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Neuroscience

Messung der Glukoseaufnahme in Drosophila-Modellen der TDP-43-Proteinopathie

Published: August 3, 2021 doi: 10.3791/62936
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1,3
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Arizona, Tucson, 2Vollum Institute, Oregon Health and Science University, 3Department of Neuroscience, University of Arizona, Tucson
* These authors contributed equally

Summary

Die Glukoseaufnahme ist in Drosophila-Motoneuronen erhöht, die von der TAR-DNA-bindenden Protein (TDP-43) -Proteinopathie betroffen sind, wie durch einen FRET-basierten, genetisch kodierten Glukosesensor angezeigt.

Abstract

Amyotrophe Lateralsklerose ist eine neurodegenerative Erkrankung, die innerhalb von 2-5 Jahren nach der Diagnose zu fortschreitender Muskelschwäche und Tod führt. Klinische Manifestationen umfassen Gewichtsverlust, Dyslipidämie und Hypermetabolismus; Es bleibt jedoch unklar, wie diese mit der Degeneration von Motoneuronen zusammenhängen. Unter Verwendung eines Drosophila-Modells der TDP-43-Proteinopathie, das mehrere Merkmale von ALS rekapituliert, einschließlich zytoplasmatischer Einschlüsse, lokomotorischer Dysfunktion und reduzierter Lebensdauer, haben wir kürzlich weitreichende Stoffwechseldefizite identifiziert. Unter diesen wurde festgestellt, dass die Glykolyse hochreguliert ist, und genetische Interaktionsexperimente lieferten Hinweise auf einen kompensatorischen neuroprotektiven Mechanismus. Trotz der Hochregulierung der Phosphofructokinase, dem geschwindigkeitsbegrenzenden Enzym in der Glykolyse, wurde gezeigt, dass eine Zunahme der Glykolyse unter Verwendung diätetischer und genetischer Manipulationen die Funktionsstörung des Lokomotors und die erhöhte Lebensdauer in Fliegenmodellen der TDP-43-Proteinopathie abschwächt. Um die Wirkung der TDP-43-Proteinopathie auf den glykolytischen Fluss in Motoneuronen weiter zu untersuchen, wurde ein zuvor berichteter genetisch kodierter, FRET-basierter Sensor, FLII12Pglu-700μδ6, verwendet. Dieser Sensor besteht aus einer bakteriellen Glukosesensordomäne und cyan- und gelb fluoreszierenden Proteinen als FRET-Paar. Bei der Glukosebindung erfährt der Sensor eine Konformationsänderung, die FRET ermöglicht. Unter Verwendung von FLII12Pglu-700μδ6 wurde festgestellt, dass die Glukoseaufnahme in Motoneuronen, die TDP-43G298Sexprimieren, signifikant erhöht ist, eine ALS-verursachende Variante. Hier zeigen wir, wie die Glukoseaufnahme ex vivoin larvalen ventralen Nervenstrangpräparaten gemessen werden kann, die den Glukosesensor FLII12Pglu-700μδ6 im Rahmen der TDP-43-Proteinopathie exprimieren. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um die Glukoseaufnahme zu messen und den glykolytischen Fluss in verschiedenen Zelltypen oder im Zusammenhang mit verschiedenen Mutationen, die ALS und verwandte neurodegenerative Erkrankungen verursachen, zu bewerten.

