Summary
Denna metod visar användning av norra hybridisering teknik för att upptäcka miRNAs från totala RNA extrakt.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) är en klass av endogent uttryckt icke-kodning, ~ 21 nt små RNAs som deltar i regleringen av genuttryck i både växter och djur. De flesta miRNAs fungerar som negativa växlar av genuttryck inriktning viktiga gener. I växter, primära miRNAs (pri-miRNAs) avskrifter genereras av RNA polymeras II, och de bildar varierande längder av stabila stem-loop strukturer som kallas pre-miRNAs. En endonuclease, Dicer-like1, bearbetar pre-miRNAs i miRNA-miRNA * duplex. En av strängarna från miRNA-miRNA* duplex väljs ut och lastas på Argonaute 1 protein eller dess homologs för att medla klyvning av mål mRNAs. Även om miRNAs är viktiga signalmolekyler, är deras detektion ofta utförs av mindre än optimala PCR-baserade metoder i stället för en känslig norra blot analys. Vi beskriver en enkel, tillförlitlig och extremt känslig nordlig metod som är idealisk för kvantifiering av miRNA-nivåer med mycket hög känslighet, bokstavligen från någon växtvävnad. Dessutom kan denna metod användas för att bekräfta storlek, stabilitet och överflöd av miRNAs och deras prekursorer.
Introduction
Den senaste upptäckten av små reglerande RNA, microRNAs, har lett forskning för att förstå dem och deras roll i växter och djur1. Långa prekursorer av miRNAs bearbetas till 21 till 24 nt mogna miRNAs av HYL1 och specifika dicer-liknande proteiner2,3. En 22 nt miRNA kan initiera kaskad ljuddämpning genom att generera sekundära siRNAs4. Studier har visat den roll som miRNAs och sekundära siRNAs i utveckling, cell öde och stress svar5,6.
Nordlig hybridisering är en experimentell metod som rutinmässigt används för att upptäcka specifika RNA-molekyler. Denna metod anpassar dess användning vid detektion av cirka 19 -24 nt långa små RNA från en pool av totala RNAs7. I denna demonstration illustrerar vi användningen av denna teknik för detektion och kvantifiering av miRNAs. Denna metod använder märkning av sonder som använder radioisotetter. miRNA-nivåerna i provet kan därför detekteras med ökad känslighet. Till skillnad från PCR-baserade metoder säkerställer denna metod kvantifiering av uttryck samt storleksbestämning av miRNAs. I det här protokollet visar vi viktiga steg som förbättrar miRNA-identifiering. Vi har ändrat steg i blotting och hybridisering för att få högupplöst signaldetektering av miRNAs. Denna teknik kan också användas för detektion andra endogena små RNA såsom siRNAs, tasi-sekundära RNAs och snoRNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av en 15% denaturering polyakristrylamid gel
- Väg och tillsätt 4,8 g urea, tillsätt 3,75 ml 40 % akrylamid: bisakrylamidlösning (19:1) lösning och 1 ml 10x TBE pH 8.2 i ett sterilt 50 ml-rör.
- Lös upp urea med hjälp av ett vattenbad som är inställt på 60 °C i en klar lösning.
- Fyll på volymen till 10 ml med nybenäven sterilt vatten och kyl gelblandningen till rumstemperatur.
- Förbered färsk 10% (w / v) ammonium persulfate lösning.
2. Montering av glasplattor och elektroforesenhet
- Tvätta alla apparater som krävs för gelelektrofores och elektro-blotting med rengöringsmedel. Skrubba dem försiktigt med en mjuk svamp för att avlägsna restbuffert och akrylamid, skölj med vatten och låt dem torka.
- Montera ihop båda glasplattorna och placera dem stadigt på svampen. Använd en 1 mm tjock platta för denna inställning. Se till att plattorna är på samma nivå för att undvika läckage.
- Tillsätt 8 μl TEMED till 10 ml gelblandningen och 80 μL nyberedd 10 % (w/v) ammoniumpersulfatelösning.
- Blanda och häll försiktigt in detta mellan de monterade glasplattorna. Placera kammen försiktigt. Undvik att generera luftbubblor i detta steg.
- Låt gelen polymeriseras i ca 45 min.
- Tvätta den polymeriserade gelen med sterilt vatten innan du placerar den i gelens löpuppställning.
- Montera plattorna inuti den löpande kassetten och ta försiktigt bort kammen.
- Häll nyberedd steril 1x TBE, pH 8.2 i tanken.
- Tvätta brunnarna försiktigt genom att pipettera bufferten för att ta bort saltkristaller. Detta steg hjälper RNA-provet att köra jämnt över gelen.
- Utför en pre-run på 80 V i 30 min.
3. Beredning av lastfärgningsfärg och prover
- För 10 ml gel lastning färgämne, väga 5 mg bromfenol blå, 5 mg xylen cyanol, tillsätt 10 ml avjoniserad formamid noggrant och blanda dem väl.
- Aliquot 10 μg totalt RNA i ett sterilt 1,5 ml-rör och torka proverna med hjälp av en speedvac. Torka inte över proverna.
- Återanvända RNA-proverna i 8 μl lastning.
- Värm proverna vid 98 °C i 2 min, svalna i 1 min vid RT, virvel och snurra proverna, i 3 gånger. Detta steg är viktigt för korrekt resuspension och i sin tur detta hjälper till att lika lastning av proverna.
4. Gel elektrofores
- Stoppa förkörningen och tvätta brunnarna innan provbelastningen laddas.
- Värm proverna vid 98 °C i 1 min och lasta proverna varma i brunnen med hjälp av kapillärspetsar. Sätt spetsen på botten av brunnen, så att provet upptar ett tunt lager i brunnen.
- Fullständig lastning av alla prover. Inkludera att läsa in RNA-tioårsmarkör.
- Kör gelen på 80 V tills bromfenolblå färgämnet går nästan helt. Bromophenol blå körs på 10 bp i en 15% denaturering akrylamid gel.
5. Förberedelse för elektro-blotting
- Skär N +nylonmembranet till glasplattans mått och märk membranet i dess övre högra hörn med en HB-penna.
- Placera försiktigt membranet på ytan av sterilt vatten, vänd mot den märkta sidan mot vattenytan. Förblöda membranet i 15 min.
- Skär 4 bitar av blotting papper I till dimensionerna av fiber pad.
- Förbered gelsmörgåsen för att placera den grå sidan av kassetten i en ren bricka.
- Förglädnad fiberdynan och placera den över kassetten. Ta bort luftbubblor.
- Förglömd en bit läskpapper i 1x TBE och placera över fiberplattan. Ta bort luftbubblor genom att rulla en plastpipett över papperet. Lägg en annan bit av förvärma blotting papper och ta bort luftbubblor.
- Ta försiktigt bort gelen från den löpande kassetten och placera den över sandwichinställningen, så att det första laddade RNA-provet är åt höger.
- Doppa försiktigt det förindränkta membranet i 1x TBE och placera det över gelen, vänd mot den märkta sidan nedåt. Rulla ut för att ta bort luftbubblorna.
- Doppa en bit läskpapper, lägg det över membranet och ta bort luftbubblorna. Doppa en annan bit av blotting papper, placera den över smörgås setup och ta bort luftbubblor.
- Fyll i smörgåsen genom att placera en förväxande fiberdyna över installationen och stäng kassetten ordentligt.
- Placera transblotkassetten i modulen och fyll 1x TBE, pH 8.2 upp till läskemärket.
- Transfer vid 10 V, över natten vid 4 °C.Transfer at 10 V, overnight at 4 °C.
- Efter överföringen, placera det fuktiga membranet på ett pappersark och korsa omedelbart RNA till membranet genom bestrålning med 254 nm UV-ljus (120 000 μjoule/cm²). Den tvärbundna blot kanske lagras vid 4 °C för ytterligare hybridisering.
6. Beredning av radioaktivt märkt sond
- Utforma en sond som är helt komplement till det lilla RNA som ska detekteras.
- Slutetikett sonden med ƳP32ATP (erhålls från BRIT) i 5'-änden genom att kombinera komponenterna enligt receptet i tabell 1.
- Inkubera ovanstående reaktionsblandning vid 37 °C i 30 min.
- Separera omärkta ƳP32ATP från sonden med hjälp av en Sephadex G-25 kolumn enligt tillverkarens protokoll.
7. Hybridisering av blot
- Placera den korsade-länkade blot, RNA sida vänd toppen inuti en hybridisering flaska.
- Blanda den ultrakänsliga hybridiseringsbufferten kraftigt, tillsätt 10 ml av den och inkubera blotet inuti en hybridiseringsugn som hålls vid 35 °C, med rotation.
- Utför förhybridisering i 20 min.
- Ta ut flaskan ur ugnen och tillsätt den märkta sonden i hybridiseringsbufferten försiktigt.
- Hybridisera blotet vid 35 °C, med rotation för 12 timmar.
- Efter hybridisering överför försiktigt hybridiseringslösningen till 15 ml-rör. Denna lösning kan förvaras vid 4 °C tills den används på nytt.
- Utför en snabb tvättning av blot för 2 min för att ta bort överskott hybridisering lösning genom att lägga till 2x SSC buffert plus 0,5% SDS. Kassera lösningen.
- Inkubera blotet med 2x SSC-buffert plus 0,5% SDS för 35 °C, med rotation i 30 min.
- Tvätta blot igen med 0,5 x SSC buffert plus 0,5% SDS för 35 ° C, med rotation i 30 min.
- Placera blot inuti en hybridisering täcka, ta bort överskottet buffert och försegla den.
- Exponera den för en strålningsfri fosforbildare över natten inuti en kassett.
- Identifiera hybridiseringssignalen med hjälp av biomolekylär imager och analysera resultaten med hjälp av lämplig programvara.
- Skala blotet genom att ruva den vid 80 °C, med rotation i 30 min med 0,5 X SSC-buffert plus 0,1% SDS och 0,1 X SSC-buffert plus 0,1% SDS i 30 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna demonstration har vi upptäckt och kvantifierat uttrycket av miR397 i olika vävnader av indica ris var whiteponni (figur 1). miR397 är en 22 nt miRNA och bevarade miRNA. Uttrycket av miR397 kan detekteras i alla testade prover. Enligt nästa generations sekvenseringsdata har prov 1 (plantvävnad) miR397 vid 5 läsningar per miljon (rpm). Vi upptäckte dess signal bekvämt, vilket tyder på att metoden är mycket känslig och kan användas för att upptäcka även mycket låg riklig miRNAs. I det här experimentet har vi använt miR168 och U6 som lastningskontroller.
I denna blot (figur 1) kvantifierades styrkan hos signalerna med ImageJ. Uttrycket av miR397 är högst i vegetativ blad mant.
Figur 1: Detektion och kvantifiering av uttryck för miR397 i olika vävnader från risprover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Buffert och lösning | Recept | Kommentarer |
| 10 X TBE | 0.89M Tris buffert | pH ska ställas in på 8,2 med hjälp av ättiksyra |
| 0.89M Borsyra | ||
| 30mM EDTA | ||
| Gel blandning | 15% akrylamid-bisakristär sol, 19:1 | Gelblandningen får inte innehålla ureakristaller |
| 8M urea | ||
| 1X TBE | ||
| Gel lastning färgämne | 0,05 %(w/v) bromfenolblå | Försiktighet bör iakttas vid hantering av deioniserade formamid |
| 0,05 %(w/v) Xylene xyanol | ||
| 100 % avjoniserad- formamid | ||
| Märkning av sond | PNK-buffert (10X, 2 μL) | Denna blandning innehåller radioaktiva molekyler, detta steg måste utföras av utbildad personel inne i ett radioaktivt labb |
| PNK enzym (1 μL) | ||
| Oligo (100 μM, 0,1 μl) | ||
| ƳP32 ATP (4 μL) | ||
| Tvättbuffert - I | 2X SSC | |
| 0,5% (w /v) SDS | ||
| Tvättbuffert - II | 0,5 X SSC | |
| 0,5% (w /v) SDS | ||
| Strippa Buffert - Jag | 0,5 X SSC | |
| 0.1% (w/v) SDS | ||
| Strippa buffert - II | 0.1X SSC | |
| 0.1% (w/v) SDS |
Tabell 1: Tabell över recept.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod kan användas i stor utsträckning för detektion och kvantifiering av små RNA inklusive mindre rikliga miRNAs. Protokollet beskriver främst stegen för denaturering av den totala RNA i en lastbuffert, storleksseparation av gelelektrofores, överföring av RNA till ett membran, tvärlänk arren på membranet och hybridisera med hjälp av önskad radiolabeled oligo sonder.
Det kritiska steget för alla blotting experiment är användningen av god kvalitet RNA för provberedning. Innan gelerna laddas måste man se till att proverna är fritt flytande och inte fastnar på lastningsspetsarna. Försiktighet måste iakttas vid lastning av provet, spets bör införas strax ovanför botten av brunnen så att provet upptar ett tunt lager i brunnen. Hybridiseringsugnens temperatur måste hållas vid 35 °C för detektion av miRNAs som är extremt mindre rikliga. För upprepad hybridisering av blot, förvara membranet vid 4 °C genom att hålla det fuktigt i 2x SSC.
Denna metod kan användas för att upptäcka små RNA från vävnader som är rika på polysackarider och polyfenoler8. I detta protokoll ger användning av vakuumtorkning för koncentration av RNA-prover bättre stabilitet och mindre förlust av prov jämfört med andra äldre metoder9. Annan ändring i metoden inkluderar, spridning av membranet i vatten innan doppning i 1x TBE under elektroöverföring. Detta förbättrar effektiviteten i RNA-överföring, vilket ger bättre upplösning av blot.
En stor begränsning av metoden är användning av radioisotetter, som behöver utbildad personal och ett radioisotoplabb för att utföra hybridiseringsexperimenten. Denna metod ger här detaljerad information om alla steg som ingår i RNA blot-analysen för detektion av miRNAs. Detta protokoll säkerställer också storleken på den lilla RNA bortsett från dess signaldetektering10. Tekniken ger ett robust verktyg för molekylärbiologer att uppskatta överflödet av olika små RNAs såsom miRNAs, sekundära siRNAs och snoRNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna erkänner tillgång till strålning lab som värdinstitutet och BRIT för radioisotope. PVS-laboratoriet stöds av National Center for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research and grants (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) från Department of Biotechnology, Indiens regering. MP erkänner DBT-Research Associateship, DBT, Indiens regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
- Baulcombe, D.
- Anushree, N., Shivaprasad, P. V.
- Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. , (2020).
- Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
- Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
- Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs. The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).
- Akbergenov, R., et al. Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species. Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).
- Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes. Journal of Experimental Botany. , (2019).
- Li, C., Zamore, P. D. Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization. Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).
- Swetha, C., et al. Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing. The Plant Cell. , (2018).
