Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kvantsetting av rabiesvirus i ulike bovine hjernestrukturer

Published: May 22, 2021 doi: 10.3791/61429
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA), INIFAP, 2Campus Toluca, Universidad del Valle de México, 3Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Autónoma de Querétaro

Summary

Denne protokollen presenterer en qRT-PCR-basert tilnærming for å bestemme rabiesvirus nukleoprotein (N) genkopinummer i ulike bovin hjerneanatomiske strukturer ved hjelp av in vitro transkripsjon.

Abstract

Bovine paralytiske rabies (BPR) er en form for viral encefalitt som er av betydelig økonomisk betydning i hele Latin-Amerika, hvor det utgjør en stor zoonotisk risiko. Her var vårt mål å bruke en laboratorieprotokoll for å bestemme det relative kopinummeret til rabiesviruset (RABV) genomet i forskjellige bovine hjerneanatomiske strukturer ved hjelp av kvantitativ sanntids omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR). qRT-PCR kvantifiserer det spesifikke antallet genkopier som finnes i en prøve basert på fluorescens som slippes ut etter forsterkning som er direkte proporsjonal med mengden målkjernesyre som finnes i prøven. Denne metoden er fordelaktig på grunn av sin korte varighet, redusert risiko for forurensning og potensial for å oppdage virale nukleinsyrer i forskjellige prøver lettere sammenlignet med andre teknikker. Hjernen til seks rabiate dyr ble delt inn i seks anatomiske strukturer, nemlig Ammons horn, cerebellum, cortex, medulla, pons og thalamus. Alle hjerner ble identifisert som positive for RABV-antigener basert på en direkte immunfluorescenstest. De samme anatomiske strukturene fra hjernen til fire RABV-negative storfe ble også vurdert. RNA ble hentet fra hver struktur og brukt til qRT-PCR. En analyse ble utført for å bestemme kopitallene til RABV-gener ved hjelp av et in vitro transkribert nukleoproteingen. Standardkurven som brukes til å kvantifisere viral RNA viste en effektivitet på 100% og linearitet på 0,99. Analyse viste at cortex, medulla og thalamus var de ideelle CNS-delene for bruk i RABV-deteksjon, basert på observasjonen om at disse strukturene hadde de høyeste nivåene av RABV. Test spesifisiteten var 100%. Alle prøver var positive, ingen falske positiver ble oppdaget. Denne metoden kan brukes til å oppdage RABV i prøver som inneholder lave nivåer av RABV under diagnostisering av BPR.

Introduction

Rabies kan bekreftes ante-mortem og post-mortem ved ulike teknikker som muliggjør påvisning av virale nukleinsyrer i hjernen, huden, urinen eller spytt1. Påvisning av rabiesviruskjerneprotein (N) genet brukes primært til rabiesdiagnose ved molekylære tester. Dette genet brukes også til viral genotyping. Rabies kan diagnostiseres hos dyr ved hjelp av en hvilken som helst del av den berørte hjernen; For å utelukke muligheten for rabies, må vev fra minst to regioner i hjernen imidlertid testes2. Det finnes flere diagnostiske metoder for rabiesdeteksjon hos dyr; Den direkte immunfluorescenstesten forblir imidlertid standard referanseteknikk3. Andre tester inkluderer biologiske tester som inkorporerer musinokulering, infeksjon i vevskultur og polymerasekjedereaksjon (PCR)4. Alle disse teknikkene anbefales av Verdens helseorganisasjon (WHO) og World Organization of Animal Health (OIE) for diagnostisering av rabies hos mennesker og dyr, henholdsvis5.

Nukleinsyredeteksjon og forsterkningsteknikker har revolusjonert diagnosen rabies de siste årene6, og disse teknikkene spiller en viktig rolle i ante mortem-diagnosen av menneskelige rabies. Flere PCR-baserte tester har blitt evaluert for å utfylle konvensjonelle tester for ante-mortem og post-mortem rabies diagnoser7,8,9,10. De fleste analyser retter seg mot rabies viral nukleoprotein gen for forsterkning som er den mest bevarte regionen i viral genom1,11. I løpet av de siste 20 årene har ulike molekylære analyser blitt utviklet for å diagnostisere RABV, og noen av disse analysene har blitt brukt til viruskarakterisering. De fleste studier har som mål å oppdage konserverte gener i det virale genomet, oftest ved å bruke konvensjonelle eller kvantitative sanntids polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR) analyser12,13.

PCR er en svært følsom diagnostisk teknikk som kan oppdage genomet til et gitt patogen i vev, selv når disse vevene brytes ned. Ved hjelp av PCR-baserte tilnærminger kan minimale mengder av et smittsomt middel påvises i en klinisk prøve gjennom selektiv og repeterende forsterkning av en DNA-nukleotidsekvens14. qRT-PCR som inkorporerer fluorescerende sonder (f.eks. TaqMan) eller DNA-bindende fargestoffer (f.eks. SYBR Green) har blitt brukt i studier for å diagnostisere RABV både ante- og post- mortem med høy følsomhet; En slik tilnærming krever imidlertid spesialisert utstyr. For å overvinne denne begrensningen har omvendt transkripsjonssløyfemediert isotermisk forsterkning (RT-LAMP) blitt foreslått, basert på lave kostnader, enkelhet og ønskelige egenskaper for påvisning av RABV. Denne analysen er spesielt viktig, da den kan brukes i utviklingsland15.

qRT-PCR er basert på deteksjon og kvantifisering av et molekyl, hvor fluorescerende signaløkninger er i direkte forhold til mengden PCR-produkt i en enkelt reaksjon. Etter hvert som antall kopier av nukleinsyremålet øker, øker også fluorescensen. Ikke-spesifikke interkalerende fargestoffer som SYBR Grønn DNA-bindende fargestoff eller sekvensspesifikke oligonukleotidprober som bærer fluorofor og en quencher brukes ofte til å gi fluorescerende avlesning i qRT-PCR. Denne analysen gir fordeler i forhold til konvensjonell RT-PCR som inkluderer kortere testtid (2-4 t), redusert risiko for forurensning på grunn av det lukkede rørsystemet (mangel på post-PCR-manipulering av forsterkede produkter), og evnen til å oppdage forskjellige mål samtidig16. qRT-PCR kan brukes til å diagnostisere rabies ante-mortem fra spytt og andre prøver. Denne analysen kan også brukes som en universell sanntidstest for påvisning av forskjellige Lyssavirus-arter eller avledninger av RABV15. I denne kombinasjonen RT-PCR tilnærming brukes to reaksjoner. Den første oppdager forskjellige genetiske linasjer av RABV, og den andre oppdager Lyssavirus-arten. Begge trinnene involverer qRT-PCR-analyser, der den første bruker hybridiseringssonder og den andre bruker fargestoffer15. På grunn av det store antallet tester som har vist vellykket molekylær deteksjon av RABV ved hjelp av denne teknikken, anbefaler den nåværende OIE Terrestrial Manual (2018) bruk av PCR for molekylær deteksjon av RABV17.

Mexico er et land med betydelig husdyrpotensial. Statene med høyest husdyrproduksjon inneholder både fuktige tropiske regioner og tørre områder som er i fare for rabiesutbrudd på grunn av tilstedeværelsen av vampyrflaggermusen Desmodus rotundus, den viktigste senderen av rabies. Derfor er det viktig å utvikle flere verktøy for forebygging og kontroll av storfe paralytiske rabies (BPR) i México. Basert på dette var målet med denne studien å bruke kvantitativ qRT-PCR for å bestemme antall virale partikler i forskjellige anatomiske strukturer av storfehjerner etter døden på grunn av rabiesinfeksjon.

Seks hjerner hentet fra RABV-positive storfe ble donert av et eksternt laboratorium for bruk i utviklingen av qRT-PCR-protokollen beskrevet nedenfor. De bovine hjernestrukturprøvene ble kaldkjedet transportert til INIFAP CENID-MA-laboratoriet BSL-2-anlegget og lagret ved -80 °C til bruk. Hjerner ble hentet fra dyr fra delstatene Campeche, Yucatán og Querétaro. Før kvitteringen ble ulike strukturer dissekert fra hjernen. Disse strukturene inkluderte Ammons horn, cerebellum, cortex, medulla, pons og thalamus18,19. Genetisk materiale ble ekstrahert som beskrevet nedenfor. RABV diagnose ble bekreftet ved hjelp av direkte fluorescerende antistoffer (DFA)20. Som en positiv kontroll ble musehjerner som ble inokulert med RABV21 brukt. I tillegg ble fire RABV-negative storfehjerner (som bestemt av DFA) brukt som negative kontroller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne studien ble godkjent av og utført i henhold til anbefalingene for bruk av dyr levert av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA).

1. Prøver

  1. Bruk forskjellige områder av hjernen dissekert fra 6 forskjellige rabies-positive storfehjerner for RT-PCR-analyse.

2. Direkte fluorescerende antistoffer (DFAer) for å bekrefte rabies

MERK: Påvisning av rabiesantigenet av DFA er en kvalitativ metode for å bestemme tilstedeværelsen av rabieskjerneproteinet ved hjelp av fluorescein-merkede antistoffer. Testen ble utført ved hjelp av protokollen levert av Dean et al. (1966)20, som beskrevet nedenfor.

  1. Gjør to inntrykk fra hvert vev dissekert fra forskjellige hjernestrukturer på et sterilt lysbilde med ca. 15 mm diameter. Bruk en treapplikator til å smøre en ca. 3 mm3 del av vevet på den sterile sklien. For å lage smøringen, trykk forsiktig treapplikatoren mot lysbildet manuelt.
  2. Fest prøvesmørelysbildene ved å senke lysbildene ned i 100 % aceton i 1 time ved -20 °C. Etter inkubasjon, tørk lysbildene på en tørr klut ved 21 °C i 30 minutter.
  3. Tilsett 50 μL fluorescein-merket anti-nukleoprotein antistoff mot hver hjernesmøring ved en 1:10 fortynning ved å dispensere gjennom en sprøyte.
  4. Inkuber lysbildene med konjugaten i et fuktig kammer ved 37 °C i 1 time.
  5. Etter inkubasjon, vask lysbildene to ganger med vann og med PBS for å eliminere overflødig konjugat. La skliene tørke ved 21 °C. Forsiktig flekk for å fjerne overflødig væske og deretter kort lufttørk før montering.
  6. Tilsett en dråpe med 50% fosfatglyserin for å dekke overflaten av delen, og dekk deretter med en dekslelip. Vær oppmerksom på seksjonene under et epifluorescensmikroskop ved 40x forstørrelse.
    1. Behandle og observere de positive og negative kontrollene (positiv kontroll: musehjerner inokulert med RABV; negative kontroller: RABV-negative storfehjerner) på samme måte som prøvene.