Introduction

Die Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine fortschreitende neurodegenerative Erkrankung, die derzeit unheilbar ist. ALS betrifft obere und untere Motoneuronen, was zu einem Verlust der motorischen Koordination, irreversibler Lähmung, Atemversagen und schließlich zum Tod innerhalb von 2-5 Jahren nach der Diagnoseführt 1. ALS ist mit Stoffwechseldefekten wie Gewichtsverlust, Dyslipidämie und Hypermetabolismus assoziiert (überprüft in2); Es bleibt jedoch unklar, wie diese Veränderungen im Stoffwechsel mit der Degeneration von Motoneuronen zusammenhängen. Ein gemeinsamer Nenner bei ALS und verwandten neurodegenerativen Erkrankungen ist TDP-43, ein Nukleinsäure-bindendes Protein, das an mehreren Schritten der RNA-Verarbeitung beteiligt ist3,4,5. Obwohl Mutationen in TDP-43 nur 3% -5% der Patienten betreffen, wird das Wildtyp-TDP-43-Protein in zytoplasmatischen Aggregaten in >97% der ALS-Fälle (überprüft in6) gefunden. Diese Pathologie wurde in Drosophila durch Überexpression von menschlichem Wildtyp oder mutantem TDP-43 (G298S) in Motoneuronen modelliert, was mehrere Aspekte von ALS rekapituliert, einschließlich zytoplasmatischer Einschlüsse, lokomotorischer Dysfunktion und reduzierter Lebensdauer7,8. Unter Verwendung dieser Modelle wurde kürzlich berichtet, dass die TDP-43-Proteinopathie einen signifikanten Anstieg der Pyruvatspiegel und der Phosphofructokinase (PFK) mRNA, dem geschwindigkeitsbegrenzenden Enzym der Glykolyse, verursacht9. Ähnliche Erhöhungen der PFK-Transkripte wurden in patienteneigenen Motoneuronen und Rückenmark gefunden, was darauf hindeutet, dass die Glykolyse im Zusammenhang mit der TDP-43-Proteinopathie hochreguliert ist. Interessanterweise milderte ein weiterer Anstieg der Glykolyse durch diätetische und genetische Manipulationen mehrere ALS-Phänotypen wie Lokomotorische Dysfunktion und erhöhte Lebensdauer in Fliegenmodellen der TDP-43-Proteinopathie, die mit einem kompensatorischen, neuroprotektiven Mechanismus in degenerierenden Motoneuronen übereinstimmen.

Um Veränderungen in der Glykolyse weiter zu untersuchen und die Glukoseaufnahme in Drosophila-Modellen der TDP-43-Proteinopathie zu messen, wurde ein zuvor berichteter genetisch kodierter FRET-basierter Sensor FLII12Pglu-700μδ610 in Motoneuronen speziell mit dem UAS-GAL4-Expressionssystem exprimiert. Der Glukosesensor FLII12Pglu-700μδ6 nutzt den Resonanzenergietransfer zwischen zwei Varianten des grün fluoreszierenden Proteins, cyanfarbene und gelb fluoreszierende Proteine (CFP und YFP), um Glukose auf zellulärer Ebene nachzuweisen. Es besteht aus einer bakteriellen Glukosebindungsdomäne aus dem E. coli MglB-Gen, das an gegenüberliegenden Enden des Moleküls mit CFP und YFP fusioniert ist. Wenn der Sensor an ein Glukosemolekül gebunden ist, erfährt er eine Konformationsänderung, die CFP und YFP näher zusammenbringt und FRET ermöglicht, die dann zur Quantifizierung der intrazellulären Glukosespiegel verwendet werden kann10,11,12 ( Abbildung1). Hier zeigen wir, wie der FLII12Pglu-700μδ6-Sensor verwendet werden kann, um Veränderungen der Glukoseaufnahme zu bestimmen, die durch TDP-43-Proteinopathie in Motoneuronen verursacht werden. Die hier beschriebenen Experimente zeigen, dass die Überexpression einer ALS-assoziierten Mutante, TDP-43G298S,in Motoneuronen einen signifikanten Anstieg der Glukoseaufnahme im Vergleich zu Kontrollen verursacht. Dieser Ansatz kann in anderen Arten von ALS (z. B. SOD1, C9orf72 usw.) und / oder anderen Zelltypen (z. B. Glia, Muskeln) verwendet werden, um Veränderungen der Glukoseaufnahme im Zusammenhang mit Neurodegeneration zu bestimmen.

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Protocol

Die UAS FLII12Pglu-700μδ6 transgenen Fliegen wurden in Volkenhoff et al.10 berichtet und freundlicherweise von Dr. S. Schirmeier zur Verfügung gestellt. Die transgenen UAS TDP-43G298S Leitungen wurden freundlicherweise von Dr. T. Iwatsubo13zur Verfügung gestellt. Rekombinante Drosophila-Linien, die sowohl UAS FLII12Pglu-700μδ6- als auch UAS TDP-43-Transgene beherbergen, wurden im Zarnescu-Labor unter Verwendung genetischer Standardansätze erzeugt und in Manzo et al.9berichtet. D42 GAL4 wurde verwendet, um die Expression des Glukosesensors allein oder zusammen mit TDP-43G298S in Motoneuronen zu steuern. Alle Fliegenschnuren werden auf Melasse-Maismehlmedien bei 25 °C im Dunkel-Licht-Zyklus gehalten.

1. Drosophila Ventral Nerve Cord (VNC) Dissektionen

  1. Machen Sie Silikonelastomer-Dissektionsschalen.
    1. Gießen Sie Silikonelastomerkomponenten in ein 50-ml-Röhrchen, wie im Protokoll des Herstellers angegeben, und rühren Sie gut um.
    2. Füllen Sie 35 mm Gewebekulturschalen mit ca. 2 ml der Elastomermischung. Verwenden Sie eine Spritze, um Blasen zu entfernen. Das Geschirr abdecken und über Nacht in einem 60 °C warmen Ofen auf eine ebene Fläche stellen, um es auszuhärten.
  2. Sezieren Sie Drosophila-Larven, um die VNC freizulegen und gleichzeitig die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten.
    1. Sammeln Sie eine wandernde Larve im dritten Stadium, spülen Sie sie mit ddH2O ab und legen Sie sie dann in einen Tropfen HL3-Puffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM Saccharose, 5 mM Trehalose, 5 mM HEPES; pH 7,1) auf eine mit Elastomeren ausgekleidete Schale.
    2. Mit einer Pinzette (# 5 oder 55 Pinzette) unter einem Seziermikroskop die vorderen und hinteren Enden der Larve dorsal mit der Seite nach oben fixieren und die Larve vorsichtig der Länge nach mit Insektenstiften (Minutein Pins) dehnen.
    3. Machen Sie einen Schnitt direkt über dem hinteren Stift mit einer abgewinkelten Irisschere. Machen Sie einen vertikalen Schnitt, beginnend mit dem Einschnitt in Richtung des vorderen Endes der Larve.
    4. Fügen Sie bei Bedarf ein paar Tropfen HL-3-Puffer hinzu. Entfernen Sie die Luftröhre und den Rest der schwimmenden Organe, ohne das ZNS zu stören. Stecken Sie die Klappen, die die Körperwand dehnen, um das ZNS freizulegen, während das neuromuskuläre System (VNCs, Axone und neuromuskuläre Verbindungen) intakt bleibt.

2. Bilderfassung

  1. Optimieren Sie die Bildgebungsparameter.
    1. Schalten Sie das Mikroskop und die Laser ein, bevor Sie mit den Dissektionen beginnen. Die Bilder müssen mit einem aufrechten konfokalen Mikroskop mit einer 40-fachen Wasserimmersionslinse aufgenommen werden. Verwenden Sie einen 405-nm-Laser, um CFP anzuregen und die Bilder sowohl im CFP- (465-499 nm) als auch im FRET- (535-695 nm) Detektionskanal aufzunehmen.
    2. Optimieren Sie Erfassungsparameter wie Scangeschwindigkeit (6), Durchschnitt (2), Objektiv (40x), Zoom (1x), Lochgröße (1 AE) und räumliche Auflösung (512 x 512). Stellen Sie die Verstärkung so ein, dass sich das Signal im optimalen Dynamikbereich befindet. Für alle Genotypen müssen die gleichen Parameter verwendet werden.
  2. Bilden Sie Motoneuronen innerhalb des VNC ab.
    1. Legen Sie die Silikonschale mit der sezierten Probe unter die Linse. Senken Sie die Linse ab, so dass sie mit Trehalose-Saccharose-HL3-Puffer in Berührung kommt (siehe 1.2.1). Es ist wichtig sicherzustellen, dass das Objektiv vollständig in den Puffer eingetaucht ist. Fügen Sie bei Bedarf weiteren Puffer hinzu.
    2. Verwenden Sie die CFP- und FRET-Kanäle, um manuell einen optischen Abschnitt auszuwählen, der aus mindestens 6 fokussierten Motoneuronen besteht und sich entlang der VNC-Mittellinie befindet. Die Motoneuronen werden anhand der Expression des Glukosesensors und der Position entlang der vorder-hinteren Achse identifiziert.
    3. Erfassen Sie Bilder alle 10 Minuten für 10 Minuten. Diese Bilder stellen die Grundlinie dar.
  3. Stimulieren Sie mit Glukose ergänzt HL-3.
    1. Entfernen Sie den Trehalose-Saccharose-haltigen HL3-Puffer mit einer Pasteur-Pipette und ersetzen Sie ihn durch 5 mM Glucose ergänzt HL-3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM Saccharose, 5 mM Glucose, 5 mM HEPES, pH 7,1). Dieser Schritt muss mit großer Sorgfalt durchgeführt werden, um die Bewegung des VNC so weit wie möglich zu vermeiden.
    2. Erfassen Sie Bilder alle 10 Sekunden für weitere 10 Minuten. Diese Bilder stellen die Stimulationsphase dar.
  4. Speichern Sie die Bilder als .czi-Dateien oder einen anderen von der Imaging-Software unterstützten Dateityp mit einem Dateinamen einschließlich Datum, genetischem Hintergrund, experimentellem Zustand (Baseline oder Stimulation) und verwendeten Kanälen.
  5. Verwenden Sie die Parameter wieder, um alle Genotypen abzubilden (Abbildung 2A).

3. Bildverarbeitung und ROI-Auswahl

  1. Öffnen Sie die CZI-Dateien in Fiji/ImageJ und legen Sie Farbmodus: Graustufenfest, wählen Sie View Stack with: Hyperstackund wählen Sie Split Channels into Separate Windows.
  2. Verarbeiten Sie Bilder mit den Driftkorrektur-Plugins: Turboreg und Stackreg. Jeder Kanal wird separat korrigiert, indem Sie unter Pluginsdie Option Stackreg auswählen und dann Transformation: Translationauswählen.
  3. Wählen Sie manuell die Regions of Interest (ROIs) aus, um den grauen Mittelwert jedes Kanals zu extrahieren.
    1. Wählen Sie die ROIs, indem Sie alle Motoneuronen verfolgen, die über die gesamte Zeitreihe im Fokus bleiben. Verwenden Sie den ROI-Manager, um jede Motoneuron-Gliederung zu speichern.
    2. Verwenden Sie die Multi-Measure-Funktion, um den mittleren Grauwert in jedem ROI zu jedem Zeitpunkt zu messen. Kopieren Sie die ROIs, die vom ersten Kanal zum zweiten Kanal für das Bild vor der Stimulation verfolgt werden.
    3. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Post-Stimulationsbilder in jedem Kanal mit den gleichen Zellen/ROIs, die für das Pre-Stimulationsbild ausgewählt wurden.

4. Datenanalyse

  1. Berechnen Sie das FRET/CFP-Verhältnis unter Verwendung der mittleren Grauwerte für die FRET- und CFP-Kanäle. Änderungen der FRET/CFP-Verhältnisse spiegeln Veränderungen der intrazellulären Glukosekonzentration wider.
    1. Zeichnen Sie FRET/CFP-Verhältnisse für jeden ROI und Zeitpunkt im Vergleich zur Zeit auf. Innerhalb jedes VNC zeigen einige der ROIs nach Stimulation einen Rückgang der FRET/CFP-Verhältnisse.
      HINWEIS: Dies wird als Unfähigkeit einiger Neuronen interpretiert, Glukose aufzunehmen, möglicherweise aufgrund von Stress, der durch Dissektionen verursacht wird, und wird daher aus der Analyse eliminiert. Die verbleibenden FRET/CFP-Verhältnisse für jeden ROI und Zeitpunkt werden gemittelt, um ein einzelnes FRET/CFP-Verhältnis pro Zeitpunkt und Genotyp zu erzeugen (Glukosesensor allein und Glukosesensor mit TDP-43G298S). Diese einzelnen FRET/CFP-Verhältnisse werden für alle nachfolgenden Normalisierungen verwendet. 31 ROIs wurden für Glukosesensorkontrollen und 24 ROIs für TDP-43G298Sanalysiert.
  2. Baseline-Normalisierung: Berechnen Sie den Durchschnitt der FRET/CFP-Verhältnisse für die ersten 10 Minuten (Baseline) und normalisieren Sie dann die einzelnen FRET/CFP-Verhältnisse für jeden Zeitpunkt des gesamten Experiments auf den 10-minütigen Basisliniendurchschnitt (siehe Abbildung 2B).
  3. Timepoint-Normalisierung: Normalisieren Sie TDP-43G298S FRET/CFP-Verhältnisse in FRET/CFP-Verhältnisse vom Glukosesensor allein zu jedem Zeitpunkt (siehe Abbildung 3A).
  4. Balkendiagramme: Für Vergleiche zwischen Baseline und Stimulation in Form von Balkendiagrammen verwenden Sie FRET/CFP-Verhältnisse von 5-10 min (Baseline) und 15-20 min (Stimulation) für jeden Genotyp. Normalisieren Sie das Stimulationsverhältnis zum Ausgangswertverhältnis (siehe Abbildung 3B).

5. Statistische Auswertungen

  1. Bewerten Sie die normalisierten Datensätze mit Hilfe der Mann-Whitney-Korrektur (für Baseline- und Zeitpunktnormalisierungen) oder des Kruskall-Walis-Tests (für die Balkendiagrammdarstellung der Stimulation im Vergleich zu den FRET/CFP-Verhältnissen der Baseline).

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Representative Results

Bildaufnahme des Glukosesensors im ventralen Nervenstrang (VNC), ex vivo
Um Unterschiede in der Glukoseaufnahme in einem Drosophila-Modell von ALS basierend auf TDP-43 zu bestimmen, wurde ein genetisch kodierter FRET-basierter Glukosesensor verwendet. Der Sensor bestand aus CFP und YFP, die mit der Glukosebindungsdomäne aus dem E. coli MglB-Gen fusionierten. Die Glucosebindung löst eine Konformationsänderung aus, die durch Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) zwischen dem CFP und YFP 10,11,12nachgewiesen werden kann. Wenn Glukose nicht an den Sensor gebunden ist, verursacht die CFP-Anregung nur eine CFP-Emission, und wenn Glukose bindet, kann das YFP-Signal aufgrund von FRET zwischen CFP und YFP nachgewiesen werden (Abbildung 1A). Der D42 GAL4-Treiber wurde verwendet, um den Sensor allein oder zusammen mit der ALS-assoziierten Mutante TDP-43G298S in Motoneuronen über das bipartite UAS-GAL4-Expressionssystem14zu exprimieren. Larven im dritten Stadium wurden im HL3-Puffer ohne Glukose seziert und fixiert, um das neuromuskuläre System freizulegen, einschließlich des VNC, das noch über motoneuronische Axone mit den neuromuskulären Verbindungen verbunden ist. Die VNC wurde mit einer 40-fachen Wasserimmersionslinse mit einer räumlichen Auflösung von 512 x 512 Pixeln abgebildet (siehe Protokoll und Abbildung 1B). CFP- und FRET-Signale wurden in den 465-499 nm bzw. 535-695 nm nach CFP-Anregung mit dem 405 nm-Laser erfasst. Der abzubildende Schnitt wurde basierend auf der Ebene ausgewählt, in der der VNC mit mindestens sechs Motoneuronen im Fokus entlang der Mittellinie sichtbar war. Die ausgewählte Ebene wurde für 10 Minuten abgebildet und alle 10 s ein Bild aufgenommen, um die Basisfluoreszenz zu bestimmen. Die CZI-Dateien wurden gespeichert unter: genotype_sample#_baseline. Nachdem der 10-minütige Zeitkurs für die Ausgangsbedingungen abgeschlossen war, wurde der Puffer durch glukoseergänztes HL3 ersetzt. Das Bild wurde neu fokussiert, um die gleiche Ebene zu finden, die unter Basisbedingungen abgebildet wurde. Für alle Samples wurden die gleichen Bildeinstellungen verwendet. Der VNC wurde dann erneut für 10 Minuten abgebildet, wobei alle 10 s ein neues Bild aufgenommen und gespeichert wurde: genotype_sample#_post Stimulation für weitere Analysen.

Bildanalyse
Eine große Herausforderung bei Live-Imaging-Experimenten ist die Drift, die VNCs während des 20-minütigen Bildgebungsintervalls durchlaufen. Um dieses Problem zu beheben, wurde stackreg in FIJI vor der Bildanalyse und ROI-Auswahl ein Driftkorrektur-Plugin verwendet (siehe Protokoll und Abbildung 2A). Aus jedem VNC wurden 6-8 einzelne Zellen/ROIs ausgewählt und mit dem FRET/YFP-Kanal skizziert. Selektionen wurden in den CFP-Kanal kopiert und die grauen Mittelwerte mit der Multi-Measure-Funktion gemessen. Die Quantifizierungen wurden durchgeführt, indem zunächst die FRET/CFP-Verhältnisse pro Zeitpunkt gemittelt und dann der Durchschnitt für die gesamten 10 Minuten pro Genotyp berechnet wurde. Diese Mittelwerte wurden dann verwendet, um die FRET/CFP-Verhältnisse zu jedem Zeitpunkt zu normalisieren und im Laufe der Zeit zu zeichnen, um eine erste Auswertung der Daten zu generieren (Abbildung 2B). Unter Verwendung dieses Normalisierungsansatzes wurde festgestellt, dass kontrollmotorische Neuronen, die den Glukosesensor allein exprimieren, bei Stimulation einen kleinen, aber signifikanten Anstieg der Glukoseaufnahme aufweisen (3,9%,P-Wert < 0,0001), während Motoneuronen, die TDP-43G298S exprimieren, eine signifikant höhere Glukoseaufnahme aufweisen (16,76%,P-Wert < 0,0001). Diese Daten stimmen mit der TDP-43-Proteinopathie überein, die eine erhöhte Glukoseaufnahme in Motoneuronen verursacht, wie zuvor in Referenz9gezeigt.

Datenanalysen - Messung der Glukoseaufnahme in Motoneuronen im Drosophila VNC
Um weitere Einblicke in die Unterschiede zwischen Kontrollen und TDP-43G298S mutierten Motoneuronen zu erhalten, wurde jedes FRET/CFP-Verhältnis zu jedem Zeitpunkt auf die Kontrolle normalisiert (Abbildung 3A). Dies ermöglicht einen Vergleich der Glukoseaufnahme zwischen ALS-Motoneuronen, die TDP-43G298S exprimieren, und Kontrollmotorneuronen, die den Glukosesensor allein in Echtzeit exprimieren. Unter Ausgangsbedingungen gab es keinen Unterschied zwischen den Genotypen. Bei Stimulation mit Glukose wurde jedoch bei TDP-43G298S im Vergleich zur Kontrolle ein schneller (7,31% nach 1 Min. Glukoseanwendung) und signifikanter Anstieg (12,76 % nach 10 Min.,P-Wert < 0,0001) der Glukoseaufnahme beobachtet.

Balkendiagramme bieten einen alternativen Ansatz zur Veranschaulichung von Unterschieden zwischen Genotypen (TDP-43G298S versus Kontrollen) vor und nach der Glukosestimulation (Abbildung 3B). Dies geschah durch Normalisierung des FRET/CFP-Verhältnisses für beide Bedingungen auf die Baseline der jeweiligen Genotypen und Aufzeichnen des durchschnittlichen Verhältnisses für die letzten 5 Minuten der Baseline- bzw. Stimulationsbildgebung. Bei Stimulation zeigen Neuronen, die nur einen Glukosesensor exprimieren, einen kleinen, aber signifikanten Anstieg des FRET/CFP-Verhältnisses (3,83% ± 0,08%,P-Wert < 0,0001) im Vergleich zum Ausgangswert. Während Neuronen, die TDP-43G298S exprimieren, bei Stimulation einen signifikanten Anstieg des FRET/CFP-Verhältnisses zeigten (14,73% ± 0,08%,P-Wert < 0,0001) im Vergleich zum Ausgangswert. Der Nettounterschied in den FRET/CFP-Verhältnissen zwischen Motoneuronen, die TDP-43G298S exprimieren, und dem Glukosesensor allein beträgt 10,9%(P-Wert = 0,005). Diese Analyse zeigt auch, dass sich die Verhältnisse um die letzten 5 Minuten jeder Zeitverlaufsbildgebung stabilisieren, so dass dieser Zeitrahmen für die Grafik gewählt wurde. Diese Analyse bietet einen allgemeinen Überblick über die Ergebnisse, einschließlich statistisch signifikanter Unterschiede zwischen Genotypen und Behandlungen in einer Grafik.

Figure 1
Abbildung 1: FRET-Sensor und Bilderfassung. (A) FRET-basiertes Glukosesensordiagramm zur Messung der Glukoseaufnahme in Motoneuronen. Glukosebindung verursacht FRET. (B) Diagramm der Dissektion des neuromuskulären Übergangs (NMJ), das den im VNC abgebildeten Bereich zeigt. Bilder links zeigen TDP-43G298S vor und nach der Glukosestimulation sowohl im FRET- (YFP) als auch im CFP-Kanal. Maßstabsbalken: 20 μm. Vergrößerung: 40x. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Bildanalyse des Glukosesensors im Kontext der TDP-43-Mutante. (A) Repräsentative Bilder von FRET- und CFP-Signalen in Glukosesensorsteuerungen und TDP-43G298S-Proben unter Basis- und Stimulationsbedingungen. Ein repräsentatives Motoneuron wird in jedem Bild als Beispiel für einen ROI skizziert. Maßstabsbalken: 20 μm. Vergrößerung: 40x. (B) Die durchschnittlichen Verhältnisse von FRET/CFP in Glukosesensor und TDP-43 mutierten Motoneuronen über 20 Min Bildgebung. Die Verhältnisse wurden auf das durchschnittliche Ausgangsverhältnis für jeden Genotyp normalisiert (siehe Baseline-Normalisierung im Protokoll). Die angezeigten Werte sind der Durchschnitt von 25-30 Motoneuronen (ROI) von 5 VNCs pro Genotyp. Mann-Whitney wurde verwendet, um die statistische Signifikanz zu bewerten. =P-Wert < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Datenanalyse des Glukosesensors im Kontext von TDP-43G298S. (A) FRET/CFP-Verhältnisse von TDP-43G298S werden zu jedem Zeitpunkt auf die Glukosesensorsteuerung normiert. Mann-Whitney wurde verwendet, um die statistische Signifikanz zu bewerten. =P-Wert < 0,0001. (B) Die Balkendiagrammdarstellung der Glukoseaufnahme in der Glukosesensorsteuerung und TDP-43G298S zeigt einen signifikanten Anstieg der Glukoseaufnahme in Kontrollmotorneuronen bei Stimulation und im Kontext von TDP-43G298S im Vergleich zu Kontrollen. Kruskall-Walis wurde verwendet, um die statistische Signifikanz zu bewerten. ** =P-Wert < 0,01, **** =P-Wert < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Die hier im Detail beschriebene Technik kann angewendet werden, um die Glukoseaufnahme in einem bestimmten Zelltyp von Interesse in lebender Drosophila mit FLII12Pglu-700μδ6 zu messen, einem FRET-basierten Sensor, der Änderungen des Glukosespiegels in einem Millimolarbereich10,11,12erkennen kann. Dieser Sensor wurde zuvor in Verbindung mit dem UAS-GAL4-System verwendet, um seine Expression auf bestimmte Zelltypen auszurichten, einschließlich der Neuronen9,10. In dieser Studie wurde D42 GAL4 verwendet, um FLII12Pglu-700μδ6 allein oder zusammen mit dem krankheitsassoziierten TDP-43G298S zu exprimieren, um zu demonstrieren, wie dieser Ansatz zur Bewertung der Glukoseaufnahme in ALS-Motoneuronen verwendet werden kann. Darüber hinaus kann diese Methode breit angewendet werden, um eine Vielzahl von Fluoreszenzsensoren im Larven-VNC abzubilden.

Zu den kritischen Schritten des Protokolls gehört die Maximierung des Signal-Rausch-Verhältnisses. Zu diesem Zweck wurden die Bildaufnahmeparameter so eingestellt, dass die Fluoreszenz nicht übersättigt wird und der gesamte Bereich der Signalintensität quantifiziert werden kann. Bildgebungsparameter wie Verstärkung, Scangeschwindigkeit, Lochgröße und Zoom blieben während der gesamten Studie unverändert. Die Experimente wurden über mehrere Tage durchgeführt; In jedem Experiment wurden jedoch beide Genotypen, d.h. Kontrollen und TDP-43G298S, zusammen abgebildet, um die Variabilität zu berücksichtigen. Die Abbildung des ZNS der Drosophila-Larve mit einer Wasserimmersionslinse könnte im Laufe der Zeit zu Veränderungen der optischen Ebene führen. Es sollte darauf geachtet werden, drastische Veränderungen in der optischen Ebene durch die Verwendung eines ausreichenden Puffers zu vermeiden. Proben mit Fokusänderungen wurden verworfen.

Obwohl die Bedingungen und Parameter während der gesamten Experimente unverändert bleiben, erfordert diese Technik eine Änderung des Puffers während der Bildgebung. Nach 10 Minuten Bildgebung muss der glukosefreie Puffer durch einen mit Glukose ergänzten HL-3-Puffer ersetzt werden, der die optische Brennebene verändern kann. Die Linse muss auf die gleiche Brennebene neu fokussiert werden, damit der gleiche Zellsatz vor und nach der Glukoseergänzung abgebildet wird. Eine Untergruppe von Motoneuronen zeigte nach Stimulation einen Abfall der FRET/CFP-Verhältnisse. Dies deutet darauf hin, dass einige Neuronen glukosefrei aufnehmen, möglicherweise aufgrund von Stress, der durch die Dissektion verursacht wird und aus der Analyse eliminiert wurde.

ROI-Auswahl, Bildverarbeitung und Quantifizierung wurden mit Fiji/ImageJ durchgeführt. Während der ROI im ersten Bild der Serie manuell ausgewählt wird, ist es wichtig, geringfügige Abweichungen in der Zeitraffer-Bildgebung zu korrigieren, um den ROI während der gesamten Imaging-Serie unveränderlich zu halten. Ein Open-Source-Plugin zur Driftkorrektur, Stackreg, wurde verwendet, um dieses Problem zu berücksichtigen.

Die Verfügbarkeit des richtigen Anregungslasers ist eine wesentliche Einschränkung dieser Technik. Obwohl der 436 nm Anregungslaser ideal für diesen Glukosesensor ist, haben wir gezeigt, dass der Sensor mit dem 405 nm Anregungslaser verwendet werden kann, der weiter verbreitet ist. Eine weitere Einschränkung dieser Technik besteht darin, dass sie zur Messung der Glukosedynamik, aber nicht der absoluten Glukosekonzentrationen verwendet werden kann. Eine mögliche alternative Strategie zur Messung des absoluten Glukosespiegels ist iGlucoSnFR-TS, ein lebenslanger Glukosesensor, der kalibriert werden kann, um absolute Glukosekonzentrationen zu messen15.

Glukose ist eine wichtige Energiequelle im Gehirn und wird für physiologische Funktionen benötigt. Defekte im Glukosestoffwechsel wurden mit mehreren pathologischen Zuständen in Verbindung gebracht (überprüft in16). Drosophila ist ein leistungsfähiges genetisches Modell, das zur Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen verwendet wird17. Es gibt jedoch nur begrenzte Techniken, um den Glukosespiegel in Drosophiladirekt zu messen. Dieser FRET-basierte Glukosesensor bietet ein direktes Maß für intrazelluläre Veränderungen des Glukosespiegels. Trotz einiger experimenteller Herausforderungen und Einschränkungen kann dieser Sensor erfolgreich eingesetzt werden, um die Glukosedynamik in bestimmten Zelltypen (z. B. Motoneuronen, Glia, Muskeln) in verschiedenen Krankheitsmodellen zu untersuchen, einschließlich mehrerer Arten von ALS und verwandten neurodegenerativen Erkrankungen.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Wir danken Stefanie Schirmeier und Takeshi Iwatsubo für die Bereitstellung von Drosophila-Sorten. Wir danken auch Patricia Jansma für die Unterstützung bei der Bildgebung im Marley Imaging Core an der University of Arizona. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health NIH NS091299, NS115514 (an DCZ), HHMI Gilliam Fellowship (an EM) und das Undergraduate Biology Research Program (an HB) finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm tissue culture dishes Sigma Aldrich CLS430165
40X water immersion lens Zeiss 440090 dippable, N.A. 0.8
dissection scissors Roboz RS-5618
Dumont #5 forceps VWR 100189-236
Dumont #55 forceps VWR 100189-244
Minutien pins Fine Science tools 26002-10 used for dissections
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit Dow 1317318
Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope Zeiss N/A

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References

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Neuroscience Glukosesensor ALS Drosophila,TDP-43 Proteinopathie
Messung der Glukoseaufnahme in <em>Drosophila-Modellen</em> der TDP-43-Proteinopathie
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Loganathan, S., Ball, H. E., Manzo,… More

Loganathan, S., Ball, H. E., Manzo, E., Zarnescu, D. C. Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy. J. Vis. Exp. (174), e62936, doi:10.3791/62936 (2021).

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