Summary
מאמר זה מפרט שיטות הממחישות שלוש טכניקות נפוצות של קצירת ביופילם ופירוק חומרים על שני סוגי משטחים, בדיקות מחוספסות של שיטת קציר ומידע מינימלי שיש לקחת בחשבון בעת בחירה ואופטימיזציה של טכניקות קצירה ופירוק כדי להגביר את הרבייה.
Abstract
שיטות הביופילם מורכבות מארבעה שלבים נפרדים: גידול הביופילם במודל רלוונטי, טיפול בביופילם הבוגר, קצירת הביופילם מפני השטח ופירוק הגושים וניתוח המדגם. מבין ארבעת השלבים, קצירה ופירוק הם הפחות נחקרים אך בכל זאת קריטיים כאשר בוחנים את הפוטנציאל להטיית מבחן. מאמר זה מדגים טכניקות קציר ופירוק נפוץ עבור biofilm גדל על שלושה משטחים שונים. שלוש טכניקות קצירת הביופילם והפירוק, שלקטו מסקירת ספרות נרחבת, כוללות מערבולת ו sonication, גירוד והומוגניזציה, ושפשוף, מערבולת ו sonication. שני סוגי משטח נחשבים: קשה לא נקבובי (פוליקרבונט וזכוכית borosilicate) ונקבובי (סיליקון). בנוסף, אנו מספקים המלצות למידע המינימלי שיש לכלול בעת דיווח על טכניקת הקציר ואחריה ושיטה נלווית לבדיקת הטיה.
Introduction
ההגדרה של ביופילם התפתחה בעשורים האחרונים וכוללת קשר מיקרוביאלי עם מגוון משטחים ביולוגיים ו/או לא ביולוגיים, הכללת רכיבים נוצרליים1 המציגים צמיחה שונה וביטוי גנטי2 בתוך מטריצה. Biofilm מספק הגנה מפני לחצים סביבתיים כגון ייבוש ועשוי להפוך את הפעולה של חומרי חיטוי כימיים פחות יעיל וכתוצאה מכך ההישרדות של חיידקים. הניצולים בתוך ביופילם יכולים לספק מקור למיקרואורגניזמים פתוגניים המהווים דאגה לבריאות הציבור3.
שיטות הביופילם מורכבות מארבעה שלבים, צמיחה, טיפול, דגימה (קצירה ופירוק) וניתוח. צמיחה, הצעד הראשון, שבו המשתמש קובע את תנאי הצמיחה האורגניזם, טמפרטורה, מדיה, וכו ', הוא הנחשב ביותר ודווח על בספרות biofilm4,5,6,7. שלב הטיפול מעריך מיקרוביאלים (למשל, חומרי חיטוי) כדי לקבוע את יעילותם או נגד biofilm בוגר3,8,9 או מיקרוביאלית עשוי להיות משולב לתוך פני השטח כדי לקבוע את היכולת של המוצר למנוע או להפחית את הצמיחה biofilm10. השלב השלישי, דגימה, כולל צעדים לקצור את הביופילם מפני השטח שעליהם הוא גדל ולפרק את הגושים שהוסרו 3,8,11. השלב הרביעי, ניתוח, עשוי לכלול ספירת תאים בת קיימא, מיקרוסקופיה, מדידות פלואורסצנטיות, תוצאות מולקולריות ו/או הערכת רכיב מטריצה8,9. הערכת נתונים מספקת מידע על התוצאה של ניסוי. מבין הארבעה, דגימה היא לעתים קרובות הצעד המתעלמים ביותר מכיוון שהיא מניחה שטכניקת קצירת הביופילם ו/או הפירוק הנבחרת יעילה ב-100%, לעתים קרובות ללא אימות11.
השעיות פלנקטוניות של חיידקים, הנחשבות לעתים קרובות הומוגניות, דורשות מערבולת פשוטה לפני הניתוח. ביופילמים, לעומת זאת, הם קהילות מורכבות המורכבות ממיקרואורגניזמים (פרוקריוטים ו/או אואוקריוטים), אקסופוליסכרידים, חלבונים, שומנים, דנ"א חוץ-תאי ותאים מארחים12. צעדים מעבר לשיטות התרבות המיקרוביולוגיות הפלנקטוניות המסורתיות נדרשים על מנת לקצור כראוי ביופילם מפני השטח ולאחר מכן לפרק אותו לתוך השעיה הומוגנית של תא יחיד. סקירת ספרות מקיפה (מידע שאינו כלול בפרסום זה) הראתה כי הבחירה בטכניקת ההסרה וההתפרקות תלויה במספר גורמים, כולל מינים הנמצאים בביופילם, משטח שהביופילם מחובר אליו (לא נקבובי או נקבובי), נגישות למשטחי צמיחה (קופון נשלף בקלות או הרס פיזי של המנגנון שבו הביופילם גדל), גיאומטריה על פני השטח (שטח וצורה), צפיפות של ביופילם על משטחי צמיחה, וציוד מעבדה זמין.
