Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En effektiv metode til produktion af Adenovirus

Published: June 10, 2021 doi: 10.3791/61691
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Cellular Biology and Pathology "Nicolae Simionescu"

Summary

Her præsenterer vi en protokol for adenovirusproduktion ved hjælp af pAdEasy-systemet. Teknologien omfatter rekombination af pAdTrack og pAdEasy-1 plasmider, adenovirusemballage og forstærkning, rensning af adenoviralpartiklerne fra cellelysat og kulturmedie, virustitrering og funktionel test af adenovirus.

Abstract

Adenoviral transduktion har den fordel, at en stærk og forbigående induktion af ekspressionen af interessegenet i en bred vifte af celletyper og organer. Men rekombinant adenoviral teknologi er besværlig, tidskrævende og dyrt. Her præsenterer vi en forbedret protokol ved hjælp af pAdEasy-systemet til at opnå rensede adenovirale partikler, der kan fremkalde et stærkt grønt fluorescerende protein (GFP) udtryk i transducerede celler. Fordelene ved denne forbedrede metode er hurtigere forberedelse og lavere produktionsomkostninger sammenlignet med den oprindelige metode udviklet af Bert Vogelstein. De vigtigste trin i adenoviral teknologi er: (1) rekombination af pAdTrack-GFP med pAdEasy-1 plasmid i BJ5183 bakterier; 2) emballering af adenoviralpartiklerne 3) forstærkning af adenovirus i AD293-celler 4) rensning af adenoviralpartiklerne fra cellelysat og dyrkningsmedium og 5) virustitrering og funktionel testning af adenovirus. Forbedringerne af den oprindelige metode består af (i) rekombinationen i BJ5183-holdige pAdEasy-1 ved kemisk omdannelse af bakterier; ii) udvælgelse af rekombinante kloner ved hjælp af "negative" og "positive" PCR — overførsel af AD293-celler ved hjælp af K2-transfekturesystemet til adenoviralemballage iv) udfældning med ammoniumsulfat af de viruspartikler, der frigives af AD293-celler i cellekulturmedium og v) rensning af virusset ved hjælp af et trins cæsiumchlorid diskontinuerlig gradient ultracentrifugering. Et stærkt udtryk for interessegenet (i dette tilfælde GFP) blev opnået i forskellige typer transducerede celler (såsom hepatocytter, endotelceller) fra forskellige kilder (human, kvæg, murin). Adenoviral-medieret genoverførsel er et af de vigtigste værktøjer til udvikling af moderne genterapier.

Introduction

Adenovirus er ikke-vidtrækkende vira, der indeholder en nucleocapsid og et dobbeltstrenget lineært DNA-genom1,2,3. Adenovirus kan inficere en bred vifte af celletyper, og infektion er ikke afhængig af aktiv værtscelledeling. Efter infektion introducerer adenovirus sit genomiske DNA i værtscellens kerne, hvor det forbliver epikromosomalt og transskriberes sammen med værtens gener. Således opnås en minimal potentiel risiko for insertional mutagenesis eller oncogenes regulering4,5,6. Det adenovirale genom replikeres ikke sammen med værtsgenomet, og dermed fortyndes adenovirale gener i en dividere cellepopulation. Blandt fordelene ved adenoviral transduktion er der: (i) høje niveauer af transgene udtryk; ii) reducerede risici i forbindelse med integreringen af det virale DNA i værtsgenomet på grund af episomalt udtryk — transduktion af en lang række celletyper, der deler sig og ikke deler sig. De fleste adenovirus , der anvendes i biomedicinsk forskning , er ikke-repliktive og mangler E1-region7,8,9. Til deres produktion kræves en cellelinje, der leverer E1-sekvensen (f.eks. Desuden blev en ikke-væsentlig region for den virale livscyklus (E3) slettet for at tillade indsættelse af en transgen i det virale genom; andre regioner (E2 og E4) blev yderligere slettet i nogle adenovirus, men i disse tilfælde blev der rapporteret om et nedsat udbytte af adenoviralproduktionen og et lavt udtryk for transgenet7.

Her præsenterer vi en forbedret protokol til konstruktion, emballering og rensning af adenovirus ved hjælp af AdEasy-systemet. Disse forbedringer gjorde det muligt at pakke adenovirus på en hurtigere og mere økonomisk måde sammenlignet med den oprindelige metode udviklet af Bert Vogelstein2,10, på grund af følgende fordele: (i) rekombinationen i BJ5183-holdige pAdEasy-1 ved kemisk transformation af bakterier; ii) pcr's valg af rekombinantklon — overførsel af AD293-celler ved hjælp af K2-transfekturesystemet til adenoviralemballage iv) udfældning af adenovirale partikler fra dyrkningsmediet efter viral emballage og forstærkning — adenoviralrensning ved hjælp af et trins cæsiumchlorid (CSCl) gradient ultracentrifugering.

Protokollen for produktion af adenovirus ved hjælp af AdEasy-systemet (figur 1) omfatter følgende trin:

(1) Rekombination af pAdTrack-GFP med pAdEasy-1 i BJ5183 bakterier
2) Emballering af adenoviralpartiklerne
3) Forstærkning af adenovirus
(4) Rensning af adenovirale partikler fra celle lysat og dyrkning medium
(5) Adenovirus titrering.

Figure 1
Figur 1: Adenovirusproduktionsteknologien. De vigtigste trin i adenoviral teknologi er: (1) Rekombination af pAdTrack-GFP med pAdEasy-1 plasmid i BJ5183 bakterier. De udvalgte rekombinerede plasmider forstærkes i DH5α bakterier og renses derefter; (2) Emballering af adenovirale partikler i AD293-celler, der producerer adeno-E1-proteiner; (3) Forstærkning af adenovirus i AD293-celler; (4) Rensning af adenoviralpartiklerne fra cellelysatet og dyrkningsmediet ved ultracentrifugering på en CSCl-tæthedsgradient; (5) Titreringen af adenovirus og den funktionelle test. Klik her for at se en større version af dette tal.

I denne protokol eksemplificerede vi teknologien til produktion af adenovirus, som kan fremkalde udtrykket af GFP i værtscellerne. GFP er allerede indsat i rygraden i pAdTrack-CMV shuttle vektor (Addgene #16405), under en anden CMV promotor og bruges som en reporter gen (Figur 1). Derfor udpegede vi her pAdTrack-CMV-vektoren som pAdTrack-GFP, og vi vurderede GFP's udtryk til demonstrative formål. Udover GFP-udtryk kan systemet bruges til at overekspressere et gen af interesse, som kan klones på pAdTrack-CMV's mange kloningssteder. Et gen eller en minigen klonet i pAdTrack-CMV er normalt mere effektiv til ekspressionsinduktion sammenlignet med cDNA11. Dataene viste et stærkt GFP-udtryk i transducerede celler (såsom hepatocytter, endotelceller) fra forskellige kilder (human, kvæg, murin). Adenoviral-medieret genoverførsel er et af de vigtigste værktøjer til udvikling af moderne genterapier.

Protocol

Sikkerhedsbemærkning: Generelt klassificeres adenovirus som biosikkerhedsniveau 2-organismer, og derfor skal alle manipulationer udføres i et biosikkerhedsskab i klasse II af en uddannet person, der bærer biologisk farligt beskyttelsesudstyr (herunder handsker, ansigtsmaske til biologiske aerosoler, laboratoriekittel osv.). Alle faste materialer, der er forurenet med adenovirus, skal desinficeres med en 10% blegemiddelopløsning i 30 minutter og autoklaveres i 30 minutter ved 121 °C og 1 bar. Afhængigt af det indsatte gen kan den skabte adenovirus have et farligt potentiale og kan klassificeres i andre biosikkerhedsniveauer.

1. Eksperimentel forberedelse

  1. Brug en separat cellekulturhætte til adenoviral manipulationer og en separat inkubator for hver adenovirustype. Der anvendes T-kolber med filterhætter til viral emballage og forstærkning; så vidt muligt undgå transduktionseksperimenter i udluftede Petri-plader.
  2. Tøm cellekulturhætten efter hver brug, og udsæt den for UV i 15 minutter.
  3. Autoklave regelmæssigt pipette støtte, pipetter, og andre redskaber. Hvis det er muligt, kultur i en separat cellekultur laboratorium / hætte cellerne til adenoviral emballage (AD293 celler) og de celler, der skal anvendes i transduktion eksperimenter. Partier af forskellige adenovirus, der forstærkes i samme periode, bør kontrolleres for krydskontaminering med PCR.
  4. Forbered følgende løsninger.
    1. Forbered SOB (Super Optimal Bouillon) medium: 20 g trypton, 5 g gærekstrakt, 0,5 g NaCl (10 mM endelig koncentration), 2,5 mL 1 M KCl (2,5 mM endelig koncentration), amd H2O til 1 L. Efter autoklavering ved 121 °C tilsættes følgende sterile opløsninger: 5 mL på 1 M MgCl2 og 5 mL på 1 M MgSO4.
    2. Forbered SOC (Super Optimal bouillon med katabolitundertrykkelse) medium: I 1 L steril SOB tilsættes følgende sterile opløsninger: 20 mL 1 M glukose, 5 mL 1 M MgCl2 og 5 mL på 1 M MgSO4.
    3. Forbered nedbørsopløsning: 29,5 g kaliumacetat opløses i 60 ml H2O, tilsættes 11,5 ml eddikesyre og H2O til 100 ml.
    4. Forbered resuspension buffer: 95 mL af 20% glukose, 5 mL af 1 M Tris-Cl pH 8, 4 mL af 0,5 M EDTA pH 8, og tilsæt H2O til 200 mL.
    5. Forbered lysis løsning: 4,8 ml 8,3 M NaOH, 10 ml 20%SDS og H2O til 200 ml.

2. Rekombination af pAdTrack-GFP viral vektor med pAdEasy-1 plasmid i BJ5183 bakterier

  1. Linearisering af pAdTrack-GFP og rensning af den lineariserede plasmid.
    1. Forbered følgende fordøjelsesblanding på is:
      10 μg pAdTrack-GFP
      5 μL 10x farveløs buffer
      2 μL pme I
      H2O af et endeligt volumen på 50 μL.
    2. Inkuber ved 37 °C i 3 timer i et vandbad.
    3. Inaktiver ved 65 °C i 20 min.
    4. Kontroller effektiviteten af fordøjelsen af pAdTrack-GFP med Pme I: kør 1 μg af den fordøjede plasmid parallelt med 1 μg ufordøjet plasmid på en 0,8% agarose gel.
  2. Isolering og rensning af DNA
    BEMÆRK: Trin 1-6 skal udføres i en røghætte.
    1. Der tilsættes et tilsvarende volumen phenol/chloroform/isoamylalkohol (25:24:1) over fordøjelsesblandingen, og røret vendes, indtil blandingen er homogen.
    2. Centrifuge i 3 min ved 16.200 x g, og derefter overføre den øverste vandige fase til en indsamling rør.
    3. Der tilsættes et lige stort antal phenol/chloroform/isoamylalkohol (25:24:1) i den lavere organiske fase og vortex.
    4. Centrifuge i 3 min ved 16.200 x g, og overfør derefter den øverste fase til det samme opsamlingsrør.
    5. Der tilsættes et tilsvarende volumen kloroform over den vandige fase, der er høstet i opsamlingsrøret og hvirvelstrømmen.
    6. Centrifuge i 3 min ved 16.200 x g, og overfør derefter den øverste vandige fase til et nyt opsamlingsrør.
    7. Tilsæt en 1/10 volumen på 3 M natriumacetat, og 2 mængder af kolde 100% ethanol og vortex.
    8. Inkuber i 1 time ved -70 °C eller natten over ved -20 °C.
    9. Prøven optøs på is og centrifuges i 10 minutter ved 16.200 x g og 4 °C.
    10. Supernatanten fjernes, og der tilsættes 750 μL 75% ethanol.
    11. Centrifuge i 3 min ved 16.200 x g og 4 °C og fjern supernatanten.
    12. Drej kortvarigt røret for at fjerne alle supernatanten og tør pelleten i emhætten. Tør ikke DNA-pellet i lang tid, fordi det er vanskeligt at opløse.
    13. Pelletlen opløses i 15 μL af H2O.
    14. Dna-koncentrationen måles ved hjælp af et spektrofotometer (f.eks. Nanodrop).
  3. Transformation af AdEasier-1 bakterier med pAdTrack-GFP
    BEMÆRK: I dette trin finder rekombinationen af pAdTrack-GFP med pAdEasy-1 plasmid sted.
    1. Forbered AdEasier-1 (BJ5183-holdige pAdEasy-1, Addgene #16399) kemiske kompetente bakterier ved hjælp af et kommercielt transformationssæt efter producentens anvisninger. Aliquots på 100 μL kompetente bakterier ved -80 °C.
    2. Tø en aliquot af kompetente AdEasier-1 bakterier på is og tilsæt 1 μg renset Pme I-fordøjet pAdTrack-GFP. Bland forsigtigt ved at svirpe røret (rør ikke blandingen). Inkuber i 10 minutter på is.
    3. Der tilsættes 900 μL SOC-medium og inkuberes i 1 time ved 37 °C ved omrystning.
    4. Mikrofuge i 5 min ved 600 x g.
    5. Fjern 900 μL af supernatanten, bland pellet og supernatant, og frø de omdannede bakterier på LB-agar plader med kanamycin.
    6. Inkuber i ~16 timer ved 37 °C (må ikke overstige 18 timer).
  4. Pcr's valg af mulige positive kloner
    1. Del tandstikkere i to halvdele og steriliser de halve tandstikkere ved autoklavering.
    2. Pick up små og gennemskinnelige kolonier ved hjælp af sterile halv-tandstikkere.
    3. Drej kort den halve tandstikker med bakterier i 10 μL vand (i et PCR-rør), og sæt derefter halv tandstikkeren i et 1,5 mL Eppendorf-rør, der indeholder 100 μL SOC-medium med kanamycin. Inkuber i 4-6 timer ved 37 °C, mens du tester klonerne med "negativ" og "positiv" PCR.
    4. Pcr-rørene, der indeholder 10 μL vand, inkuberes med bakterier i 5 min ved 95 °C for at opnå bakterieprøven og køre parallelt med den "negative" og "positive" PCR.
    5. "Negativ" PCR - for at teste pAdTrack-GFP integritet: Forbered følgende PCR mix for den negative PCR på is.
      5 μL af bakterieprøven
      0,1 μL primer Forward (4631 F: 5'-CAGTAGTCGGTGCTCGTCCAG)
      0,1 μL primer Omvendt (5616 R: 5'-TATGGGGGCTGTAATGTTGTCTC)
      0,1 μL dNTP 10 mM
      3 μL 5x buffer
      1,5 μL mgCl2 25mM
      0,1 μL GoTaq Polymerase
      H2O til et slutvolumen på 15 μL
      BEMÆRK: Den positive kontrol, som DNA-skabelonen er pAdTrack-GFP-vektoren i, skal medtages.
    6. "Positiv" PCR - for at teste tilstedeværelsen af genet af interesse. Brug specifikke primere til det indsatte gen og forbered blandingen som i det foregående trin. De primere, der blev brugt til GFP, var følgende:
      F: 5'-CAAGGACGACGGCAACTACA
      R: 5'-ATGGGGGTGTTCTGCTGGTA
    7. Kør parallelt den "negative" og den "positive" PCR. PCR-programmet er: 5 min, 95 °C; 40 cyklusser af følgende trin: 30 sek., 95 °C; 30 sek., 68 °C; 1 min., 72 °C; endelig forlængelse: 10 min., 72 °C.
      BEMÆRK: Tilpas udglødningstemperaturen for at forstærke det gen, der er af interesse.
    8. Vurder PCR-produkterne på en 1% agarosegel og foretag valget af klonerne.
    9. Overvej til videre behandling af kloner, der ikke giver PCR-produkter til den "negative PCR" og det specifikke PCR-produkt efter den "positive PCR".
  5. Dyrk de bakterielle kulturer i udvalgte rekombinante kloner
    1. De formodede positive kloners kulturer fortyndes (resulterede i trin 2.4.3.) i 4 ml SOC-medium med kanamycin og inkuberes natten over ved 37 °C med rysten.
  6. Isolering af plasmid-DNA fra AdEasier-1 bakterier (Miniprep ved hjælp af alkalisk lysis)
    1. Der overføres 1,5 mL bakteriekultur i mikrocentrifugerør, centrifuge i 1 min ved 16.200 x g, og supernatanten fjernes.
    2. Overfør en anden 1,5 mL bakteriekultur i samme rør, gentag centrifugering, og fjern supernatanten.
    3. Der tilsættes 200 μL resuspensionsbuffer (50 mM glukose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl pH 8).
    4. Der tilsættes 200 μL lysisopløsning (0,2 N NaOH, 1% SDS), blandes forsigtigt ved at vende røret.
    5. Der tilsættes 200 μL nedbørsopløsning (60 ml 5 M kaliumacetat, 11,5 ml istidseddikesyre, tilsættes H2O indtil 100 ml) og blandes forsigtigt ved at vende røret.
    6. Centrifuge i 3 min ved 16.200 x g.
    7. Supernatanten overføres i et nyt mikrocentrifugerør, tilsættes 500 μL isopropanol, blandes og inkuberes i 20 minutter på is.
    8. Centrifuge i 15 minutter ved 16.200 x g og tilsæt 500 μL 75% ethanol.
    9. Centrifuge i 10 min ved 16.200 x g og fjern supernatanten.
    10. Centrifuge i 3 min ved 16.200 x g, fjern supernatanten og tilsæt 15 μL H2O.
  7. Forstærkning, isolering og gentestning af de rekombinerede plasmider
    1. Transformation af DH5α bakterier med DNA isoleret fra AdEasier-1 celler.
      1. Forbered DH5α kompetente bakterier ved hjælp af det kommercielle transformationssæt i nedenstående vejledning.
      2. Tø 100 μL DH5α kompetente bakterier på is, tilsæt rekombinant DNA, og inkuber 10 min på is. Så frø bakterierne på LB-agar plader med kanamycin.
      3. Inkuber ved 37 °C natten over.
      4. Saml flere kolonier op og voks hver i 2 ml LB-medium med kanamycin ved 37 °C natten over med rystelser.
    2. Isolater DNA'et (Miniprep ved hjælp af alkalisk lysis) og genbrug det opnåede DNA i 25 μL H2O.
    3. Bekræft de positive kloner ved enzymatisk fordøjelse.
      1. Forbered følgende blanding på is:
        5 μL rekombinant DNA
        1,5 μL 10x farveløs buffer
        0,5 μL af hind III eller pst I
        H2O til et slutvolumen på 15 μL
      2. Inkuber ved 37 °C i 30 min.
        BEMÆRK: Som en kontrol, fordøje også pAdTrack-GFP og pAdEasy-1 plasmider.
      3. I hvert eksempel tilsættes 3 μL Sx6-læssebuffer med RNase A (hvis RNase A ikke findes i miniprepbufferne).
      4. Kør de fordøjede DNA-fragmenter på 1% agarose gel elektroforese.
        BEMÆRK: Fordøjelsesmønsteret for en positiv klon omfatter størstedelen af fragmenter af den fordøjede pAdEasy plasmid, afslørende pAdEasy rekombination med pAdTrack vektor. Det pågældende gen skal dokumenteres ved fordøjelsen med de restriktionsenzymer, der anvendes til kloning.
    4. Forberedelse af plasmid-DNA (transfektkvalitet) til adenovirusemballage.
      1. Dyrk en 200 mL bakteriekultur fra en positiv klon for at isolere plasmid-DNA'et.
      2. Isoler plasmid-DNA'et ved hjælp af et kommercielt kit til plasmid DNA Midiprep (f.eks. Qiagen Plasmid Midi Kit) efter producentens anvisninger.

3. Emballering af adenoviralpartiklerne

  1. Dag 1. Seed AD293-cellerne
    1. AD293-cellerne vaskes med PBS, og de inkuberes med 0,125% Trypsin i 2-5 min ved 37 °C.
    2. Saml cellerne i koldt medium med serum.
    3. Centrifuge i 5 min ved 400 x g ved 4 °C.
    4. Resuspend cellerne i medium med serum og frø cellerne ved en densitet på ~ 2 x 106/ T25 kolbe. Brug helst en kolbe med et filter.
  2. Dag 1. Fordøje det rekombinante DNA med Pac I
    1. Forbered følgende blanding:
      6 μL rekombinant DNA (1 μg/μL)
      2 μL pac I
      2,5 μL 10x farveløs buffer
      H2O til et slutvolumen på 25 μL
    2. Inkuberes i 3 timer (eller natten over) ved 37 °C, og inaktiver derefter enzymet ved 65 °C i 20 min.
    3. DNA-nedbør med ethanol: Der tilsættes 2,5 μL (1/10 v/v) 3 M natriumacetat og 2-3 volumener 100% ethanol. Inkubation i 30 minutter ved -70 °C eller natten over ved -20 °C.
    4. Centrifuge ved 16.200 x g i 30 min ved 4 °C og opsuge pellet i sterilt vand.
  3. Dag 2: Transfekt af AD293-celler ved hjælp af K2-reagens
    1. Der tilsættes 40 μL K2 Multiplikator over cellerne to timer før transinfektion.
    2. Forbered A- og B-løsninger:
      Løsning A: Der tilsættes 6 μg Pac l-lineariseret DNA i 260 μL Opti-MEM.
      Opløsning B: Der tilsættes 21,6 μL K2 Reagens i 248,4 μL Opti-MEM.
    3. Tilsæt opløsning En overopløsning B og bland forsigtigt ved pipetter.
    4. Inkuber blandingen i 20 minutter ved stuetemperatur. Tilføj dropwise A og B mix til cellerne.
  4. Dag 3-11: Overvåg GFP-udtrykket ved fluorescensmikroskopi
    BEMÆRK: Cellerne skal fremstå grønne i fluorescensmikroskopi og bør gradvist løsne sig.
  5. Dag 11: Høst F1 adenoviral partikler
    1. Saml de løsrevne celler og mediet i et 50 mL rør, skrab de klæbende celler, og tilsæt dem i samme rør.
    2. Centrifuge i 5 min ved 400 x g, indsamle supernatant i et nyt rør og genbruge celle pellet i 0,5 mL PBS.
    3. Celleafbrydelse
      1. Overfør celleaffjedringen i et mikrocentrifugerør.
      2. Der udføres tre fryse-/optøningscyklusser (fryse i flydende nitrogen eller ved -80 °C /optøning ved 37 °C i højst 7 min.).
      3. Pass de ødelagte celler gennem en 23 G sprøjte nål tre gange.
    4. Fjern celleresterne ved centrifugering ved 9.600 x g i 12 min.
    5. Overfør supernatanten til 50 mL røret med det opsamlede medium.

4. Forstærkning af adenovirus

BEMÆRK: Hvis AD293-cellerne ikke nåede det nødvendige sammenløb, kan aliquots af adenoviralbestandene (lysat fra de virusproducerende celler), der skal anvendes til infektion, opbevares ved -80 °C.

  1. Forbered F2 adenoviral partikler.
    1. Cellerne I EN.293 frø i en T75-kolbe (5 x 106 celler/kolbe).
    2. Infektiøs ~90% sammenføjeDE AD293-celler ved hjælp af F1-adenoviralpartiklerne: Tilsæt celle homogenatet og mediet fra T25-kolben over de celler, der dyrkes i T75-kolben.
    3. Overvåg GFP-udtrykket ved fluorescensmikroskopi.
    4. Høst de virusproducerende celler, når ~ 90% af de transducerede AD293 er løsrevet (~ den5. dag efter transduktion). Cellekulturmediet skal holdes ved 4 °C.
    5. Cellerne (på samme måde med cellerne for F1) forstyrres i 1 mL PBS.
  2. Forbered F3 adenoviral partikler.
    1. Inficere ~ 90% sammenflydende AD293 celler seedet i T175 kolbe med F2 adenoviral partikler og cellekultur medium fra F2 adenoviral partikler.
    2. Høst cellerne (~5 dage efter transduktion).
    3. Cellerne (på samme måde som cellerne for F1) forstyrres i 2 mL PBS.
  3. Forbered F4 adenoviral partikler.
    1. Inficere 5 T175 kolber, der indeholder ~ 90% sammenflydende AD293 celler med F3 adenoviral partikler og cellekultur medium.
    2. Høst cellerne (~5 dage efter transduktion).
    3. Cellerne (på samme måde med cellerne for F1) forstyrres i 3 mL PBS.
  4. Forbered F5 adenoviral partikler.
    1. Inficere 25 T175 kolber, der indeholder ~ 90% sammenflydende AD293 celler med F4 adenoviral bestand og cellekultur medium.

5. Rensning af adenovirus fra cellelysat og dyrkningsmedium

  1. Høst af virusproducerende celler og kulturmediet.
    1. Høst AD293-cellerne i F5 efter 5 dage fra transduktion.
    2. Gem mediet i en steril flaske til udfældning af adenoviralpartiklerne.
      BEMÆRK: Opbevar mediet i køleskabet, indtil adenovirussen er renset.
    3. Centrifuge cellerne ved 400 x g, i 5 min, ved 4 oC.
    4. Genbrug den endelige pellet i 5 mL på 10 mM Tris HCl, pH 8 med 2 mM MgCl2.
    5. Aliquot suspensionen i 1,5 mL rør.
    6. Forstyrre cellerne (på samme måde med dem for F1): tre cyklusser af frysning / optøning.
      BEMÆRK: Hvis ultracentrifugeringen ikke kan udføres med det samme, skal prøverne opbevares ved -80 °C.
    7. Pass celle suspension gennem en 23G sprøjte nål i tre gange.
    8. Homogenatet centrifuges ved 9 600 x g i 12 min.
    9. Gem supernatanten til adenovirusrensning ved CsCl gradient ultracentrifugering.
  2. Nedbør af adenovirus frigivet i kulturmediet.
    1. Medbring flasken med gemt cellekulturmedium ved stuetemperatur.
    2. Der tilsættes 121 g ammoniumsulfat til hvert 500 ml cellekulturmedium (mætning af opløsningen skal være mellem 40 - 42%).
    3. Bland forsigtigt, indtil ammoniumsulfatet er helt opløst.
    4. Inkuber i mindst 2,5 timer ved stuetemperatur.
    5. Centrifuge ved 1600 x g, i 15 min, ved 22 oC og gem pellet.
    6. Pelletpen i 4 mL på 10mM Tris HCl pH 8 med 2mM MgCl2; denne suspension bør straks renses ved CSCl gradient ultracentrifugering.
      BEMÆRK: Hvis rensningstrinnet ikke kan udføres efterfølgende, dialyze natten over den genopståede pellet mod 10mM Tris HCl, pH 8 med 2mM MgCl2.
  3. Adenovirusrensning ved ultracentrifugering.
    1. Forbered en diskontinuerlig CsCl gradient i polypropylenrør til SW41Ti rotor. Der tilsættes 3 mL på 765 mg/mL CSCl (høj densitet: 1,4 g/l) i bunden af røret. Der tilsættes langsomt 3 mL på 288,5 mg/mL CSCl (lav densitet: 1,2 g/l) oven på det første CSCl-lag.
    2. Overlejr forsigtigt 3 - 4 mL adenoviral partikelaffjedring frigivet fra cellerne eller udfældet fra cellekulturmediet (som beskrevet før) oven på gradienten.
    3. Fyld rørene med mineralsk olie, og læg rørene i de kolde SW41Ti spande.
    4. Ekvilibrere rørene. Sørg for, at de fyldte polypropylenrør er indlæst symmetrisk i rotoren. Sæt rotoren i ultracentrifuge.
    5. Centrifuge ved 210.000 x g og 4 °C, i 18 timer, ingen bremse.
    6. Placer ultracentrifugerørene på et stativ med et sort papir bag for at få båndene.
    7. Kassér den klare øverste fase, celleresterne og det øverste bånd i en affaldsbeholder med blegeopløsningen.
    8. Høst det laveste bånd, der indeholder den komplette adenovirus (~700 μL - 1 mL) i et sterilt 1,5 mL rør og hold det på is.
    9. Forsyg en dialysekassette i dialysebuffer (10 mM Tris-Cl buffer pH 8, 2 mM MgCl2).
    10. Den rensede adenovirus injiceres i dialysekassetten med en 2 mL sprøjte.
    11. Dialyze natten over mod 10 mM Tris-Cl buffer pH 8, 2 mM MgCl2 (ændre dialyse buffer 3 - 4 gange).
    12. Høst adenoviralbestanden fra dialysekassetten i aliquots på 10 - 100 μL.
    13. Der tilsættes saccharose til 4% endelig koncentration til virale aliquots (til kryoprotektion).
    14. Opbevares aliquots ved -80 °C.

6. Adenovirus titrering

  1. Dag 1: Plating cellerne
    1. AD293-cellerne sås med en tæthed på 2,5 × 105 celler pr. brønd (i en 12-brønds kulturplade) i 1 mL komplet vækstmedium, som vist i figur 2. Sørg for, at cellerne spredes jævnt i hver brønd for nøjagtig titerbestemmelse.

Figure 2
Figur 2: Titreringspladedesign. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Dag 2: Transduktion af celler
    1. Tag cellerne fra en brønd med trypsin og tæl dem. Bemærk dette nummer, fordi det vil blive brugt til at beregne den virale titer.
    2. Der foretages serielle fortyndinger (1/104;1/105;1/106;1/107) af virusbestanden i 1 mL komplet vækstmedium som følger:
    3. 1/103: Fortynding af virusbestanden - tilsættes 2 μL virusbestand til 1998 μL af hele mediet.
    4. 1/104: Der fremstilles 1:10 fortynding af 1/103 ved fortynding af 120 μL til 1080 μL komplet medium (A).
    5. 1/105: Der foretages 1:10 fortynding af B ved fortynding af 120 μL A til 1080 μL komplet medium (B).
    6. 1/106: Der foretages 1:10 fortynding af C ved fortynding af 120 μL B til 1080 μL komplet medium (C).
    7. 1/107: Der foretages 1:10 fortynding af D ved fortynding af 120 μL C til 1080 μL komplet medium (D).
      BEMÆRK: Forbered 3 rør af hver fortynding (A, B, C, D) for at udføre forsøget i tre eksemplarer.
    8. Fjern cellekulturmediet fra brøndene og tilsæt de forberedte fortyndinger af virusset som vist i figur 2.
  2. Dag 3: Overvågning af GFP-udtryk
    1. Kontroller brøndene for tilstedeværelsen af grønne celler ved hjælp af et fluorescensmikroskop.
  3. Dag 4: Flow cytometry analyse af GFP-positive celler
    1. Forbered og mærk tolv 1,5 mL rør.
    2. Opsamles cellekulturmediet (sammen med de løsrevne celler) i 1,5 mL rør og hold dem på is.
    3. Tilsæt 200 μL trypsin i hver brønd.
    4. Pladen inkuberes i 2 - 3 minutter ved 37 °C i CO 2-inkubatoren.
    5. Høst cellerne i de samme Eppendorf rør med cellekulturmediet. Hold rørene på is.
    6. Cellerne pellets ved 400 x g i 5 min. ved 4 °C.
    7. Fjern supernatanten; holde rørene på is.
    8. Genindsuspende pellet i 250 μL PBS + 2% FBS; holde rørene på is.
    9. Cellaffjedringen overføres i flowcytometrirør eller plade.
    10. Kør prøverne på et flowcytometer, der registrerer fluorescensen af GFP-udtrykkende celler.
      Titer beregning: Prøverne med 5 - 20% GFP positive celler fra den overordnede befolkning bør tages i betragtning ved beregning af viral titer ved hjælp af følgende formel:
      Titer (TU/mL) = D x F/100 x C/V
      D = fortyndingsfaktor
      F = procent af positive celler / 100
      C = antal celler / godt
      V = volumen af viral inoculum

7. Adenoviral transduktion af målceller og testning af induceret proteinudtryk

  1. Dag 1: Såning af cellerne
    1. Seed målcellerne for at sikre, at de spredes jævnt i brøndene.
  2. Dag 2: Transduktion af cellerne
    1. Fjern målcellerne fra en brønd og tæl dem.
    2. Beregn den passende mængde adenoviral suspension, der kræves for at transduce cellerne med det ønskede antal infektiøse partikler pr. celle.
    3. Tilføj den tilsvarende mængde viral suspension til målcellerne.
  3. Dag 3: Fjernelse af viral suspension og kontrol for GFP udtryk
    1. Udskift cellekulturmediet, der indeholder adenoviralpartikler, med frisk medium.
    2. Kontroller GFP-udtrykket ved fluorescensmikroskopet.

Representative Results

Vi ændrede og forbedrede den oprindelige Vogelsteins protokol for at opnå hurtigere og mere effektiv adenovirusproduktion. For det første reviderede vi metoden for at opnå en lettere udvælgelse af rekombinanter. Efter rekombination blev BJ5183 bakterieklonerne testet af "negativ PCR" for at vurdere integriteten af pAdTrack-GFP som en indikator for manglen på rekombination (Figur 3A) eller ved "positiv PCR" for at identificere det gen af interesse, der i vores tilfælde er ligestillet med GFP (Figur 3B). I både "negative" og "positive" PCR'er brugte vi pAdTrack-GFP som en kontrolskabelon, som gav et bånd på 986 bp for pAdTrack-integritet(Figur 3A, bane 1) og et bånd på 264 bp for GFP (Figur 3B, bane 3). De primere, der anvendes til den "negative PCR" var designet til at forstærke et fragment af 986 bp indeholder PmeI site i pAdTrack-GFP. Dette DNA-fragment forstørres drastisk efter rekombination og forstærkes ikke i de positive rekombinante kloner. Negative kloner til rekombination, hvor pAdTrack-GFP forblev intakt, er repræsenteret i figur 3A, bane 3, 4 og 6. Primerne anneal på DNA-sekvenserne støder op til rekombination site. Potentielle positive rekombinante kloner (Figur 3A, bane 2 og 5) udtrykte GFP som vist i figur 3B,bane 1 og 2. Plasmid DNA fra disse kloner blev isoleret og brugt til DH5α transformation for at opnå en højere mængde DNA. Disse forudvalgte rekombinante plasmider forstærket i DH5α blev derefter testet ved enzymatisk fordøjelse. I figur 3erC-E illustreret resultaterne af den enzymatiske fordøjelse af en rekombinant-positiv klon fordøjet med Hind III, PstI, BamHI restriktion enzymer(Figur 3C, D, E lane 2). HindIII- og PstI-fordøjelsesmønstrene for rekombinantklonen svarede til dem, der blev opnået for pAdEasy-1, da hindIII og pstI skar henholdsvis pAdEasy-1 plasmid 24 og 25 gange(figur 3C og D, bane 3); HindIII skære én gang og PstI skære fire gange pAdTrack-GFP vektor(Figur 3C og D,lane 1). BamHI skæres to gange pAdEasy-1 vektor(Figur 3C,vognbane 3), og en gang pAdTrack-GFP(Figur 3C, vognbane 1).

PacI skåret ud et fragment på 4,5 kb fra rekombinant plasmid (Figur 3F, lane 2), et fragment af 2863 bp fra pAdTrack-GFP(Figur 3F, lane 1), og linearized den pAdEasy-1 vektor (Figur 3F, lane 3). DNA-stigen er repræsenteret i figur 3C-Fi vognbane 4. Den rekombinant plasmid blev fordøjet med Pac I til videre brug for AD293 transfekt.

Figure 3
Figur 3: Rekombinationen af pAdTrack-GFP med pAdEasy-1 plasmid. Plasmiderne opnået efter rekombinationen af pAdTrack-GFP og pAdEasy-1 blev testet af "negativ" PCR for pAdTrack-GFP integritet (A). De ikke-rekombinante kloner blev tydeligt ved tilstedeværelsen af et 986 bp-bånd svarende til sekvensen forstærket fra pAdTrack-GFP plasmid (A, bane 3, 4 og 6). Klonerne, der potentielt var positive for rekombination (A, bane 2 og 5), blev også opnået. Da pAdTrack-GFP-vektoren blev brugt som skabelon, blev der opnået et bånd på 986 bp for pAdTrack-GFP (A, vognbane 1). De potentielt positive rekombinante kloner blev testet for GFP-udtryk af "positiv" PCR (B); et bånd på 264 bp vises for både potentielt rekombinerede kloner (B, bane 1 og 2), samt for pAdTrack-GFP plasmid. DNA'et fra en potentiel rekombinant klon blev testet med HindIII, PstI, BamHI og PacI restriktionsenzym (C-F, bane 2). I kontrollerne blev pAdEasy-1-vektoren (C-F, bane 3) og pAdTrack-GFP plasmid (C-F, bane 1) fordøjet med de samme enzymer. DNA-stigen er repræsenteret i C-F bane 4. Klik her for at se en større version af dette tal.

Adenoviralemballagen og forstærkningen blev udført i AD293-celler. Adenoviralpartiklerne (AdV-GFP) blev renset fra AD293 celle lysate såvel som fra cellekulturmediet, hvor de var blevet frigivet af de inficerede celler. For at koncentrere adenovirus fundet i cellekulturmediet blev partiklerne udfældet med ammoniumsulfat og derefter genopfrisket i 10 mM Tris HCl pH 8 med 2 mM MgCl2, den samme buffer som den, der bruges til celle lysis. Efterfølgende blev adenoviralpartiklerne fra cellelysatet og fra kulturmediet renset af CsCl diskontinuerlig gradient ultracentrifugering. Efter ultracentrifugering blev der opnået et stærkt bånd af renset AdV-GFP, som vist i figur 4.

Figure 4
Figur 4: Adenoviral rensning ved ultracentrifugering på en diskontinuerlig CSCl-gradient. Cellen homogeniseres, og den adenovirus, der blev udfældet fra mediet, blev udsat for ultracentrifugering på en diskontinuerlig gradient dannet af CsCl-opløsninger med lav og høj densitet. Stærke bånd af GFP-adenovirus blev dokumenteret i begge tilfælde. Klik her for at se en større version af dette tal.

For at bestemme virustitæren udtrykt i transducerende enheder pr. mL (TU/mL) blev AD293-cellerne inficeret med serielle fortyndinger af AdV-GFP. Efter 48 timer udtrykte de inficerede celler GFP i en omvendt korrelation med fortyndingsfaktoren for virussuspensionen. Dette blev observeret ved fluorescensmikroskopi, og procentdelen af GFP-positive celler blev bestemt af flowcytometry (figur 5). For at beregne titeren blev den virale fortynding, der inducerede 5 - 20% af GFP-positive celler, overvejet (Figur 5C). Normalt får vi en viral titer på ~ 1010 (TU / mL) for GFP-adenovirus.

Nedenfor giver vi et eksempel på en adenoviral titer beregning for et bestemt adenoviralt parti, hvor 300000 celler (C) blev transduceret med 1 ml adenoviral opløsning (V), ved en fortyndingsfaktor på 106 (D), for hvilken 6% GFP-positive celler (F) blev opnået:

Titer (TU/mL) = D x F/100 x C/V = 106 x 6/100 x 300000/1 = 1,8 x 1010 TU/mL

Figure 5
Figur 5: Vurderingen af adenoviral titer. AD293 celler blev inficeret med forskellige adenoviral fortyndinger. 48 timer senere blev cellerne observeret ved fluorescensmikroskopi og analyseret ved flowcytometry for at bestemme procentdelen af GFP-positive celler induceret af forskellige adenoviral fortyndinger (A-D). For at etablere porten til flowcytometry blev ikke-transducerede celler også analyseret (E). Titeren beregnet for fortyndingsfaktoren 106, når 6% af cellerne var GFP positive, var 1,8 x10 10 TU /mL. For paneler A-E, barer: 100μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

For at teste transduktionspotentialet for den forberedte adenovirus blev der anvendt fire cellelinjer: humane endotelceller (EA.hy926), kvægaortateldotelceller (BAEC), murine hepatocytter (Hepa 1-6) og murine mesenchymale stromale celler (MSC). Endotelceller (EA.hy926 og BAEC) blev transduceret med 25 TU/celle, hepatocytterne blev transduceret med 5 TU/celle, og MSC blev transduceret med 250 TU/celle.

Her er et eksempel på, hvordan mængden af adenoviral suspension er nødvendig for at inficere 3 x 106 celler med 25 TU / celle, ved hjælp af adenoviral suspension med 1,8 x 1010 TU / mL, blev beregnet.

For 1 celle .............. 25 TU
3 x 106 celler .............. x TU Equation 1 x=75 x 106 TU
Hvis viruslageret indeholder
1,8 x 1010 TU .............. 1 mL
75 x 106 TU .............. y mL Equation 1 y= 4,2 x 10-3 mL = 4,2μL viral bestand

48 timer efter transduktion blev cellerne analyseret ved fluorescensmikroskopi. Som det fremgår af figur 6, blev humane eller kvæg endotelceller transduceret med god effektivitet (~50%) for 25 TU/celle(figur 6 EA.hy926 og BAEC). Murine hepatocytter (Hepa 1-6) blev effektivt transduceret af adenovirus ved en lav mængde adenoviruspartikler (5 TU / celle), men de er også følsomme over for adenovirus, da en højere procentdel af døde celler (PI-positive celler) blev registreret (~ 16%) sammenlignet med de andre celletyper. Mesenchymale stromale celler var de sværeste at transduce (Figur 6), på grund af manglen på specifikke adenoviral receptorer (ikke-offentliggjorte data).

Figure 6
Figur 6: Adenovirussens infektivitet og induktion af GFP-ekspression i transducerede celler. Humane endotelceller (EA.hy926), kvægaortateldikale celler (BAEC), murin hepatocytter (Hepa 1-6) og murine mesenchymale stromale celler (MSC) blev transduceret med den angivne mængde adenovirus. GFP blev opdaget ved fluorescensmikroskopi, og procentdelen af GFP-positive celler blev analyseret af flowcytometry. PI-positive celler bestemt af flowcytometry viser celledødeligheden bestemt ved viral transduktion. EA.hy926 celler, kvæg aorta endotelceller, og Hepa 1-6 celler var stærkt transduceret af adenovirus, udbyttet af transduktion spænder fra 41 - 52%. For MSC fremkaldte en større mængde virus (250 TU/celler) kun 27% GFP-positiv af de transducerede celler. Søjler: 100μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Rekombinant adenovirus er et alsidigt værktøj til genlevering og udtryk12,13,14. For at fremkalde stærkt proteinudtryk ved adenoviral transduktion indsættes kodningssekvensen af det pågældende gen i adenovirusgen. AdEasy adenoviral system, udviklet i laboratoriet af Bert Vogelstein, består af en rygrad plasmid (pAdEasy-1), der indeholder de fleste af de vilde-type adenovirus serotype 5 genom, og en shuttle vektor (pAdTrack), designet til gen kloning2,10. Sletningen af adenoviral gener E1 (ansvarlig for samling af infektiøse viruspartikler) og E3 (kodning af proteiner, der er involveret i at undgå værtsimmunitet) skabte et rum i det adenovirale genom, hvor et gen af interesse på 6,5-7,5 kb kan indsættes2,3. Denne størrelse er tilstrækkelig til mange gener, især for dem med kortere introner15,16,17. Der er også forskere, der rapporterer om produktion af adenovirus , der bærer cDNA af en transgene18,19,20. Vi opnåede dog et lavere udbytte af transgenekspression for cDNA-bærende adenovirus end for deres modparter, der bærer et gen eller et minigen (data vises ikke).

Forbedring og tilpasning af de tidligere metoder2,10,14,18,21, teknologien til adenoviral produktion kræver kortere tid, lavere omkostninger og mindre indsats. Den fulde længde adenoviral DNA opnås ved rekombination mellem shuttle vektor og pAdEasy-1 plasmid i homolog rekombination udsat E. coli stamme, BJ5183. Protokollen indebærer den kemiske transformation af AdEasier-1 celler (BJ5183 bakterier, der indeholder pAdEasy-1). Denne teknik kræver ikke en elektroporator, der muligvis ikke er tilgængelig i nogle laboratorier, er meget enkel, øger rekombinationsudbyttet og reducerer den tid, der er nødvendig for at opnå kompetente celler og udføre transformationen. Forvalget af rekombinante kloner udført af PCR forkorter tiden yderligere og letter hele proceduren. En lignende procedure blev brugt af Zhao og kolleger22, men i protokollen optimerede vi primernes sekvenser.

Til GFP-adenovirusemballage og forstærkning blev der anvendt en HEK293 afledt cellelinje, nemlig AD293-celler, som er mere klæbende til kulturpladen. Andre cellelinjer, der almindeligvis anvendes til adenoviral produktion, er følgende: 911, 293FT, pTG6559 (A549 derivat), PER. C6 (HER derivat), GH329 (HeLa afledte), N52. E6, og HeLa-E123,24,25,26. I vores hænder blev der ikke opnået nogen forbedring i adenoviralproduktionen, da der blev brugt 911 celler (data vises ikke). Transfekten af AD293-celler med rekombinant plasmid ved hjælp af K2-reagens øgede i høj grad effektiviteten af det virale emballagetrin. Efter adenovirus produktion, op til ~ 70% af adenovirus er stadig inde i cellerne og frigives af tre frysning og optøning cykler. At øge antallet af cyklusser er ikke egnet, fordi det ødelægger adenovirus.

Gennem hele den rutinemæssige adenoviral produktionsproces frigives mange virale partikler i cellekulturmediet. Kassering af dette cellekulturmedium under høsten af de inficerede AD293-celler ville resultere i et vigtigt viralt tab. Vi optimerede protokollen beskrevet af Schagen og kolleger for at rense adenoviralpartiklerne fra cellekulturmediet ved nedbør med ammoniumsulfat27. Denne metode har en højere effektivitet i adenovirusgenvinding fra cellekulturmediet sammenlignet med metoden ved hjælp af polyethylenglycol28. Den udfældede adenovirus skal renses straks ved ultracentrifugering eller opbevares i køleskabet i et par dage, men kun efter dialyse, for at fjerne saltoversvømmelsen. At holde bundfaldet længere end et par timer uden dialyse er skadeligt for virussen.

Rensning af adenoviral partikler ved ultracentrifugering udført i et trin reducerer manipulationen af adenoviralbestanden og letter proceduren sammenlignet med protokollerne ved hjælp af successive ultracentrifugeringstrin14,29. Dialyse af den rensede adenovirus er nødvendig for at fjerne cæsiumchlorid, der yderligere kan påvirke transduktionen. I protokollen brugte vi Tris buffer indeholdende MgCl2, men ikke saccharose til dialyse, da det kræver en enorm, uberettiget mængde saccharose, der ellers er nødvendig som konserveringsmiddel til frysning. Således tilføjede vi saccharose senere direkte i de adenovirale lagre, der var forberedt til frysning. For at undgå hyppig frysning og optøning af den rensede adenovirus anbefales det at aliquot adenoviralbestandene og opbevare dem ved -80 °C. Adenoviral titer blev evalueret af flowcytometry i betragtning af GFP reporter genet og procentdelen af transducerede celler for en bestemt viral fortynding. Denne metode er hurtigere sammenlignet med den klassiske "plaque assay" og er mere tillidsfuld sammenlignet med evalueringen af capsidproteiner (ved forskellige metoder som ELISA eller flow cytometry), som ikke afslører infektionskapaciteten hos adenoviralpartiklerne. Elisa-baseret kvantificering, Q-PCR eller plakanalyse ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits er imidlertid alternative metoder, især nyttige til titrering af adenovirus, som ikke indeholder et fluorescerende sporstof.

I betragtning af at pAdTrack adenovirus er afledt af humane adenoviruses serotype 5, som er anerkendt af Coxsackievirus og Adenovirus Receptors (CAR), demonstrerede vi GFP-adenovirussens evne til at transduce celler af menneskelig oprindelse (endothelialceller), men også celler af anden oprindelse: kvæg (endothelialceller) og murin (mesenchymale stromale celler og heocpatytter). Dataene viste, at GFP-adenovirus kan fremkalde et højt udtryk for en transgene.

Afslutningsvis optimerede vi denne besværlige teknologi for at reducere tiden, omkostningerne og den indsats, der er nødvendig for at opnå de adenovirale partikler. Den forberedte adenovirus er i stand til at inficere forskellige celletyper og fremkalde ekspressionen af det af interessegenet. Denne protokol kan anvendes i en række forsøg, da den adenoviral-medierede genoverførsel udgør et af de vigtigste værktøjer til udvikling af moderne genterapier.

FORKORTELSER: AdV-GFP, adenoviral partikler; BAEC, akreortatiske endotelceller; CsCl, cæsiumchlorid; GFP, grønt fluorescerende protein; MSC, mesenchymale stromale celler; TU, transducerende enheder.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af et projekt, der medfinansieres af Den Europæiske Fond for Regionaludvikling gennem det operationelle program for konkurrenceevne 2014-2020 (POC-A.1-A.1.1.4-E-2015, ID: P_37_668; akronym DIABETER), en bevilling fra det rumænske ministerium for forskning og innovation PCCDI- UEFISCDI, projektnummer PN-III-P1-1.2-PCCDI-2017-0697 inden for PNCD III og af det rumænske akademi. Forfatterne takker Kyriakos Kypreos (University of Patras, Grækenland) for hans generøse og relevante råd, Ovidiu Croitoru (University of Fine Arts, Bukarest, Rumænien) for at filme, filmredigering og grafisk design, og Mihaela Bratu for teknisk bistand.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AD293 cells Agilent Technologies 240085
AdEasier-1 cells Addgene 16399
Agarose I (for electrophoresis) Thermo Scientific 17850
Ammonium sulfate Sigma A4418
Ampicillin sodium salt Sigma A0166
BamH I Thermo Scientific FD0054
Cell culture plates 100 mm Eppendorf 30702115
Cesium chloride Sigma L4036
DH5alpha bacteria Thermo Scientific 18265017
DMEM (GlutaMAX, 4.5g/L D-Glucose) Gibco 3240-027
EA.hy926 cells ATCC CRL-2922
EDTA Sigma E5134
Ethanol (99.8%) Roth 5054.2
Fetal Bovine Serum Sigma F7524
Flasks T25, T75, T175 Eppendorf 30712129
Glucose Sigma G7021
Hepa 1-6 murine hepatocytes ATCC CRL-1830
Hind III Thermo Scientific FD0504
Kanamycin Sulfate Thermo Scientific 15160054
K2 Transfection System Biontex T060-5.0
LB medium Formedium LBx0102
LB-agar Formedium LBx0202
Mix & Go E. coli Transformation kit Zymo Research T3001
Midori Green Advanced DNA stain Nippon Genetics Europe MG-04
NaOH Sigma S8045
Opti-MEM Thermo Scientific 31985070
Pac I Thermo Scientific FD2204
pAdEasy-1 Addgene 16400
pAdTrack-CMV Addgene 16405
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (24:24:1) Invitrogen 15593-031
Polymerase GoTaq Promega M3005
Pme I (Mss I) Thermo Scientific FD1344
Potassium acetate VWR Chemicals 43065P
Pst I Thermo Scientific FD0614
Qiagen Midi Prep kit Qiagen 12125
Cell Scraper TPP 99003
SDS Thermo Scientific 28365
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes Thermo Scientific 66330
Sodium pyruvate SIGMA P5280-100G
Syringe with 23G neeedle B Braun 464BR
Tris HCl Sigma 1185-53-1
Trypan blue Roth CN76.1
Tubes 50ml TPP 91050
Ultra-Clear Tubes (14x89 mm) Beckman Coulter 344059
Centrifuge (refrigerated) Sigma Sartorius 3-19KS
HeraeusFresco 17 Microcentrifuge Thermo Scientific 75002420
Ultracentrifuge with SW41Ti rotor Beckman Coulter Optima L-80 XP
Culture Hood Thermo Scientific Class II
Pipettes (0-2µl, 1-10µl, 2-20µl, 10-100µl, 20-200µl, 100-1000µl) Thermo Scientific
Dry Block Heating Thermostat Biosan TDB-120
Thermocycle SensoQuest 012-103
Water Bath Memmert WNB 14

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes and Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  2. He, T. C., et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2509-2514 (1998).
  3. Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. The Journal of General Virology. 81, Pt 11 2573-2604 (2000).
  4. Rauschhuber, C., Noske, N., Ehrhardt, A. New insights into stability of recombinant adenovirus vector genomes in mammalian cells. European Journal of Cell Biology. 91 (1), 2-9 (2012).
  5. Saha, B., Wong, C. M., Parks, R. J. The adenovirus genome contributes to the structural stability of the virion. Viruses. 6 (9), 3563-3583 (2014).
  6. Kreppel, F., Kochanek, S. Modification of adenovirus gene transfer vectors with synthetic polymers: a scientific review and technical guide. Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (1), 16-29 (2008).
  7. Dormond, E., Perrier, M., Kamen, A. From the first to the third generation adenoviral vector: what parameters are governing the production yield. Biotechnol Advances. 27 (2), 133-144 (2009).
  8. Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13565-13570 (1996).
  9. Jager, L., Ehrhardt, A. Emerging adenoviral vectors for stable correction of genetic disorders. Current Gene Therapy. 7 (4), 272-283 (2007).
  10. Luo, J., et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system. Nature Protocols. 2 (5), 1236-1247 (2007).
  11. Dumitrescu, M., et al. Adenovirus-Mediated FasL Minigene Transfer Endows Transduced Cells with Killer Potential. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).
  12. Campos, S. K., Barry, M. A. Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting. Current Gene Therapy. 7 (3), 189-204 (2007).
  13. Khare, R., Chen, C. Y., Weaver, E. A., Barry, M. A. Advances and future challenges in adenoviral vector pharmacology and targeting. Current Gene Therapy. 11 (4), 241-258 (2011).
  14. Jager, L., et al. A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors. Nature Protocols. 4 (4), 547-564 (2009).
  15. Zvintzou, E., et al. Pleiotropic effects of apolipoprotein C3 on HDL functionality and adipose tissue metabolic activity. Journal of Lipid Research. 58 (9), 1869-1883 (2017).
  16. Karavia, E. A., et al. Apolipoprotein A-I modulates processes associated with diet-induced nonalcoholic fatty liver disease in mice. Molecular Medicine. 18, 901-912 (2012).
  17. Lampropoulou, A., Zannis, V. I., Kypreos, K. E. Pharmacodynamic and pharmacokinetic analysis of apoE4 [L261A, W264A, F265A, L268A, V269A], a recombinant apolipoprotein E variant with improved biological properties. Biochemical Pharmacology. 84 (11), 1451-1458 (2012).
  18. Zheng, S. Y., Li, D. C., Zhang, Z. D., Zhao, J., Ge, J. F. Adenovirus-mediated FasL gene transfer into human gastric carcinoma. World Journal of Gastroenterology. 11 (22), 3446-3450 (2005).
  19. Ambar, B. B., et al. Treatment of experimental glioma by administration of adenoviral vectors expressing Fas ligand. Human Gene Therapy. 10 (10), 1641-1648 (1999).
  20. Okuyama, T., et al. Efficient Fas-ligand gene expression in rodent liver after intravenous injection of a recombinant adenovirus by the use of a Cre-mediated switching system. Gene Therapy. 5 (8), 1047-1053 (1998).
  21. van Dijk, K. W., Kypreos, K. E., Fallaux, F. J., Hageman, J. Adenovirus-mediated gene transfer. Methods in Molecular Biology. 693, 321-343 (2011).
  22. Zhao, Y. D., Li, T., Huang, G. A simple negative selection method to identify adenovirus recombinants using colony PCR. Electronic Journal of Biotechnology, North America. 17 (1), 46-49 (2014).
  23. Kovesdi, I., Hedley, S. J. Adenoviral producer cells. Viruses. 2 (8), 1681-1703 (2010).
  24. Lin, X. Construction of new retroviral producer cells from adenoviral and retroviral vectors. Gene Therapy. 5 (9), 1251-1258 (1998).
  25. Fallaux, F. J., et al. Characterization of 911: a new helper cell line for the titration and propagation of early region 1-deleted adenoviral vectors. Human Gene Therapy. 7 (2), 215-222 (1996).
  26. Altaras, N. E., et al. Production and formulation of adenovirus vectors. Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology. 99, 193-260 (2005).
  27. Schagen, F. H., et al. Ammonium sulphate precipitation of recombinant adenovirus from culture medium: an easy method to increase the total virus yield. Gene Therapy. 7 (18), 1570-1574 (2000).
  28. Colombet, J., et al. Virioplankton 'pegylation': use of PEG (polyethylene glycol) to concentrate and purify viruses in pelagic ecosystems. Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 212-219 (2007).
  29. Kypreos, K. E., van Dijk, K. W., van Der Zee, A., Havekes, L. M., Zannis, V. I. Domains of apolipoprotein E contributing to triglyceride and cholesterol homeostasis in vivo. Carboxyl-terminal region 203-299 promotes hepatic very low density lipoprotein-triglyceride secretion. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19778-19786 (2001).

Tags

Tilbagetrækning Problem 172 Adenovirus pAdTrack grønt fluorescerende protein rekombinant udvælgelse titer adenovirusrensning
En effektiv metode til produktion af Adenovirus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dumitrescu, M., Trusca, V. G.,… More

Dumitrescu, M., Trusca, V. G., Fenyo, I. M., Gafencu, A. V. An Efficient Method for Adenovirus Production. J. Vis. Exp. (172), e61691, doi:10.3791/61691 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter