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Biochemistry

मल्टी-कॉलम प्लेट एडाप्टर का उपयोग करके एक किफायती और बहुमुखी उच्च-थ्रूपुट प्रोटीन शुद्धिकरण प्रणाली

Published: May 21, 2021 doi: 10.3791/62075
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1School of Life Sciences, University of Liverpool, 2Health Sciences Center, Texas Tech University

Summary

एक बहु-कॉलम प्लेट एडाप्टर क्रोमेटोग्राफी कॉलम को समानांतर आत्मीयता या आयन विनिमय शुद्धिकरण के लिए बहु-अच्छी संग्रह प्लेटों के साथ इंटरफेस करने की अनुमति देता है जो किफायती उच्च थ्रूपुट प्रोटीन शुद्धिकरण विधि प्रदान करता है। इसका उपयोग गुरुत्वाकर्षण या वैक्यूम उपज मिलीग्राम मात्रा में किफायती इंस्ट्रूमेंटेशन के माध्यम से किया जा सकता है।

Abstract

प्रोटीन शुद्धिकरण प्रोटीन संरचना और कार्य के अध्ययन के लिए जरूरी है और आमतौर पर जैव भौतिक तकनीकों के संयोजन में प्रयोग किया जाता है। यह भी नए चिकित्सा विज्ञान के विकास में एक महत्वपूर्ण घटक है । कार्यात्मक प्रोटेओमिक्स का विकसित युग इस सुविधा के लिए उच्च-थ्रूपुट प्रोटीन शुद्धिकरण और बेहतर तकनीकों की मांग को भड़का रहा है। यह परिकल्पना की गई थी कि एक मल्टी कॉलम प्लेट एडाप्टर (एमसीपीए) समानांतर शुद्धिकरण के लिए बहु-अच्छी प्लेटों के साथ विभिन्न रेजिन के कई क्रोमेटोग्राफी कॉलम को इंटरफेस कर सकता है। यह विधि प्रोटीन शुद्धिकरण की एक किफायती और बहुमुखी विधि प्रदान करती है जिसका उपयोग गुरुत्वाकर्षण या वैक्यूम के तहत किया जा सकता है, जो स्वचालित प्रणाली की गति को प्रतिद्वंद्विता करता है। MCPA बाद के लक्षण वर्णन और विश्लेषण के लिए एक सस्ती और समय कुशल विधि द्वारा प्रोटीन की मिलीग्राम पैदावार को ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एमसीपीए का उपयोग SH3 डोमेन के उच्च थ्रूपुट आत्मीयता शुद्धि के लिए किया गया है। आयन एक्सचेंज भी MCPA के माध्यम से प्रोटीन पोस्ट नी-एनटीए आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी शुद्ध करने के लिए प्रदर्शन किया गया है, यह दर्शाता है कि कैसे इस प्रणाली को अंय शुद्धिकरण प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । कई स्तंभों के साथ इसके सेटअप के कारण, मापदंडों का व्यक्तिगत अनुकूलन एक ही शुद्धि में किया जा सकता है, जो वर्तमान प्लेट-आधारित तरीकों से अप्राप्य नहीं है।

Introduction

शुद्ध प्रोटीन की मिलीग्राम मात्रा प्राप्त करने के लिए प्रोटीन शुद्धिकरण तकनीक उनके लक्षण वर्णन और विश्लेषण के लिए जरूरी हैं, विशेष रूप से एनएमआर जैसे जैव भौतिक तरीकों के लिए। प्रोटीन शुद्धिकरण भी अध्ययन के अन्य क्षेत्रों में केंद्रीय है जैसे दवा खोज प्रक्रियाएं और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन अध्ययन; हालांकि, शुद्ध प्रोटीन की इतनी मात्रा को प्राप्त करना इन तकनीकों के लिए एक अड़चन बन सकता है1,2,3. प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए प्रमुख विधि क्रोमेटोग्राफी है, जिसमें विभिन्न प्रकार के तरीके शामिल हैं जो प्रोटीन की व्यक्तिगत विशेषताओं और उनके टैग पर भरोसा करते हैं। एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी में, प्रोटीन में एक अतिरिक्त प्रोटीन या पेप्टाइड आकृति होती है जो एक टैग के रूप में काम करती है जिसमें क्रोमेटोग्राफी राल4पर एक निश्चित सब्सट्रेट के लिए एक लगाव है। सबसे आम आत्मीयता विधि स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी (आईमैक) है जो उसके टैग वाले प्रोटीन का उपयोग करके है, जबकि एक अन्य लोकप्रिय विधि आयन एक्सचेंज क्रोमेटोग्राफी है जो उनके आवेश के आधार पर प्रोटीन को अलग करती है। उच्चतम शुद्धता के लिए, आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी और आयन एक्सचेंज का एक संयोजन अक्सर एक साथ उपयोग किया जाता है, आमतौर पर उच्च-थ्रूपुट के लिए महंगे प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता होती है।

कार्यात्मक प्रोटेओमिक्स का विकसित युग विशिष्ट विश्लेषण के लिए एकवचन प्रोटीन को शुद्ध नहीं करने के लिए उच्च थ्रूपुट तकनीकों की मांग को भड़का रहा है, लेकिन व्यापक विश्लेषण और जीनोम व्यापक अध्ययन के लिए एक साथ बड़ी संख्या में प्रोटीन5। स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी (आईमैक) उच्च थ्रूपुट प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले तरीकों में से एक है6,7 अभी तक इसकी स्वचालित प्रणालियां छोटी प्रयोगशालाओं के लिए महंगी और सस्ती हैं8। अधिक किफायती प्लेट आधारित विकल्प जो वर्तमान में उपलब्ध हैं, सुलभ प्रयोगशाला-आधारित उपकरणों के उपयोग को नियोजित करते हैं, जैसे कि वैक्यूम। हालांकि ये विधियां शुद्धिकरण की गति में सुधार करने में सफल हैं, लेकिन यह केवल छोटे पैमाने पर उच्च थ्रूपुट शुद्धि प्राप्त कर सकती है, केवल माइक्रोग्राम रेंज में प्रोटीन पैदा कर सकती है। इन सीमाओं का मतलब है कि पूर्व पैक 96 अच्छी तरह से फिल्टर प्लेटें (उदाहरण के लिए, जीई हेल्थकेयर से अब Cytiva के स्वामित्व में) जैव भौतिक तकनीकों से पहले इस्तेमाल नहीं किया जा सकताहै 9. गुरुत्वाकर्षण क्रोमेटोग्राफी शुद्धि की सबसे अधिक लागत-कुशल विधि है; हालांकि, कई स्तंभों की स्थापना असुविधाजनक है और कई प्रोटीन के लिए त्रुटि के लिए प्रवण हो सकता है ।

एक बहु स्तंभ प्लेट एडाप्टर (MCPA) विकसित किया गया है और सफलतापूर्वक और आसानी से समानांतर आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी कॉलम चलाने के लिए एक बार में अपने टैग खमीर SH3 डोमेन10शुद्ध करने के लिए साबित कर दिया गया है । एमसीपीए एक लागत कुशल उच्च-थ्रूपुट शुद्धिकरण विधि प्रदान करता है जो महंगे इंस्ट्रूमेंटेशन पर निर्भर नहीं करता है। इसका लचीला डिजाइन गुरुत्वाकर्षण या वैक्यूम के तहत कई आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी कॉलम द्वारा प्रोटीन के मिलीग्राम को प्रभावी ढंग से शुद्ध कर सकता है। इसके अलावा, तेजी से अनुकूलन के लिए प्रत्येक व्यक्तिगत कॉलम के लिए राल प्रकार, मात्रा और अन्य मापदंडों को समायोजित किया जा सकता है। यह अध्ययन दर्शाता है कि एमसीपीए द्वारा आयन एक्सचेंज क्रोमेटोग्राफी का उपयोग एबीपी 1 एसएच 3 डोमेन के शुद्धिकरण को बढ़ाने के लिए एमसीपीए द्वारा आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी के साथ किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, इन तरीकों का उपयोग करके समानांतर रूप से 24 विभिन्न प्रोटीन को अलग किया जा सकता है।

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Protocol

1. नी-एनटीए क्रोमेटोग्राफी को डेनटुरिंग

  1. बफर तैयार करना
    नोट: सभी बफ़र्स के विवरण के लिए तालिका 1 देखें।
    1. 0.5 एम NaOH के 500 एमएल बनाओ, पहले मिल्ली-क्यू पानी जोड़ने के लिए सुनिश्चित कर रही है और फिर नाओएच धीरे-धीरे जोड़ने के दौरान बीकर एक उभारने वाला पर है। 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर करें।
    2. 0.1 एम निकल सल्फेट और फिल्टर के 100 एमएल एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर तैयार करें।
    3. 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके 2 एम इमिडाजोल और फिल्टर के 50 एमएल तैयार करें।
    4. 5.3 एमएम ट्रिस-एचसीएल से मिलकर पीएच 8.0 पर 0.22 माइक्रोन फिल्टर 1.5 एल डिनेचरिंग बफर, 4.7 m Tris-base (Tris (हाइड्रोक्सीमिथाइल) मिथाइलमाइन), 13.7 m NaH2पीओ4,86.3 mMNa 2HPO4 और 6 M guanidine हाइड्रोक्लोराइड।
    5. 2 एम इमिडाजोल स्टॉक का उपयोग करके 10 एमएम इमिडाजोल के लाइसिस बफर सॉल्यूशन को तैयार करें और 0.22 माइक्रोन फिल्टर 500 एमएल का डिसिस बफर सॉल्यूशन करें (1.1.4 देखें) में भंग करें।
    6. 2 एम इमिडाजोल स्टॉक का उपयोग करके 10 एमएम इमिडाजोल के वॉश बफर समाधान को तैयार करें और 0.22 माइक्रोन फिल्टर 500 एमएल करें।
    7. 100 m EDTA बफर के 500 मिलियन फिल्टर 500 मिलियन फ़िल्टर तैयार करें, पीएच को 1 एम नाओएच का उपयोग करके 8 में समायोजित करें।
    8. 6 एम ग्वानिडीन हाइड्रोक्लोराइड में 99% हिमनदों एसिटिक एसिड के 7 एमएल से बना एल्यूशन बफर का 0.22 माइक्रोन फिल्टर 500 एमएल तैयार करें।
      नोट: यदि देशी बफ़र्स का उपयोग कर रहे हैं, तो तालिका 1के अनुसार अनुकूलित करें ।
  2. Lysing कोशिकाओं (denaturing विधि)
    1. काटा ई. कोलाई सेल छर्रों कि अधिक व्यक्त अपने टैग प्रोटीन होते हैं की हर 1 ग्राम के लिए लाइसिस बफर के 2 एमएल जोड़ें। कई मिनट के लिए भंवर जब तक कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर रहे हैं । नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक घुमाव पर छोड़ दें।
    2. 30 मिनट के लिए 18,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज lysed छर्रों। एसडीएस-पेज जेल पर बाद में विश्लेषण करने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में 50 माइक्रोन को अलग रखें।
    3. ध्यान से यह सुनिश्चित करने के लिए कि गोली परेशान न हो, सुपरनेटेंट को बंद कर दें। Lysates एक स्पष्ट, हल्के पीले रंग होना चाहिए। यदि lysates बादल छाए हुए हैं, तो अपकेंद्रित्र नमूना फिर से; न्यूक्लिक एसिड को नीचा दिखाने के लिए उपलब्ध होने पर सोनीफिकेशन पर विचार करें।
    4. एक खाली कॉलम (राल के बिना लेकिन फिल्टर के साथ) के माध्यम से सुपरनेटेंट को फ़िल्टर करें और एक खुले संग्रह ट्रे में एकत्र करें। फिर चरण 1.3 में उपयोग के लिए एक ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: यदि देशी बफ़र्स का उपयोग कर रहे हैं, तो चरण 1.2.1 के बाद, नमूनों को फ्रीज के 3 चक्रों का इलाज करें/
  3. वैक्यूम शुद्धिकरण सेटअप तैयार करना और कॉलम को बराबर करना
    नोट: देखें अंक 1 24 स्तंभों के साथ एक सेट अप एमसीपीए के लिए।
    1. निर्धारित करें कि वांछित राल प्रकार और मात्रा के साथ-साथ कितने स्तंभों की आवश्यकता है। T7 आधारित प्लाज्मिड्स का उपयोग करके अपने टैग किए गए एसएच 3 डोमेन को व्यक्त करते हुए ऑटोडक्शन कल्चर (~ 2 ग्राम गोली) के 100 एमएल के लिए अंगूठे के नियम के रूप में, नी-एनटीए राल के 0.6 एमएल प्रति कॉलम का उपयोग करने के लिए लगभग 6 मिलीग्राम प्रोटीन से लगभग 3 मिलीग्राम प्रोटीन प्राप्त करने के लिए।
    2. एक पूर्व-इकट्ठे MCPA (पंचर सीलिंग चटाई के साथ लंबी ड्रिप प्लेट) में 12 मिलीएल कॉलम (राल के बिना लेकिन फिल्टर के साथ) की वांछित संख्या डालें। कॉलम को पंचर किए गए सीलिंग चटाई के छेद में चुस्त रूप से फिट होना चाहिए।
    3. यदि 24 से कम स्तंभों का उपयोग किया जाता है, तो खाली बंद कॉलम के साथ खाली छेद बंद करें।
    4. एक खुली संग्रह प्लेट लें और इस प्लेट को वैक्यूम के आधार में कई गुना डाल दें और कई गुना के शीर्ष के साथ बंद करें।
    5. वैक्यूम के शीर्ष पर कॉलम के साथ इकट्ठे MCPA कई गुना रखें।
    6. वैक्यूम पंप सिस्टम से वैक्यूम के नीचे इंलेट/नोजल तक टयूबिंग अटैच करें।
    7. सुनिश्चित करें कि नी-एनटीए मोती 20% इथेनॉल के साथ 50% समाधान में हैं। मोतियों के साथ कुछ भी करने से पहले धीरे से हिला/मनका मिश्रण/इथेनॉल समाधान समान रूप से resuspend । फिर, कॉलम में 5 एमएल पिपेट, 50% समाधान के 1.2 एमएल का उपयोग करना। जबकि पिपटिंग सुनिश्चित करें कि मोती पूरी तरह से मिश्रित रहें।
    8. सभी 24 स्तंभों में पाइपिंग के बाद, वैक्यूम पंप चालू करें और कॉलम के माध्यम से और नीचे संग्रह प्लेट में 20% इथेनॉल चलाएं।
    9. एक बार सभी 20% इथेनॉल सभी स्तंभों के माध्यम से चला गया है पंप बंद कर दें (नी-एनटीए राल संक्षिप्त सुखाने को बर्दाश्त कर सकता है यदि बफर कॉलम के माध्यम से पारित होने के बाद वैक्यूम अभी भी लागू किया जाता है)। खुले संग्रह प्लेट में जो कुछ है उसे अपशिष्ट बॉक्स में निपटाएं।
      सावधानी: नी-एनटीए मोतियों से सभी अपशिष्ट उत्पाद खतरनाक हैं, जब मोतियों को संभालना या कचरे का निपटान करना, दस्ताने, चश्मे और अन्य पीपीई पहनें। इसके अलावा, बाद में व्यक्तिगत निपटान के लिए एक अलग कंटेनर में सभी निकल सल्फेट कचरे का निपटान करें।
      नोट: यदि राल नया है या हाल ही में पुनर्जीवित किया गया है, तो इन चरणों के बाकी चरणों को नजरअंदाज किया जा सकता है, अगले अनुभाग में जाएं।
    10. 50 मिली सिरिंज के साथ 20 एमएल सिरिंज या रिपीटर सिरिंज डिवाइस का उपयोग करके 100 मिलियन ईडीए बफर के 3 राल वॉल्यूम (1.8 एमएल) जोड़ें। फिर वैक्यूम पंप पर स्विच करने के लिए EDTA बफर के माध्यम से धोने और पंप बंद करने के लिए एक बार यह के माध्यम से धोया है ।
      नोट: इस धोने निकल नीले रंग को दूर करना चाहिए, लेकिन अगर यह मामला नहीं है तो इस कदम को दोहराने जब तक सभी स्तंभों अपने नीले रंग खो दिया है । पंप बंद कर दें और खुले संग्रह प्लेट की सामग्री को अपशिष्ट बॉक्स में डालें।
    11. पंप चालू करने और प्रत्येक कॉलम के माध्यम से इसे चलाने से पहले प्रत्येक कॉलम में 0.5 एम नाओएच बफर के 3 राल वॉल्यूम (1.8 एमएल) जोड़ें। खाली संग्रह प्लेट।
    12. प्रत्येक कॉलम में 100 mm निकल सल्फेट के 4 राल वॉल्यूम (2.4 एमएल) जोड़ें। वैक्यूम पंप चालू करें और कॉलम के माध्यम से इसे एक बार फिर से चलाएं।
    13. मिल्ली-क्यू पानी के 10 राल वॉल्यूम (~ 6000 माइक्रोन) जोड़ें और कॉलम के माध्यम से इसे चला रहे हैं। पंप बंद करें और संग्रह प्लेट की सामग्री को अपशिष्ट बॉक्स में बंद कर दें।
    14. किसी भी अतिरिक्त निकल और संतुलन को दूर करने के लिए हर बार वॉश बफर (डेन्चरिंग या देशी) में 10 एमएम इमिडाजोल के 4 राल वॉल्यूम (2.4 एमएल) के साथ कॉलम को दो बार धोएं। खाली संग्रह प्लेट।
      नोट: यदि कोई कॉलम काफी धीमी चल रहे हैं, तो एक बड़ी सिरिंज का उपयोग करके एमसीपीए के माध्यम से अलग कॉलम और चेक एयर को धक्का दिया जा सकता है। यदि यह अनब्लॉक है, तो एक नए फ़िल्टर के साथ एक अलग कॉलम का उपयोग करें।
    15. यदि कई अलग-अलग नमूने/प्रोटीन एमसीपीए पर शुद्ध होने जा रहे हैं तो खुले संग्रह प्लेट को ४८ x (5 एमएल/वेल) संग्रह प्लेट से प्रतिस्थापित करें । हालांकि, जब केवल हर कॉलम पर एक ही प्रोटीन नमूने चल रहा है, यह एक खुले संग्रह प्लेट का उपयोग कर पर ले जाने के लिए ठीक है ।
  4. लोडिंग, धुलाई और eluting
    1. वैक्यूम ऑफ के साथ, कॉलम में लोड lysates (lysate की मात्रा अलग-अलग होगी, आमतौर पर 1 से 12 एमएल या उससे अधिक और कई बैचों में लोड करने के लिए आवश्यक हो सकता है)। बाध्यकारी को अधिकतम करने के लिए कॉलम में मोतियों और lysate को धीरे से मिलाने के लिए एक पतली प्लास्टिक स्टरर का उपयोग करें।
    2. धीरे-धीरे कुछ मिनटों के लिए प्रत्येक कॉलम को मिलाने के बाद, वैक्यूम पंप पर स्विच करें और कॉलम के माध्यम से lysates चलाएं। यदि कई प्रोटीन नमूने चलाए जा रहे हैं, तो 48 अच्छी तरह से संग्रह प्लेट का उपयोग करें और 4 एमएल के माध्यम से चलने के बाद एक और 48 अच्छी तरह से प्लेट के लिए संग्रह प्लेट को स्वैप करना सुनिश्चित करें क्योंकि इन प्लेटों में कुएं केवल समाधान के 4 एमएल रख सकते हैं। जब तक सभी lysates एक कॉलम के माध्यम से चलाया गया है lysate चल रहा है जारी रखें । संग्रह प्लेटों को फ्रीज करें जिनमें प्रवाह होता है।
      नोट: कॉलम "अवरुद्ध" हो सकते हैं जिससे lysate कॉलम के माध्यम से बहुत धीमी गति से प्रवाहित हो सकता है। यह आसानी से देखा जाता है क्योंकि पड़ोसी कॉलम सामान्य दर पर बह रहे होंगे। यदि ऐसा होता है, तो यह सिफारिश की जाती है कि lysate/राल मिश्रण को एक ताजा फ़िल्टर वाले कॉलम में स्थानांतरित किया जाए।
    3. संग्रह प्लेट को एक खाली खुली संग्रह प्लेट के साथ बदलें और फिर प्रत्येक कॉलम में 10 एमएम इमिडाजोल वॉश बफर के 9 राल वॉल्यूम (5.4 एमएल) जोड़ें और वैक्यूम चालू करें और धोने के माध्यम से चलाएं। इसे 4-5 बार दोहराएं। ओवरफ्लो से बचने के लिए, समय-समय पर खाली अपशिष्ट प्लेट।
      1. फिर संग्रह प्लेट को एक साफ उपयुक्त प्लेट के साथ बदलें (सिर्फ एक प्रोटीन के लिए खुली प्लेट और 96 अच्छी तरह से यदि कई प्रोटीन हैं, तो यह सुनिश्चित करना कि A1 शीर्ष बाएं कोने में है)।
    4. प्रत्येक कॉलम में 12.5 एमएल सिरिंज, पिपेट ~ 1 राल की मात्रा (0.75 एमएल) के साथ रिपीटर सिरिंज का उपयोग करना।
    5. प्रोटीन फोमिंग से बचने के लिए, सबसे कम सेटिंग पर वैक्यूम पंप चालू करें। धीरे से एमसीपीए लिफ्ट की जांच करने के लिए कुछ भी नहीं संग्रह प्लेट में ड्रिप करने के लिए छोड़ दिया है ।
      नोट: वैक्यूम या गुरुत्वाकर्षण के साथ eluting के लिए एक विकल्प कॉलम के शीर्ष में एक 10 मिलीएल सिरिंज प्लंजर धक्का है धीरे कॉलम के माध्यम से elution बफर धक्का । हर कॉलम के लिए ऐसा करें, सिरिंज प्लंजर को हटाते समय सावधान रहें ताकि कॉलम के नीचे मोतियों को परेशान न किया जा सके। एक बार एल्यूशन बफर के माध्यम से धक्का दिया गया है, धीरे पिछले कॉलम में यह इस्तेमाल किया गया था और संक्षेप में वैक्यूम पंप पर बारी करने के लिए स्तंभों से पिछले बूंदों को दूर करने से सिरिंज प्लंजर हटा दें ।
      1. यदि एक ९६ अच्छी तरह से संग्रह प्लेट का इस्तेमाल किया गया है, तो संग्रह प्लेट की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि क्या लंबी ड्रिप प्लेट के माध्यम से प्रत्येक स्तंभ से बह रहा है केवल एक अच्छी तरह से बह रहा है और कुछ भी नहीं संग्रह प्लेट पर पड़ोसी कुओं में eluting है ।
    6. अगले एल्यूशन के लिए उपरोक्त 2 चरणों को दोहराएं और एक ताजा मल्टी-वेल (विभिन्न नमूने) या खुले संग्रह प्लेट (एक ही नमूने) में एकत्र करें।
    7. वैकल्पिक कदम, शुद्धता और एकाग्रता विश्लेषण के लिए प्रत्येक एल्यूशन का 50 माइक्रोन एलिकोट लें।
    8. प्रत्येक कॉलम में 20% इथेनॉल की 2 मिलील जोड़ें और वैक्यूम पंप का उपयोग करके इसे चलाएं। फिर कॉलम में 20% इथेनॉल का एक और 2 मिलियन का एक और 2 मिलियन जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए 50 मिली ट्यूब में स्थानांतरित करने से पहले 20% इथेनॉल और मोतियों को मिलाने के लिए एक ताजा पतली प्लास्टिक स्टरर का उपयोग करें। कॉलम को साफ करें और जांचें कि पानी प्रत्येक कॉलम के माध्यम से स्वतंत्र रूप से बहता है और फिर सब कुछ साफ करता है और बाद में उपयोग के लिए दूर रख देता है।
      नोट: कुछ स्तंभों में अंततः उनके फ़िल्टर अवरुद्ध हो जाएंगे और धीरे-धीरे चलेंगे, इन स्तंभों को बदल दिया जाना चाहिए, या फ़िल्टर को साफ किया जाना चाहिए. इस प्रकार, राल को हटाकर और कॉलम को पानी से भरने के लिए समय-समय पर फिल्टर का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है ताकि यह देखा जा सके कि यह जल्दी से बहती है या नहीं। फिल्टर एक बंद स्पष्ट स्फूर्ति बफर और रात भर मिलाते हुए से भरा स्तंभ छोड़ कर साफ किया जा सकता है ।

2. आयन एक्सचेंज - एकल प्रोटीन शुद्धि

  1. बफ़र्स की तैयारी
    नोट: सभी बफ़र्स के विवरण के लिए तालिका 1 देखें
    1. एक 2 एल कम नमक बफर तैयार करें: 10 m Tris पीएच 8.1 (5 mM Tris एसिड, 5 mM Tris बेस)। 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर समाधान।
    2. 0.5 एल उच्च नमक बफर तैयार करें: 10 एमएम ट्रिस पीएच 8.1, 4 एम एनएसीएल। नैसीएल के 116.9 ग्राम को मापें और ऊपर से 10 एमएमएम ट्रिस पीएच 8.1 के साथ 0.5 एल तक बनाएं। 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर समाधान।
  2. नमक एकाग्रता श्रृंखला बनाना: 0-1 एम एनएसीएल।
    नोट: नमक सांद्रता की सीमा हर प्रोटीन के लिए समायोजित किया जा सकता है ।
    1. सेटअप 24 x 50 एमएल एक रैक में अपकेंद्रित्र ट्यूब लेबल
    2. ऊपर बने बफर का उपयोग करके, 0-1000 माइक्रोन से लेकर 24 x 14 एमएल एनएसीएल कमजोर पड़ने की तैयारी करें। 4 एम एनएसीएल 10 एमएम ट्रिज़ की आवश्यक मात्रा जोड़कर शुरू करें। यह प्रोटीन के आधार पर 25 mm या 50 mM की वेतन वृद्धि द्वारा किया जा सकता है।
    3. फिर प्रत्येक ट्यूब में 10 एमएमएम ट्रिस की आवश्यक मात्रा जोड़ें। प्रत्येक ट्यूब को कई बार मिलाने के लिए उलटा करें।
  3. नमूने तैयार करना
    1. आयन एक्सचेंज द्वारा शुद्ध किए जाने वाले नमूनों को प्राप्त करें। वैकल्पिक रूप से, बाद में विश्लेषण के लिए 50 माइक्रोन एलिकोट लें।
      नोट: नमूने हमेशा ठंडा रखा जाना चाहिए; ये lysates हो सकता है, या शायद नी-एनटीए के बाद । नी-एनटीए से 10 एमएम ट्रिस बफर में डायलिजिंग या बफर एक्सचेंज की आवश्यकता होती है। देशी बफ़र्स में नी-एनटीए के नमूनों को नमक एकाग्रता को कम करने के लिए 10 एमएम ट्रिस बफर के साथ पतला किया जा सकता है ताकि प्रोटीन आईईएक्स राल को बांध सके।
    2. 10 मिनट के लिए 18,000 x ग्राम पर स्पिन नमूने।
    3. ध्यान से एक वजन नाव में सुपरनटेंट डालना। गोली से परेशान होने से बचें।
    4. सुपरनेट को ध्यान से 20 एमएल सिरिंज में लें और 0.22 माइक्रोन फिल्टर संलग्न करें।
    5. धीरे-धीरे एक ताजा 50 एमएल ट्यूब में फिल्टर के माध्यम से सुपरनेट बाहर निकालें।
    6. यदि कमजोर पड़ने की आवश्यकता है, तो ऊपर किए गए 10 एमएम ट्राइस बफर के साथ पतला सुपरनाटेंट (इस प्रयोग में सुपरनॉट को 2 में 1 पतला किया गया था)। इस दौरान 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. वैक्यूम शुद्धिकरण सेटअप और संतुलन सेटअप तैयार करना
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, एक नमूने के आईईएक्स शुद्धिकरण के लिए केवल एक कॉलम का उपयोग किया जाता है। कई शुद्धिकरण के लिए, अगले अनुभाग देखें।
    1. वांछित राल प्रकार और मात्रा निर्धारित करें। आंशिक रूप से शुद्ध अपने टैग एसएच 3 डोमेन के 20 मिलीग्राम तक के लिए अंगूठे के नियम के रूप में, प्रति कॉलम क्यू-सेफ्रॉम फास्ट फ्लो राल के 0.4 एमएल का उपयोग करें (चरण 2.4.8 देखें)।
    2. एक पूर्व इकट्ठे MCPA में 24 खुले खाली कॉलम (नीचे फिल्टर के बिना खाली) डालें । कॉलम को पंचर किए गए सीलिंग चटाई के छेद में चुस्त रूप से फिट होना चाहिए।
    3. पहली स्थिति को छोड़कर हर खाली कॉलम में 10 एमएल सिरिंज प्लंजर रखें, जहां शुद्धि शुरू होगी।
    4. कॉलम के अंत में रबर की अंगूठी बनाने के लिए 5 एमएल सिरिंज प्लंजर रबर गैसकेट (जिसे छेदा गया है) के माध्यम से एक खुले कॉलम (फिल्टर के साथ) के नीचे पुश करें। यह रबर रिंग एक अच्छी मुहर सुनिश्चित करेगा जब यह कॉलम ऊपर प्रत्येक खाली कॉलम में डाला जाता है। अभी के लिए, इस कॉलम को एमसीपीए पर पहले खाली कॉलम में डालें।
    5. एक खुली संग्रह प्लेट लें और इस प्लेट को वैक्यूम के आधार में कई गुना डाल दें और कई गुना के शीर्ष के साथ बंद करें।
    6. इकट्ठे MCPA (कॉलम के साथ) वैक्यूम के शीर्ष पर कई गुना रखें ।
    7. वैक्यूम पंप सिस्टम से वैक्यूम के नीचे इनलेट/नोजल में टयूबिंग संलग्न करें।
    8. नीचे से एक नीली पिपेट टिप ~ 2 सेमी काटें और क्यू-सेफ्रॉस मोतियों (या किसी अन्य आयन एक्सचेंज राल) के 800 माइक्रोन लेने के लिए उपयोग करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि 50/50 मनका-इथेनॉल समाधान लेयरिंग से बचने के लिए मिलाया जाता है। पिपेट 800 माइक्रोन को पहली स्थिति में एक खुले कॉलम (फ़िल्टर के साथ) में और एक बार मोती कॉलम के नीचे बसने के बाद 20% इथेनॉल के माध्यम से चलने के लिए पर्याप्त वैक्यूम पर स्विच करते हैं।
    9. 10 एमएम ट्रिस के 2 x 2 एमएल के साथ सेफरोज मोतियों वाले कॉलम को धोएं। राल को सूखने से रोकने के लिए ट्राइस बफर के माध्यम से चलने से ठीक पहले वैक्यूम बंद करें। रन ऑफ को छोड़ दिया जा सकता है।
      नोट: यदि राल का उपयोग पहले किया गया है, तो 4 एम एनएसीएल के 5 राल वॉल्यूम में धोने और फिर चरण 2.4.9 से पहले 10 एमएमएम ट्रिज़ के 5 राल की मात्रा को बढ़ाकर पुनर्जीवित करें।
  5. लोडिंग, धुलाई और eluting
    1. सभी नमूने को शुद्ध करने के लिए स्थानांतरित करें (सेक्शन 3 देखें) को पहली स्थिति में क्यू सेफरोज कॉलम में, वैक्यूम पंप पर स्विच करने से पहले लगभग ~ 2 मिनट के लिए नमूना और मोतियों को हिलाने के लिए एक छोटे प्लास्टिक लूप का उपयोग करें।
      नोट: अतिरिक्त सुपरनिटेंट (>12 एमएल) के मामलों में, कॉलम को ओवरफिलिंग करने से सावधान रहें। नमूना के माध्यम से चलाने के लिए तो और अधिक जोड़ने के लिए, दे फिर से चलाने से पहले मिश्रण ।
    2. बाद में विश्लेषण के लिए प्रवाह को स्टोर/फ्रीज करें ।
    3. वैक्यूम में एक और खुला संग्रह प्लेट कई गुना रखें और फिर प्रत्येक सेफरोज कॉलम को 10 एमएम ट्रिस और स्टोर के 2 x 2 एमएल के साथ धोएं।
    4. एक 96 अच्छी तरह से संग्रह प्लेट डालें, सुनिश्चित करें कि A1 शीर्ष बाएं कोने में है।
    5. पहले एल्यूशन अंश को इकट्ठा करने के लिए, अगले कॉलम से सिरिंज प्लंजर को हटा दें, क्यू सेफ्रॉज कॉलम को इस स्थिति में ले जाएं और सिरिंज प्लंजर को पिछली स्थिति में रखें। फिर क्यू सेफरोज कॉलम में पहले नमक एकाग्रता के 1 एमसीएल को पिपेट करें। पंप चालू करें और एल्यूशन इकट्ठा करें। मोतियों को सुखाने से बचने के लिए मोतियों के पास तरल रेखाओं के रूप में पंप बंद कर दें।
    6. अगले एल्यूशन अंश को इकट्ठा करने के लिए, अगले कॉलम से सिरिंज प्लंजर को हटा दें, क्यू सेफ्रॉज कॉलम को इस स्थिति में ले जाएं और सिरिंज प्लंजर को पिछली स्थिति में रखें।
    7. कॉलम में अगले नमक एकाग्रता के 1 एमएल जोड़ें और इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी सांद्रता का उपयोग नहीं किया गया हो और 24 अलग-अलग कुओं में 24 एल्यूशन एकत्र किए गए हों। जांच कोई तरल किसी भी पड़ोसी कुओं में प्रवेश किया है ।
    8. 4 एम एनएसीएल 10 एमएमएल ट्रिस के 2 एमसीएल के साथ कॉलम धोएं। इस के माध्यम से चलाने के लिए करते हैं ।
    9. 20% इथेनॉल के 2 मिलील के साथ धोएं। इथेनॉल को तब तक चलने दें जब तक कि यह भंडारण के लिए मोतियों और सील कॉलम के ठीक ऊपर न हो जाए।
    10. स्टोर 96 अच्छी तरह से संग्रह प्लेट और यूवी स्पेक्ट्रोस्कोपी और एसडीएस पेज द्वारा विश्लेषण करें।

3. आयन एक्सचेंज - 24 विभिन्न प्रोटीन के एक साथ शुद्धिकरण

नोट: बफ़र्स बनाने, नमक सांद्रता की एक श्रृंखला और नमूने तैयार करने पर विवरण के लिए कदम 2.1-2.3 देखें

  1. शुद्धिकरण सेटअप की तैयारी
    नोट: शुद्धिकरण प्रणाली कैसे स्थापित की जाती है, यह इस बात पर बहुत अधिक निर्भर करता है कि कितने प्रोटीन शुद्ध किए जा रहे हैं और कितने नमक की स्थिति का उपयोग किया जाएगा । एक साथ अधिकतम 24 नमूनों तक 12 नमूनों को शुद्ध करने के लिए, एल्यूट करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक नमक एकाग्रता के लिए एक संग्रह प्लेट की आवश्यकता होती है। 12 से कम नमूनों के लिए, संग्रह प्लेटों को बदलने से पहले क्रोमेटोग्राफी कॉलम को एक ही एमसीपीए के भीतर कुछ पदों पर स्थानांतरित करना संभव है। इस मामले में, कॉलम को खाली कॉलम में रखने की आवश्यकता नहीं है और उन्हें सीधे एमसीपीए सीलिंग मैट से जोड़ा जा सकता है। नीचे दिए गए प्रोटोकॉल 24 एक साथ आयन विनिमय शुद्धि के लिए है।
    1. इकट्ठे MCPA सीधे वैक्यूम के शीर्ष पर फिल्टर के साथ 24 खाली स्तंभों से जुड़े रखें कि एक खुला संग्रह प्लेट शामिल है और तैयार करने और ऊपर एक शुद्धिकरण विधि में के रूप में 24 आयन विनिमय कॉलम धोने । इस शुद्धि के लिए, कॉलम में तेजी से पिपेट करने के लिए एप्पेंडोर्फ रिपीटर या सिरिंज का उपयोग करना सुविधाजनक है।
  2. लोडिंग, धुलाई और eluting
    1. एमसीपीए (धुले हुए शुद्धिकरण स्तंभों के साथ) को फिट करने से पहले वैक्यूम के आधार में 48-अच्छी तरह से संग्रह प्लेट रखें। सुनिश्चित करें A1 शीर्ष बाएं कोने में है ।
    2. प्रत्येक प्रोटीन नमूना (एक समय में 5 एमएल तक) को उनके संबंधित कॉलम में पिपेट करें। लगभग 2 मिनट के लिए एक पतली प्लास्टिक लूप (प्रदूषण से बचने के लिए हर कॉलम के लिए एक लूप) का उपयोग करके प्रत्येक कॉलम को हिलाएं। फिर वैक्यूम पंप पर स्विच करें और सुपरनेट को प्रवाहित होने दें।
      नोट: अतिरिक्त सुपरनेट के मामलों में, स्तंभों को ओवरफिलिंग करने से सावधान रहें। नमूना अपने कॉलम के माध्यम से चलाने के लिए तो और अधिक जोड़ने के लिए, दे फिर से चलाने से पहले मिश्रण ।
    3. स्टोर/बाद में विश्लेषण के लिए ४८-अच्छी तरह से संग्रह प्लेट फ्रीज के रूप में यह हर प्रोटीन के लिए प्रवाह शामिल हैं ।
    4. वैक्यूम में एक और 48-अच्छी तरह से संग्रह प्लेट कई गुना रखें और फिर प्रत्येक सेफरोज कॉलम को 10 एमएल ट्रिज़ के 2 x 2 एमएल के साथ धोएं।
    5. पहले 96-अच्छी तरह से संग्रह प्लेट को कई गुना में डालें, यह सुनिश्चित करते हुए कि A1 शीर्ष बाएं कोने में है और फिर प्रत्येक कॉलम में पहले नमक एकाग्रता के 1 एमएल को पिपेट करें और फिर कॉलम के माध्यम से इसे चलाने के लिए वैक्यूम पंप चालू करें। संग्रह प्लेट निकालें, पैराफिल्म के साथ कवर करें और विश्लेषण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    6. प्रत्येक क्रमिक नमक एकाग्रता के लिए दोहराने कदम elute करने के लिए इस्तेमाल किया। सुनिश्चित करें कि हर एल्यूशन के लिए एक नई संग्रह प्लेट का उपयोग किया जाता है और प्रत्येक संग्रह प्लेट को लेबल और संग्रहीत किया जाता है।
    7. प्रत्येक कॉलम को 10 एमएल ट्रिस, 4 एम एनएसीएल के 2 एमसीएल से धोएं।
    8. प्रत्येक कॉलम को 20% इथेनॉल के 2 मिलील के साथ धोएं। इथेनॉल को तब तक चलने दें जब तक कि यह भंडारण के लिए मोतियों और सील कॉलम के ठीक ऊपर न हो जाए।
    9. स्टोर 96 अच्छी तरह से संग्रह प्लेटें और यूवी स्पेक्ट्रोस्कोपी और एसडीएस-पेज द्वारा विश्लेषण करें।

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Representative Results

एक उदाहरण के रूप में, एमसीपीए ने नी-एनटीए(चित्रा 2A)के माध्यम से 14 AbpSH3 म्यूटेंट को सफलतापूर्वक शुद्ध किया है। एक छोटा सा संदूषक ~ 25 केडीए देखा जा सकता है, हालांकि प्रोटीन अभी भी काफी हद तक शुद्ध है। इस संदूषक को योडा माना जाता है, जो ई कोलाई11में पाया जाने वाला एक आम सह-शुद्ध प्रोटीनहै । चित्रा 2B देशी परिस्थितियों में 11 अलग-अलग एसएच 3 डोमेन की शुद्धि दिखाता है। डेन्चरिंग स्थितियों में देखे गए छोटे संदूषक को देशी परिस्थितियों में हटा दिया जाता है। इससे पता चलता है कि एमसीपीए का उपयोग टेबल 1 में सूचीबद्ध देशी या डेन्चरिंग बफ़र्स से बने शुद्धिकरण की तुलना के लिए किया जा सकता है। 

आईईएक्स एमसीपीए के माध्यम से एक lysate के शुद्धिकरण के लिए प्रतिनिधि डेटा चित्र 3में दिखाया गया है । इससे पता चलता है कि एबीपीएच3 को अधिकांश संदूषकों से अलग किया जा सकता है क्योंकि यह बाद में 425 m m से 700 mM के बीच है। स्तंभ से प्रोटीन को स्पष्ट करने के लिए आवश्यक नमक की एकाग्रता प्रोटीन और राल के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन की ताकत से संबंधित है। अधिकांश बैक्टीरियल प्रोटीन में कम पीआई होता है; हालांकि ब्याज का प्रोटीन बहुत नकारात्मक है और कम पीआई प्रतीत होता है। काफी शुद्ध AbpSH3 प्रोटीन की अच्छी पैदावार कुछ विभिन्न उच्च आणविक वजन प्रदूषक AbpSH3 ~ 5 केडीए पर बैंड के रूप में देखा के साथ बरामद किया गया । इसलिए एमसीपीए के माध्यम से आईईएक्स को शुद्धिकरण प्रोटोकॉल में पहले कदम के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है क्योंकि यह वर्तमान संदूषकों से पर्याप्त मात्रा में प्रोटीन को अलग कर सकता है।

MCPA का उपयोग कर IEX द्वारा आगे शुद्धि सफलतापूर्वक एक नी-एनटीए MCPA रन(चित्रा 4)से eluted अंशों पर प्रदर्शन किया गया है । उल्लेखनीय है कि दो मुख्य चोटियों को 400 और 700 एमएम नमक पर मैक्सिमा के साथ हल किया गया है, जो इस प्रोटीन के एन-टर्मिनल कटेटेड संस्करण को अलग करने के अनुरूप हो सकता है। आगे डीएसएफ डेटा विश्लेषण के माध्यम से यह स्पष्ट किया गया था कि पीक 1 थोड़ा कम स्थिर था और पीक 2 के सापेक्ष थोड़ा कम टीएम था। lysate के आईईएक्स रन की तुलना में, कुल मिलाकर अंश बहुत क्लीनर हैं और आईईएक्स से पहले नी-एनटीए कदम चलाने का लाभ दिखाते हैं। हालांकि वहां एक उच्च आणविक वजन के प्रोटीन के साथ मामूली संदूषण है, अंश अभी भी काफी हद तक शुद्ध है और अच्छा जैव भौतिक डेटा एनएमआर और थर्मल/रासायनिक denaturation परख का उपयोग कर मिले हैं ।

Figure 1
चित्रा 1:MCPA साधन का एक सामने दृश्य । 24कॉलम संलग्न के साथ एमसीपीए इंस्ट्रूमेंट का फ्रंट व्यू । कॉलम को 96, 48 या खुले संग्रह प्लेट में एल्यूशन का मार्गदर्शन करने के लिए 96 अच्छी तरह से सीलिंग चटाई के भीतर समान रूप से बाहर निकाला जाता है। (ख)सीलिंग मैट का टॉप व्यू।(C)एक ही सीलिंग मैट का बॉटम व्यू ।(D)कॉलम और सिरिंज प्लंजर के साथ एमसीपीए का फ्रंट व्यू । इस आंकड़े को डोमिंगुएज़ एट अल10से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:1 x 24 कॉलम विन्यास का एक उदाहरण, डेन्चरिंग और देशी परिस्थितियों में विभिन्न एसएच 3 म्यूटेंट का शुद्धिकरण। (क)विभिन्न एबीपीएच3 म्यूटेंट की शुद्धि । प्रत्येक लेन में ~ 25 केडीए का एक मामूली संदूषण देखा जा सकता है। (ख)11 अलग खमीर SH3 डोमेन के देशी शुद्धि । संदूषकों को प्रत्येक लेन से हटा दिया गया है और अब जेल पर दिखाई नहीं दे रहा है। इस आंकड़े को संशोधित किया गया है डोमिंगुएज़ एट अल10। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:MCPA के माध्यम से आईईएक्स का उपयोग करके lysate का शुद्धिकरण। (A)आयन-एक्सचेंज (आईईएक्स) से सभी एल्यूशन्स की अवशोषक रीडिंग को एलविस प्लेट (बीएमजी) द्वारा मापा गया था । रीडिंग को एल्यूशन की इसी एनएसीएल एकाग्रता के खिलाफ साजिश रची जाती है। सबसे ज्यादा प्रोटीन कंसंट्रेशन वाली चोटी 700 एमएमएल एनएसीएल में देखी जाती है। (ख)आईईएक्स सॉल्ट एल्यूशन्स का एसडीएस-पेज एनालिसिस(ए)में प्रस्तुत किया गया । आणविक वजन मार्कर जेल के बाईं ओर दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:MCPA प्रणाली के माध्यम से IEX का उपयोग कर VJM2 पूल (पोस्ट नी-एनटीए) का शुद्धिकरण ।

(A)आयन-एक्सचेंज (आईईएक्स) से एकत्र किए गए एल्यूशन की अवशोषण रीडिंग नैनोड्रॉप का उपयोग करके मापी गई थी । रीडिंग को एल्यूशन की इसी एनएसीएल एकाग्रता के खिलाफ साजिश रची जाती है। (ख)आईईएक्स सॉल्ट एल्यूशन्स का एसडीएस-पेज एनालिसिस(ए)में प्रस्तुत किया गया । आणविक वजन मार्कर जेल के बाईं ओर दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

डेनेचरिंग बफर कंपोजीशन देशी बफर कंपोजीशन
लाइसिस बफर 10 एमएमएनएएच 2पीओ4,10 एमएम ट्रिस, 6 एम गुहसीएल, 10 एमएम इमिडाजोल, पीएच 8.0 20 एमएम ट्रिस, 300 एमएमएम एनएसीएल, 10 एमएम इमिडाजोल, पीएच 8.0
बफर धोएं 10 एमएमएनएएच 2पीओ4,10 एमएम ट्रिस, 6 एम गुहसीएल, 20 एमएम इमिडाजोल, पीएच 8.0 20 एमएमएम ट्रिस, 300 एमएमएम एनएसीएल, 20 एमएम इमिडाजोल, पीएच 8.0
एल्यूशन बफर 10 m NaH2पीओ,10 mM Tris, 6 M GuHCl, 0.2 मीटर एसीटिक एसिड, पीएच 3.0 20 एमएमएम ट्रिस, 300 एमएमएम एनएसीएल, 250 एमएम इमिडाजोल, पीएच 8.0
बफर कंपोजीशन
उच्च नमक 5 एमएम ट्रिस एसिड, 5 एमएम ट्रिस बेस, पीएच 8.1, 4 एम एनएसीएल
कम नमक 5 एमएम ट्रिस एसिड, 5 एमएम ट्रिस बेस, पीएच 8.1

तालिका 1: बफ़र्स, नी-एनटीए डेन्चरिंग और देशी शुद्धिकरण और आयन एक्सचेंज कम और उच्च नमक बफ़र्स की संरचना।

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Discussion

विधि अपेक्षाकृत अनुभवहीन प्रोटीन बायोकेमिस्टों के लिए उपयोग करने के लिए मजबूत और सरल है, हालांकि ध्यान में रखने के लिए कुछ विचार हैं।

ओवरफिलिंग कलेक्शन प्लेट्स के बारे में सावधानी

48-अच्छी तरह से संग्रह प्लेट में केवल 5 एमएल प्रति अच्छी तरह से रखती है जबकि प्रत्येक 96-अच्छी तरह से केवल 2 एमएल रखती है। कॉलम के माध्यम से बफर और रनिंग सैंपल जोड़ते समय इस बात को ध्यान में रखने की जरूरत है क्योंकि कुओं को ओवरफिलिंग करने का खतरा है । विशेष रूप से, शुद्धिकरण के लिए क्रोमेटोग्राफी कॉलम में बड़े नमूनों को स्थानांतरित करते समय देखभाल की आवश्यकता होती है। ऐसे मामलों में जहां अतिरिक्त सुपरनिटेंट होता है, भागों में विभाजित होता है, कॉलम को भरने के लिए पर्याप्त होता है, जिसे किसी भी ओवरफिल और नमूने के नुकसान को रोकने के लिए अगले भाग को जोड़ने से पहले चलाने की अनुमति दी जानी चाहिए। सुपरनैंट के प्रत्येक अतिरिक्त के बाद, कॉलम को पंप चालू करने से पहले मोतियों के लिए प्रोटीन बाध्यकारी होने की संभावना को बढ़ाने के लिए एक छोटे प्लास्टिक लूप के साथ मिलाया जाना चाहिए। प्लेट के अभिविन्यास और इसलिए कुओं की सामग्री का ट्रैक रखने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि शुद्धिकरण शुरू करने से पहले लेबल किया गया कोने 'A1' हमेशा प्लेट के शीर्ष बाएं कोने पर होता है।

एल्यूटिंग प्रोटीन

आईईएक्स और आत्मीयता चरण में एल्यूटिंग करते समय, वैक्यूम का उपयोग कॉलम के माध्यम से एल्यूशन बफर को खींचने के लिए सबसे कम सेटिंग पर किया जाता है। यह गुरुत्वाकर्षण की तुलना में प्रवाह दर को गति देता है, हालांकि यदि प्रोटीन एकाग्रता अधिक है, तो यह प्रोटीन समाधान को झाग और संभावित रूप से विकृत कर सकता है। यदि यह मामला है, तो एक विकल्प कॉलम के माध्यम से बफर को पुश करने के लिए खुले कॉलम के शीर्ष पर एक सिरिंज प्लंजर का उपयोग करना है। इस मामले में, सिरिंज प्लंजर धीरे (जबरदस्ती नहीं) कॉलम में नीचे धकेल दिया जाना चाहिए के माध्यम से और नीचे संग्रह प्लेट में तरल धक्का । मैकपा पर शेष किसी भी एल्यूशन बूंदें पड़ोसी कुओं में फैल नहीं है, संदूषण के कारण सुनिश्चित करने के लिए संग्रह प्लेट को हटाने के लिए देखभाल की जानी चाहिए।

राल और स्तंभों का रखरखाव

इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम नी रेजिन और कॉलम का पुनर्जनन है। कॉलम को शुद्धिकरण प्रोटोकॉल के शुरू या अंत में पुनर्जीवित किया जाना चाहिए। यदि अंत में पुनर्जनन होता है, तो राल को 4 डिग्री सेल्सियस पर 20% इथेनॉल में संग्रहीत किया जाना चाहिए। क्रोमेटोग्राफी कॉलम फिल्टर "अवरुद्ध" हो सकते हैं जिससे नमूना कॉलम के माध्यम से बहुत धीमी दर पर प्रवाहित हो सकता है। यदि यह मामला है, तो कॉलम को प्रतिस्थापित करने या फिल्टर हटाने और रात भर बफर में भिगोने और पानी के साथ कुल्ला करके साफ करने की आवश्यकता है।

जैसा कि चरण 3 के तहत प्रदर्शित किया गया है, एमसीपीए उपकरण की विविधता का एक नमूने के रूप में प्रभावी रूप से कई प्रोटीन के शुद्धिकरण के लिए शोषण किया जा सकता है। आयन विनिमय प्रोटोकॉल प्रयोग की जरूरतों के अनुरूप किया जा सकता है, विभिन्न नमूनों की संख्या और नमक सांद्रता की संख्या के अनुकूल इस्तेमाल किया जा रहा है । उदाहरण के लिए, यदि 12 से कम नमूने एक साथ शुद्ध कर रहे हैं, यह एक ही थाली के भीतर प्रत्येक योग के बाद कॉलम ले जाने का कोई संयोजन शामिल होगा और/या प्रत्येक योग के लिए संग्रह प्लेटों गमागमन । यदि उदाहरण के लिए, केवल 4 प्रोटीन समानांतर में शुद्ध किया जा रहा था, कॉलम प्लेटों को बदलने से पहले 4 नमक सांद्रता तक के elutions इकट्ठा करने के लिए एक संग्रह प्लेट भर में ले जाया जा सकता है । एमसीपीए विभिन्न रेजिन - एफ़िनिटी और आयन एक्सचेंज का उपयोग करके शुद्धि करने में सक्षम है, लेकिन हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन क्रोमेटोग्राफी भी संभव है और इम्यूनोएफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी12की और अधिक संभावना है। यद्यपि इस विधि ने कई छोटे पैमाने पर शुद्धिकरण पर ध्यान केंद्रित किया है, लेकिन मैकपीए का उपयोग नमूना पंप या महंगे एफपीएलसी की आवश्यकता के बिना, बैक्टीरियल संस्कृति के कई लीटर से शुद्धिकरण के लिए सिर्फ एक बड़े क्रोमेटोग्राफी कॉलम के लिए किया जा सकता है।

चर्चा के रूप में उच्च थ्रूपुट आयन विनिमय के लिए MCPA का उपयोग करने के लिए कई, 24 तक, अलग संग्रह प्लेटों की आवश्यकता होगी । यह अव्यावहारिक हो सकता है और एक मानक प्रयोगशाला बेंच शीर्ष पर अंतरिक्ष की एक बहुत आवश्यकता है और मानव त्रुटि का खतरा बढ़ गया । इसके अलावा, 24 विभिन्न नमूनों से elutions के प्रोटीन अवशोषण को मापने चुनौतीपूर्ण हो सकता है । इस स्थिति में एक बहु चैनल पिपेट फायदेमंद होगा और कई नमूनों के हस्तांतरण को जल्दी और आसान बना देगा। छोटे संस्करणों के लिए, 16 माइक्रोड्रॉप युक्त एलविस प्लेट (बीएमजी) का उपयोग करने पर विचार करें क्योंकि यह सीधे सांद्रता के माप को सक्षम बनाता है, बिना किसी अन्य अभिकर् तेकार का उपयोग करने की आवश्यकता के बिना जैसे ब्रैडफोर्ड परख अभिकर् ता।

जबकि एक वैक्यूम पंप का उपयोग राल की अखंडता से समझौता किए बिना, सिर्फ गुरुत्वाकर्षण10का उपयोग करके प्राप्त की तुलना में 3x तेज शुद्धिकरण गति के लिए अनुमति देता है, यह कुछ अन्य मुद्दों को बनाता है। शुद्धिकरण के दौरान वैक्यूम की ताकत को बनाए रखने, उदाहरण के लिए, सभी स्तंभों को 10 एमएल सिरिंज प्लंजर के साथ अवरुद्ध करने की आवश्यकता होती है जिसे राल से भरे कॉलम को डालने से पहले बाहर ले जाने की आवश्यकता होती है। एक-एक करके प्लंपर्स को बाहर ले जाना भी एक समय पर प्रक्रिया है और वैक्यूम का प्रतिरोध उन्हें कॉलम से हटाने में मुश्किल बना सकता है।

एमसीपीए का उपयोग करके एक बहु प्रोटीन आईईएक्स शुद्धिकरण का विवरण प्रोटोकॉल में दिया जाता है। यह उच्च-थ्रूपुट विधि समय कुशल और नियंत्रणीय है, प्रत्येक शुद्धि के लिए सभी मापदंडों को उपयोगकर्ता द्वारा हेरफेर किया जा सकता है। हालांकि, उद्योग सहित अधिकांश प्रोटीन बायोकेमिस्ट्री प्रयोगशालाओं में, फास्ट प्रोटीन लिक्विड क्रोमेटोग्राफी प्रोटीन शुद्धिकरण की पसंदीदा विधि है, जो थ्रूपुट, प्रजनन क्षमता और विधि हस्तांतरण और मजबूती के मामले में बेहतर है। प्रोटीन बायोसॉल्यूशंस द्वारा प्रोटीन मेकर और एकेटीए एफपीएलसी बायोमॉल्यूल शुद्धिकरण प्रणाली जैसे ये सिस्टम बड़ी सफलता के साथ शुद्धि अड़चन समस्या को कम कर सकते हैं। इन प्रणालियों के बेहतर परिणाम प्राप्त करने के बावजूद, जुदाई हम MCPA प्रणाली का उपयोग कर देख अभी भी काफी अच्छा उच्च शुद्धता प्रोटीन प्राप्त करने के लिए है । दिलचस्प बात यह है कि हमारी प्रयोगशाला आयन एक्सचेंज क्रोमेटोग्राफी करने के लिए एकेटीए स्टार्ट एफपीएलसी का भी उपयोग करती है और हालांकि संकल्प इस मशीन के साथ सक्षम रैखिक ढाल के साथ अधिक हो सकता है, यह विशेष रूप से कई नमूनों को चलाने के लिए अधिक समय लेने वाला है और इस प्रणाली पर अनुभवहीन छात्रों को प्रशिक्षित करना बहुत अधिक चुनौतीपूर्ण है।

अन्य काफी सस्ता प्लेट आधारित शुद्धिकरण विकल्प मौजूद हैं। उदाहरण के लिए, जीई हेल्थकेयर लाइफ साइंसेज (अब साइटिवा) और सिग्मा एल्ड्रिच विशिष्ट शुद्धिकरण रेजिन के साथ प्री-पैकेज्ड 96 अच्छी तरह से फिल्टर प्लेट और कारतूस बेचते हैं। ये फिल्टर प्लेटें छोटे पैमाने पर उच्च-थ्रूपुट शुद्धिकरण प्रदान करते हैं लेकिन केवल माइक्रोग्राम यील्ड रेंज में शुद्ध होते हैं। इसके अलावा, QIAGEN से QIAvac 24 प्लस वैक्यूम के तहत स्पिन कॉलम का उपयोग करता है, हालांकि, यह प्रवाह के माध्यम से या धोता इकट्ठा करने के लिए व्यावहारिक नहीं है।

MCPA के लचीले डिजाइन समानांतर प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए अनुमति देता है, हालांकि मैन्युअल रूप से एमसीपीए विधि का उपयोग कर कॉलम और प्लेटें चलती संभावित मानक FPLC सिस्टम की तुलना में मानव त्रुटियों को बढ़ाता है । हालांकि, मैन्युअल रूप से नमूनों को कॉलम पर लोड करना मानक एफपीएलसी का उपयोग करके स्तंभों पर नमूने लोड करने की तुलना में अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं के लिए अधिक विश्वसनीय है, जहां गलतियों को अधिक आसानी से बनाया जा सकता है क्योंकि इसमें वाल्व और पंपों को स्विच करना शामिल है जिन्हें अधिक व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। यह स्पष्ट है कि प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए पूरी तरह से स्वचालित प्रणालियां उद्योग और अकादमिक प्रयोगशालाओं में शुद्धिकरण समूहों के लिए एमसीपीए की तुलना में बेहतर अनुकूल हैं जो नियमित रूप से शुद्धिकरण पर काम करते हैं। हालांकि, छोटी प्रयोगशालाओं के लिए जो महंगे उपकरण और रखरखाव का खर्च नहीं उठा सकते हैं और व्यापक प्रशिक्षण से बचना चाहते हैं या केवल कभी-कभार प्रोटीन शुद्धिकरण पर काम करते हैं, एमसीपीए एक प्रभावी वैकल्पिक प्रणाली प्रदान करता है जो अभी भी अच्छा अलगाव प्राप्त करता है और सस्ता और स्थापित करना आसान है ।

एमसीपीए में सरल और सस्ती इंस्ट्रूमेंटेशन होते हैं जो प्रोटीन की मिलीग्राम मात्रा का उत्पादन करने के लिए एक साथ समानांतर शुद्धिकरण के लिए कई स्तंभों को इंटरफेस करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, यह तकनीक व्यक्तिगत स्तंभों की मॉड्यूलरता को थ्रूपुट को बढ़ाने की अनुमति देती है। यह इस विधि के लिए अद्वितीय है और वर्तमान प्लेट आधारित शुद्धिकरण किट का उपयोग करके प्राप्त नहीं किया जा सकता है।

प्रोटीन शुद्धिकरण प्रोटीन के अध्ययन और लक्षण वर्णन और चिकित्सा के विकास में आवश्यक रहेगा। एनएमआर और प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी जैसी जैव भौतिक तकनीकें शुद्ध प्रोटीन की मिलीग्राम मात्रा पर निर्भर करती हैं, इसलिए वर्तमान अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण प्रणालियों कोइस2,13,14को प्राप्त करने की लागत और समय में सुधार करने के लिए और विकास की आवश्यकता है। जैसा कि चर्चा की गई है, स्वचालित शुद्धिकरण प्रणालियों के संयुक्त राष्ट्र-स्वचालित तरीकों पर कई फायदे हैं, लेकिन वे महंगे इंस्ट्रूमेंटेशन और प्रशिक्षण की आवश्यकता वाले छोटे पैमाने की प्रयोगशालाओं के लिए बहुत महंगे रहते हैं। MCPA 4510डॉलर की शुरुआती लागत के साथ काफी सस्ता है. इसके अतिरिक्त, इस MCPA व्यापक प्रशिक्षण या निरंतर रखरखाव की जरूरत नहीं है और किसी भी समस्याओं को पैदा करना चाहिए इन आसानी से हल किया जा सकता है । नी-एनटीए के लिए उपयोग किए जाने वाले डेनैचिंग बफ़र्स जैसे संक्षारक बफ़र्स शुद्धिकरण प्रणालियों को खराब कर सकते हैं यदि उन्हें ठीक से साफ नहीं किया जाता है। हालांकि, एमसीपीए का लचीला डिजाइन यदि आवश्यक हो तो डिब्बों की त्वरित सफाई, मरम्मत और परिवर्तन के लिए अनुमति देता है। अंत में, एमसीपीए छोटी प्रयोगशालाओं के लिए प्रभावी, उच्च-थ्रूपुट प्रोटीन शुद्धिकरण की सुविधा प्रदान करेगा जब तक कि अधिक किफायती स्वचालित सिस्टम10 स्थापितनहीं हो जाते।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस प्रकाशन में सूचित शोध को अनुदान संख्या P20GM103451 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान से एक संस्थागत विकास पुरस्कार (IDeA) द्वारा समर्थित किया गया था और लिवरपूल विश्वविद्यालय से एक आंतरिक अनुसंधान अनुदान ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL/ well collection plate Agilent technologies 201240-100
5 mL/ well collection plate Agilent technologies 201238-100
12 mL chromatography columns Bio-Rad 7311550
96 well long drip plate Agilent technologies 200919-100 Come with 0.25 um filters which are to be removed.
96 well plate seal/mat Agilent technologies 201158-100 Should be peirceable
His60 Ni Superflow Resin Takara Bio 635660
HiTrap Q HP anion exchange column GE Healthcare (Cytiva) 17115301
Lvis plate reader BMG LABTECH Compatible with FLUOstar Omega plate reader
Male leur plugs Cole-Parmer EW-45503-70
PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit Sigma-Aldrich 575650-U
Reservoir collection plate Agilent technologies 201244-100
The Repeater Plus Eppendorf 2226020 With 5 mL and 50 mL syringes
VACUSAFE vacuum INTEGRA 158 320 The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle

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References

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बायोकेमिस्ट्री अंक 171 उच्च थ्रूपुट शुद्धिकरण एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी आयन एक्सचेंज क्रोमेटोग्राफी एमसीपीए किफायती प्रोटीन शुद्धि एसएच 3 डोमेन
मल्टी-कॉलम प्लेट एडाप्टर का उपयोग करके एक किफायती और बहुमुखी उच्च-थ्रूपुट प्रोटीन शुद्धिकरण प्रणाली
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Kineavy, F. B., Davies, A. A.,… More

Kineavy, F. B., Davies, A. A., Mitchell, M. R., Lay, D., Dominguez, M. J., Stollar, E. J. An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter. J. Vis. Exp. (171), e62075, doi:10.3791/62075 (2021).

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