3. Generere positiv kontroll for RT-PCR

  1. Få BHK-21 celler fra bakterieplasmabanken. Bruk celler opp til den 70. passasjen for å gjenskape RABV Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA)-stammen ved hjelp av passasje 2.
  2. Vedlikehold og forplant BHK-21 celler i flasker som inneholder minimum essensiell medium (MEM) supplert med 10% fosterkalvserum (FCS) ved 37 °C i nærvær av CO2 (5 %) og under fuktige forhold. Vokse cellene i 25 cm2 kulturflasker til de når 80% samløp og deretter subkultur.
  3. Fjern kulturmediet fra cellene og vask flasken med fosfatbufret saltvann (PBS). Inokuler kulturen med 105 TCID/ml RABV-stamme ERA. Inkuber det virale inokulumet i 2 timer under konstant risting ved 37 °C i nærvær av CO2 (5 %) og under fuktige forhold.
  4. Fjern infeksjonsmediet og tilsett MEM supplert med 5% (serumfetisal storfe) SFB. Inkuber i 72 timer ved 37 °C i nærvær av CO2 (5 %) under fuktige forhold.
  5. Høst RABV 3 dager etter inokulering når cellene viser cytopatiske effekter. Frys de infiserte cellene og tin dem deretter ved 4 °C for å lyse cellene. Samle mediet fra flasken, og legg deretter cellene i et sentrifugerør for sentrifugering ved 1050 x g i 10 minutter ved 4 °C.
  6. Oppbevar supernatantene fra RABV ved -80 °C, og forbered arbeids aliquots til oppbevaring ved -70 °C.
  7. Intracerebrally inokuler viruset oppnådd i forrige trinn inn i 21 dager gamle kvinnelige CD1 mus. Bruk en 1 ml sprøyte til å inokulere 50 μL oppløsninger som inneholder 106 MICLD50 (mus infeksiøs kultur dødelig dose 50%) doser i mus22.

4. RNA-ekstraksjon

MERK: Total RNA ble hentet direkte fra storfehjerner ved hjelp av en organisk ekstraksjonsmetode i henhold til følgende protokoll.

  1. Bruk 100 mg hjernevev fra hver anatomiske struktur for å trekke ut total RNA ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig reagens som inneholder guanidium isothiocyanat.
  2. Homogeniser manuelt totalt 100 mg vev fra hver struktur i 1 ml av guanidiumisiocyanatreagenset ved å virvelere ved hjelp av en Dounce homogenisator med en liten pestle inne i mikrorøret i 15 s ved maksimal hastighet.
  3. Inkuber prøvene på is i 5 min, og tilsett deretter 200 μL kloroform. Bland prøvene kraftig i 15 s, inkuber på is i 2 til 3 min, og sentrifuger deretter ved 12.000 x g i 15 min ved 4 °C.
  4. Overfør den vandige fasen til et rent rør og tilsett 500 μL isopropylalkohol. Inkuber prøvene i 15 min ved 21 °C.
  5. Sentrifuger prøvene ved 12 000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Aspirer den vandige supernatanten ved pipettering. Den isolerte RNA vil være til stede som en pellets i røret.
  6. Deretter vasker du RNA-pelletsen med 1 ml 75% etanol ved pipettering, og sentrifugerer ved 7500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
  7. Dekanter den supernatante og lufttørk RNA-pellet ved romtemperatur (21 °C). Deretter fortynner du pelletsen i 50 μL nukleasefritt vann.
  8. Bestem RNA-konsentrasjonen og kvaliteten ved 260 nm ved hjelp av et spektrofotometer. Oppbevar RNA ved -80 °C til bruk.
  9. Fjern DNA fra RNA-prøver ved fordøyelsen med DNase I. Tilsett 2 U DNase I per 1 μg RNA ekstrahert i forrige trinn. Tilsett deretter 5 μL 10x reaksjonsbuffer og inkuber deretter ved 37 °C i 30 minutter. Inaktiver DNase I ved å tilsette 1 μL EDTA i blandingen etterfulgt av inkubasjon i 10 minutter ved 65 °C.

5. cDNA syntese og PCR

  1. Syntetisere første tråd cDNA ved hjelp av oligo dT og omvendt transkripsjonase. For hver 1 μg RNA, tilsett 1 μL oligo DT (500 μg/ml), 1 μL 10 mM dNTP-blanding og nukleasefritt destillert vann til et endelig volum på 12 μL. Inkuber blandingen ved 65 °C i 5 minutter.
  2. Avkjøl reaksjonsblandingen til 4 °C. Sentrifuger røret i 30 s ved 1050 x g, og tilsett deretter 4 μL reaksjonsbuffer, 2 μL 0,1 M DTT og 1 μL ribonukleasehemmer (40 U/μL).
  3. Inkuber reaksjonsblandingen ved 37 °C i 2 minutter, og tilsett deretter 1 μL omvendt transkripsjonase (200 U). Deretter inkuberer du reaksjonsblandingen i 50 min ved 37 °C, og inaktiverer deretter reaksjonen ved 70 °C i 15 minutter.
  4. Oppbevar cDNA ved -20 °C før bruk.
    MERK: For å verifisere kvaliteten på den syntetiserte cDNA, utfør forsterkning av et 761 bp fragment av RABV N-genet før du utfører syntesen in vitro. Bruk protokollen beskrevet av Loza-Rubio et al.11 som beskrevet i trinn 5.5 nedenfor.
  5. Utfør PCR ved hjelp av Taq DNA-polymerase under følgende forhold. Utfør reaksjonsoppsettet på følgende måte: 10x Taq-buffer som inneholder 20 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPer, 1 U Taq polymerase, 10 μM av hver primer (SuEli +: 5′ cgtrgaycaatatgagtaca 3′ og SuEli-: 5′ caggctcraattcttctta 3′), 2,5 μL cDNA, og ultrapure vann til et endelig volum på 50 μL.
  6. Utfør forsterkningen i en termosykler ved hjelp av følgende sykkelforhold: 95 ° C i 3 min; 35 sykluser på 95 ° C i 30 s, 60 °C i 30 s og 72 °C i 1 min; en syklus på 72 °C i 7 min.
  7. Vurder tilstedeværelsen av 761 bp PCR-produkter ved hjelp av en 1% agarose gel.

6. In vitro transkripsjon

MERK: In vitro transkripsjon genererer mRNA av et målgen. Bruk et primerpar som forsterker det komplette RABV N-genet og et som brukes som en positiv kontroll for qRT-PCR-analysen. Disse primerne er designet for å forsterke det komplette RABV N-genet og legge til en promotor som gjenkjenner T7-polymerase (TAATACGACTCACTATAG).

  1. For å forsterke hele N-genet RABV, bruk primerne Trans-Nrab fremover (5ʹ gatgagtcactcgaatatgtctt 3ʹ) og revers (5ʹ caataatacgactcactatagggatggatgccgacaagatt 3ʹ) og et PCR-sett med høy kvalitet.
    1. For hver reaksjon, lag en PCR-masterblanding ved å legge til en ren PCR-rørreaksjonsbuffer 10x, 2 mM DMSO, 25 mM MgCl2, 10 mM dNTPer, 10 μM av hver primer, 0,5 U med høy kvalitet polymerase, 1,5 μL cDNA (fremstilt i trinn 5) og ultrarent vann til et endelig volum på 50 μL.
    2. Bruk en termosykler satt til følgende betingelser for forsterkning: 94 °C i 1 min; 4 sykluser på 94 °C i 1 min, 40 °C i 1 min og 72 °C i 2 minutter; 35 sykluser på 94 °C i 1 min, 60 °C i 1 min og 72 °C i 2 minutter; den endelige forlengelsen på 72 °C i 2 min.
  2. Hvis du vil bruke PCR-produktet som mal for in vitro-syntesen og fjerne komponenter i den enzymatiske reaksjonen fra trinn 6.1.2, renser du PCR-produktet ved hjelp av et kolonnebasert konsentratorsett i henhold til produsentens instruksjoner, og kvantifiserer deretter ved hjelp av et spektrofotometer.
  3. For RNA-syntese, bruk et in vitro transkripsjonssett med følgende reaksjonsblanding: 5 μL T7 Transkripsjon 5x buffer, 1,9 μL av hvert tripfosfatkjernekleotid, 10 μg renset RABV N DNA VP2 DNA og 2,5 μL av enzymblandingen. Deretter inkuberer du blandingen ved 37 °C i 4 timer. Tilsett deretter 1 μL 1 U/μg RNase-Free DNase til reaksjonsblandingen og inkuber i 15 minutter ved 37 °C for å eliminere DNA-forurensning.
  4. Rens in vitro transkribert RNA og konsentrer den deretter ved hjelp av fenol:kloroform:isoamylalkohol (25:24:1).
  5. Resuspend den rensede RNA-pelletsen til 70 μL TE-buffer, og lagre deretter ved -80 °C til bruk.
  6. Gjenta PCR-protokollen fra trinn 6.1 til ca. 5 μg PCR-produkt er oppnådd. Etter rensing og konsentrasjon vil in vitro transkribert N gen mRNA være til stede i en konsentrasjon på 4,711 μg/μL.
  7. Bekreft at in vitro transkribert mRNA tilsvarer N-genet etter trinn 5 i denne protokollen og bruk dette som en positiv kontroll for sanntids omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR).

7. Sanntids omvendt transkripsjon polymerase kjedereaksjon (qRT-PCR)

  1. For qRT-PCR, bruk en in vitro mRNA-transkripsjon som koder hele N-genet som en positiv kontroll sammen med et kommersielt ett-trinns qRT-PCR-sett ved hjelp av hybridiseringssonder i henhold til produsentens instruksjoner. Bruk sonden og primerne beskrevet av Carneiro et al. (2010)23 for å oppdage en bevart region av RABV gen N (BRDesrot-Rev: 5′ aaactcaagagaaggcca 3′, BRDesrot-Fwd: 5′ cgtactgatgtggaagggaattg 3′, og BRDesrot-Probe: 5′-FAM-acaagggaccctactgttcagagcatgc-3′-BHQ).
  2. Bruk følgende termiske sykkelforhold: 1 syklus på 50 °C i 10 minutter og 95 °C i 2 minutter; 40 sykluser på 95 °C i 15 s og 50 °C i 30 s.

8. Kalibreringskurve eller standardkurve

  1. Utfør serielle fortynninger av in vitro transkribert mRNA ved å røre 1 μg/μL mRNA seriell i rør til seks decuple fortynning er oppnådd. Forbered rør med et 100 μL volum i triplikat for bruk i å skape standardkurven. Utfør qRT-PCR som beskrevet i trinn 7.
  2. Utfør qRT-PCR i en termocycler med en rotor ved å behandle de forskjellige hjerneprøvene samtidig med løpereaksjonene for å skape standardkurven og bruke positive kontroller, negative kontroller og supernatanter isolert fra cellekulturen.
  3. For å evaluere grensen for deteksjon, testeffekt og følsomhet for testen, bruk en standardkurve i triplikat under de samme forholdene.

9. qRT-PCR av biologiske prøver

  1. For påvisning av RABV-gen N, bruk RNA fra feltprøver, positive kontroller, negative kontroller og supernatanter for cellekultur for å utføre qRT-PCR ved hjelp av PCR-settet som er beskrevet i trinn 7.
  2. For å bestemme antall kopier av RABV-genomet som finnes i de storfehjerneprøvene, få Ct-data fra standardkurven og biologiske prøver og fra de som er interpolert fra kalibreringskurveligningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DFA-resultatene viste henholdsvis 100%, 100%, 83,3%, 66% og 50% positivitet for RABV i cortex, thalamus, medulla, pons og horn. Disse resultatene bekreftet de tidligere resultatene, og minst tre av strukturene dissekert fra hver hjerne var positive for RABV. En representativ positiv DAF-farging er vist i figur 1.

Figur 2 viser forsterkning av et fragment av RABV N-genet (trinn 5.5) med primerne først rapportert av Loza-Rubio et al.11. Dette viste at materialet som ble oppnådd brukt i forsterkning var av god kvalitet.

Størrelsen på det PCR-forsterkede fragmentet vises i figur 3. Ligningen av standardkurven viser forholdet mellom mengden RABV genetisk innhold i en prøve og størrelsen på det PCR-forsterkede fragmentet. Mengden av RABV genetisk innhold (i ng) ble utledet ved interpolering av Ct-verdiene i kalibreringskurven ved hjelp av ligningen presentert i figur 4. Ved hjelp av denne ligningen ble deteksjonsgrensen på 1 x 105 μg / μL viral RNA funnet å tilsvare 36 kopier av RABV-genomet. Disse resultatene viser at analysen er sensitiv og kan brukes til å oppdage viruset i prøver som inneholder et lavt antall kopier RABV N gen. Analysens effektivitet ble beregnet ved hjelp av skråningen av standardkurven, som var -3,28. Prøvene som ble brukt for qRT-PCR viste forsterkning av RABV N-genet.

For å bestemme antall virale kopier som finnes, ble Ct-verdiene for hver prøve interpolert ved hjelp av kalibreringskurveligningen. Resultatet oppnådd (i nanogrammer) ble erstattet i formelen beskrevet nedenfor fra følgende referanse24:

Antall kopier RABV N gen = (ng prøve * 6.022 x 1023) / (104 bp (lengde på PCR produkt) * 1 x 109 * 650).

Til sammenligning var resultatene av qRT-PCR-analyser i samsvar med resultatene som ble oppnådd ved hjelp av DFA. Ifølge resultatene oppnådd i qRT-PCR-testen i tilfelle C og D (tabell 1), er thalamus strukturen som har det høyeste antallet kopier av RABV N-genet. Dette antyder at tidlig infeksjon av hypothalamus og thalamic nevroner er viktig i utviklingen av sykdommen, gitt at disse nevronene kontrollerer dyrets vegetative funksjoner. Kopinumrene til RABV N-genet som ble påvist i hver struktur i hver prøve, er vist i tabell 1. Følsomheten og spesifisiteten til qRT-PCR-testen var begge 100%, da alle prøvene var positive. Dette resultatet samsvarer med de første diagnosene i prøvene.

Figure 1
Figur 1: Bovint hjernevev som viser positiv farging i henhold til den direkte immunfluorescenstesten som oppdager rabiesvirusprotein N i infisert vev. En eplegrønn fargestoffer observeres ved farging, hvor antistoffet binder seg til rabiesantigenet. Skalalinje: 50 μm Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: 1,5 % agarosegel som viser forsterkningsproduktene. Forsterkning av et 761 bp fragment av RABV N-genet for å demonstrere tilstedeværelsen og kvaliteten på cDNA som skal brukes i in vitro transkripsjon. Lane 1 inneholder en molekylvektmarkør, linje 2: forsterkning av positiv kontroll; kjørefelt 3: negativ kontroll (ikke-infisert prøve); linje 4: forsterkning av cDNA som brukes til in vitro transkripsjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: 1,5 % agarosegel som viser forsterkningsproduktene. Forsterkning av hele N-genet er vist i bane 2. Bane 1 inneholder en molekylvektmarkør, og kjørefelt 3 inneholder den negative forsterkningskontrollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Standardkurven til qRT-PCR ved bruk av in vitro transkribert N gen mRNA for å kvantifisere antall kopier av RABV N-genet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

ID-hjerne struktur DAF Antall kopier (x109)
A. Ammons horn + 0.261
lillehjerne + 0.0663
bark + 0.02
Medulla + 0.146
Pons + 30.7
Thalamus + 108
B Ammons horn - 0.0251
lillehjerne + 4.64
bark + 12.4
Medulla + 0.175
Pons \u2012 0.0721
Thalamus + 121
C. Ammons horn \u2012 0.168
lillehjerne + 0.0239
bark + 21.5
Medulla + 17.2
Pons + 1.32
Thalamus + 102
D. Ammons horn + 11.8
lillehjerne + 0.0239
bark + 8.72
Medulla + 1.25
Pons \u2012 0.0165
Thalamus + 33.4
E. Ammons horn + 4.15
lillehjerne + 6.78
bark + 1.53
Medulla + 1.41
Pons + 0.025
Thalamus + 95
F. Ammons horn + 0.0221
lillehjerne \u2012 0.00023
bark + 4.95
Medulla \u2012 0.000556
Pons + 1.02
Thalamus + 89

Tabell 1: Bestemmelse av antall kopier av RABV N-genet i hver hjernestruktur. Resultatene ble oppnådd fra seks anatomiske strukturer av RABV-positive storfehjerner diagnostisert ved hjelp av DFA. Ordene uthevet med fet skrift angir strukturene med flest kopier. Resultatene ble uttrykt som antall kopier av N-genet per milligram vev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tidligere studier har vist at DFA bare kan oppdage RABV innen syv dager etter at prøven er lagret ved romtemperatur (21 °C)14. Derimot viste dette arbeidet at følsomheten til RT-PCR begynner å avta etter at prøvene har blitt utsatt for romtemperatur i 12 dager. Derfor kan RABV-genomet påvises av qRT-PCR i prøver utsatt for romtemperatur i opptil 23 dager. Dette viser at følsomheten til qRT-PCR er relativt høyere for mer nedbrutte prøver. Det er imidlertid fortsatt nødvendig å utvikle enklere metoder som ikke kompromitterer spesifisitet25. Den nåværende forskningen viste en molekylær analyse som har høyere følsomhet enn DFA, basert på observasjonen om at den var i stand til å oppdage det virale genomet uavhengig av den spesifikke hjernestrukturen.

Fordelene med RT-PCR-teknikken for bruk i detektering av smittsomme stoffer har blitt fremhevet i flere vitenskapelige studier. Denne teknikken kan imidlertid ha noen ulemper, for eksempel utførelseskostnader, da det krever spesialisert utstyr. Utdannet personell er pålagt å håndtere molekylærbiologiske analyser. I tillegg bør det nevnes at som en svært følsom teknikk er noen av trinnene avgjørende for å oppnå de beste resultatene. En av disse er riktig håndtering av prøver for RNA-ekstraksjon. Dette trinnet er avgjørende, da RNA lett blir degradert, og resultatene kan derfor bli påvirket. Vurder å opprettholde prøven under kalde forhold (ca. 4 °C) under prosessen. I tillegg bør du vurdere at flere runder med PCR-søknad utføres som nevnt i trinn 6.1 for å generere transkripsjonsin vitro. Dette skyldes at en stor mengde genetisk materiale er nødvendig for at reaksjonen skal gi betydelige (mer enn milligram) mengder DNA. Et annet viktig aspekt ved denne analysen er kravet om rensing av det genetiske materialet i kolonnene, da DNA også kan gå tapt i løpet av dette trinnet.

qRT-PCR er kjent for å være like spesifikk som DFA-testen, som er standardtesten godkjent av WHO og OIE. Imidlertid har molekylære analyser som bruker RT-qPCR vist seg å ha høyere følsomhet og dermed tillate analyse av prøver med høyere grad av dekomponering for å lette påvisning av et relativt lite antall kopier av viralgenomet. Det er også mye raskere, reduserer risikoen for forurensning, og kan brukes ante-mortem26,27.

