2017).
1. murina bröstkörtel insamling och matsmältning
- För ett typiskt experiment, offra 8-10 veckor gamla Virgin kvinnliga möss genom CO2 inandning. Beroende på experimentets mål använder du 5-30 möss. Placera möss på dissektion styrelser under en huva. Använd nålar för att sträcka frambenen och tvätta pälsen av djuret med etanol.
- Lyft huden med pinpetter och utföra en vertikal snitt börjar på nivån av bäckenområdet och flytta hela vägen till livmoderhalsen, lämnar bukhinnan intakt. För att undvika bristning av huden eller bukhinnan, Använd rund kanter sax.
- Ta försiktigt bort huden från kroppen med mjuka rörelser av saxen över den laterala axeln av kroppen.
- När huden är helt fristående från bröst-och bukområdet, utföra fyra snitt över de fyra extremiteterna av djuret och stift ner huden med nålar. Använd saxen och pinps för att helt lossa djurets kropp från den utvidgade huden.
- Använd tång för att försiktigt lyfta mjölkfett kuddar som nu är fullt exponerade och försiktigt lossa dem från huden med hjälp av saxen. Samla de nedre bröstkorg och buken bröstkörtlar i varje mus och doppa dem i Dulbecco s fosfatbuffrad saltlösning (DPBS), i en 50 mL koniskt rör. Samla upp till 20 körtlar per tub. Håll vävnaderna på isen.
Anmärkning: Om det behövs, kan körtlarna kvar på isen över natten. Detta är en säker stopp punkt. Följande steg ska utföras under sterila förhållanden. - Förbered och filtrera matsmältningen medium: Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM) kompletteras med 2 mM glutamin, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 200 U/mL kollagenase och 100 μg/mL hyaluronidas (se tabell över material).
- Överför upp till 20 körtlar till en 100 mm petriskål och finhacka vävnaden med en skalpell eller böjd sax. Undvik att överföra stora volymer DPBS till skålen.
- Tillsätt 10 ml digestionsmedium till varje petriskål och överför den malda vävnaden till ett 50 ml koniskt rör med en 25 ml serologiska pipett.
- Försegla rören med parafilm och placera dem på en rotator. Ställ in rotatorn med låg hastighet (0,03 x g) och inkubera i 2,5 h vid 37 ° c i en fuktig atmosfär som innehåller 5% Co2.
- Inspektera fjädringen visuellt innan du fortsätter till nästa steg. Om stora bitar av vävnad förblir osmält, förlänga inkuberingen vid 37 ° c i ytterligare 30 min.
Anmärkning: Som ett alternativ, kan matsmältningen utföras över natten vid 37 ° c, 5% CO2, med hjälp av en mild kollagenase/hyaluronidas enzym mix13.
2. isolering av primära murina MECs
- Stoppa rotatorn och ta bort rören från inkubatorn. Justera en P1000 spets vid öppnandet av en 5 ml serologiska pipett. Om suspensionen passerar genom P1000 spetsen, gå vidare till nästa steg. Annars förlänga inkuberingen vid 37 ° c i ytterligare 30 min.
- Centrifugera vid 100 x g, i 5 min vid 4 ° c. Häll försiktigt av supernatanten och Omsuspendera pelleten av varje tub i 3 mL DPBS.
Anmärkning: Den låga centrifugering hastigheten tillåter avlägsnande av lymfocyter och fettvävnad celler. Skonsam manipulation krävs för att undvika att ta bort pelleten i detta steg. - Filtrera cellsuspensionen i varje rör separat, med hjälp av 100, 70 och 40 μm cell silar. Vid varje filtrerings steg tvättar du silar med 2 mL DPBS innan du samlar in genomströmningen.
Anmärkning: Från denna punkt på, cellsuspensioner kan poolas och bearbetas tillsammans. - Centrifugera vid 300 x g, i 5 min vid 4 ° c. Häll försiktigt av supernatanten och Omsuspendera cellerna i den resterande volymen av DPBS.
- Fortsätt till röda blodkroppar (RBC) lysis genom att tillsätta en lika volym av ammonium-klorid-kalium (ACK) lysis buffert (se tabell över material). Blanda genom att Pipettera och inkubera på is i upp till 5 min.
- Tillsätt 10 mL DPBS och centrifugera vid 300 x g, i 5 min vid 4 ° c. Häll försiktigt av supernatanten och inspektera pelleten visuellt. Om pelleten är vit, gå vidare till nästa steg. Upprepa i annat fall RBC Lys-steget (steg 2,5).
- Omsuspendera cellpelleten i 1-5 mL mammosfär media: tillväxt bas medium för bröst epitelceller (MEBM), kompletterat med 2 mM glutamin, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 5 μg/mL insulin, 0,5 μg/mL hydrokortison, 2% B27, 20 ng/mL Epidermal tillväxtfaktor (EGF), 20 ng/mL grundläggande fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) och 0,4 IU/mL heparin (se tabell över material).
3. seriell Mammosfär Omplätering
- För inrättandet av mammosfär kulturer, plattan cellerna på icke-vävnad kultur behandlas (ultra-låg vidhäftning) 6-well plattor med en densitet av 200 000 livskraftiga celler/mL i mammosfär medium. Inkubera cellerna i 7-10 dagar vid 37 ° c, 5% CO2.
- Förbered och filtrera 1% Poly-HEMA lösning i 95% etanol (se tabell över material). Coat ultra-låg vidhäftning 6-well plattor för följande passager, genom att tillsätta 400 μL av 1% Poly-HEMA lösning per brunn och låta etanol torka helt. För bättre resultat, upprepa beläggningen två gånger.
Anmärkning: Användningen av icke-belagda plattor under den första passagen tillåter selektiv avlägsnande av fibroblaster från kulturen. - I slutet av 7-10 dagar kultur, samla primära mammospheres från alla brunnar och centrifugera vid 300 x g, för 5 min vid 4 ° c.
- Försiktigt Dekantera supernatanten och gå vidare till mekanisk dissociation av mammosfärer med hjälp av en P200 pipett med filtrerade tips. Pipettera i ca 100 gånger och inspektera fjädringen visuellt för att det finns stora sfäroider.
Anmärkning: En kort inkubering (2-5 min) av sfärpelleten i en låg volym (0,2-0,5 mL) trypsin eller Accutase vid 37 ° c, 5% CO2, kan användas för att underlätta mekanisk dissociation. Förbered färskt mammosfär medium (steg 2,7) för bordläggningen av varje passage. - Omsuspendera i 1-5 mL färskt mammosfär medium och räkna de livskraftiga cellerna. Om tillämpligt, dela cellerna i behandlingsgrupper eller odlingsförhållanden.
- Platta 20 000 livskraftiga celler/mL på Poly-HEMA-belagd ultra-låg vidhäftning 6-brunn plattor och inkubera vid 37 ° c, 5% CO2.
Anmärkning: Mammospheres når sin maximala storlek inom 5-7 dagar efter cellplätering. När det är möjligt, fördela cellerna i varje prov eller tillstånd till flera brunnar för att få tekniska replikat. Beläggningstätheten bör hållas låg för att undvika cell aggregering. Högst 20 000 celler/mL rekommenderas för 6-brunn plattor och 5 000 celler/mL för 24-brunn plattor. - Efter 5-7 dagar, räkna antalet sfärer per brunn. Detta kan göras antingen manuellt, med hjälp av ett Mikroskop utrustat med en 10X förstoringslins, eller med hjälp av digital bildanalys (se steg 4).
- Samla mammosfärerna i varje brunn separat och centrifugera vid 300 x g, i 5 min vid 4 ° c.
- Försiktigt Dekantera supernatanten och gå vidare till mekanisk dissociation av mammosfärer med hjälp av en P200 pipett med filtrerade tips. Pipettera i ca 100 gånger och inspektera fjädringen visuellt för att det finns stora sfäroider.
- Omsuspendera i 1 mL färskt mammosfär medium och räkna de livskraftiga cellerna. Pool cellerna i varje prov eller tillstånd och upprepa steg 3.6-3.10. Anteckna antalet celler som är pläterade och antalet sfärer och celler som räknas per brunn för varje passage. Fortsätt till steg 5 för den kumulativa tillväxt beräkningen.
4. sphere uppräkning med hjälp av digital bildanalys (DIA)
- I slutet av varje passage, skanna hela ytan av alla brunnar och hämta bilder av sfärerna med hjälp av en digitalkamera monterad på ett stereoskop. Spara bilderna som. TIF-filer.
- Importera stereoscopebilder som en bildsekvens med imagej14. Ange skalan och typen av bild till 8-bitars.
- Duplicera avbildningsstapeln och välj subtrahera bakgrund från flikprocessen på menyraden. Kontrollera alternativen ljus bakgrund och glidande Paraboloid och klicka på knappen OK. Bearbeta alla bilder av stacken.
- Välj Justera och sedan tröskelvärde från flikbilden i menyraden. Genom att klicka på Verkställvisas ett dialogfönster med titeln konvertera stack till binär . Välj standard som metod och ljus som bakgrund. Markera rutan Beräkna tröskel för varje bild och klicka på knappen OK.
- Välj sekventiellt kommandona Watershed, Öppna och erodera från den binära listan under flikprocessen i menyraden. Bearbeta alla bilder av stacken genom att klicka på knappen Ja i dialogrutan som visas.
Anmärkning: Dessa processer möjliggör visuell segmentering av objekt som berör, objekt utjämning och borttagning av pixlar från kanten av objekten. - Välj funktionen analysera partiklar från menyn analysera. Ange minsta storleks tröskel vid 10 000 μm2 och loopkontroll mellan 0,50 och 1,00. Välj alternativet ellipser på rullgardinsmenyn Visa . Check summera, utesluta på Egg och i situ utställning och klick på det knapp OK. Bearbeta alla bilder av stacken.
- Visuellt inspektera korrespondensen av ellipserna med sfärer och, om det behövs, korrigera partikel räkningen i enlighet därmed. Summera räkningarna från alla ramar i varje brunn för att få den totala räkningen av mammospheres per brunn.
5. kumulativ beräkning av tillväxtkurvan
Anmärkning: Antalet mammosfärer som räknas i varje brunn i slutet av varje passage (Pn) återspeglar antalet mammosplakerande celler som har Seedat i början av Pn.
- För varje passage (PN), registrera antalet pläterade celler och antalet celler och sfärer räknas per brunn. Beräkna sfär storleken i slutet av varje passage:
sfär storlek Pn (celler/sfär) = celler räknade pn /sfärer räknade pn
Anmärkning: Sfär storleken vid Pn är ett mått på den proliferativa potentialen hos varje mammosfär-initierande cell som är seedad vid pn. - Härleda antalet ytskikt genom att dividera antalet celler som är pläterade för Pn med sfär storleken beräknad i slutet av föregående passage (pn-1):
sfärer pläterade Pn = celler pläterade pn /sfär storlek pn-1
Anmärkning: Enligt konvention antas sfär storleken vara stabil under kulturens första passage (dvs. sfär storlek P0 = sfär storlek p1). Om flera brunnar används som tekniska replikat, använder du den genomsnittliga sfär storleken på PN-1 som nämnare. - Beräkna den kumulativa cellen och sfär numret för varje brunn per passage:
ackumulerat Antal Pn = (antal pn /pläterat pn) X ackumulerat antal pn-1.
Anmärkning: Enligt konvention, ackumulerat Antal P0 = pläterad p1. Om flera brunnar används som tekniska replikat, beräkna det genomsnittliga kumulativa antalet per prov eller villkor för varje passage. - Rita datapunkterna på en semi-logaritmisk skala. Visa passage numret (P0 till pN) på x-axeln (linjär skala) och det kumulativa cell-eller sfär numret på y-axeln (logaritmisk skala).
- Passa in en exponentiell trendlinje till datapunkterna och beräkna determinationskoefficienten (R2) för att mäta godhetens godhet.
Anmärkning: Den trendlinje som är monterad på datapunkterna bör approximera en exponentiell kurva, som förväntat för en cellpopulation som växer eller dör med en konstant hastighet. R2 tar värden mellan 0 och 1, med värden närmast 1 som indikerar en bättre passform. - Skildra ekvationen för trendlinjen som en naturlig exponentiell funktion för att härleda tillväxttakten (GR) av kulturen:
y = y0 e(gr) x, där y0 är värdet för y när x = 0.
Representative Results
MYC överuttryck i normala MECs, leder till en ökad frekvens av mammosphere initiera celler. Detta uppnås genom en dubbel mekanism: MYC ökar graden av MaSC symmetriska divisioner och frekvensen av progenitorceller omprogrammering till nya MaSCs11. För att testa effekten av låg konstituerande MYC uttryck, vi använde Rosa26-MycER transgena musmodell, där MYC aktivitet kan induceras av 4-hydroxytamoxifen (4-OHT)15. Vi pläterade först MECs på ultra-låg vidhäftning 6-bra tallrikar för att ta bort fibroblaster, i avsaknad av 4-OHT. Efter den första passagen, delade vi kulturen i två: två brunnar hölls obehandlade (kontroll) och två brunnar behandlades med 200 nM 4-OHT (MycER). Vi räknade sfär-och cellnumren på 5 på varandra följande passager för tre oberoende experiment (tabell 1). De kumulativa cell-och sfär numren per passage visas i tabell 2. Induktion med 4-OHT leder till ökad sfär och celltillväxt, som visas i figur 1.
Figur 1: representativa resultat. Kumulativa sfär (a) och cell (B) tillväxtkurvor av kontroll och mycer mammosfärer. Medelvärdet och standardavvikelsen för 3 oberoende experiment visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| 1st plätering | 2: a plätering | 3: e plätering | 4: e plätering | 5. plätering | ||||||||||||
| Celler pläterade | Antal celler | Antal sfär | Celler pläterade | Antal celler | Antal sfär | Celler pläterade | Antal celler | Antal sfär | Celler pläterade | Antal celler | Antal sfär | Celler pläterade | Antal celler | Antal sfär | ||
| Exp1 | Kontroll | 77 000 | 50 000 | 31 | 65 000 | 58 500 | 41 | 57 000 | 30 000 | 32 | 30 000 | 22 000 | 5 | 22 000 | 0 | 0 |
| 77 000 | 81 000 | 41 | 65 000 | 55 000 | 23 | |||||||||||
| MycER | 77 000 | 31, 0000 | 193 | 80 000 | 375 000 | 323 | 80 000 | 380 000 | 217 | 80 000 | 220 000 | 223 | 80 000 | 170 000 | 155 | |
| 77 000 | 110 000 | 142 | 80 000 | 505 000 | 396 | 80 000 | 270 000 | 149 | 80 000 | 290 000 | 194 | 80 000 | 250 000 | 160 | ||
| Exp2 | Kontroll | 75 000 | 75 000 | 71 | 60 000 | 17 000 | 34 | 28 000 | 45 000 | 29 | 45 000 | 13 000 | 2 | 13 000 | 0 | 0 |
| 75 000 | 47 000 | 45 | 60 000 | 11 000 | 47 | |||||||||||
| MycER | 75 000 | 200 000 | 188 | 80 000 | 225 000 | 277 | 80 000 | 230 000 | 155 | 80 000 | 210 000 | 211 | 80 000 | 100 000 | 95 | |
| 75 000 | 250 000 | 192 | 80 000 | 202 500 | 283 | 80 000 | 305 000 | 185 | 80 000 | 160 000 | 237 | 80 000 | 100 000 | 133 | ||
| Exp3 | Kontroll | 82 500 | 130 000 | 121 | 80 000 | 45 000 | 105 | 80 000 | 110 000 | 86 | 80 000 | 58 500 | 75 | 58 500 | 58 500 | 78 |
| 82 500 | 125 000 | 177 | 80 000 | 71 250 | 42 | |||||||||||
| MycER | 82 500 | 325 000 | 457 | 80 000 | 610 000 | 327 | 80 000 | 367 000 | 309 | 80 000 | 500 000 | 260 | 80 000 | 115 000 | 146 | |
| 82 500 | 475 000 | 463 | 80 000 | 455 000 | 392 | 80 000 | 415 000 | 204 | 80 000 | 470 000 | 295 | 80 000 | 185 000 | 161 | ||
Tabell 1: antal sfärer som räknas och antal celler som är pläterade och räknade vid varje passage.
Tabell 2: beräkning av pläterade sfär nummer och kumulativa sfär-och cell nummer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna tabell. (Högerklicka för att ladda ned.)
Discussion
Här beskriver vi ett protokoll för kvantitativ beskrivning av MaSC Growth Properties in vitro. Som ett exempel presenterar vi effekten av låg nivå konstitutiva MYC uttryck på normala murina MaSCs. Detta tillvägagångssätt kan dock tillämpas lika på olika sammanhang. Mänskliga eller murina primära celler, samt etablerade cellinjer, kan odlas i Anchorage oberoende villkor för att etablera mammosphere kulturer som kan seriellt passaged. Genöveruttryck och RNA-interferens kan lätt införas i protokollet med tillägg av en viral signaltransduktion steg i slutet av den första passagen (efter steg 3,5). Alternativt kan celler smittas i vidhäftning och sedan pläteras som mammosfärer.
En kritisk aspekt av analysen som presenteras här är sådd CELLTÄTHETEN, som bör vara tillräckligt låg för att undvika generering av aggregat stör tolkningen av resultaten16,17. Morfologin av mammosfärerna kan vara informativ för att lösa denna tvetydighet. Endast kompakta, runda sfärer bör räknas upp i slutet av varje passage. Både cirkularitet av spheroids och storleken bör beaktas. Genom att använda den automatiserade processen i DIA, säkerställs detta steg med lämpliga tröskelvärden på ett objektivt och absolut sätt. Ofta, progenitorer kommer att bilda acinar strukturer eller mindre kluster av celler som bör uteslutas från mammosfär räknas. Som tumregel använder vi ett tröskelvärde på 100 μm diameter. Slutligen, försiktighet bör iakttas för att undvika överföring av intakt eller icke-helt dissocierade mammopsheres från en passage till nästa. Å andra sidan kommer överpipettering leda till ökad celldöd. Således, om sådana svårigheter påträffas, rekommenderar vi att du använder mild trypsinization eller Accutase behandling och passerar dissocierade sfärer genom en 40 μm sil för att säkerställa generering av encelliga suspensioner.
Sfär formnings effektivitet (SFE) har använts alternativt, som ett surrogat för SC eller CSC kvantifiering ex vivo i mammosphere kulturer. SFE är verkligen ett mått på stamliknande celler i en viss cellpopulation. Det är dock ett mindre samvetsgrant förhållningssätt eftersom det ger information endast vid olika tidpunkter. Beräkningen av kumulativa sfär nummer och generering av kumulativa tillväxtkurvor, i stället möjliggör inferens av tillväxttakten i kulturen från den initiala cellen sådd steg tills kulturen avgassystem eller, i fråga om förevigade kulturer, för det önskade antalet passager. Bedömningen av tillväxt egenskaper gör det möjligt att utvärdera avvikelsen från den exponentiella tillväxten genom koefficienten R2 och, i ett andra steg, bedömningen av gr-värdet i sig.
Viktigt, kumulativa mammosphere tillväxtkurvor kan användas för att utvärdera effekten av små molekyler hämmare eller andra kemoterapeutiska läkemedel selektivt på CSC nivå6,11. I motsats till normala primära mammospheres, som funktionellt avgassystem i 5-7 passager, tumör mammospheres tenderar att expandera på obestämd tid. Den här funktionen är länkad till den obegränsade CSC-självförnyelse förmågan. Effekterna på proliferation och CSC självförnyelse kan kopplas bort genom generering av tumör cell och mammosfär tillväxtkurvor, respektive. En CSC-specifik effekt förväntas resultera i en minskning av den kumulativa mammosfärens tillväxttakt, med eller utan effekt på den kumulativa celltillväxt takten6,11.
Slutligen, ett annat område av intresse är en av vuxen vävnad SC omprogrammering. Fullvuxna mammosfärer består av en fenotypisk heterogena cellpopulation, där endast en mindre fraktion behåller Stem-liknande funktioner, inklusive mammosfär-initierande förmåga och bröstkörtel förnyelse vid transplantation in vivo6,9,11,18,19. Bröstprogenitorer kan således isoleras antingen med hjälp av in vitro-etikett-behållande analyser6,9,11 eller, ex vivo, med hjälp av fastställda ytmarkörer2,3. Särskilt, bröst föregångare överlever inte Anoikis och är oförmögna att bilda mammosfärer. Påtvingad MYC uttryck har visat sig ge mammosphere initiering potential att bröst-stamceller isolerade som pkhneg11, vilket resulterar i generering av en kultur som kan blint på obestämd tid. Likaså kan interferens av negativa regulatorer av fysiologiska omprogrammering testas med samma analys. I detta sammanhang är ett vanligt problem som kan uppstå det begränsade antalet cellinmatning. Om cell ingången är lägre än 10 000 celler, rekommenderar vi sådd i 24-brunn plattor (maximalt 5 000 livskraftiga celler/mL). Icke desto mindre kan förankrings oberoende odlingsförhållanden bevisas vara för hårda för att göra en omprogrammering, särskilt i de fall då omprogrammeringen inte är omedelbar. I sådana fall kan användningen av en stödjande matris och 3-dimensionella Organoid kulturer vara lämpligare20.
Sammantaget är mammosphere-analysen ett kostnadseffektivt alternativ som lätt kan användas för att poänggöra stamliknande egenskaper i normala och tumoraliska MEC-populationer. Det kvantitativa tillvägagångssättet i detta protokoll underlättar jämförelser mellan kulturer som utförs under olika förhållanden eller utsätts för olika stimuli. När den följs rigoröst, det ger en relativt enkel ex vivo modellsystem som tillåter avkoppling av flera aktörer som definierar Stem egenskaper in vivo, erbjuder möjlighet till mer detaljerade mekanistiska studier.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Bruno Amati för den vänliga gåvan av Rosa26-MycER transgena musmodell. Detta arbete finansierades av bidrag från WWCR, AIRC, ERC, och det italienska hälsoministeriet till P.G.P. T.V. och X.A. stöddes av FIRC och A.S. av en FUV Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysis buffer | Lonza | 10-548E | Ammonium-chloride-potassium lysis bufer, 100 mL. |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | B27 supplement 50X (10 mL). Final concentration 2% v/v. |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Human recombinant fibroblast growth factor - basic, 50 μg. Stock solution 100 μg/μL in Tris 5 mM pH 7.6. Final dilution 0.02% v/v. |
| Collagenase | Sigma | C2674 | Collagenase from Clostridium histolyticum. Type I-A, lyophilized powder, 1 g. Stock 20,000 U/mL in DMEM. Final dilution 1% v/v. |
| DMEM | Lonza | 12-614F | Dulbecco's modified Eagle's medium |
| DPBS | Microgem | S17859L0615 | Dulbecco's phosphate buffered saline |
| EGF | Tebu-Bio | AF-100-15 | Recombinant human epithelial growth factor. Stock solution 100 μg/mL in sterile dH2O. Final dilution 0.02% v/v. |
| Glutamine | Lonza | 17-605E | L-Glutamine, 200 mM. Final dilution 1% v/v. |
| Heparin | PharmaTex | 34692032 | Stock concentration 5,000 IU/mL. Final dilution 0.008% v/v. |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Type IV-S, powder, 750-3,000 U/mg solid, 30 mg. Stock solution 10 mg/mL in sterile dH2O. Final dilution 1% v/v. |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 μg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
| Insulin | SAFCBiosciences | 91077C | Insulin, human recombinant, dry powder, 250 mg. Stock concentration 1 mg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
| Low attachment 6-well plates | Corning | 351146 | Sterile 6-well not treated cell culture plates with clear flat bottom and lid. |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary epithelial cell growth basal medium |
| Penicllin-Streptomycin mixture | Lonza | 17-602F | Contains 10,000 U potassium penicillin and 10,000 µg streptomycin sulfate per mL in 0.85% saline. Final dilution 1% v/v. |
| Poly-HEMA | Sigma | P3932 | Dissolve in 95% EtOH overnight at 55 °C. Stock concentration 12% w/v. Final dilution 1% v/v in 95% EtOH. Filter (0.22 μm) before use. |
References
- Kordon, E. C., Smith, G. H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- van Amerongen, R., Bowman, A. N., Nusse, R. Developmental stage and time dictate the fate of Wnt/beta-catenin-responsive stem cells in the mammary gland. Cell Stem Cell. 11 (3), 387-400 (2012).
- Van Keymeulen, A., et al. Distinct stem cells contribute to mammary gland development and maintenance. Nature. 479 (7372), 189-193 (2011).
- Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138 (6), 1083-1095 (2009).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Grimshaw, M. J., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Research. 10 (3), R52 (2008).
- Pece, S., et al. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140 (1), 62-73 (2010).
- Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
- Santoro, A., et al. p53 Loss in Breast Cancer Leads to Myc Activation, Increased Cell Plasticity, and Expression of a Mitotic Signature with Prognostic Value. Cell Reports. 26 (3), 624-638 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gao, H., et al. Murine mammary stem/progenitor cell isolation: Different method matters? Springerplus. 5, 140 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Murphy, D. J., et al. Distinct thresholds govern Myc's biological output in vivo. Cancer Cell. 14 (6), 447-457 (2008).
- Bailey, P. C., et al. Single-Cell Tracking of Breast Cancer Cells Enables Prediction of Sphere Formation from Early Cell Divisions. iScience. 8, 29-39 (2018).
- Lombardo, Y., de Giorgio, A., Coombes, C. R., Stebbing, J., Castellano, L. Mammosphere formation assay from human breast cancer tissues and cell lines. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Peng, T., Qinghua, M., Zhenning, T., Kaifa, W., Jun, J. Long-term sphere culture cannot maintain a high ratio of cancer stem cells: a mathematical model and experiment. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Smart, C. E., et al. In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Panciera, T., et al. De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