כאשר ביופילם נקצר מפני השטח, ההשעיה התאית המתקבלת היא הטרוגנית. אם יש לספור במדויק את ההשעיה הלא-יוניפורמית הזו, יש לפרק אותה לתאים בודדים. ספירת לוחות קיימא מניחה שיחידת הרכבת מושבה מקורה בחיידק אחד. אם אגרגטים של ביופילם ממוקמים על מדיום הצמיחה, אי אפשר להבחין בין תאים בודדים אשר יכול להוביל להערכות לא מדויקות. לדוגמה, במהלך בדיקות יעילות חיטוי, אם טיפול מסיר biofilm ביעילות רבה מפני השטח לעומת הפקד, הפחתת יומן יכול להיראות גדול באופן מלאכותי לעומת הפקד. מצד שני, חומר חיטוי כימי שמתקן ביופילם על משטח בהשוואה לבקרה ייראה כבעל הפחתת יומן נמוכה יותר11. סוג זה של תרחיש יכול להוביל לפרשנות מוטה של נתונים ניסיוניים.
לקראת הפרסום, סקירה של הספרות קבעה כי גישות נפוצות לקטיף ופירוק ביופילם כוללות גירוד, ניקוי, sonication, מערבולת או שילוב של אלה. גירוד מוגדר כהסרה פיזית של ביופילם ממשטחים עם מקל סטרילי, מרית או כלי אחר. ניקוי מתייחס להסרת ביופילם ממשטחים עם מוט כותנה או חומר סופג קבוע אחר. Sonication מתייחס שיבוש של biofilm מפני משטחים באמצעות גלים קוליים מופצים דרך מים. מערבולת מתייחסת לשימוש במיקסר כדי להשיג מערבולת נוזלית של המדגם בתוך צינור. הומוגניזציה משתמשת בלהבים מסתובבים כדי להטות גושי ביופילם שנקטפו לתוך השעיה של תא יחיד. במאמר זה, אנו מציגים שלוש שיטות קציר ופירוק עבור שני סוגי משטח שונים, קשה / לא נקבובי ונקבובי.
רשימה של מידע מינימלי מומלץ שהחוקרים צריכים לכלול בסעיפי השיטות של הפרסומים מסופקת. אנו מקווים כי הכללת מידע זה תאפשר לחוקרים אחרים לשחזר את עבודתם. אין שיטת קציר ופירוק מושלמת, ולכן, המלצות כיצד לבדוק את הטכניקה מסופקים גם.
שלוש שיטות נפוצות לקצור ולפרק ביופילם ממשטחי גדילה נפוצים מודגמות במאמר זה. מידע זה יאפשר לחוקרים להבין טוב יותר את הדיוק וההטיה הכוללים של שיטת בדיקת ביופילם. השיטות המתוארות הן כדלקמן: (1) ביופילם פסאודומונס aeruginosa הגדל על קופונים פוליקרבונט (משטח קשה שאינו נקבובי) תחת גזירה נוזלית גבוהה בכור Biofilm CDC נקטף ומפוזר בעקבות שילוב של חמישה שלבים של מערבולת ו sonication כדי להשיג קציר ביופילם ופירוק (2) A P. aeruginosa ביופילם שגדל על קופונים זכוכית borosilicate (משטח קשה לא נקבובי) בכור זרימת טפטוף תחת גזירה נוזלית נמוכה נקטף ומנוטרל באמצעות גירוד והומוגניזציה (3) ביופילם קולי Escherichia גדל בצינורות סיליקון (משטח נקבובי) הוא נקצר ומפוזר באמצעות גירוד, ואחריו sonication ו מערבולת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מערבולת ו sonication
- לגדל ביופילם בוגר P. aeruginosa ATCC 15442 הגדל על פי תקן ASTM E25622.
- בסוף תקופת הצמיחה של 48 שעות, היכונו לטיפול בביופילם ובקופונים לדוגמה על פי תקן ASTM E28718
- הכנס באופן אספטי שומרי התזה משועבדים אוטומטית לצינורות חרוטיים סטריליים של 50 מ"ל באמצעות מלקחיים מעוקרים. חזור על הפעולה עבור כל הצינורות שיקבלו טיפול. צינורות עבור תלושי בקרה לא צריך מגן התזה.
- הסר באופן אספטי מוט שנבחר באקראי מכור הביופילם של המרכז לבקרת מחלות. לשטוף קופונים כדי להסיר תאים מחוברים באופן רופף על ידי טבילה עדינה של המוט לתוך 30 מ"ל של מים חוצצים סטריליים.
- החזק את המוט במקביל לחלק העליון של הספסל, מעל שפופרת חרוטית ריקה וסטרילית של 50 מ"ל ובאמצעות מפתח ברגים אלן מעוקר להבה, שחרר בורג מוגדר כדי להפיל קופון מצופה ביופילם לצינור. חזור על הפעולה עבור מספר הקופונים הרצוי. מוציאים את שומרי ההתזה ומניחים במיכל נפרד לעיקור.
- באמצעות פיפטה סרולוגית 5 מ"ל, לאט פיפטה 4 מ"ל של הטיפול או שליטה לתוך הצינורות, כך הנוזל זורם במורד החלק הפנימי של הקיר של הצינור.
- הקש בעדינות על החלק התחתון של הצינור, כך כל בועות אוויר מתחת לקופון נעקרו. אפשר 30 - 60 s בין כל תוספת.
- בסוף זמן המגע שצוין, פיפטה 36 מ"ל של מנטרל לתוך הצינורות באותו סדר שבו הטיפול (או הפקד) הוחל.
הערה: הנפח הסופי של טיפול משולב ומנטרל חשוב לקביעת צפיפות יומן ביופילם מדויקת. - מערבולת כל צינור על ההגדרה הגבוהה ביותר עבור 30 ± 5 s. ודא כי מערבולת מלאה מושגת.
הערה: יש לנקוט זהירות כאשר מערבולת קופונים כבדים כגון נירוסטה בבקבוקוני זכוכית שבו שבירה יכולה להתרחש. - קבע את המספר האופטימלי של צינורות לכל אמבטיה ומיקום בתוך מדף המבחנה לפני עיבוד דגימות בפועל. אם עיבוד דגימות מרובות, לאשר כי טמפרטורת המים באמבטיה sonicating הוא 21 ± 2 oC.
- מניחים צינורות במתלה צינור מושעה sonicator degassed כך מפלס המים באמבטיה שווה לרמת הנוזל בצינורות. Sonicate ב 45 kHz, 100% כוח ותפקוד רגיל עבור 30 ± 5 שניות. חזור על מערבולת ומחזורי sonication ולאחר מכן לסיים עם מערבולת סופית (5 מחזורים בסך הכל).
הערה: צינורות אלה עם biofilm שנקטפו ומפורקים הם דילול 100 או 0. - מדללים באופן סדרתי דגימה במים חוצצים. צלחת על אגר R2A בשיטת ציפוי מתאימה. דגירה ב 36 ± 2 oC עבור 24 שעות. ספור מושבות בהתאם לשיטת הציפוי שבה נעשה שימוש ורשום נתונים.
2. גירוד והומוגניזציה
- לגדול בוגר P. aeruginosa ATCC 15442 ביופילם על פי תקן ASTM E264713.
- הקימו את תחנת הדגימה כך שתכלול לוח דגימה, 95% אתנול בכוס, מבער אלכוהול, המוסטטים, כלי להסרת קופונים, כוסות עם מי דילול סטריליים וצינורות דילול לשטיפת הקופונים.
- כבה את המשאבה. הסר כיסוי ערוץ ולהשתמש בכלי להסרת קופונים סטריליים hemostats כדי להסיר את הקופון, נזהר לא להפריע biofilm.
- לשטוף את הקופון על ידי טבילה עדינה, עם תנועה נוזלית, ב 45 מ"ל של מי דילול סטריליים (הכלול צינור צנטריפוגה 50 מ"ל). מיד להפוך את התנועה כדי להסיר את הקופון.
- מניחים את הקופון לתוך המכילה 45 מל של מי דילול סטריליים. לגרד את משטח הקופון מכוסה biofilm בכיוון כלפי מטה עבור כ 15 s, באמצעות מרית סטרילית או מגרד. יש לשטוף את המרית או המגרדת על ידי ערבוב בכוס. חזור על תהליך גירוד ושטיפה 3-4 פעמים, הבטחת כיסוי מלא של משטח הקופון.
- לשטוף את הקופון על ידי החזקתו בזווית של 60° מעל הכוס הסטרילית וצינורות 1 מ"ל של מי דילול סטריליים על פני השטח של הקופון. יש לחזור על הפעולה במשך 5 שטיפה. הכרך הסופי בכוס הוא 50 מ"ל.
הערה: הנפח הסופי של טיפול משולב ומנטרל חשוב לקביעת צפיפות יומן ביופילם מדויקת. - החלף כל כיסוי ערוץ כמו הקופונים מוסרים.
- עבודה בארון בטיחות ביולוגית, הומוגניזציה מדגם biofilm שרוט. חברו גשושית הומוגניזר סטרילית להומוגניזר, הניחו את קצה הגשוש בנוזל, הפעילו את ההומוגניזר והגדילו את ה-20,500 סל"ד.
- הומוגניזציה המדגם עבור 30 s. תנמיך את האר-פי-אם ותכבה את ההומוגניזר.
- לחטא את הבדיקה בין דגימות ביופילם על ידי הומוגניזציה של 9 מ"ל של דילול סטרילי ריק ב 20,500 סל"ד עבור 30 s כמתואר לעיל. הומוגניזציה צינור 9 מ"ל של 70% אתנול עבור 30 s, לנתק את הגשוש ולתת לעמוד בצינור האתנול במשך 1 דקות. הומוגניזציה שני כדורי דילול נוספים.
הערה: ניתן להשתמש בבדיקת הומוגניזר חד פעמית עבור כל דגימה. - לדלל באופן סדרתי את הדגימות במים חוצצים. צלחת על אגר R2A באמצעות שיטת הציפוי המתאימה. לוחות דגירה ב 36 ± 2oC עבור 24 שעות, לספור מושבות בהתאם לשיטת ציפוי בשימוש ולהקליט נתונים.
3. גירוד, מערבולת ו sonication
- לגדל Escherichia coli בוגר ATCC 53498 ביופילם בצנרת סיליקון10.
- הכינו חומרי דגימה: צינורות שטיפה, שפופרת צנטריפוגה סטרילית, צלחת פטרי סטרילית ריקה, המוסטאט נירוסטט נירוסטה מעוקר להבה ומספריים, טיימר וסרגל.
- עם המשאבה מושהית, השתמש 70% אתנול כדי לנקות את החלק החיצוני של הצינורות. מדוד 2 ס"מ מהסוף, הימנעות מהשטח המחובר למחבר, וסמן את הצינורות כדי לקבוע את מיקומי החיתוך.
- עם מספריים מעוקרים להבה, לחתוך את הצינורות על הסימן 2 ס"מ ומניחים את הקטע בצלחת פטרי סטרילית ריקה. נגב את הצינורות עם 70% אתנול וחבר מחדש את הקצה הדיסטלי לצינורות פסולת.
- יש לשטוף את מקטע הצינורות כדי להסיר תאים פלנקטוניים. עם מלקחיים מעוקרים להבה, יש לטבול בעדינות את מקטע הצינורות ב-20 מ"ל של מי דילול סטריליים ולאחר מכן להסיר מיד. מניחים את המקטע ב- 10 מ"ל של מנטרל.
- עם מלקחיים מעוקרים להבה, להחזיק את קטע הצינורות ולגרד עם מקל אפליקטור עץ סטרילי עד כל האזורים הפנימיים של הצינורות כבר גירד. מדי פעם לשטוף את המקל ב 10 מ"ל של מנטרל ולהניח את המקטע בחזרה לתוך צינור המדגם. קטע הצינורות המגרדים הוא דילול 100 או 0.
הערה: הנפח הסופי של טיפול משולב ומנטרל חשוב לקביעת צפיפות יומן ביופילם מדויקת. - מערבולת כל צינור על ההגדרה הגבוהה ביותר עבור 30 ± 5 s. מניחים את הצינור במתלה צינור מושעה sonicator כך מפלס המים באמבטיה שווה לרמת הנוזל בצינורות. Sonicate ב 45 kHz, 100% כוח ותפקוד רגיל במשך 30 ± 5 שניות. חזור על מערבולת ומחזורי sonication ולאחר מכן לסיים עם מערבולת סופית.
הערה: צינור זה עם הביופילם שנקטף ומפוזר הוא 100 דילול. - לדלל באופן סדרתי את הדגימות במים חוצצים. צלחת על טריפטי סויה אגר באמצעות שיטת הציפוי המתאימה.
- צלחות דגירה ב 36 ± 2 oC עבור 24 שעות. ספור מושבות בהתאם לשיטת הציפוי שבה נעשה שימוש, רשום נתונים וחשב את הממוצע האריתמטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אימות/אישור של שיטת קציר
מספר מחקרים שנערכו במעבדה שלנו בחנו את היכולת של מערבולת ו sonication לקצור ביעילות ביופילם גדל בכור biofilm (ASTM E2562)2 באמצעות שיטת צינור יחיד (ASTM E2871)8.
P. aeruginosa ATCC 15442 ביופילם גדל על פי ASTM E25622 על קופונים זכוכית borosilicate. לאחר 48 שעות, ארבעה קופונים הונחו לתוך בקבוקונים, "מטופלים" עם 4 מ"ל מים חצוצים סטריליים מ"ל ונוטרלו עם 36 מ"ל של 2x D / E מנטרל מרק. ההגדרה הראשונית sonication של 45 kHz, 10% כוח, הגדרת לטאטא, 30 ± 5 s שימש לקצור ולפרק את biofilm משלושה מתוך ארבעת הקופונים. עם השלמת מחזור המערבולת והסוניציה, כל קופון היה מוכתם בסגול קריסטל וצולם. איור 1 מדגים את כמות הביופילם שנותרה על שלושת הקופונים לאחר מערבולת ו sonication לעומת הפקד.
כדי לבדוק זאת עוד יותר, P. aeruginosa ATCC 15442 biofilm גדל כמתואר לעיל ושתי הגדרות sonication הושוו: 1) 45 kHz, 10% כוח, הגדרת לטאטא, 30 ± 5 שניות ו 2) 45 kHz, 100% כוח, הגדרה רגילה, 30 ± 5 שניות. קופון אחד מכל סט של השלושה היה מוכתם בכתם BacLight Live/Dead ותמונה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית (CM). שני הקופונים הנותרים מכל קבוצה היו מדוללים, מצופים ונספרים עבור תאים בני קיימא. תוצאות ספירת הלוחות קיימא היו 9.230 Log10 CFU / קופון ± 0.007 (SD_R) עבור הגדרה 1 ו 9.272 Log10 CFU / קופון ± 0.066 (SD_R) עבור הגדרת sonication 2. נתונים אלה אימתו 2015 EPA אחד צינור שיטת מחקר שיתופי שבו 9.03 Log10 CFU / קופון ± 0.272 (SD_R) הושג9. על פי ספירת הלוחות המעשיים, נראה כי כל שלושת האמצעים דומים מספיק כדי לא להצדיק חקירה נוספת של ההבדלים בין שתי שיטות הקציר. עם זאת, התמונות המיקרוסקופיות המוצגות באיור 2 עשויות לרמוז שיותר ביופילם נשאר לאחר השימוש בהגדרה 1 מאשר הגדרה 2. בעוד אנו מבחינים כי biofilm שנותר על הקופונים נראה מת (אדום בצבע), פרשנות של הכדאיות בעת שימוש BacLight Live / Dead כתם קשה14,15. במקום להתמקד בהשלכות הכדאיות של הביופילם המוכתם, השתמשנו בכתם זה כדי לדמיין ביופילם שנותר על המשטחים. בנוסף, בעוד אנו מכירים כי sonication יכול להיות מזיק הכדאיות חיידקית, פרסום 2007 על ידי קוביאשי et al.16 הראה כי זמן sonication מוגבר מעבר 5 minues הביא ספירת לוחות קיימא ירד. מאז המחקר שלנו השתמש בסך הכל 1 דקה sonication, אנו בטוחים כי תאים מעטים נהרגו באמצעות sonication כפי שמוצג על ידי >9.2 LOG10 CFU / קופונים עבור שני הפרמטרים sonication. מעניין כי קציר מלא של biofilm מפני השטח לא הושג על ידי אף אחת מהשיטות. ממצא זה ממחיש כי ספירת לוחות קיימא לבדה אינה מספקת כדי לקבוע הטיית קציר ופירוק ולכן יש לזווג עם שיטה נוספת, מיקרוסקופיה, למשל.
בנוסף להגדרות sonicator, חקרנו גורמים חשובים אחרים המשפיעים sonication. אלה כללו את נפח הנוזל בבקבוקונים (10 או 40 מ"ל), את סוג הנוזל בבקבוקון (מים חוצצים או מרק מנטרל 2X D/E) ואת מספר הבקבוקונים שהונחו באמבטיה בו זמנית (3 או 12 בקבוקונים)9.
P. aeruginosa biofilms על CDC Biofilm כור קופונים היו sonicated באמצעות הגדרת sonicator 2 (45 kHz, 100% כוח, הגדרה רגילה, 30 ± 5 שניות). כל הדגימות היו מערבולת או 3 בכל פעם או 6 בכל פעם באמצעות מערבולת מצוידת מצורף צינור 6 מקומות אז sonicated כמתואר באיור 3. קופון אחד מכל אחת מהקטגוריות הבאות צולם באמצעות CM (איור 3).
במחקר השני שבו נחקרו הפרמטרים של sonication, התמונות המיקרוסקופיות (איור 3) מציעות כי מזעור הנפח בצינורות, הפחתת מספר הצינורות המעובדים בבת אחת ושימוש במרק מנטרל D/E (המכיל פעילי שטח) תורמים כולם לקציר ביופילם משופר מהקופונים.
ביוצידים עשויים לשפר באופן חיובי או שלילי את הקציר וההתפרקות. בדומה לאישור כי מנטרל ביעילות מפסיק את הפעיל תוך לא להגדיל להרוג לפני ביצוע בדיקת יעילות, חשוב לאשר כי biocide אינו משפיע באופן דיפרנציאלי קציר ופירוק. לבדיקת יעילות, תוצאות הטיה אם ורק אם יש הסרה דיפרנציאלית עבור הבקרה לעומת דגימות ביופילם מטופלות11.
איור 1: תמונות של קופונים מוכתמים בסגול קריסטל ומדגימים ביופילם שיורית. A) קופון הוסר מהכור ומוכתם סגול קריסטל. B, C, D) שלושה קופונים משוכפלים "טופלו" בנפרד עם מים חוצצים סטריליים ואז נוטרלו. כדי לקצור ולפרק, הקופונים היו מערבולת (30 ± 5 שניות) ו sonicated (45 kHz, 10% כוח, הגדרת לטאטא, 30 ± 5 שניות) פעמיים ואז קיבל מערבולת סופית. התמונות באדיבות דניאל אור ובליין פריץ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות מיקרוסקופיות קונפוקליות של קופונים המשווה בין שתי הגדרות sonication שונות. קופונים (הגדלה 12.5X) מעובד באמצעות הגדרת sonication 1 (45 kHz, 10% כוח, הגדרת לטאטא) בצד שמאל או הגדרת sonication 2 (45 kHz, 100% כוח, הגדרה רגילה) בצד ימין. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. תמונות מיקרוסקופיות קונפוקליות של קופונים השוואת כרכים, נוזל sonication ומספר צינורות. קופונים (הגדלה פי 12.5) מעובדים בנפחים של 10 או 40 מ"ל, במי דילול (DW) או D/E מנטרלים מרק (D/E), 3 או 12 צינורות בכל פעם עם הגדרת sonication ממוטבת (45 kHz, 100% כוח, הגדרה רגילה). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים 1: פרמטרים מרכזיים של חשיבות לקציר ופירוק אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מידע מינימלי לשיטות קצירה ופיזור
כדי ליצור נתוני ביופילם הניתנים לשחזור ברחבי הקהילה המדעית, חובה על המחברים לכלול כמה שיותר פרטים לגבי כל אחד משלבי הצמיחה, הטיפול, הדגימה והניתוח של שיטת ביופילם. התקינה של שיטות ביופילם סייעה במאמץ זה שכן היא מאפשרת לחוקר להתייחס לשיטה ספציפית ולכל שינוי רלוונטי. עם זאת, מאמרים רבים כוללים רק משפט או שניים לתיאור קציר ביופילם ופירוק. לקבלת שחזור טוב יותר, אנו ממליצים כי מידע מינימלי לקציר ביופילם ייכלל בפרסומים. זה מתבסס על המידע המינימלי על ניסוי ביופילם (MIABiE) היוזמה שהוצגה על ידי לורנקו ואח '17. במקרה של שימוש sonication עבור קציר biofilm ופרמטרים פירוק המידע צריך לכלול: מיקום של צינורות בתוך האמבטיה (המלצות היצרנים כדי למנוע פגיעה במתמרים), מספר צינורות sonicated באותו זמן, חומר צינור, נפח וסוג של נוזל בצינור, נוכחות של פעילי שטח, מיקום של נוזל בצינורות ביחס לרמה הנוזלית של אמבטיה קולית, מכשיר המשמש להחזיק את הצינורות באמבטיה (כוסות זכוכית לעומת מתלה מבחנה), degassing של אמבט מים לפני sonication של דגימות (אם degassing אינו אופציה היצרן, פעולה פשוטה של האמבטיה לפני החדרת הדגימות יעזור להסיר כמה גזים מומסים מנוזל האמבטיה), הטמפרטורה של אמבט מים (הטמפרטורות יכולות לעלות לאחר תקופות ארוכות של sonication), תדירות (25 קילו-הרץ או 45 קילו-הרץ, למשל), פונקציית אמבטיה (לטאטא או רגיל, למשל) וטווח הספק המועבר למתמרים (10- 100%, למשל). הגדרות אלה צריך להיות ממוטב עבור biofilm נחקר, המערכת המשמשת כדי לגדל את biofilm ואת היצרן הספציפי / מודל של אמבטיה קולית18.
הגדרות Sonicator עשויות להשתנות כדי למטב את השפעות הקציר הרצויות. הסרת גזים מסירה אוויר מומס בתוך נוזל האמבטיה ובכך משפרת את כוח הניקוי. ניתן להתאים את התדירות להגדרה נמוכה או גבוהה. הגדרה נמוכה כגון 25 kHz, למשל, תסייע בקצירת דגימות עקשניות בעוד הגדרה גבוהה יותר של 45 kHz תהיה מתאימה יותר לדגימות רגישות. פונקציית אמבטיה של לטאטא או נורמלי מאפשר הפצה של cavitation. פונקציית הטאטוא יוצרת הסטה רציפה של מקסימה לחץ הקול. הפונקציה הרגילה מאפשרת למתמרים לפעול במצב חצי גל כפול אשר עלול לגרום לאזורים מתים, ובכך להפוך את sonication פחות יעיל. טווחי הספק יכולים להשתנות מ 10 - 100% מהכוח המועבר למתמרים19. זה ידוע כי sonication יכול להשפיע לרעה על הכדאיות החיידקית. מחקר משנת 2008 שנערך על ידי Stamper et al.20 חשף תרביות חיידקים להגברת האנרגיה הקולית לאורך זמן כדי ליצור עקומות הרג חיידקיות. אנו ממליצים למשתמשים לאשר כי שילוב מסוים של הגדרות sonication אינו גורם לירידה בחיידקים קיימא20.
אין שיטה מושלמת אחת לקצור ולפרק ביופילם, אבל שיטות מסוימות לעבוד טוב יותר עבור כמה משטחים / שילובי חיידקים יותר מאחרים. אנו תומכים בקורא כדי לקבוע אילו פרמטרים חשובים לתרחיש הביופילם המסוים שלהם. פרמטרים מרכזיים בעלי חשיבות לקציר ופירוק נכללים בקובץ משלים 1.
עבור מחקרים sonication נעשה כדי להעריך קציר ופירוק הטיה, מצאנו כי sonication הוא נוח, יעיל ומסוגל להיות סטנדרטי עבור קציר ופירוק biofilm מפני משטחים. מיקום קופונים בבקבוקונים ממזער את השונות של הטכנאי לטכנאים שתיתקל בהם בשיטות שבהן קופונים מגרדים פיזית על ידי אנשי המעבדה, למשל. למרות שזה נראה פשוט מספיק כדי למקם בקבוקונים באמבט מים sonicating, ישנם פרמטרים רבים שיש לשקול כדי להשיג קציר אופטימלי של biofilm.
שני סוגים של ציוד sonication זמינים, אמבטיות קוליות ובדיקות קוליות. מאמר זה מתמקד בעיקר באמבטיות קוליות שבהן נוצרת אנרגיה קולית בטווח של תדר גבוה (20 - 45 kHz) לנורמלי (40 - 60 הרץ).
שלושה תהליכים עיקריים נמצאים במשחק בעת שימוש במכשיר קולי כדי לנקות משטח. אנרגיה חשמלית מומרת לאנרגיה אקוסטית כאשר זרם בתדר גבוה נשלח למתמר פיזואלקטרי או מגנטי שמתנדנד בתגובה לזרם. התנודה יוצרת גלי דחיסה (נדירים) בנוזל. בועות cavitation טופס עקב לחץ שלילי במהלך נדירות. הבועות גדלות עד שהן מגיעות לגודל לא יציב ומתמוטטות, ויוצרות סילון מים שמנקה משטחים21.
שלוש גישות קציר ופירוק מודגמים במאמר זה: sonication ושיטות מערבולת לקציר ופירוק ביופילם כאשר גדל על קופונים פוליקרבונט בכור Biofilm CDC על פי שיטת צינור יחיד. שיטות גירוד והומוגניזציה לקציר ופירוק ביופילם מוצגים כאשר גדלים על קופונים זכוכית באמצעות כור Biofilm זרימה טפטוף. גירוד, sonication ושיטות מערבולת עבור קציר ופירוק biofilm מוצגים כאשר גדלים צינורות סיליקון.
אין שיטה מושלמת לקצור ולפרק את הביופילם, אבל כמה גישות טובות יותר עבור משטחים שונים ו / או יישומים. מה שחשוב הוא לקחת את הזמן כדי לאמת את השיטה המשמשת. במאמר זה דנו בשימוש בסגול קריסטל ובמיקרוסקופיה, אך אפשרויות אחרות קיימות בהתאם לרגישות הנדרשת. אם המחקר כולל בדיקות יעילות, אז זה קריטי כדי לאשר את תוקפו של הגישה בנוכחות מיקרוביאלית6. כל הציוד שונה במקצת, כך שגם אם שיטת הקציר והפירוק תוקנה, עדיין זה נבון לאשר את התהליך עבור הציוד המשמש. שיטות קציר ופירוק הן ספציפיות עבור חיידקים הקשורים פני השטח וביופילם. מחקרים הוכיחו כי בחירות לא נכונות עלולות להוביל לתוצאות בדיקה מוטות. עם זאת, קציר ופירוק הם הפחות נחקרים מבין ארבעת השלבים בשיטות ביופילם. זה בדרך כלל גם צעד לא מוערך (נלקח כמובן מאליו כעבודה) עם המידע הנמוך ביותר נוכח במאמר שפורסם מה שהופך אותו מאתגר לשחזר את התהליך במעבדה אחרת. נייר זה ווידאו נלווה מציגים שלוש גישות נפוצות עבור שני סוגי משטח ומציעים כיצד לאמת שיטה עבור מעבדה בודדת. מידע זה יסייע לחוקרים לקבל החלטות מושכלות יותר באיזו שיטה להשתמש ומספק הדרכה על מה לדווח כדי לשפר את הרבייה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין גילויים.
Acknowledgments
אנו מבקשים להודות לדניאל אור גוביה, בליין פריץ, ג'ניפר סאמרס ופיי סן לי על תרומתם לעיתון זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical vials | Thermo Scientific | 339652 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific | FB102100 | |
| 5 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-12D | For adding treatment to vials containing coupons. |
| 50 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-14C | For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time. |
| Applicator sticks | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Metal spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| PTFE policemen | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool | IKA | 4446700 | For homogenization of biofilm samples. |
| Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Silicone Foley catheter, size 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Silicone tubing, size 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Splash Guards | BioSurface Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser | IKA | 3737001 | For homogenization of biofilm samples. |
| Tubing connectors | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Ultrasonic Cleaner | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder | Scientific Industries | SI-V506 |
References
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).
- ASTM International. ASTM Standard E2562, 2017, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor. ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2017).
- Environmental Protection Agency (USEPA). Efficacy Test Methods, Test Criteria, and Labeling Guidance for Antimicrobial Products with Claims Against Biofilm on Hard, Non-Porous Surfaces. Environmental Protection Agency (USEPA). , Available from: http://www.epa.gov/perticide-analytical-methods/efficacy-test-methods-test-criteria-and-labeling-guidance-antimicrobial (2021).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews In Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Gomes, I. B., et al. Standardized reactors for the study of medical biofilms: a review of the principles and latest modifications. Critical Reviews in Biotechnology. 38 (5), 657-670 (2018).
- Goeres, D. M., et al. Design and fabrication of biofilm reactors. Recent Trends in Biofilm Sciences and Technology. Simoes, M., et al. , Elsevier Science and Technology. 71-88 (2020).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4 (5), 783-788 (2009).
- ASTM International. ASTM Standard E2871, Standard Test Method for Determining Disinfectant Efficacy Against Biofilm Grown in the CDC Biofilm Reactor Using the Single Tube Method. ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2019).
- Goeres, D. M., et al. Validation of a Biofilm Efficacy Test: The Single Tube Method. Journal of Microbiological Methods. , (2019).
- Summers, J. G. The development and validation of a standard in vitro method to evaluate the efficacy of surface modified urinary catheters. Theses and Dissertations at Montana State University. , Available from: https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149 (2019).
- Hamilton, M. A., Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M. Checking the Validity of the harvesting and Disaggregating Steps in Laboratory Tests of Surface Disinfectants. Journal of AOAC International. 92 (6), 1755-1762 (2009).
- Conlon, B. P., Rowe, S. E., Lewis, K. Persister Cells in Biofilm Associated Infections. Biofilm-based Healthcare-associated Infections. Donelli, G. , (2015).
- ASTM International. ASTM Standard E2647, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown Using Drip Flow Biofilm Reactor with Low Shear and Continuous Flow. ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2020).
- Rosenberg, M., Azevedo, N., Ivask, A. Propidium iodide staining underestimates viability of adherent bacterial cells. Scientific Reports. , (2019).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Manuira-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. , (2015).
- Kobayashi, N., Bauer, T. W., Tuohy, M. J., Fujishiro, T., Procop, G. W. Brief Ultrasonication Improves Detection of Biofilm-formative Bacteria Around a Metal Implant. Clinical Orthopaedics and Related Research. 457, 210-213 (2007).
- Lourenco, A., et al. Minimum information about a biofilm experiment (MIABiE), standards for reporting experiments and data on sessile microbial communities living at interfaces. Pathogens and Disease. 0, 1-7 (2014).
- Nascentes, C. C., Korn, M., Sousa, C. S., Arruda, M. A. Z. Use of Ultrasonic Baths for Analytical Applications: A New Approach for Optimisation Conditions. Journal of Brazilian Chemical Society. 12 (1), 57-63 (2001).
- Elma GmbH & Co. KG TI-H Ultrasonic Cleaning Units: Operating Instructions. Elma GmbH & Co. , Singen, Germany. (2009).
- Stamper, D. M., Holm, E. R., Brizzolara, R. A. Exposure times and energy densities for ultrasonic disinfection of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus avium and sewage. Journal of Environmental Engineering and Science. 7 (2), 139-146 (2008).
- Suslick, K. S.