Bingham og van Der Merwe (2002)28 gjennomførte en studie ved hjelp av DFA for å finne ut hvilke hjernestrukturer som hadde høyere konsentrasjoner av RABV N-genet. Totalt ble 252 hjernestrukturer fra flere arter evaluert. Thalamus, pons og medulla var de mest relevante hjernestrukturene, da de var positive i alle evaluerte hjerneprøver. Disse resultatene er enige med resultatene som presenteres her, som var i samsvar med DFA resultater i følgende strukturer: cortex og thalamus, 100%; medulla, 83,3%; pons, 66%; og horn, 50%. Tidligere studier rapporterte derimot ingen falske negativer. I dette arbeidet ble det påvist noen negative resultater i komplette hjernestrukturer som tidligere hadde blitt diagnostisert som positive. Dette kan skyldes at den delen av prøven som ble brukt til testen ikke inneholdt viruspartikler identifisert av antistoffet eller den mer følsomme molekylære analysen. En annen mulig forklaring er at prøvene ikke ble transportert eller lagret på riktig måte før mottak på laboratoriet.

qRT-PCR-analysen som ble utført i denne studien, kunne oppdage så få som 36,3 kopier av RABV N-genet per milligram vev. De mest egnede hjernestrukturene for qRT-PCR inkluderte cortex og thalamus. Dette er basert på observasjonene om at høyere konsentrasjoner av RABV N-genet ble påvist i disse strukturene, og at de også ble funnet å være positive ved hjelp av RABV-referansetesten. Testen var i stand til å oppdage svært lave konsentrasjoner (0,00023 x 109 kopier) av viruset i ulike prøver. I tillegg til å kvantifisere viruspartiklene i prøven, ser testen ut til å gi et godt alternativt diagnostisk og forskningsverktøy for påvisning av RABV.

Med resultatene oppnådd ved hjelp av rabiesviruset viral genomdeteksjonsprotokoll presentert her, forventes det at denne teknikken kan brukes til molekylær diagnose av viruset i forskjellige typer prøver, da den er i stand til å oppdage minimale mengder av virusgenomet. Den største fordelen i forhold til andre metoder som DFA er at den er mer følsom og kan brukes ante-mortem, som det er foreslått av andre forfattere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Agricultural, Forestry, and Livestock Research (INIFAP). Vi takker Jerzayn Fraustro Esquivel for hans samarbeid i utviklingen av videoen knyttet til dette dokumentet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform SIGMA C7559 Facilitates recovery of the aqueous phase of PCRs which have been overlaid with mineral oil.
DNA Clean & Concentrator-500 Zimo D4031 The DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is designed for the rapid, large format purification and concentration of up to 500 µg of high quality DNA from samples including large-scale restriction endonuclease digestions and impure DNA preparations.
Ethanol Amresco 193-500 Purification of nucleic acids
FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack Roche 3553400001 High fidelity enzyme for the amplification of PCR products avoiding random base changes
GelDoc XR BioRad XR+ Analyzes larger protein and DNA gels
GelRed Biotium 41003 A new generation of nucleic acid gel stains, they possess novel chemical features designed to minimize the chance for the dyes to interact with nucleic acids in living cells.
iCycler Thermal Cycler Gradient BioRad 582BR Temperature can be monitored and controlled by instrument algorithm, in-sample probe, or sample block modes
iTaq Universal Probes One-Step Kit BioRad 1725141 Reaction mixture to carry out PCR reactions in real time using TaqMan type hybridization probes
Isopropyl alcohol Amresco 0918-500 Precipitation of nucleic acids
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28706 QIAquick Kits contain a silica membrane assembly for binding of DNA in high-salt buffer and elution with low-salt buffer or water. The purification procedure removes primers, nucleotides, enzymes, mineral oil, salts, agarose, ethidium bromide, and other impurities from DNA samples
M-MLV Reverse Transcriptase Invitrogen 28025-021 Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) uses singlestranded RNA or DNA in the presence of a primer to synthesize a complementary
DNA strand.
NanoDrop 2000 Thermo-Scientific ND2000 Microvolume Spectrophotometer
Oligo(dT)18 primer Invitrogen SO132 The oligo (dT)18 primer is a synthetic single-stranded 18-mer oligonucleotide with 5'- and 3'-hydroxyl ends.
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 and T7 Promega P1300 In vitro transcription reactions are used to synthesize microgram amounts of RNA probes from recombinant DNA templates. Most transcription reactions designed to generate RNA probes are optimized to maximize incorporation of radiolabeled ribonucleotides rather than to produce large amounts of RNA
Taq DNA Polymerase Invitrogen #EP0402 Taq DNA Polymerase is a highly thermostable DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. The enzyme catalyzes 5’ and 3’ synthesis of DNA
 
TRIzol reagent Invitrogen 15596026 The TRIzol reagent is a complete, ready-to-use reagent, designed for the isolation of high quality total RNA or the simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from a variety of biological samples.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Subramaniam, M. R., Madhusudana, S. Laboratory diagnosis of human rabies: recent advances. ScientificWorld Journal. 2013 (569712), 1-10 (2013).
  2. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/diagnosis/animals-humans.html (2019).
  3. Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).
  4. Prabhu, K. N., et al. Application and comparative evaluation of fluorescent antibody, immunohistochemistry, and reverse transcription polymerase chain reaction tests for the detection of rabies virus antigen or nucleic acid in brain samples of animals suspected of rabies in India. Veterinary Science. 5 (1), 24 (2018).
  5. Woldehiwet, Z. Clinical laboratory advances in the detection of rabies virus. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 49-63 (2005).
  6. Singh, R., et al. Rabies - epidemiology, pathogenesis, public health concerns and advances in diagnosis and control: a comprehensive review. Veterinary Quarterly. 37 (1), 212-251 (2017).
  7. David, D. Role of the RT-PCR method in ante-mortem & post-mortem rabies diagnosis. Indian Journal of Medical Research. 135 (6), 809-811 (2012).
  8. Biswal, M., Ratho, R. K., Mishra, B. Role of reverse transcriptase polymerase chain reaction for the diagnosis of human rabies. Indian Journal of Medical Research. 135, 837-842 (2012).
  9. Wacharapluesadee, S., et al. Comparative detection of rabies RNA by NASBA, real-time PCR and conventional PCR. Journal of Virological Methods. 175 (2), 278-282 (2011).
  10. Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for ante mortem and post-mortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).
  11. Loza-Rubio, E., Rojas-Anaya, E., Banda-Ruiz, V. M., Nadin-Davis, S. A., Cortez-Garcia, B. Detection of multiple strains of rabies virus RNA using primers designed to target Mexican vampire bat variants. Epidemiology and Infection. 133 (5), 927-934 (2005).
  12. Dedkov, V. G., et al. Development and evaluation of a RT-qPCR assay for fast and sensitive rabies diagnosis. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 90, 18-25 (2018).
  13. Boldbaatar, B., et al. Rapid detection of rabies virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Japanese Journal Infectious Diseases. 62, 187-191 (2009).
  14. Rojas Anaya, E., Loza Rubio, E., Banda Ruiz, V., Hernández-Baumgarten, E. Use of reverse transcription-polymerase chain reaction to determine the stability of rabies virus genome in brains kept at room temperature. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 18 (1), 98-101 (2006).
  15. Dacheux, L. Dual combined Real-Time reverse transcription polymerase chain reaction assay for the diagnosis of Lyssavirus infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 004812 (2016).
  16. Tamay De Dios, L., Ibarra, C., Velasquillo, C. Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigigación en Discapacidad. 2 (2), 70-78 (2013).
  17. Chapter 2.1.17. Rabies (infection with rabies virus and other Lyssaviruses. OIE. , Available from: https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.p (2018).
  18. Wacharapluesadee, S., Hemchudha, T. Ante-and post-mortem diagnosis of rabies using nucleic acid-amplification tests. Expert Reviews of Molecular Diagnostics. 10 (2), 207-218 (2010).
  19. Protocol for Postmortem Diagnosis of Rabies in Animals by Direct Fluorescent Antibody Testing. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2017).
  20. Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).
  21. Cuevas-Romero, S., Colmenares, V. G., Batalla, C. D., Hernández, B. E. Selección de un virus rábico de origen vampiro para utilizarse como cepa de desafío en bovino. Veterinaria México. 20, 271-275 (1989).
  22. Mendez-Ojeda, M. L., et al. Detection of rabies virus in organs unrelated to the central nervous system of experimentally inoculated vampire bats. Revista Méxicana de Ciencias Pecuarias. 9 (3), 435-450 (2018).
  23. Carneiro, A. J., et al. Rabies virus RNA in naturally infected vampire bats, Northeastern Brazil. Emerging Infectious Diseases. 16, 2004-2006 (2010).
  24. Andrew, S. Calculator for determining the number of copies of a template. URI Genomics & Sequencing. , Available from: http://cels.uri.edu/gsc/cdna.html (2020).
  25. Beltran, F. J., Dohmen, F. G., Del Pietro, H., Cisterna, D. M. Diagnosis and molecular typing of rabies virus in samples stored in inadequate conditions. The Journal of Infection in Developing Countries. 13 (8), 1016-1021 (2018).
  26. Finke, S., Cox, J. H. Differential transcription attenuation of rabies virus genes by intergenic regions: generation of recombinant viruses overexpressing the polymerase gene. Journal of Virology. 74 (16), 7261-7269 (2000).
  27. Fooks, A. R., et al. Rabies. 3, Macmillan Publishing Limited. 1-18 (2017).
  28. Bingham, J., Van Der, M. M. Distribution of rabies antigen in infected brain material: determining the reliability of different regions of the brain for the rabies fluorescent antibody test. Journal Virological Methods. 101 (1-2), 85-94 (2002).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 171 virus bovint paralytisk rabies qRT-PCR diagnose zoonose hjerne
Kvantsetting av rabiesvirus i ulike bovine hjernestrukturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rojas-Anaya, E., Anaya-Razo, D.,… More

Rojas-Anaya, E., Anaya-Razo, D., Bárcenas-Reyes, I., Loza-Rubio, E. Quantitation of Rabies Virus in Various Bovine Brain Structures. J. Vis. Exp. (171), e61429, doi:10.3791/61429 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter