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Biochemistry

मास फोटोमेट्री द्वारा एंटीबॉडी-एंटीजन आत्मीयता का तेजी से निर्धारण

Published: February 8, 2021 doi: 10.3791/61784
Automatic Translation
1, 1
1Biophysics Core Facility, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health

Summary

हम बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री (एमपी) का उपयोग करके एंटीजन-एंटीबॉडी आत्मीयता माप के लिए एक एकल अणु दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। एमपी-आधारित प्रोटोकॉल तेज, सटीक है, बहुत कम मात्रा में सामग्री का उपयोग करता है, और प्रोटीन संशोधन की आवश्यकता नहीं है।

Abstract

एंटीजन-एंटीबॉडी इंटरैक्शन की विशिष्टता और आत्मीयता के माप चिकित्सा और अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए गंभीर रूप से महत्वपूर्ण हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम इस उद्देश्य के लिए एक नई एकल अणु तकनीक, मास फोटोमेट्री (एमपी) के कार्यान्वयन का वर्णन करते हैं। एमपी एक लेबल और स्थिरीकरण मुक्त तकनीक है जो आणविक जनता और एंटीबॉडी और एंटीजन-एंटीबॉडी परिसरों की आबादी को एकल अणु स्तर पर पता लगाती है और मात्रा देती है। सांसद मिनटों के भीतर एंटीजन-एंटीबॉडी नमूने का विश्लेषण करता है, बाध्यकारी आत्मीयता के सटीक निर्धारण के लिए अनुमति देता है और साथ ही स्टोइचिओमेट्री और प्रोटीन की ओलिगोमेरिक स्थिति के बारे में जानकारी प्रदान करता है। यह एक सरल और सीधी तकनीक है जिसके लिए प्रोटीन की केवल पिकोमोल मात्रा और कोई महंगी उपभोग्य सामग्री की आवश्यकता होती है। इसी प्रक्रिया का उपयोग प्रोटीन के लिए प्रोटीन-प्रोटीन बाध्यकारी का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जिसमें 50 केडीए से बड़ा आणविक द्रव्यमान होता है। बहुसंत प्रोटीन इंटरैक्शन के लिए, कई बाध्यकारी साइटों की समानताएं एक ही माप में प्राप्त की जा सकती हैं। हालांकि, माप के एकल अणु मोड और लेबलिंग की कमी कुछ प्रयोगात्मक सीमाएं लगाता है । यह विधि उप-माइक्रोमॉलर इंटरैक्शन एफ़िनिटीज के माप पर लागू होने पर सबसे अच्छा परिणाम देती है, 20 केडीए या उससे अधिक के आणविक द्रव्यमान के साथ एंटीजन, और अपेक्षाकृत शुद्ध प्रोटीन नमूने। हम बुनियादी डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके आवश्यक फिटिंग और गणना चरणों को करने की प्रक्रिया का भी वर्णन करते हैं।

Introduction

एंटीबॉडी आणविक जीव विज्ञान के सर्वव्यापी उपकरण बन गए हैं और चिकित्सा और अनुसंधान अनुप्रयोगों दोनों में बड़े पैमाने पर उपयोग किए जाते हैं। चिकित्सा में, वे निदान में गंभीर रूप से महत्वपूर्ण हैं, लेकिन उनके चिकित्सीय अनुप्रयोगों का भी विस्तार हो रहा है और नए एंटीबॉडी आधारित उपचार लगातार विकसित किए जा रहे हैं1,2,3,4। एंटीबॉडी के वैज्ञानिक अनुप्रयोगों में इम्यूनोफ्लोरेसेंस5,इम्यूनोप्रिपिष6,प्रवाह साइटोमेट्री7,एलिसा और पश्चिमी ब्लॉटिंग जैसी कई अपरिहार्य प्रयोगशाला तकनीकें शामिल हैं। इन अनुप्रयोगों में से प्रत्येक के लिए, बाध्यकारी आत्मीयता और विशिष्टता सहित एंटीबॉडी के बाध्यकारी गुणों का सटीक माप प्राप्त करना महत्वपूर्ण महत्व का है।

चूंकि 1 99 0 में पहली वाणिज्यिक सतह प्लाज्मन अनुनाद (एसपीआर) उपकरण पेश किया गया था, ऑप्टिकल बायोसेंसर एंटीबॉडी लक्षण वर्णन के "स्वर्ण मानक" बन गए हैं, लेकिन एलिसा सहित अन्य तकनीकों का उपयोग नियमित रूप से एंटीबॉडी एफ़िनिटी8, 9को मापने के लिए कियाजाताहै। इन तरीकों को आमतौर पर विश्लेषण किए गए अणुओं के स्थिरीकरण या लेबलिंग की आवश्यकता होती है, जो संभावित रूप से ब्याज की बातचीत को प्रभावित कर सकते हैं। वे भी अपेक्षाकृत धीमी गति से कर रहे हैं, कई परख कदम शामिल इससे पहले कि परिणाम डेटा विश्लेषण के लिए एकत्र किया जा सकता है । हाल ही में विकसित एकल अणु विधि, मास फोटोमेट्री (एमपी), जब वे माइक्रोस्कोप कवरलिप10, 11की सतह पर उतरते हैं तो सीधे समाधान में अणुओं का पता लगाताहै। एमपी द्वारा नियोजित प्रकाश बिखरने वाले ऑप्टिकल डिटेक्शन में प्रोटीन लेबलिंग या संशोधन की आवश्यकता नहीं होती है। अलग - अलग प्रोटीन अणुओं को इंटरफेरोमेट्रिक बिखरने वाले माइक्रोस्कोप द्वारा छवि(चित्र 1डी)में दिखाई देने वाले काले धब्बे के रूप में दर्ज किया जाता है और एक मिनट के डेटा अधिग्रहण12के दौरान कई हजार अणुओं का पता लगाया जा सकता है। प्रत्येक कण द्वारा उत्पन्न संकेत की मात्रा निर्धारित की जाती है, और इसके विपरीत मूल्य (सापेक्ष अंधेरे) की गणना की जाती है। इंटरफेरोमेट्रिक कंट्रास्ट वैल्यूज प्रोटीन के आणविक जनता के आनुपातिक होते हैं, जो एंटीजन-एंटीबॉडी मिश्रण में बंधे और मुक्त प्रजातियों की पहचान के लिए अनुमति देता है। इसके साथ ही आणविक लैंडिंग की घटनाओं की गणना करके, सांसद सीधे प्रजातियों की आबादी को मापता है । यह सांसद आधारित तरीकों को स्वतंत्र रूप से कई बाध्यकारी साइटों की समानताओं को निर्धारित करने की एक अनूठी क्षमता देता है।

अक्षुण्ण एंटीबॉडी(एबी)के दो बाध्यकारी स्थलों के लिए एंटीजन(एजी)अणुओं के बाध्यकारी के रूप में वर्णित किया जा सकता है:
Equation 1
संतुलन संघ के साथ स्थिर कश्मीर a1 और कश्मीरa2 के रूप में परिभाषित:
Equation 2
जहां सीमैं और एफमैं क्रमशः एकाग्रता और घटक मैं के अंश का प्रतिनिधित्व करते हैं। कुल एंटीजन एकाग्रता(सीएजी)मुन्ना के रूप में व्यक्त किया जा सकता है:
Equation 3

चूंकि एंटीबॉडी(सीएबी)मुन्ना और एंटीजन(सीएजी)मुन्ना की कुल सांद्रता ज्ञात है, इसलिए इस समीकरण का उपयोग एमपी माप से प्राप्त प्रयोगात्मक घटक अंशों को सीधे फिट करने और संतुलन संघ कॉन्स्टेंट्स K a1 और Ka2 (अनुपूरक जानकारी देखें) की गणना करने के लिए किया जा सकता है।

एमपी के आंकड़ों का उपयोग दो एंटीबॉडी बाइंडिंग साइटों के बीच सहयोगशीलता का अनुमान लगाने के लिए भी किया जासकताहै । समान सूक्ष्म बाध्यकारी स्थिरांक वाले दो एंटीबॉडी पैराटोप के लिए, सांख्यिकीयकारक एबी की जनसंख्या की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं · एजी और एबी· एजी2 परिसरों हुक्म है कि स्पष्ट स्थूल संतुलन स्थिरांक Ka1 और Ka2 संख्यात्मक रूप से बराबर नहीं होगा, और कश्मीरa1 = 4Ka2। इसलिए, Ka1 & 4Ka2 के प्रायोगिक मूल्य दो एंटीबॉडी बाध्यकारी साइटों के बीच सकारात्मक सहयोगशीलता का संकेत देते हैं। इसी तरह, Ka1 > 4Ka2 नकारात्मक सहयोगशीलता को इंगित करता है।

एंटीजन-एंटीबॉडी बाध्यकारी आत्मीयता के एमपी माप तेज होते हैं और थोड़ी मात्रा में सामग्री की आवश्यकता होती है। संतुलन निरंतर गणना के लिए उपयोग किए जाने वाले एमपी मास वितरण नमूना गुणों के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करते हैं और एक ही प्रयोग में नमूना शुद्धता, अल्पाहारीकरण और एकत्रीकरण का आकलन सक्षम करते हैं। एक ही विधि का उपयोग उच्च आत्मीयता प्रोटीन-प्रोटीन बाध्यकारी को मापने के लिए किया जा सकता है, और एमपी बहु-वैलेंट प्रोटीन इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। बहु-प्रोटीन परिसरों में आमतौर पर बड़े आणविक जनता होती है, जो एमपी डिटेक्शन के लिए इष्टतम होती है, और एकल-अणु डेटा का उपयोग स्टोइकिओमेट्री को मापने और एक साथ कई बाध्यकारी साइटों की समानताओं की गणना करने के लिए किया जा सकता है। यह जानकारी आमतौर पर थोक-आधारित तरीकों का उपयोग करके प्राप्त करना मुश्किल होता है।

संशोधनों के बिना, वर्तमान प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत उच्च-आत्मीयता, 20 केडीए या उससे बड़े आणविक द्रव्यमान के एंटीजन के साथ उप-माइक्रोमोलर इंटरैक्शन के माप के लिए उपयुक्त है। इष्टतम परिणामों के लिए, प्रोटीन स्टॉक उच्च शुद्धता का होना चाहिए, लेकिन कोई विशिष्ट बफर आवश्यकताएं नहीं हैं। एमपी का इस्तेमाल करके एंटीजन-एंटीबॉडी बाइंडिंग का आकलन पांच मिनट से भी कम समय में किया जा सकता है । सटीक Kd गणना के लिए आवश्यक डेटा संग्रह और विश्लेषण 30 मिनट केभीतर किया जा सकता है।

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Protocol

1. प्रवाह कक्षों तैयार

  1. ग्लास कवरस्लिप को साफ करें
    1. आसुत पानी, इथेनॉल और आइसोप्रोपैनॉल के साथ धोने की बोतलों का उपयोग करके, निम्नलिखित क्रम में 24 मिमी x 50 मिमी कवरलिप कुल्ला: पानी, इथेनॉल, पानी, आइसोप्रोपेनॉल, पानी। साफ नाइट्रोजन की धारा के साथ कवरस्लिप को सुखाएं। ऊपर से नीचे तक कवरस्लिप को कुल्ला करना महत्वपूर्ण है, जो नीचे के कोने को नरम-इत्तला वाले संदंश के साथ पकड़े हुए हैं। संदंश(चित्रा 2 ए)से संदूषण को स्थानांतरित करने से बचने के लिए एक ही दिशा में कवरस्लिप को सुखा लें।
    2. इसी तरह, आसुत पानी, इथेनॉल और आसुत पानी के साथ 24 मिमी x 24 मिमी कवरस्लिप कुल्ला। साफ नाइट्रोजन की धारा के साथ कवरस्लिप को सुखाएं।
    3. कवरस्लिप के काम करने वाले पक्ष की पहचान करें, स्वच्छ कवरस्लिप की सतह पर आसुत पानी की एक बूंद रखें और प्रोटोकॉल के चरण 3.1-3.2 का पालन करें। आमतौर पर 24 मिमी x 50 मिमी कवरलिप के केवल एक तरफ एमपी माप के लिए उपयुक्त ऑप्टिकल गुणवत्ता होती है।
      नोट: ध्यान केंद्रित करने के बाद, कोई महत्वपूर्ण सतह खामियों का पता लगाने योग्य नहीं होना चाहिए, और डेटा संग्रह सॉफ्टवेयर में दिखाए गए "सिग्नल" मूल्य 0.05%(चित्रा 1-सी)से कम होना चाहिए। बॉक्स में सभी कवर्लिप के कामकाजी पक्ष एक ही दिशा में उन्मुख होते हैं। कवरस्लिप सफाई की दक्षता का परीक्षण करने के लिए एक ही प्रक्रिया का उपयोग किया जाना चाहिए।
  2. प्रवाह कक्ष को इकट्ठा करें
    1. एल्यूमीनियम पन्नी के एक टुकड़े पर 24 मिमी x 24 मिमी कवरलिप की स्थिति। चित्रा 2B में दिखाए गए 24 मिमी x 24 मिमी कवरस्लिप के शीर्ष पर डबल-तरफा टेप की स्ट्रिप्स रखें और ग्लास के किनारे के साथ टेप काटें। एल्यूमीनियम पन्नी से कवरस्लिप को अलग करें और इसे 24 मिमी x 50 मिमी कवरस्लिप(चित्रा 2C)के कामकाजी पक्ष से संलग्न करें।
      नोट: चैनल का आकार भिन्न हो सकता है, लेकिन 3 मिमी-5 मिमी की चौड़ाई की सिफारिश की जाती है। व्यापक चैनलों को बड़े नमूना संस्करणों की आवश्यकता होती है और बहुत संकीर्ण चैनलों को लोड करना मुश्किल हो सकता है। आमतौर पर, 24 मिमी x 24 मिमी कवरलिप पर दो समानांतर चैनल आसानी से बनाए जा सकते हैं। यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है।

2. आत्मीयता माप के लिए एंटीबॉडी-एंटीजन नमूने तैयार करें

  1. धूल कणों या समुच्चय को दूर करने के लिए 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का उपयोग करके पीबीएस बफर के कम से कम 2 मिलील को फ़िल्टर करें। टेबलटॉप सेंट्रलाइज (लगभग 16,000 x ग्राम)की अधिकतम गति से प्रोटीन स्टॉक को 10 मिनट तक सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: PBS इस प्रोटोकॉल के लिए अनुशंसित बफर है, लेकिन एमपी में कोई विशेष बफर आवश्यकताएं नहीं हैं, और अन्य जैविक बफर भी स्वीकार्य हैं। हालांकि, उच्च ग्लिसरोल सांद्रता (>10%) और बहुत कम आयनिक ताकत (नमक एकाग्रता और लेफ्टिनेंट;10 mM) छवि और डेटा की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं और अनुशंसित नहीं हैं।
  2. उनके 280 एनएम यूवी अवशोषण को मापने के द्वारा एंटीबॉडी और एंटीजन स्टॉक की वास्तविक सांद्रता निर्धारित करें।
  3. एंटीजन-एंटीबॉडी मिश्रण की माप सांद्रता की गणना करें। यदि एंटीबॉडी बाध्यकारी आत्मीयता के अनुमानित मूल्य का पता नहीं है, तो 30 एनएम एंटीजन और 20 एनएम एंटीबॉडी एकाग्रता के साथ एक नमूना तैयार करने की योजना बनाएं। जब अनुमानित आत्मीयता ज्ञात होती है, तो एंटीजन अनुपात के लिए एंटीबॉडी और उनकी सांद्रता को अपेक्षित केडी मूल्यों के अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए। अपेक्षित केडी के योग और नीचे दिएगए समीकरण में कुल एंटीबॉडी एकाग्रता के बराबर मिश्रण में कुल एंटीजन एकाग्रता का उपयोग करें। एंटीबॉडी केदो पैराटोप्स के लिए Kd1 = Kd2 को मानते हुए, इसके परिणामस्वरूप नमूने में मुफ्त एंटीबॉडी और एंटीबॉडी-एंटीजन परिसरों की तुलनीय सांद्रता होगी।
    Equation 4
    10 एनएम और 50 एनएम रेंज के भीतर नमूने में कुल प्रोटीन एकाग्रता रखने के लिए एंटीबॉडी एकाग्रता को समायोजित करें। 5 एनएम और 25 एनएम के बीच एंटीबॉडी सांद्रता के साथ मिश्रण का उपयोग करके सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त किए जाते हैं।
    नोट: सांसद 40 केडीए से बड़े आणविक द्रव्यमान वाले प्रोटीन का पता लगाता है। नतीजतन, 40 केडीए से छोटे आणविक द्रव्यमान वाले एंटीजन की नमूना सांद्रता विशिष्ट 50 एनएम सीमा से अधिक हो सकती है। हालांकि, लगभग 100 एनएम से अधिक सांद्रता पर, यहां तक कि कम आणविक द्रव्यमान एंटीजन केडी निर्धारण की छवि गुणवत्ता और सटीकता को प्रभावित कर सकते हैं।
  4. चरण 2.3 में गणना की गई अंतिम माप एकाग्रता पर एंटीबॉडी-एंटीजन मिश्रण का 50 माइक्रोन तैयार करें।
    नोट: केडी निर्धारण के लिए एंटीजन-एंटीबॉडी मिश्रण का केवल एक नमूना आवश्यक है। हालांकि, एंटीबॉडी अनुपात के लिए विभिन्न एंटीजन के साथ कई नमूनों को तैयार करने से नमूना एकाग्रता को अनुकूलित करने में मदद मिल सकती है। यदि कई नमूनों से डेटा एकत्र किए जाते हैं, तो वैश्विक फिट के माध्यम से उनका विश्लेषण किया जा सकता है।
  5. एंटीजन-एंटीबॉडी मिश्रण (ओं) को कमरे के तापमान पर लगभग 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें ताकि बाध्यकारी प्रतिक्रिया रासायनिक संतुलन तक पहुंच सके। बेवजह लंबे समय इनक्यूबेशन समय से बचें।
    नोट: बाध्यकारी काइनेटिक्स के आधार पर इनक्यूबेशन समय भिन्न हो सकता है। इस बात की पुष्टि करने के लिए कि रासायनिक संतुलन तक पहुंच गया है, नमूना माप को अलग-अलग समय पर दोहराया जा सकता इनक्यूबेशन। समय-अपरिवर्तनीय केडी मूल्य पर्याप्त रूप से लंबी इनक्यूबेशन का संकेत देते हैं। लंबे समय तक इनक्यूबेशन प्लास्टिक लैबवेयर की सतह पर महत्वपूर्ण प्रोटीन सोखने का कारण बन सकता है और इसके परिणामस्वरूप, प्रोटीन एकाग्रता निर्धारण में महत्वपूर्ण त्रुटियां हो सकती हैं। इस कारण से, एमपी नमूना तैयार करने के लिए कम आसंजन लैबवेयर की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है13।

3. मास फोटोमेट्री डेटा एकत्र करें

  1. एमपी इंस्ट्रूमेंट ऑब्जेक्टिव पर माइक्रोस्कोप विसर्जन तेल की एक बूंद लगाएं और इकट्ठे प्रवाह कक्ष को माइक्रोस्कोप स्टेज पर रखें। सुनिश्चित करें कि तेल कवरस्लिप और उद्देश्य के बीच के अंतर को फैलाता है।
  2. प्रवाह कक्ष लोड करें और बड़े पैमाने पर फोटोमीटर पर ध्यान केंद्रित करें।
    1. चरण 1 में तैयार प्रवाह कक्ष चैनल के एक छोर पर एक साफ, फ़िल्टर बफर समाधान के 10 μL जमा करें। तरल केशिका कार्रवाई द्वारा चैनल में प्रवेश करेगा।
    2. 24 x 50 मिमी कवरस्लिप की कामकाजी सतह पर माइक्रोस्कोप को केंद्रित करने के लिए चरण की जेड-स्थिति को समायोजित करें।
      1. डेटा संग्रह सॉफ्टवेयर के फोकस कंट्रोल टैब में, प्रारंभिक समायोजन करने के लिए मोटे चरण आंदोलन अप और डाउन बटन का उपयोग करें।
      2. शार्पनेस सिग्नल रीडआउट दिखाने के लिए शार्पनेस बटन पर क्लिक करें और शार्पनेस वैल्यू को अधिकतम करने के लिए फाइन अप और डाउन एडजस्टमेंट बटन का इस्तेमाल करें।
      3. फोकस ट्रैकिंग फ़ंक्शन को सक्रिय करने के लिए सेट फोकस और लॉक फोकस बटन पर क्लिक करें। एक ठीक से केंद्रित छवि(चित्रा 1ए, सी)में 0.05% से नीचे "सिग्नल" मूल्य होना चाहिए।
        नोट: यदि अधिकतम तीखेपन की स्थिति में "संकेत" मूल्य 0.05% से ऊपर है, तो यह कांच की सतह पर या बफर में अशुद्धियों को इंगित कर सकता है।
  3. एक ही चैनल का उपयोग करते हुए, एंटीबॉडी-एंटीजन नमूने के 20 माइक्रोन लोड करके इसे चैनल के एक तरफ जमा करके और दूसरे छोर से तरल को ब्लॉटिंग पेपर(चित्रा 2डी)के एक छोटे से टुकड़े के साथ दागदार करें।
    नोट: 3-5 मिमी चौड़े चैनल की मात्रा लगभग 10 माइक्रोल है। अतिरिक्त नमूना मात्रा को चैनल में मौजूद बफर को पूरी तरह से बदलने और नमूना कमजोर पड़ने से बचने के लिए सिफारिश की जाती है।
  4. नमूना लोड करने के बाद, डेटा संग्रह शुरू करने के लिए तुरंत रिकॉर्ड बटन पर क्लिक करें, 100 s वीडियो(चित्रा 1D)प्राप्त करें।
  5. डेटा संग्रह के अंत में फ़ाइल का नाम दर्ज करें और डेटा फ़ाइल को सहेजने के लिए ओके पर क्लिक करें।
  6. कवरस्लिप को त्यागें और आइसोप्रोपैनॉल के साथ गीले कॉटन ऑप्टिकल स्वाब के साथ ऑब्जेक्टिव लेंस से तेल को पोंछें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।

4. सांसद डेटा का विश्लेषण करें

  1. लैंडिंग घटनाओं की पहचान करने के लिए एमपी डेटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एकत्र किए गए वीडियो फ़ाइल को संसाधित करें।
    1. विश्लेषण और विश्लेषण पर क्लिक करने के लिए फ़ाइल लोड करने के लिए फ़ाइल/ओपन मेनू विकल्प काउपयोग करें ।
    2. अंशांकन फ़ंक्शन लोड करने के लिए लोड बटन पर क्लिक करें और फ़ाइल का उपयोग करके विश्लेषण डेटा को सहेजें/
  2. नमूने में प्रत्येक प्रजाति की सापेक्ष सांद्रता प्राप्त करने के लिए गॉसियन कार्यों के साथ आणविक जन वितरण को फिट करें। यह विश्लेषण एक सामान्य वैज्ञानिक रेखांकन सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके किया जा सकता है।
    1. "eventsFitted.csv" फ़ाइल को सॉफ्टवेयर में आयात करें और प्लॉट/स्टैटिस्टिक्स/हिस्टोग्राम फ़ंक्शन का उपयोग करके आणविक जन वितरण (.csv फ़ाइल में कॉलम एम) की साजिश करें ।
    2. प्लॉट प्रॉपर्टीज विंडो खोलने के लिए हिस्टोग्राम पर डबल क्लिक करें। स्वचालित बिनिंग को अक्षम करें और 2.5 केडीए के बिन आकार का चयन करें। बिन सेंटर्स बनाने और डेटा काउंट करने के लिए अप्लाई और गो बटन पर क्लिक करें ।
    3. बिन केंद्रों और गिनती कॉलम का चयन करें और विश्लेषण/चोटियों और बेसलाइन/मल्टीपल पीक फिट मेनू समारोह का उपयोग करने के लिए गॉसियन कार्यों के साथ हिस्टोग्राम फिट । वितरण भूखंड पर अनुमानित पीक पोजीशन को इंगित करने के लिए डबल क्लिक करें और फिर ओपन एनएलफिट बटन पर क्लिक करें।
    4. "xc" पीक केंद्रों के लिए फिक्स्ड चेकबॉक्स की जांच करें और मुक्त एंटीबॉडी और एकल और डबल एंटीजन-एंटीबॉडी परिसरों की अपेक्षित आणविक जनता के लिए अपने मूल्यों को सेट करें। चौड़ाई के मापदंडों के लिए शेयर विकल्प की जांच करें। फिट बटन पर क्लिक करें। गॉसियन घटकों के फिट पीक ऊंचाई मूल्य नमूना11में प्रत्येक प्रजाति की सापेक्ष एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
      नोट: बड़े पैमाने पर वितरण भूखंड के संकल्प को अनुकूलित करने के लिए बिन आकार को समायोजित किया जा सकता है। एमपी सटीक सीमा लगभग 1 केडीए है, और छोटे बिन आकार वितरण के शोर को बढ़ा सकते हैं, जबकि किसी भी अतिरिक्त जानकारी का खुलासा नहीं कर सकते हैं। बहुत बड़े बिन आकार बड़े पैमाने पर वितरण के ठीक विवरण अस्पष्ट होगा ।
  3. निम्नलिखित समीकरण का उपयोग कर प्रत्येक प्रजाति के एकाग्रता अंश की गणना करें:
    Equation 5
    जहां एचआई और एफआई वैल्यूज क्रमशः मुफ्त एंटीबॉडी और सिंगल-और डबल-बाउंड एंटीबॉडी के पीक हाइट्स और एकाग्रता अंशों का प्रतिनिधित्व करते हैं।

5. संतुलन निरंतर मूल्यों की गणना

  1. एक उपयुक्त विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके ईक्यू 1 और 2 के साथ चरण 4.3 में गणना की गई इंटरैक्शन प्रजातियों के एकाग्रता अंशों को फिट करें। यहां हम स्प्रेडशीट प्रोग्राम14 (पूरक जानकारीदेखें) का उपयोग करके संतुलन स्थिरांकों की गणना करने के लिए एक विधि प्रदर्शित करते हैं।
    1. "केडी कैलकुलेशन.xlsx" वर्कशीट खोलें। इस वर्कशीट में, पीले रंग में हाइलाइट की गई पंक्तियों 1 से 10 में सेल मूल्यों को संतुलन स्थिरांक गणना करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।
    2. नैनोमोलर इकाइयों में अनुमानित केडी मानों को तालिका में बी 1 और बी 2 कोशिकाओं में दर्ज करें। उन शुरुआती मूल्यों को फिटिंग प्रक्रिया में अनुकूलित किया जाएगा। यदि अनुमानित Kd मान ज्ञात नहीं हैं, तो कोशिकाओं B1 और B2 में डिफ़ॉल्ट मूल्यों को अपरिवर्तित छोड़ दें।
    3. नैनोमोलर इकाइयों में(सीएबी)मुन्ना और(सीएजी)मुन्ना के मूल्योंको कोशिकाओं डी 2 और ई 2 में दर्ज करें। चरण 4.3 में गणना किए गए अंश मूल्यों को एफ 2, जी-2 और H2 में दर्ज करें। यदि विभिन्न एकाग्रता अनुपात में कई नमूनों को मापा गया था, तो उन नमूनों के लिए प्राप्त अतिरिक्त एकाग्रता मूल्यों को पंक्तियों में 2 से 10 में दर्ज किया जा सकता है ।
    4. डेटा/सॉल्वर मेनू फ़ंक्शन का चयन करें। "सेट ऑब्जेक्टिव" बॉक्स में "$B $ 15" और "$B $ 1:$B $ 2" में "परिवर्तनीय कोशिकाओं को बदलकर:" बॉक्स में दर्ज करें। टू: विकल्प के लिए मिन रेडियो बटन का चयन करें। मेक अनिरुद्ध वेरिएबल्स नॉन-निगेटिव चेकबॉक्स की जांच करें और जीआरजी नॉनलाइनियर को सुलझाने की विधि के रूप में चुनें। सॉल्व बटन पर क्लिक करें। सबसे अच्छा फिट Kd1 और Kd2 मान सेल B1 औरB2 में दिखाया जाएगा और सेल B15 में चुकता त्रुटियों की अंतिम राशि ।
      नोट: यदि सॉल्वर फ़ंक्शन सक्रिय नहीं है, तो स्प्रेडशीट प्रोग्राम में फ़ाइल मेनू के तहत विकल्पों का चयन करें। ऐड-इन कैटेगरी में इनएक्टिव एप्लीकेशन ऐड-इन के तहत सॉल्वर ऐड-इन को सिलेक्ट करें और गो बटन पर क्लिक करें। सॉल्वर ऐड-इन चेकबॉक्स चेक करें और ओकेपर क्लिक करें ।

Figure 1
चित्रा 1: मास फोटोमेट्री छवियां। (ए)सतह खामियों के साथ एक कवरस्लिप पर एक साफ कवरस्लिप और(बी)पर एकत्र इमेजिंग बफर की प्रतिनिधि देशी दृश्य छवि । (ग)इमेजिंग बफर की अंतरअनुपातमेट्रिक इमेज और(डी)एएचटी· एचटी समाधान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एमपी फ्लो चैंबर तैयार करने और लोडिंग। (A)सफाई प्रक्रिया के लिए कवरस्लिप होल्डिंग पोजीशन। (ख)एल्यूमीनियम पन्नी (नीचे परत, नहीं दिखाया) की सतह पर 24 x 24 मिमी कवरलिप (मध्य परत) और डबल तरफा टेप (ऊपर परत) के संरेखण। नीली धराशायी लाइनें कट लाइनों का स्थान दिखाती हैं । (ग)दो नमूना चैनलों के साथ इकट्ठे प्रवाह कक्ष के ऊपर और पक्ष दृश्य, और इकट्ठे प्रवाह कक्ष की एक तस्वीर । (घ)पहले बफर से भरे फ्लो चैनल में सैंपल लोडिंग की प्रक्रिया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Representative Results

हमने पहले एमपी आधारित परख11का उपयोग करके मानव α-थ्रोम्बिन (एचटी) और माउस मोनोक्लोनल एंटी-ह्यूमन थ्रोम्बिन एंटीबॉडी (एएचटी) की बातचीत की जांच की है । चूंकि एचटी (37 केडीए) का आणविक द्रव्यमान 40 केडीए डिटेक्शन सीमा से नीचे है, इसलिए अधिकतम नमूना एकाग्रता बड़े पैमाने पर वितरण के संकल्प को नकारात्मक रूप से प्रभावित किए बिना 50 एनएम एमपी एकाग्रता सीमा से अधिक हो सकती है। प्रयोग एक निश्चित 25 एनएम एकाग्रता पर एएचटी एंटीबॉडी के साथ एक टाइटेशन श्रृंखला के रूप में योजना बनाई गई थी, और 7.5 एनएम, 15 एनएम, 30 एनएम, 60 एनएम और 120 एनएम की सांद्रता पर एचटी। चित्रा 3 एंटीजन-एंटीबॉडी मिश्रण और एंटीबॉडी-केवल नमूने के आणविक द्रव्यमान वितरण को दर्शाता है। यहां हम प्रोटोकॉल में वर्णित विधि का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करते हैं। एक वैज्ञानिक रेखांकन सॉफ्टवेयर का उपयोग मुफ्त एएचटी, एएचटी का प्रतिनिधित्व करने वाले तीन गॉसियन घटकों के साथ बड़े पैमाने पर वितरण को फिट करने के लिए किया गया था। एचटी और एएचटी· एचटी2। तीन घटकों के ज्ञात आणविक द्रव्यमान मूल्यों को तय किया गया था, और तीन प्रजातियों के लिए एक ही चोटी चौड़ाई पैरामीटर फिट किया गया था। प्रजातियों की एकाग्रता अंश(तालिका 1)प्राप्त करने के लिए गॉसियन घटकों के सर्वश्रेष्ठ फिट पीक ऊंचाई मापदंडों को Eq. 3 का उपयोग करके सामान्यीकृत किया गया था। उन मूल्यों, एक साथ कुल एंटीबॉडी और प्रत्येक नमूने के लिए एंटीजन एकाग्रता के साथ "केडी गणना.xlsx" में प्रवेश किया गया । स्प्रेडशीट में वैश्विक फिट पैदावार Kd1 = 40 एनएम (68.3% विश्वास अंतराल: 28 एनएम, 68 एनएम) और Kd2 = 28 एनएम (68.3% विश्वास अंतराल: 17 एनएम, 45 एनएम) । प्रायोगिक एकाग्रता के अंश और फिट परिणाम चित्र 4में रची जाती हैं । एकीकृत एकाग्रता अंशों को फिट करके यहां प्राप्त विघटन निरंतर मूल्य सीधे सांसद वितरण को फिट करके पहले प्राप्त किए गए लोगों के साथ समझौते में हैं, और इसोथमल टिटरेशन कैलोरिमेट्री (आईटीसी)11द्वारा प्राप्त वियोजन निरंतर मूल्यों के साथ।

Figure 3
चित्रा 3: 25 एनएम एएचटी के एमपी आणविक जन वितरण क्रमशः 0, 7.5, 15, 30, 60 और 120 एनएम (ए-एफ) पर एचटी के साथ मिश्रित। ब्लैक डॉट्स 2.5 केडीए बिन आकार के साथ प्लॉट किए गए प्रायोगिक सांसद डेटा को दिखाते हैं। सियान, हरी और नीली रेखाएं क्रमशः मुफ्त एंटीबॉडी, एकल बंधे एंटीबॉडी और डबल बाउंड एंटीबॉडी प्रजातियों के सर्वश्रेष्ठ फिट गॉसियन वितरण का प्रतिनिधित्व करती हैं। लाल रेखाएं तीन गॉसियन घटकों का योग दिखाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: मुक्त एएचटी (नीला), एएचटी के अंश· एचटी (लाल), और एएचटी· एचटीएकाग्रता के एक समारोह के रूप में एचटी 2 (काला)। अंक सांसद वितरण के गॉसियन फिटिंग से प्राप्त प्रायोगिक मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं। ठोस लाइनें Eq. 1 और Eq. 2 का उपयोग कर सबसे अच्छा फिट प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एएचटी आणविक जन वितरण मापन की तकनीकी प्रतिकृति। भूखंड एमपी माप की पुन: उत्पन्नता और एंटीबॉडी तैयारी की शुद्धता को दर्शाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एबी कॉन (एम) एजी कॉन (एम) f_Ab f_AbAg f_AbAg2
2.50E-08 7.50E-09 0.88 0.10 0.02
2.50E-08 1.50E-08 0.81 0.15 0.04
2.50E-08 3.00E-08 0.72 0.21 0.07
2.50E-08 6.00E-08 0.27 0.37 0.35
2.50E-08 1.20E-07 0.05 0.23 0.72

तालिका 1: सांसद वितरण(चित्रा 3) को फिट करके प्राप्त गॉसियन घटकों की सामान्यीकृत चोटी की ऊंचाइयों।

अनुपूरक सूचना: एक्सेल और एफ़िनिटी कैलकुलेशन वर्कशीट में संतुलन स्थिरांक फिटिंग प्रक्रिया का कार्यान्वयन। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां उल्लिखित मास फोटोमेट्री आधारित प्रोटोकॉल एंटीजन-एंटीबॉडी बाध्यकारी समानताओं को मापने की एक तेज और सटीक विधि प्रदान करता है। एमपी विश्लेषण सामग्री की एक बहुत छोटी राशि का उपयोग करता है, और अतिरिक्त जानकारी-stoichiometry, अल्पाधिकार, और शुद्धता सहित-एक ही डेटा(चित्रा 5)से मूल्यांकन किया जा सकता है । संशोधनों के बिना, यह विधि लगभग 5 एनएम से 500 एनएम रेंज में वियोजन स्थिरांकों के माप पर लागू होती है, और लगभग 20 केडीए या उससे बड़े आणविक द्रव्यमान वाले लिगांड अणुओं के लिए। एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग न केवल एंटीजन-एंटीबॉडी बाइंडिंग का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है, बल्कि प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन संबंधों को मापने के लिए भी किया जा सकता है जब बाध्यकारी भागीदारों में से कम से एक का आणविक द्रव्यमान 50 केडीए से बड़ा होता है। चूंकि एमपी डिटेक्शन गैर-विशिष्ट है, इसलिए एमपी माप वाहक प्रोटीन या बड़े आणविक द्रव्यमान अशुद्धियों की उच्च एकाग्रता वाले नमूनों पर नहीं किया जा सकता है।

एसपीआर आमतौर पर एंटीजन-एंटीबॉडी बाइंडिंग के लक्षण वर्णन के लिए प्रयोग किया जाता है, और दोनों तरीकों की सीधी तुलना परख चयन में मदद कर सकती है। एसपीआर की तुलना में, एमपी बाध्यकारी परख तेज होती है और प्रोटीन स्थिरीकरण की आवश्यकता नहीं होती है। एक विशिष्ट बाध्यकारी प्रयोग के लिए, सांसद को एसपीआर की तुलना में कम सामग्री की आवश्यकता होती है । एमपी डेटा परिसरों की स्टोइकिओमेट्री का पता चलता है जो एसपीआर10, 11से आसानी से उपलब्ध नहीं है । बाध्यकारी के गतिज मापदंडों को एमपी डेटा13से प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन एसपीआर बाध्यकारी काइनेटिक्स को सीधे मापता है, और संघ और वियोजन दरों की एक व्यापक श्रृंखला को मापने में सक्षम है। दो अलग-अलग बाध्यकारी साइटों के एसोसिएशन कॉन्स्टेंशन केवल एसपीआर डेटा से प्राप्त किए जा सकते हैं जब दोनों साइटों की एसोसिएशन और वियोजन दरें पर्याप्त रूप से अलग हों। दूसरी ओर, सांसद आणविक परिसरों को कई बाध्यकारी साइटों10, 11के साथ ठीक से चित्रित करसकताहै। एसपीआर छोटे आणविक द्रव्यमान लिगामेंट्स के लिए बाध्यकारी आत्मीयता को मापने में सक्षम है, और एमपी लगभग 20 केडीए या उससे बड़े आणविक द्रव्यमान के साथ लिगामेंट्स के लिए सबसे अच्छा काम करता है।

अच्छी गुणवत्ता वाले एमपी डेटा एकत्र करना इस प्रोटोकॉल से सटीक परिणाम प्राप्त करने में एक महत्वपूर्ण कदम है। बफर में या कवरस्लिप की सतह पर अशुद्धियां एमपी डेटा संग्रह में हस्तक्षेप करेंगी। अनुचित ध्यान केंद्रित करने से एमपी सिग्नल विकृत हो जाता है जिससे आणविक जन अनुमानों और संतुलन स्थिरन गणनाओं में त्रुटियां होती हैं । प्रोटोकॉल का निवारण करते समय इन दोनों कारकों की जांच की जानी चाहिए । कम एकाग्रता प्रोटीन समाधानों के साथ काम करते समय एक महत्वपूर्ण विचार यह है कि सतह के सोखने से सामग्री की हानि और नमूना एकाग्रता में परिवर्तन हो सकता है। परिणामस्वरूप त्रुटियों को कम सोखने वाले लैबवेयर का उपयोग करके और सतह की passivation लागू करके कम किया जा सकता है। सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए, सभी प्रोटीन कमजोर पड़ने और मिश्रण को रासायनिक संतुलन तक पहुंचने की अनुमति देना महत्वपूर्ण है, लेकिन अनावश्यक रूप से लंबे समय से इनक्यूबेशन बार बचा जाना चाहिए। प्रत्येक प्रोटीन प्रणाली के लिए, यह सिफारिश की जाती है कि कवरस्लिप ग्लास के लिए बाध्यकारी गैर-विशिष्ट प्रोटीन की दरों का आकलन एमपी डेटा से किया जाए। यदि विभिन्न प्रजातियों के लिए विभिन्न दरों को काफी अलग-अलग देखा जाता है, तो केडी गणना10, 11में संभावित त्रुटियों से बचने केलिए एमपी डेटा को आसानी से ठीक किया जासकताहै।

नमूना तैयार करने की योजना बनाते समय कई कारकों पर विचार किया जाना चाहिए। एक ही नमूने को मापने के द्वारा सटीक परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं, लेकिन एंटीजन और एंटीबॉडी सांद्रता को मुक्त और बाध्य प्रजातियों की तुलनीय एकाग्रता प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। प्रतिक्रिया प्रजातियों में से एक के प्रभुत्व वाले एकल द्रव्यमान वितरण का विश्लेषण स्वीकार्य केडी मूल्यों का अनुमान प्रदान कर सकता है लेकिन आमतौर पर अपेक्षाकृत बड़ी फिटिंग त्रुटियां11की पैदावार होती है । एक वैकल्पिक रणनीति में टिटरेशन डेटा का वैश्विक विश्लेषण शामिल है। इस प्रोटोकॉल के साथ प्रदान किए गए स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर आधारित फिटिंग टूल का उपयोग व्यक्तिगत डेटा और वैश्विक विश्लेषण दोनों के लिए फिटिंग के लिए किया जा सकता है। यदि किसी एक प्रयोग या डेटा सेट का विश्लेषण किया जाता है, तो त्रुटि प्रक्षेपण विधि का उपयोग करके सर्वश्रेष्ठ फिट मापदंडों के आत्मविश्वास अंतराल का अनुमान लगाया जा सकता है। स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में विश्वास अंतराल गणना प्रक्रिया का विस्तृत विवरणकहींऔर प्रदान किया गया है । परख डिजाइन करते समय, प्रयोगों को दोहराने के लिए योजना बनाने की सिफारिश की जाती है। जब दोहराने वाले प्रयोगों के डेटा का विश्लेषण किया जाता है, तो मानक विचलन का उपयोग Kd मूल्यों की त्रुटियों की रिपोर्ट करने के लिए किया जा सकता है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल को विशिष्ट आणविक द्रव्यमान और आत्मीयता सीमा सीमाओं से परे अपनी प्रयोज्यता का विस्तार करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। मापने योग्य समानताओं की सीमा एमपी द्वारा सुलभ प्रोटीन एकाग्रता रेंज द्वारा सीमित है, आमतौर पर 10 एनएम से 50 एनएम तक। इस रेंज को बढ़ाया जा सकता है और 10 एनएम से नीचे की सांद्रता पर प्रोटीन नमूनों को perfused प्रवाह कोशिकाओं और लंबे समय तक डेटा अधिग्रहण समय का उपयोग करके मापा जा सकता है । उच्च सांद्रता पर प्रोटीन नमूनों को संभावित रूप से एमपी माप के लिए passivated कवर्लिप्स का उपयोग करके मापा जा सकता है। एक छोटे से आणविक द्रव्यमान के साथ एंटीजन के लिए, मुक्त एंटीबॉडी और एमपी जन वितरण में एंटीजन-एंटीबॉडी परिसर चोटियों अनसुलझे हो जाएगा । यह प्रोटोकॉल में वर्णित गॉसियन पीक फिटिंग विश्लेषण के उपयोग को बाधित करेगा। उस मामले में, बाध्यकारी आत्मीयता अभी भी एंटीजन के साथ एंटीबॉडी titrating और प्रत्येक नमूने के लिए सभी प्रजातियों के औसत आणविक द्रव्यमान प्राप्त करने के लिए सांसद वितरण औसत द्वारा मापा जा सकता है । बाध्यकारी समीकरण तो इस डेटा के लिए फिट किया जा सकता है एंटीजन एंटीबॉडी बाध्यकारी आत्मीयता11प्राप्त करने के लिए ।

जब सटीक आत्मीयता जानकारी की आवश्यकता नहीं होती है, तो प्रोटोकॉल को सरल बनाया जा सकता है और तेजी से एंटीबॉडी इंटरैक्शन स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया जा सकता है। उस स्थिति में, प्रायोगिक प्रक्रिया को और सरल बनाने के लिए नमूना चैनलों के बजाय वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध गैसकेट कुओं का उपयोग किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के अपने महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए कीर न्यूमन को धन्यवाद देते हैं । इस काम को एनएचएलबीआई, एनआईएच के इंट्राम्यूरल प्रोग्राम ने सपोर्ट किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AcquireMP Refeyn MP data collection software
Anti-human thrombin Haematologic Technologies AHT-5020 RRID: AB_2864302
Cotton-tipped applicators Thorlabs CTA10 cotton optical swabs for lens cleaning
Coverslips 24x24 mm Globe Scientific 1405-10
Coverslips 24x50 mm Fisher Scientific 12-544-EP
DiscoverMP Refeyn MP data processing software
Forceps Electron Microscopy Sciences 78080-CF soft-tipped forceps for coverslips handling
Human α-thrombin Haematologic Technologies HCT-0020
Immersion oil Thorlabs MOIL-30
Isopropanol Alfa Aesar 36644
Microsoft Excel Microsoft spreadsheet
OneMP Refeyn Mass Photometry instrument
Origin OriginLab scientific graphing software
PBS Corning 46-013-CM 10x stock
Syringe filter Millipore SLGSR33SS buffer and sample filtering

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References

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बायोकेमिस्ट्री अंक 168 मास फोटोमेट्री एंटीबॉडी एफ़िनिटी प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन लेबल-फ्री बाध्यकारी आत्मीयता माप बहुसंबंधी प्रोटीन इंटरैक्शन
मास फोटोमेट्री द्वारा एंटीबॉडी-एंटीजन आत्मीयता का तेजी से निर्धारण
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Wu, D., Piszczek, G. Rapid… More

Wu, D., Piszczek, G. Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry. J. Vis. Exp. (168), e61784, doi:10.3791/61784 (2021).

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